ITRM990117A1

ITRM990117A1 - Isolamento e caratterizzazione di un gene per il silenziamento genicoda n. crassa e suoi usi.

Info

Publication number: ITRM990117A1
Application number: IT1999RM000117A
Authority: IT
Inventors: Carlo Cogoni; Giuseppe Macino
Original assignee: Univ Roma
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 1999-02-22
Publication date: 2000-08-22
Also published as: AU3189700A; DE60028007T2; IT1306014B1; CA2362203A1; WO2000050581A3; ATE326529T1; US7001762B1; EP1155122B1; AU776057B2; EP1155122A1; DE60028007D1; WO2000050581A2

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: “Isolamento e caratterizzazione di un gene per il silenziamento genico da N. crassa e suoi usi”

La presente invenzione concerne l’isolamento e la caratterizzazione di un gene per il silenziamento genico da N. crassa e suoi usi.

Più in particolare l'invenzione riguarda l'isolamento e la caratterizzazione di un gene da Neurospora crassa codificante per un’attività essenziale per il processo di co-soppressione, e suoi usi e applicazioni in campo vegetale, animale e fungino.

L’ottenimento di organismi transgenici è di grande utilità sia nella ricerca biologica di base che in quella applicata. Il DNA transgenico viene normalmente integrato nel genoma e trasmesso come carattere Mendeliano. Tuttavia, in diversi casi, l’introduzione di transgeni induce fenomeni di silenziamento genico (Flavell, R.B.

1994), cioè di repressione dell’espressione del transgene stesso e/o di uno o più geni omologhi endogeni.

Il silenziamento genico agisce a due livelli: trascrizionale (trans-inactivation) quando i transgeni contengono sequenze omologhe al promotore del gene silenziato (Vaucheret, 1993); e posttrascrizionale (co-soppressione) che richiede omologie tra le regioni codificanti (Flavell, 1994; Stam et al. 1997; Baulcombe, 1996).

In generale, il silenziamento indotto da transgeni necessita di una quasi completa omologia di sequenza (tra 70% e 100%) tra il transgene e il gene silenziato (Elkind, 1990).

Nel fungo filamentoso Neurospora crassa, in fase vegetativa, la presenza di transgeni induce un fenomeno di silenziamento genico a livello post-trascrizionale, denominato “quelling” (Cogoni et al. 1996).

Attraverso l'uso del gene al-1 (albino 1) (Schmidhauser et al.

1990) come marcatore visuale per il silenziamento, ne sono state evidenziate diverse caratteristiche (Cogoni et al. 1996). In particolare, il '‘quelling” del gene al-1 in Neurospora è caratterizzato da: 1) il silenziamento genico è reversibile, a causa della perdita di copie dei transgeni; 2) la riduzione del livello basale del mRNA é dovuto a un effetto post-trascrizionale; 3) i transgeni contenenti almeno una regione di 132 coppie di basi identica alla regione codificante del gene bersaglio sono sufficienti ad indurre il “quelling”; 4) la duplicazione delle sequenze promotore é inefficace nell'indurre il silenziamento; 5) il “quelling” ha un comportamento dominante in eterocarion contenenti sia nuclei transgenici che nuclei non trasformati, indicando il coinvolgimento di una molecola diffusibile, che agisce "in trans" tra i nuclei; 6) l'espressione di un RNA aberrante trascritto dal locus transgenico é strettamente correlata con il silenziamento, suggerendo che il ‘'quelling” può essere indotto e/o mediato da una molecola di RNA transgenica.

Pertanto possono essere evidenziate delle omologie tra il silenziamento in Neurospora e la co-soppressione nelle piante. Il silenziamento genico é reversibile in Neurospora, come conseguenza della instabilità delle copie transgeniche in fase mitotica; anche nelle piante la reversione della co-soppressione é associata con la riduzione del numero di copie di transgene, risultante dalla ricombinazione intracromosomale durante la mitosi o la meiosi (Mittelstein Scheid et al.

1994; Stam et al. 1997). Quindi, sia nelle piante che in Neurospora, la persistenza dei transgeni é necessaria per il mantenimento del silenziamento. Come in Neurospora, la diminuzione del livello basale del mRNA del gene silenziato é causata da un meccanismo posttrascrizionale (Dehio and Schei! 1994; van Blokland et al. 1994; de Carvalho et al. 1995). Ed ancora, per l'induzione del “quelling” é necessario che i transgeni contengano una porzione della regione codificante del gene bersaglio del silenziamento, essendo la regione promotore inefficace per la sua induzione. Nelle piante porzioni codificanti senza promotore possono indurre il silenziamento (van Blokland et al. 1994) e, come, nel “quelling" i promotori o i prodotti genici funzionanti non sono richiesti per la co-soppressione.

Uno dei paralleli tra il “quelling” e la co-soppressione nelle piante é che entrambi i meccanismi sono mediati da fattori diffusibili. In ceppi eterocariotici di Neurospora, i nuclei in cui il gene albino 1 é silenziato sono in grado di indurre il silenziamento del gene al-1 residente in nuclei non trasformati, ma che condividono un citoplasma comune (Cogoni et al. 1996). Nelle piante la presenza di un fattore diffusibile é dimostrata dal fatto che la co-soppressione é in grado di inibire la replicazione del Tobacco Etch Virus (TEV), un virus ad RNA con un ciclo esclusivamente citoplasmatico. L'esistenza di fattori altamente diffusibili in grado di mediare la co-soppressione é stata dimostrata usando la tecnica di innesto in tabacco (Palaqui et al., 1997), dimostrando che piante di tabacco silenziate sono in grado di trasmettere il silenziamento a piante non silenziate attraverso un innesto anche a grande distanza.

Il fatto che il “quelling” e la co-soppressione condividano tutte queste caratteristiche suggerisce che i meccanismi coinvolti nel silenziamento genico post-trascrizionale nelle piante e nei funghì può essere evoluto da un comune meccanismo ancestrale.

Recentemente sono stati descritti fenomeni di inattivazione genica in seguito ad introduzione di transgeni anche in specie animali. In Drosophila melanogaster, il posizionamento di un transgene vicino a centri eterocromatinici determina una espressione variegata (Wallrath and Elgin 1995; Pirrotta, V. 1997). Simili profili d'espressione sono stati osservati quando il transgene di riferimento é all'interno di trasposoni organizzati in tandem, indicando che le ripetizioni sono in grado, di indurre la condensazione della cromatina (Dorer and Henikoff, 1994). Sempre in Drosophila, Pal-Bhadra et al. (1997) hanno osservato che l'introduzione di transgeni può condurre a fenomeni di inattivazione genica, simili alla co-soppressione.

Fenomeni di silenziamento genico dovuto a sequenze transgeniche ripetitive sono stati recentemente riportati nei mammiferi.

Garrick et al. (1998) hanno generato delle linee transgeniche di topo in cui 100 copie transgeniche sono presenti in un unico locus ed organizzate in tandem diretti. E' stato osservato che l'espressione del transgene é inversamente proporzionale al numero di copie presenti, indicando che fenomeni di silenziamento dipendenti da copie ripetute sono presenti anche nei mammiferi.

L’identificazione di geni coinvolti nel silenziamento in Neurospora è pertanto il primo passaggio per modulare lo stesso processo in piante, animali e funghi. La modulazione del silenziamento è di grande importanza applicativa per la produzione di organismi transgenici in grado di esprimere il fenotipo di interesse.

Gli autori della presente invenzione hanno già isolato ceppi di Neurospora crassa mutati in funzioni essenziali per il meccanismo di silenziamento genico (Cogoni and Macino, 1997): 15 mutanti indipendenti isolati definiscono tre gruppi di complementazione identificando tre geni qde-1, qde-2 e qde-3 (per qde si intenda "quelling” deficient), i cui prodotti sono indispensabili per il macchinario di silenziamento. I geni qde sono essenziali per il silenziamento in Neurospora, come suggerito dal fatto che il silenziamento di tre geni indipendenti (a/-f, al-2 e qa-2) é impedito dalle mutazioni qde (Cogoni and Macino, 1997).

Gli autori della presente invenzione hanno già identificato il gene qde-3 (Domanda di Brevetto Italiano No. RM98/A000730).

Gli autori della presente invenzione hanno ora identificato e clonato un altro dei geni qde in Neurospora , il gene qde-1 , identificando un altro dei fattori richiesti per il silenziamento. In considerazione delle similarità tra “quelling" e co-soppressione, i geni ortoioghi al gene isolato sono coinvolti nella co-soppressione e più in generale nel silenziamento genico in altri organismi, sia piante, che funghi, che animali.

Si possono individuare due ambiti_generali per l'applicazione dell'invenzione: 1) potenziamento del silenziamento come sistema per inattivare in maniera più efficace e stabile un gene d'interesse, e 2) soppressione del silenziamento per ottenere una migliore espressione dei transgeni introdotti.

Per un potenziamento del silenziamento, la sovraespressione di uno o più geni che controllano il fenomeno può condurre ad una maggiore efficienza e/o stabilità del silenziamento dell'espressione. Pertanto, l'introduzione in organismi del gene qde-1 , o di geni omologhi, può costituire un sistema per reprimere più efficacemente funzioni geniche. In particolare, questo approccio è particolarmente utile nelle piante dove la co-soppressione viene comunemente usata per il "knock out" di funzioni geniche. Sempre nelle piante il potenziamento del silenziamento genico può essere usato allo scopo di ottenere linee resistenti a virus patogeni, per introduzione di transgeni codificanti sequenze virali, al fine di ottenere l'inibizione dell’espressione del virus stesso (Flavell et al., 1994).

Analoghe applicazioni sono trasponibili in ambito animale, dove diverse osservazioni indicano che fenomeni di silenziamento possono determinare l'impossibilità di un’adeguata espressione dei transgeni introdotti (Garrick et al. 1998).

Al contrario vi sono casi in cui si desidera evitare e/o ridurre il silenziamento genico, per esempio quando s’intende sovraesprimere un transgene. E’ noto che la co-soppressione é strettamente correlata sia con la presenza di un alto numero di copie di transgene, che con l’alta espressione dei transgeni. Questa correlazione può rendere difficile ottenere organismi transgenici che esprimono ad alti livelli un transgene, in quanto più é alta l'espressione e/o il numero di copie più é probabile scatenare risposte di silenziamento. Come già accennato, analoghi meccanismi di inattivazione genica, dipendenti da un alto numero di copie, sono stati evidenziati anche in sistemi animali. In questi casi linee di piante o linee animali, incapaci totalmente o parzialmente di silenziare, costituiscono l'ideale recipiente in cui sovraesprimere il transgene d'interesse. L'invenzione può trovare applicazioni in questo ambito usando diversi approcci:

A) Identificazione e produzione di linee mutanti nei geni omologhi aLgene qde-1 in piante, animali e funghi.

La conoscenza del gene qde-1 di Neurospora, essenziale per il meccanismo di silenziamento può consentire l'isolamento di linee mutanti in altri organismi, negli omologhi del gene qde-1. Ad esempio, attraverso amplificazioni usando primers degenerati, disegnati sulle regioni conservate del gene qde-1 , si possono identificare linee mutanti nei geni omologhi, analizzando banche di mutanti per inserzione già disponibili per diverse specie vegetali. Nei funghi e negli animali tali mutanti possono essere ottenuti, una volta identificato il gene omologo, sfruttando le classiche tecniche di 'gene disruption’ che fanno uso della ricombinazione omologa.

B) Riduzione dell'espressione del gene qde-1 .

Altre strategie, per ottenere linee incapaci di silenziare, prevedono l'uso o del gene qde-1 di Neurospora o di geni omologhi ad esso. Il gene qde-1 od omologhi possono essere introdotti in vettori d'espressione opportuni ed espressi in direzione antisenso per bloccare l'espressione dei geni endogeni residenti. Alternativamente, porzioni di qde-1 od omologhi possono essere sovraespresse, nell'intento di ottenere un effetto dominante negativo, che blocchi la funzione dei geni qde-1 endogeni.

Gli autori della presente invenzione hanno clonato e caratterizzato il gene qde-1 di Neurospora crassa. L'analisi della sequenza del gene qde-1 ha rivelato una regione con una significativa omologia con la sequenza di una RNA polimerasi RNA-dipendente isolata da pomodoro per la quale è stato suggerito, ma non dimostrato, un coinvolgmento nel meccanismo di co-soppressione (Schiebel et al., 1998).

Gli autori dell’invenzione hanno per la prima volta dimostrato che un gene codificante per una RNA polimerasi RNA-dipedente è coinvolto nel silenziamento genico indotto da transgeni. Quindi, per la prima volta, è dimostrato che un gene appartenente alla famiglia delle RNA polimerasi RNA-dipedenti è un componente essenziale del meccanismo di inattivazione delle sequenze ripetute.

Nell’ambito dell’invenzione il riferimento a percentuali di omologia và inteso come percentuale di similarità, cioè numero di residui identici numero di residui conservati, rispetto al totale di residui della sequenza considerata.

Forma pertanto oggetto della presente invenzione una sequenza nucleotidica codificante per una proteina caratterizzata dal fatto di avere un’attività di silenziamento e di comprendere un dominio di RNA polimerasi RNA-dip.edente, in cui il dominio è omologo almeno per il 30% con la sequenza amminoacidica dall’amminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1. Preferibilmente il dominio è omologo almeno per il 40% con la sequenza amminoacidica dall'amminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1. Più preferibilmente il dominio è omologo almeno per il 50% con la sequenza amminoacidica dall'amminoacido 710 all'amminoacido 1282 di SEQ ID No.1. Ancora più preferibilmente il dominio comprende la sequenza amminoacidica dall’amminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1. In una forma particolare di attuazione, la sequenza nucleotidica codifica per una proteina avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID No.1, o porzioni funzionali di essa. Ancora più preferibilmente la sequenza nucleotidica è la sequenza nucleotidica di SEQ ID No.1 o la sua sequenza complementare.

Ulteriore oggetto dell’invenzione è un vettore di esoressione comprendente sotto il controllo di un promc , _ _ sequenza nucleotidica dell'invenzione. Gli esperti del settore realizzeranno che qualsiasi plasmide in grado di esprimere in maniera corretta e efficace la proteina dell'invenzione in batteri può essere utilizzato e rientra nell’ambito dell’invenzione stessa.

Ulteriore oggetto dell’invenzione è un vettore di espressione comprendente sotto il controllo di un promotore esprimibile in piante o in parti di esse la sequenza nucleotidica dell’invenzione, in orientamento senso o antisenso. Gli esperti del settore realizzeranno che qualsiasi plasmide in grado di esprimere in maniera corretta e efficace la proteina dell’invenzione in piante o in parti di esse può essere utilizzato e rientra nell’ambito dell’invenzione stessa.

Ulteriore oggetto dell’invenzione è un vettore di espressione comprendente sotto il controllo di un promotore esprimibile in funghi la sequenza nucleotidica dell’invenzione, in orientamento senso o antisenso. Gli esperti del settore realizzeranno che qualsiasi plasmide in grado di esprimere in maniera corretta e efficace la proteina dell’invenzione in funghi può essere utilizzato e rientra nell’ambito dell’invenzione stessa.

Ulteriore oggetto dell’invenzione è un vettore di espressione comprendente sotto il controllo di un promotore esprimibile in animali la sequenza nucleotidica dell’invenzione, in orientamento senso o antisenso. Gli esperti dei settore realizzeranno che qualsiasi plasmide in grado di esprimere in maniera corretta e efficace la proteina dell’invenzione in animali può essere utilizzato e rientra nell’ambito dell’invenzione stessa.

E’ ulteriore oggetto dell’invenzione un organismo procariotico trasformato con il vettore di espressione in batteri dell’invenzione.

E’ ulteriore oggetto dell’invenzione una pianta o parti di essa trasformata con il vettore di espressione in piante dell’invenzione.

E’ ulteriore oggetto dell’invenzione una pianta mutata nella sequenza nucleotidica dell'invenzione con un'attività di silenziamento ridotta o inibita.

E’ ulteriore oggetto dell’invenzione un fungo trasformato con il vettore di espressione in funghi dell'invenzione.

E’ ulteriore oggetto dell’invenzione un fungo mutato nella sequenza nucleotidica dell'invenzione con un’attività di silenziamento ridotta o inibita.

E’ ulteriore oggetto dell’invenzione un animale non umano trasformato con il vettore di espressione in animali dell'invenzione· E’ ulteriore oggetto dell'invenzione un animale non umano mutato nella sequenza nucleotidica dell’invenzione con un’attività di silenziamento ridotta o inibita.

Costituisce un ulteriore oggetto dell'invenzione una proteina caratterizzata dal fatto di avere un’attività di silenziamento e di comprendere un dominio RNA polimerasi RNA-dipedente, in cui il dominio è omologo almeno per il 30% con la sequenza amminoacidica dall’amminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1. Preferibilmente il dominio è omologo almeno per il 40% con la sequenza amminoacidica dall’amminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1. Più preferibilmente il dominio è omologo almeno per il 50% con la sequenza amminoacidica dall'amminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1. Ancora più preferibilmente il dominio è la sequenza amminoacidica dall’amminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1. In una forma particolare di attuazione, la proteina comprende la sequenza amminoacidica di SEQ ID No.1, o porzioni funzionali di essa.

Rientra nell’ambito della presente invenzione l'uso della sequenza_nucleotidica dell’invenzione stessa per la modulazione del silenziamento genico in piante, animali e funghi.

La presente invenzione verrà ora descritta in suoi esempi non limitativi con riferimento alle seguenti figure:

La figura 1 illustra il ripristino dell’espressione di al-1 nel ceppo mutante inserzionale 107. L'RNA totale è stato estratto da miceli prelevati dopo 10 minuti di induzione alla luce, di un ceppo silenziato per al-1 (6XW), di un ceppo non trasformato selvatico (WT) e del ceppo mutante 107. Per la ibridazione, è stata utilizzata una sonda specifica per al-1. La normalizzazione utilizzando una sonda specifica al-2 è mostrata al di sotto.

La figura 2 illustra la organizzazione genomica del gene qde-1. a) Sono rappresentati i due cosmidi (56G11 e 40H7) in grado di complementare i mutanti qde-1. Il riquadro chiaro nel cosmide 40H7 rappresenta le sequenze dal vettore cosmidico. Una mappa di restrizione del frammento di 7.9 Kb ottenuto con EcoRI, da 40H7, contenente qde-1 è mostrato: E (EcoRI), P(Pstl), B(Bglll). Il riquadro scuro rappresenta la ORF identificata all’interno del frammento di 7.9 Kb di EcoRI. I plasmidi pDX e pSX contenenti i frammenti di DNA subclonati nei siti Xbal (X) e EcoRI (E) sono anche mostrati, b) Analisi per Southern dei ceppi 107 e WT. Il DNA genomico è digerito con Bgll e Nael. Nel diagramma al di sotto è mostrata la sonda di DNA utilizzata per la ibridazione e i frammenti di restrizione Bgll/Nael (B/N) attesi. Il triangolo rappresenta il sito di integrazione nel ceppo 107 che provoca una scomparsa del frammento di restrizione di 1.0 Kb.

La figura 3 illustra l'espressione di qde-1 nel ceppo mutante inserzionale 107, nel ceppo selvatico non trasformato (WT) e nel ceppo silenziato per al-1 (6XW). L’RNA totale è stato ibridato con una sonda specifica per qde-1 . La quantità di RNA caricata su gel è mostrata di sotto.

La figura 4 rappresenta la sequenza amminoacidica dedotta dal gene qde-1 . La sottolineatura indica il dominio conservato RdRP come mostrato nell’allineamento in figura 5.

La figura 5 mostra un allineamento di sequenza della proteina QDE1 con altri polipeptidi dal database SwissProtien sequence: ORF di C. elegans 2488334 (elegl), ORF di S. pombe Z98553 (pom), ORF di A. thaliana AF080120 (araB) e la RNA polimerasi RNA dipendente di pomodoro Y10403 (RdRP). I residui identici sono evidenziati in nero, mentre le sostituzioni conservative sono mostrate in grigio.

MATERIALI E METODI

Ceppi, condizioni di crescita e trasformazione

La metodologia e l’analisi degli eterocarion in Neurospora crassa è sostanzialmente la stessa di quella descritta in (Davis and De Sevres, 1970). Gli sferoplasti sono stati preparati secondo il protocollo di Vollmer e Yasnofsky (1997). Il ceppo 107 è stato isolato come segue: un ceppo silenziato per qde-1, denominato 6xw già descritto (Cogoni and Macino, 1997) è stato trasformato con pMXY2 che contiene il gene della beta-tubulina per la resistenza al benomile, che funziona come marcatore selezionabile dominante in N.crassa (Staben et al., 1989). I trasformanti resistenti al benilato sono stati selezionati in base alla produzione di carotenoidi per visualizzazione del colore dei conidi: i selvatici erano arancioni, mentre i trasformanti da bianco a giallo erano indicativi di un’attività di silenziamento.

Plasmidi e genoteche

Il gene genomico qde-1 è stato isolato da una genoteca cosmidica di N.crassa (Cabibbo et al., 1991). La subclonazione dei frammenti di restrizione dai cloni della genoteca è stata effettuata nel plasmide pBSK. Conseguentemente, i subcloni sono stati utilizzati in esperimenti di cotrasformazione utilizzando pMXY2 oppure pES200 (contenente la resistenza per la igromicina).

Ibridazioni Southern e Northern

Il DNA cromosomale è stato preparato come descritto da Morelli et al (1993). Dopo digestione, il DNA genomico è stato trasferito come descritto in Maniatis et al (1982). Le sonde sono state marcate per innesco casuale (Boheringer). L’RNA è stato sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio, trasferito su membrane Hybond-N e sondato.

Analisi e sequenziamento del DNA

La sequenza nucleotidica di qde-1 è stata determinata per entrambe le eliche utilizzando la TAQ FS polimerasi e il metodo fluorescente, e analizzata utilizzando un apparato automatico Applied Biosystems 373A: Le sequenze nucleoniche e quella amminoacidica derivata sono state analizzate utilizzando il programma MacMolly Tetra. Un paragone delle proteine è stato effettuato con le ricerche BLASTP. L’algoritmo Gusta! W è stato utilizzato per l’allineamento. Risultati

Per clonare i geni qde, è stata utilizzata una mutagenesi inserzionale su un ceppo transgenico per al-1 (6XW) che mostra un fenotipo albino (bianco) come conseguenza di un silenziamento posttrascrizionale del gene endogeno al-1: Tra i 100.000 trasformanti inserzionali indipendenti, un ceppo (107) ha mostrato una reversione del silenziamento genico visibile come recupero di un fenotipo selvatico arancione. Il fenotipo selvatico arancione del ceppo 107 è dovuto al ripristino dell'espressione del mRNA di al-1, come dimostrato da un’analisi Northern (si veda figura 1). Inoltre, un’analisi di eterocarion ha rivelato che la mutazione è recessiva e agisce in trans. L'analisi di eterocarion ha anche reso possibile assegnare il mutante nel ceppo 107 ad uno dei tre gruppi di complementazione qde già identificati (Cogoni and Macino 1997). Il restauro di un fenotipo silenziato per al-1 avviene in eterocarion con mutanti qde- 2 e qde- 3. Non è possibile complementare con mutanti qrcte-1 (Tabella 1), indicando che il ceppo 107 è mutato nel gene qrc/e-1.

WT= eterocarion con fenotipo selvatico per l'accumulo di carotenoidi (arancione); AL= eterocarion con fenotipo albino in cui il silenziamento del gene al-1 è ripristinato. I mutanti qde sono stati descritti in Cogoni and Macino (1997): M17 e M18 sono mutanti qde-3, M10 e M11 sono mutanti gcfe-2; M7 e M20 sono mutanti qde-1. I fenotipi degli eterocarion sono stati esaminati per ispezione visiva dopo sette giorni di crescita alla luce.

Per isolare il gene qde-1, il piasmide “tagging” è stato recuperato dal ceppo 107 con una procedura di liberazione del piasmide, utilizzando l’enzima di restrizione Bgl\\ che ha un singolo sito di restrizione all’interno del piasmide tagging. Un piasmide, pCR4 è stato recuperato dopo riligazione del DNA cromosomale a seguito di restrizione con Bgl\\ (si veda figura 2a). Il DNA cromosomale che fiancheggia il sito di inserzione è stato isolato utilizzando gli enzimi Sg/ll e Psfl e il frammento di restrizione risultante è stato utilizzato come sonda su una genoteca cosmitica di N.crassa. Due cosmidi ibridizzanti positivi 56G11 e 40H7 sono stati introdotti con un esperimento di trasformazione nel ceppo 107 e nel ceppo mutante per qde-1 M7 indotto per UV. Entrambi i cosmidi sono in grado di complementare i due mutanti qde-1 saggiati. Il ripristino del silenziamento del gene al-1 che conduce alla comparsa di un fenotipo bianco, indica che entrambi i cosmidi contengono un gene qde-1 funzionale. Utilizzando lo stesso DNA fiancheggiante come sonda, due frammenti di EcoRI da 40H7 e da 56G11, rispettivamente di 7.9 e 10.0 Kb, sono stati identificati e subclonati (si veda figura 2a). Entrambi i frammenti di EcoRI (plasmidi P79E e p10E) sono in grado di complementare il ceppo qde-1 (107 e M7), ma non i ceppi mutanti in qde-2 (M10) e qde-3 (M17) (Tabella 2) indicando che il gene funzionale qde-1 è contenuto nel frammento EcoRI di 7.9 Kp.

Tabella 2 Complementazione con il gene qde-1

La frequenza di complementazione è riportata come percentuale dei ceppi trasformanti che mostrano un fenotipo albino rispetto ai numero totale di trasformanti. Il plasmide pMXY2 è stato usato come controllo negativo.

Il fatto che il gene qde- 1 sia in grado di ripristinare il silenziamento del gene al-1 solo nei mutanti corrispondenti, esclude la possibilità che il frammento di DNA clonato sia in grado di riattivare il silenziamento del gene al-1, a prescindere dal gruppo di complementazione qde. Inoltre, il ceppo M7 trasformato con il frammento di 7.9 Kb EcoRI conferisce una capacità di silenziare un altro gene carotenogenico aì-2, quando introdotto per trasformazione (dati non mostrati), il frammento EcoRI di 7.9 Kb è stato ulteriormente subclonato utilizzando il sito Xbal (si veda figura 2a) che taglia al centro del frammento EcoRI. Entrambi i frammenti Xbal/EcoRI (plasmidi pSX e pDX) non erano in grado di complementare i ceppi 107 e M7 (si veda Tabella 2), suggerendo che il sito Xbal è probabilmente localizzato all’interno del gene qde-1.

L’intera regione del frammento EcoRI che comprende il gene qde-1 putativo e le regioni adiacenti sono state sequenziale, rivelando una cornice di lettura aperta (ORF) di 4206 bp che codifica per una proteina putativa di 1402 amminoacidi. Due risultati diversi indicano che questa ORF è coincidente con il gene qde-1. In primo luogo, il sito di restrizione Xbal utilizzato per subclonare il frammento di 7.9 Kb EcoRI è localizzato al centro della ORF (figura 2a), ed è pertanto consistente con il risultato che entrambi i frammenti Kbal/EcoRI non siano in grado di complementare la mutazione qde-1 (Tabella 2). In secondo luogo, per analisi Southern (si veda figura 2b) il sito di inserzione del plasmide tagging nel ceppo 107 è stato mappato all’interno dei siti di restrizione Bglll e Nael all’interno della ORF. Non è stata rivelata alcuna alterazione di dimensione delle regioni fiancheggianti, escludendo la possibilità che le delezioni comprendano altre ORF all’interno della regione di 7.9 Kb di EcoRI. I cDNA, sintetizzati per PCR inversa (RT-PCR), hanno rivelato una colinearità con il DNA genomico indicando che non è presente alcun introne. L'espressione del gene qde-1 è stata analizzata per analisi Northern utilizzando una sonda che comprende la ORF di qde-1 (figura 2a). E’ stato cosi rivelato un trascritto di circa 5000 nt, e il livello basale di mRNA di qde-1 è risultato essere due volte più alto in un ceppo silenziato per al-1 (6XW) rispetto ad un ceppo WT non trasformato (si veda figura 3). Inoltre, l'mRNA di intera lunghezza di qde-1 non è rivelabile nel ceppo mutante inserzionale 107 di qde-1, dove invece una banda più piccola è presente suggerendo che i trascritti troncati di qde-1 sono prodotti come conseguenza dell'integrazione. Il fatto che l’espressione genica di qde-1 sia aumentata in maniera specifica in un ceppo silenziato indica l’esistenza di un meccanismo regolativo in grado di attivare componenti cellulari del macchinario di silenziamento nei ceppi trasgenici.

La proteina QDE-1 dedotta dalla sequenza nucleotidica è composta di 1402 amminoacidi (si veda figura 4) ed ha un peso molecolare di 158.004 Da ed un pi statistico di 8.0. La proteina QDE-1 non contiene un peptide segnale o un dominio transmembrana, indicando che è probabilmente una proteina intracellulare. Inoltre, il plot di idropatia indica che QDE-1 è una proteina solubile. Una ricerca BLAST ha mostrato che qde-1 ha una omologia statisticamente significativa con proteine ipotetiche da diversi altri organismi comprendenti: due ORF di C.elegans (numeri di accesso EMBL Z4834 e Z78419) con valori attesi (valore E) di 2e-16 e 9e-10 rispettivamente; una ORF di S.pombe (numero di accesso EMBL Z98553) con un valore E 3e-13; quattro ORF di AJhaiiana (numeri di accesso EMBL AF080120, AC005169 comprendente tre ORF alla stessa localizzazione cromosomale) e con un valore E 8e-15, 7e-06, 4e-05, 5e-02, rispettivamente. Infine è stata trovata una omologia significativa (valore E 2e-17) con una proteina putativa codificata da un cDNA di pomodoro (numero di accesso EMBL Y10403). L'omologia trovata non si estende per l’intera proteina, ma è ristretta ad una porzione di 570 amminoacidi, dall'amminoacido 710 all'amminoacido 1282, che definisce un dominio conservato (si veda figura 5). Tra le proteine putative omologhe identificate, solo quella derivata dalla sequenza del cDNA di pomodoro è stata caratterizzata in maniera funzionale come una RNA polimerasi RNA dipendente (RdRP, 9).

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Sequenza nucleotidica codificante per una proteina caratterizzata dal fatto di avere un’attività di silenziamento e di comprendere un domìnio di RNA polimerasi RNA-dipendente, in cui il dominio è omologo almeno per il 30% con la sequenza amminoacidica dallamminoacido 710 all'amminoacido 1282 di SEQ ID No.1.
2. Sequenza nucleotidica codificante per una proteina caratterizzata dal fatto di avere un’attività di silenziamento e di comprendere un dominio di RNA polimerasi RNA-dipendente secondo la rivendicazione 1 in cui il dominio è omologo almeno per il 40% con la sequenza amminoacidica dallamminoacido 710 all'amminoacido 1282 di SEQ ID No.1.
3. Sequenza nucleotidica codificante per una proteina caratterizzata dal fatto di avere un’attività di silenziamento e di comprendere un dominio di RNA polimerasi RNA-dipendente secondo la rivendicazione 2 in cui il dominio è omologo almeno per il 50% con la sequenza amminoacidica dallamminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1.
4. Sequenza nucleotidica codificante per una proteina caratterizzata dal fatto di avere un'attività di silenziamento e di comprendere un dominio di RNA polimerasi RNA-dipendente secondo la rivendicazione 3 in cui il dominio è la sequenza amminoacidica dallamminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1.
5. Sequenza nucleotidica codificante per una proteina caratterizzata dal fatto di avere un’attività di silenziamento e di comprendere un dominio di RNA polimerasi RNA-dipendente secondo la rivendicazione 4 in cui detta sequenza nucleotidica codifica per una proteina avente la sequenza amminoacidica di SEQ 1D No.1, o porzioni funzionali di essa.
6. Sequenza nucleotidica codificante per una proteina caratterizzata dal fatto di avere un’attività di silenziamento e di comprendere un dominio di RNA polimerasi RNA-dipendente secondo la rivendicazione 5 in cui detta sequenza nucleotidica è la sequenza nucleotidica di SEQ ID No.1 o la sua sequenza complementare.
7. Vettore di espressione comprendente sotto il controllo di un promotore esprimibile in batteri la sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6.
8. Vettore di espressione comprendente sotto il controllo di un promotore esprimibile in piante o in parti di esse la sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in orientamento senso o antisenso.
9. Vettore di espressione comprendente sotto il controllo di un promotore esprimibile in funghi la sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in orientamento senso o antisenso.
10. Vettore di espressione comprendente sotto il controllo di un promotore esprimibile in animali la sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in orientamento senso o antisenso.
11. Organismo procariotico trasformato con il vettore di espressione in batteri secondo la rivendicazione 7.
12. Pianta o parti di essa trasformata con il vettore di espressione in piante secondo la rivendicazione 8.
13. Pianta mutata nella sequenza nucieotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 con un’attività di silenziamento ridotta o inibita.
14. Fungo trasformato con il vettore di espressione in funghi secondo la rivendicazione 9.
15. Fungo mutato nella sequenza nucieotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 con un’attività di silenziamento ridotta o inibita.
16. Animale non umano trasformato con il vettore di espressione in animali secondo la rivendicazione 10.
17. Animale non umano mutato nella sequenza nucieotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 con un'attività di silenziamento ridotta o inibita.
18. Proteina caratterizzata dal fatto di avere un'attività di silenziamento e di comprendere un dominio di RNA polimerasi RNA-dipendente, in cui il dominio è omologo almeno per il 30% con la sequenza amminoacidica dall'amminoacido 710 all' amminoacido 1282 di SEQ ID No.1.
19. Proteina caratterizzata dal fatto di avere un'attività di silenziamento e di comprendere un dominio di RNA polimerasi RNA-dipendente secondo la rivendicazione 18 in cui il dominio è omologo almeno per il 40% con la sequenza amminoacidica dall’amminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1.
20. Proteina caratterizzata dal fatto di avere un’attività di silenziamento e di comprendere un dominio di RNA polimerasi RNA-dipendente secondo la rivendicazione 19 in cui il dominio è omologo almeno per il 50% con la sequenza amminoacidica dall’amminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1.
21. Proteina caratterizzata dal fatto di avere un’attività di silenziamento e di comprendere un dominio di RNA polimerasi RNA-dipendente secondo la rivendicazione 20 in cui il dominio è la sequenza amminoacidica dall’amminoacido 710 all’amminoacido 1282 di SEQ ID No.1.
22. Proteina caratterizzata dal fatto di avere un’attività di silenziamento e di comprendere un dominio di RNA polimerasi RNA-dipendente secondo la rivendicazione 21 comprendente la sequenza amminoacidica di SEQ ID No.1, o porzioni funzionali di essa.
23. Uso della sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 per la modulazione del silenziamento genico in piante, animali e funghi.