ITRM960052A1 - Peptidi e loro usi nella terapia della malattia celiaca - Google Patents
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Abstract
Sono descritti peptidi da frumento duro ad azione protettiva in soggetti affetti da patologia celiaca o patologie ad essa correlate.
Description
DESCRIZIONE
"Peptidi e loro usi nella terapia della malattia celiaca?
La presente invenzione concerne peptidi e loro usi nella terapia della malattia celiaca.
Pi? in particolare l?invenzione riguarda peptidi con sequenza amminoacidica dedotta da proteine estratte dal frumento duro, con attivit? protettiva nei confronti dell?attivit? biologica esercitata dai cereali notoriamente tossici per gli individui affetti da patologie correlate al morbo celiaco.
La malattia celiaca ? una enteropatia che si manifesta in individui geneticamente predisposti (circa 3 per mille) quando alimenti a base di frumento sono presenti nella dieta. Oltre il frumento anche la segale, l'orzo e l'avena risultano tossici per gli individui affetti. In tali circostanze, compaiono diarrea e altri sintomi di malassorbimento, in associazione ad una atrofia subtotale della mucosa intestinale.
E' accertato che, nell'uomo, tali alterazioni patologiche sono prodotte dall'azione di prodotti della digestione del glutine di frumento sulla mucosa intestinale e, pi? in particolare, della frazione proteica del glutine, solubile in etanolo al 70% in soluzione acquosa. Questa frazione proteica, indicata nei cereali generalmente con il termine di "prolamina" (mentre rt$t frumento, in particolare, ? denominata "gliadina") ? presente nei vari cereali in diversa proporzione, ed ? costituita da numerose proteine di vario peso molecolare, che hanno la caratteristica di avere un elevato contenuto di glutammina (un residuo ogni tre amminoacidi) e prolina (un residuo ogni sette amminoacidi), e una bassa forza ionica (presenza di pochi residui capaci di ionizzarsi in soluzione).
L?autore della presente invenzione sta da alcuni anni conducendo delle indagini, con colture di tessuto e colture cellulari, sulle propriet? di miscele di peptidi, ottenute mediante una digestione proteolitica sequenziale con pepsina e tripsina in vitro, di prolamine estratte da vari cereali, simulando il processo digestivo a cui vengono sottoposte le proteine nell'apparato gastrointestinale. Lo scopo di queste ricerche ?, da un lato, quello di chiarire la composizione dei peptidi tossici ottenuti dalle differenti prolamine e, dall'altro, quello di stabilire se differenti specie e/o cultivars di frumento possano essere meglio tollerati da soggetti celiaci .
Le ricerche sono basate essenzialmente su tre sistemi biologici:
- colture di frammenti intestinali bioptici di celiaci in fase florida;
- colture di frammenti intestinali di ratto;
- test di agglutinazione con linee cellulari eritroidi K562 (S).
Con tali sistemi, l?autore ha dimostrato che i prodotti della digestione delle gliadine estratte da cultivars di frumento duro risultano non tossici, o molto meno tossici, rispetto a quelli provenienti dalle gliadine del frumehto tenero. Infatti i peptidi gliadinici da frumento duro: a) non sono tossici per colture in vitro di frammenti bioptici di celiaci (Ped. Res. 16, 1004, 1983); b) non inibiscono lo sviluppo e la morfogenesi dell'intestino fetale di ratto prelevato al 17? giorno di gestazione (Ped. Res. 18, 1372, 1984); c) non hanno propriet? agglutinanti nei confronti di cellule K562(S) (Biochem. Biophys. Res. Comm. 121 , 428, 1984), d) non hanno alcuna attivit? citotossica sulle linee cellulari Hep-2 e MCR-5 (Toxicol. Lett. 13, 1255, 1983), e CaCo-2 (Toxicology in vitro, 9, 251, 1995).
E? stato ritenuto che il diverso comportamento dei frumenti duri, rispetto ai cereali tossici, fosse dovuto alla scarsa capacit? delle variet? di grano tetraploidi (cio? delle variet? di frumento duro) di sintetizzare la frazione peptidica, responsabile della patologia nei celiaci (Ped. Res. 22, 102, 1987). Contrariamente a ci?, anche nei frumenti duri ? stato possibile evidenziare una frazione peptidica, confrontabile per attivit? biologica e quantit?, alla frazione tossica presente nei cereali tossici per i celiaci. L'attivit? di questa frazione, nel test di agglutinazione con cellule K562 (S), ? risultata inibita da una diversa frazione peptidica, presente nel grano duro (Toxicology, 96, 29, 1995).
L'autore della presente invenzione ha ora identificato un peptide che esercita un'attivit? di inibizione dell'agglutinazione di cellule K562 indotta dall'esposizione alla frazione gliadinica di cereali tossici per i celiaci, rappresentando un vantaggioso strumento per la terapia e la diagnosi di individui affetti da patologia celiaca o da patologie ad essa correlate.
Un?analisi di peptidi da frazione proteica da frumento duro, effettuata mediante spettrometria di massa, ha evidenziato la presenza di un peptide di 10 aa., di sequenza: QQPQDAVQPF. Questo peptide, alla concentrazione di 2 x 10<'3 >mM ? capace di proteggere le cellule K 562 (S), dall'azione di uno qualsiasi dei cereali notoriamente tossici per i celiaci: frumento tenero, segale, orzo ed avena.
Il sistema in vitro utilizzato, test di agglutinazione con cellule K 562(S), ? un test molto sensibile per valutare la tossicit? delle proteine dei cereali, o dei peptidi che da esse si formano nel tratto digerente. Ad oggi esiste una correlazione del 100% tra la tossicit? dei cereali in vivo o in vitro e l'attivit? agglutinante su questo sistema cellulare. I risultati di queste correlazioni sono citati nelle seguenti riviste: (Biochem. Biophys. Res. Comm., 121, 428, 1984; Pediatrie Res., 18, 189a, 1984; J. of Pediatrie Gastr. and Nutr., 4, 923, 1985; Gastroenterology, 92, 1368, 1987; Gastroenterology, 92, 1301 , 1987; Pediatrie Res. 22, 107,1987; Pediatrie Res., 24, 233, 1988; Pediatrie Res, 24, 412, 1988; Gastroenterology, 99, 977, 1990; Gastroenterology, 99, 1668, 1990; Ital. J. Gastroenterology 24, 397, 1992; ATLA, 21, 43, 1993; Gastroenterology 104, 88, 1983; ATLA, 22, 116, 1994; ATLA, 22 (6) 50, 1994; Toxicology 96, 29, 1995; J. Scand. Gastroenterol. (in stampa).
Per patologie correlate al morbo celiaco si intendono: a) patologie di natura immunologica come ad esempio, il diabete mellito, l'ipertiroidismo, il Morbo di Addison, le pericarditi ricorrenti, la miastenia grave, la porpora porpocitopenica, le vasculiti trombocitopeniche, l?anemia emolitica autoimmune, la cirrosi biliare, l?epatite cronica, le connettiviti, la Sindrome di Sjogren, le malattie infiammatorie intestinali, la nefropatia a IgA, la atopia, l?intolleranza alle proteine del latte vaccino; b) patologie di natura neurologica e psichiatrica come, ad esempio, l?encefalopatia progressiva, la polineuropatia, la demenza con atrofia celebrale, l?autismo e la schizofrenia, la leucoencefalopatia e la neuropatia assonale, l?epilessia con calcificazioni cerebrali posteriori; c) la fibrosi cistica, la Sindrome di Down, la Malattia di Hartnup, le cardiopatie congenite, le neoplasie.
Forma pertanto oggetto dell?invenzione una molecola sostanzialmente di natura peptidica per la terapia e la diagnosi di patologia celiaca e ad essa correlate. In particolare la molecola ? un peptide avente una sequenza amminoacidica derivata da frazioni proteiche da frumento duro. Pi? in particolare la molecola comprende una sequenza amminoacidica compresa nella sequenza QQPQDAVQPF, o sostanzialmente omologa ad essa.
Secondo una forma di attuazione particolare la molecola ? prodotta per via sintetica, alternativamente ? prodotta da purificazione da frumento duro.
Costituisce un ulteriore oggetto dell?invenzione una composizione comprendente in dosi farmaceuticamente efficaci ed accettabili la molecola dell?invenzione per la terapia della patologia celiaca o di patologie ad essa correlate.
Costituisce un ulteriore oggetto dell?invenzione una composizione apprendente in dosi farmaceuticamente efficaci la molecola dell?invenzione per la diagnosi della patologia celiaca o di patologie ad essa correlate.
Costituisce ulteriore oggetto dell?invenzione un metodo per la identificazione di molecole ad attivit? protettiva per individui affetti da patologia celiaca e ad essa correlate che comprende la fase di incubare cellule sensibili alla frazione prolaminica dei cereali a detta frazione e a dette molecole e misurare l?attivit? inibitoria di dette molecole per l'attivit? della frazione prolaminica dei cereali su dette cellule. Preferibilmente le cellule sono le cellule K562 e l?azione della frazione prolaminica dei cereali su dette cellule ? un?attivit? di agglutinazione.
La presente invenzione verr? ora descritta a titolo illustrativo ma non limitativo, con riferimento ai disegni allegati in cui:
la figura 1 rappresenta il profilo di eluizione di un digesto peptidico da gliadina su colonna Sepharose6B/mannano;
la figura 2 rappresenta il profilo di eluizione della frazione B, ottenuta come in fig. 1 , su colonna Biogel-P30;
la figura 3 rappresenta un profilo di spettrometria di massa della frazione 1 D ottenuta come in fig. 2;
la figura 4 rappresenta un profilo di spettrometria di massa del peptide 1157 sintetizzato;
la figura 5 rappresenta fotografie la microscopi a contrasto di fase di cellule K562 di controllo (A), trattate con frazione gliadinica da frumento tenero (B), trattate con frazione gliadinica da frumento tenero e peptide 1157 (C).
PREPARAZIONE DEL PEPTIDE
a) Estrazione delle gliadine e preparazione del digesto enzimatico Le gliadine estratte da frumento duro (Variet? Adamello) con alcool etilico al 70% sono state sottoposte ad idrolisi enzimatica con pepsina e tripsina per un totale di 6 ore. La miscela di peptidi ottenuta (P.T. totale) ? stata sottoposta a riscaldamento in bagno maria a 100?C per 30', allo scopo di inattivare le attivit? enzimatiche residue.
b) Cromatograf?a di affinit?
Circa 50 mg di digesto di gliadina sono stati caricati su una colonna (Sepharose 6B/ Mannano ) 35 x 5 cm, equilibrata con tampone ammonio acetato. Le frazioni A e B sono state eluite con il tampone di lavaggio mentre la frazione C ? stata eluita con acido acetico 0.1 M (Fig 1). Questa frazione (circa 1.5 % del materiale totale caricato in colonna), a differenza della miscela totale di provenienza, che era risultata inattiva, esibiva un'attivit? agglutinante confrontabile con le identiche frazioni C, ottenute da altri cereali tossici.
Sorprendentemente la frazione B, circa il 90 - 95 %, del digesto totale, ? capace d'inibire l'attivit? biologica indotta dalla frazione C. Inoltre questa frazione B, ancora eterogenea, ha protetto le cellule dall'azione tossica di vari cereali. Questi dati indicano che anche nel frumento duro ? presente una frazione tossica, la cui attivit? ? inibita da altri peptidi presenti nello stesso frumento.
c) Cromatografia su Biogel -P30
La frazione B, ottenuta dalla cromatografia di affinit?, ? stata ulteriormente^zionata su una colonna (3 cm x 170 cm ) di Biogel-P30 (Fig.2). L'attivit? protettiva delle quattro frazioni eluite ? stata valutata con il test di agglutinazione. Le frazioni 1A, 1B, 1C, sono risultate incapaci di proteggere le cellule K562 (S) dall'azione tossica dei peptidi prolamminici. Al contrario la frazione 1D, saggiata alla concentrazione di 70 mg/L, ha mostrato una elevata attivit? protettiva nei confronti delle prolammine dei cereali tossici per i celiaci.
d) Spettrometria di massa
La frazione 1D, disciolta in CH3CN/H20, 60/40 con TFA O.t % e ammonio acetato 30 mM, ? stata esaminata mediante spettrometria di massa per mezzo di una infusione continua, utilizzando una pompa alla velocit? di 10 mi/ m. La Fig. 3 mostra lo spettro di massa del digesto enzimatico, relativo alla frazione 1D, in cui ? possibile osservare la presenza di un peptide con peso molecolare di circa 1157. La sequenza amminoacidica del peptide ? la seguente: QQPQDAVQPF. Questo peptide, denominato 1157, ? stato sintetizzato con un sintetizzatore automatico (Applied Biosystems 431 A), con una purezza superiore al 98 % (Fig.4) e saggiato sulle cellule K562.
e) Cellule e test di agglutinazione
Le cellule usate sono le K562(S), una linea stabilizzata, isolata da Lozzio, dal sangue di un paziente con leucemia cronica in fase acuta. Queste cellule vengono considerate come proeritroblasti in grado, in vitro, di andare incontro a un processo di differenziamento simile a quello che si ha in vivo. Le cellule vengono fatte crescere in RPMI 1640 addizionato con siero fetale al 10%, glutammina 2mM, penicillina e streptomicina. Le K562 (S) vengono centrifugate, lavate per tre volte con tampone alla concentrazione di 100 x 106 cellule/ml. Per le prove di agglutinazione, 25 pi della sospensione cellulare viene aggiunta nei pozzetti di una piastra per microtitolazione insieme a 25 pi di tampone contenente i peptidi. Concentrazioni scalari delle sostanze da esaminare, ottenute con diluizioni in successione 1:1 con tampone, vengono aggiunte alle cellule. L'osservazione al microscopio viene effettuata dopo 30' d'incubazione a temperatura ambiente.
Nella figura 5A ? possibile osservare le cellule controllo; la Fig.5B mostra l'agglutinazione indotta da uno dei cereali tossici (frumento tenero); mentre nella Fig. 5C ? possibile osservare l'attivit? protettiva del peptide 1157 nei confronti della tossicit? del cereale suindicato.
La presente invenzione ? stata descritta, a titolo illustrativo ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, ma ? da intendersi che variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.
Claims (8)
- RIVENDICAZIONI 1 . Molecola sostanzialmente di natura peptidica per la terapia e la diagnosi della patologia celiaca e di patologie ad essa correlate.
- 2. Molecola secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dai fatto di essere un peptide avente una sequenza amminoacidica derivata da frazioni proteiche da frumento duro. 3. Molecola secondo la rivendicazione 2 comprendente una sequenza amminoacidica compresa nella sequenza QQPQDAVQPF, o sostanzialmente omologa ad essa.
- 3. Molecola secondo la rivendicazione 1 o 2 prodotta per via sintetica.
- 4. Molecola secondo la rivendicazione 1 o 2 prodotta da purificazione da frumento duro.
- 5. Composizione comprendente in dosi farmaceuticamente efficaci ed accettabili la molecola secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per la terapia della patologia celiaca e di patologie ad essa correlate.
- 6. Composizione comprendente in dosi farmaceuticamente efficaci la molecola secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 per la diagnosi della patologia celiaca e di patologie ad essa correlate.
- 7. Metodo per la identificazione di molecole ad attivit? protettiva per individui affetti dalla patologia celiaca o da patologie ad essa correlate che comprende la fase di incubare cellule sensibili alla frazione prolamina dei cereali a detta frazione e a dette molecole e misurare l?attivit? inibitoria di dette molecole per l?attivit? della frazione prolamina dei cereali su dette cellule.
- 8. Metodo secondo la rivendicazione 9 in cui le cellule sono le cellule K562 e l?azione della frazione prolamina dei cereali su dette cellule ? un?attivit? d? agglutinazione.
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