ITRM950380A1 - VARIATIONS OF THE HUMAN CHILIARY NEUROTROPHIC FACTOR (HCNTF) WITH IMPROVED RECEPTOR BINDING AFFINITY. - Google Patents
VARIATIONS OF THE HUMAN CHILIARY NEUROTROPHIC FACTOR (HCNTF) WITH IMPROVED RECEPTOR BINDING AFFINITY. Download PDFInfo
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Abstract
Varianti del fattore neurotrofico ciliare umano (hCNTF) caratterizzati, per la maggior parte, dal fatto di essere varianti di hCNTF in cui almeno il residuo di glutammina (Gln) nella posizione 167 è sostituito con un residuo di amminoacido scelto dal gruppo comprendente Alanina (Ala), Istidina (His), Treonina (Thr) e Tirosina (Tyr). Queste proteine sono importanti principi attivi nella preparazione di farmaci per la cura di malattie del sistema nervoso.Figura 5 rappresenta l'effetto dei varianti di hCNTF secondo l'invenzione sulla sopravvivenza di neuroni embrionali del ganglio ciliare di pollo in coltura.Variants of the human ciliary neurotrophic factor (hCNTF) characterized, for the most part, by being hCNTF variants in which at least the glutamine residue (Gln) in position 167 is replaced with an amino acid residue chosen by the group comprising Alanine (Ala ), Istidina (His), Treonina (Thr) and Tirosina (Tyr). These proteins are important active ingredients in the preparation of drugs for the treatment of diseases of the nervous system. Figure 5 represents the effect of the hCNTF variants according to the invention on the survival of embryonic neurons of the cultured chicken ciliary ganglion.
Description
DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE INDUSTRIALE dal titolo "VARIANTI DEL FATTORE NEUROTROFICO CILIARE UMANO (hCNTF) CON MIGLIORATA AFFINITÀ DI LEGAME AL RECETTORE" DESCRIPTION OF THE INDUSTRIAL INVENTION entitled "VARIATIONS OF THE HUMAN CHILIARY NEUROTROPHIC FACTOR (hCNTF) WITH IMPROVED RECEPTOR BINDING AFFINITY"
DESCRIZIONE DESCRIPTION
Oggetto della presente invenzione sono varianti del fattore neurotrofico ciliare umano (hCNTF) che, rispetto a hCNTF di tipo selvatico, esibiscono un'affinità superiore per il recettore Questi varianti, per le loro proprietà, si candidano ad essere importanti principi attivi nella preparazione di composizioni farmaceutiche nella cura di malattie del sistema nervoso. Subject of the present invention are variants of the human ciliary neurotrophic factor (hCNTF) which, compared to wild-type hCNTF, exhibit a higher affinity for the receptor These variants, due to their properties, are candidates to be important active ingredients in the preparation of compositions pharmaceuticals in the treatment of diseases of the nervous system.
Come è noto, il fattore neurotrofico ciliare (hCNTF) è una neuro-citochina di 23 KDa che viene espressa sia nel sistema nervoso periferico che centrale. (Manthorpe, M., Louis, J.C., Hagg, T. e Varon,S (1993) In Loughlin, S.E. e Fallon, J.H. (eds), Neurotrophic factors. Academic Press, San Diego, CA, pp. 443-473; Sendtner, M., Carroll, P., Holtmann, B., Hughes, R.A. e Thoenen, H. (1994) J. Neurobiol., 25, 1436-1453). Il CNTF ha dimostrato di esercitare una potente azione di promozione della crescita o di differenziazione su una grande varietà di cellule nervose e gliali, inclusi neuroni motori, neuroni sensori, neuroni simpatetici, neuroni dell’ippocampo e oligodendrociti , come descritto dagli autori sopra citati. L'azione protettiva dimostrata in vivo dal CNTF nei confronti di molte cellule nervose ha suscitato speranze per la sua applicazione clinica nella cura di malattie neurodegenerative umane {Lindsay, R.M., Wiegand, S.J., Aitar, C.A. e DiStefano, P.S. (1994) Trends Neurosci., 17, 182-190) . As is known, the ciliary neurotrophic factor (hCNTF) is a 23 KDa neuro-cytokine which is expressed in both the peripheral and central nervous systems. (Manthorpe, M., Louis, J.C., Hagg, T. and Varon, S (1993) In Loughlin, S.E. and Fallon, J.H. (eds), Neurotrophic factors. Academic Press, San Diego, CA, pp. 443-473; Sendtner, M., Carroll, P., Holtmann, B., Hughes, R.A. and Thoenen, H. (1994) J. Neurobiol., 25, 1436-1453). The CNTF has been shown to exert a powerful growth-promoting or differentiation action on a large variety of nerve and glial cells, including motor neurons, sensor neurons, sympathetic neurons, hippocampal neurons and oligodendrocytes, as described by the aforementioned authors. The protective action demonstrated in vivo by the CNTF against many nerve cells has raised hopes for its clinical application in the treatment of human neurodegenerative diseases {Lindsay, R.M., Wiegand, S.J., Aitar, C.A. and DiStefano, P.S. (1994) Trends Neurosci., 17, 182-190).
Il CNTF è membro di una famiglia di proteine, che comprende il leukemia inibitory factor (LIF), 1 1interleuchina 6, L 'oncostatina M e 1 1interleuchina 11. E' caratteristica comune di questa famiglia l'uso di sub-unità recettoriali strutturalmente correlate e parzialmente condivise (Kishimoto, T., Taga, T. e Akira, S. (1994) Celi, 76, 253-262; Stahl, N. e Yancopoulos, G.D. (1994) J. Neurobiol., 25, 1454-1466). Inoltre, sulla base di predizioni di struttura, si è proposto -che CNTF condivida con queste proteine quattro eliche alfa come motivo centrale della loro struttura tridimensionale, simile quindi a quella dell'ormone della crescita (Bazan, E. (1991) Neuron, 7, 197-208). Il CNTF esercita le sue azioni biologiche mediante attivazione di un complesso recettoriale, che consiste di una subunità specifica per il ligando (CNTFRa) e due proteine transmembranarie, strutturalmente correlate, che trasducono il segnale, vale a dire gp!30 e il recettore β di LIF. Il legame di CNTF con CNTFRa verosimilmente stimola L 'eterodimerizzazione di gpl30 e del recettore β di LIF. Si attiva così una cascata di segnali di trasduzione mediata da proteine intracellulari specifiche ad attività tirosina chinasica (vedi articolo di Stahl e Yancopoulos, 1994, già citato in precedenza). CNTF is a member of a family of proteins, which includes leukemia inhibitory factor (LIF), 11 interleukin 6, oncostatin M and 11 interleukin 11. The use of structurally related receptor subunits is a common feature of this family. and partially shared (Kishimoto, T., Taga, T. and Akira, S. (1994) Celi, 76, 253-262; Stahl, N. and Yancopoulos, G.D. (1994) J. Neurobiol., 25, 1454-1466 ). Furthermore, on the basis of structure predictions, it has been proposed that CNTF shares four alpha helices with these proteins as the central motif of their three-dimensional structure, therefore similar to that of growth hormone (Bazan, E. (1991) Neuron, 7 , 197-208). CNTF exerts its biological actions by activating a receptor complex, which consists of a ligand-specific subunit (CNTFRa) and two structurally related transmembrane proteins that transduce the signal, namely gp! 30 and the β receptor of LIF. The binding of CNTF to CNTFRa likely stimulates the heterodimerization of gpl30 and the β receptor of LIF. Thus a cascade of transduction signals mediated by specific intracellular proteins with tyrosine kinase activity is activated (see article by Stahl and Yancopoulos, 1994, already mentioned above).
Due singolari caratteristiche di questo complesso recettoriale sono che le sue due componenti di transmembrana costituiscono un recettore funzionale per LIF, e che gpl30 è presente in tutti i recettori della sottofamiglia di citochine collegate a CNTF. Le azioni biologiche ad elevata affinità- di CNTF dipendono dalla subunità CNTFR ligando- specifica e neuronespecifica (Davis, S , Aldrich, T.H., Ip, N.Y., Stahl,N., Scherer,S., Farruggella, T., DiStefano, P.S., Curtis, R., Panayotatos, N. , Gascan, H., Chevalier, S., and Yancopoulos, G.D. (1993) Relased forra of CNTF receptor a component as soluble raediator of CNTF responses. Scince, 259, 1736-1739.; Ip, N.Y. , McClain, J, Barrezueta, N.X., Aldrich, T.H. , Pan, L, L., Li. Y., Wiegand, S.J., Friedman, B., Davis, S. and Yancopoulos, G.D. (1993) The a component of thè CNTF receptor is required for signaling and defines potential CNTF targets in thè adult and during development. Neuron, 10, 89-102. Ancora, ad elevate concentrazioni CNTF può elicitare effetti CNTFRaindipendenti , presumibilmente attivando recettori di altre citochine (Nesbitt, J.E., Fuentes, N.L. and Fuller, G.M. (1993) Ciliary neurotrophic factor regulates fibrinogen gene expression in hepatocytes by binding to thè interleukin- 6 receptor. Biochem. Biophys. Res. Comraun., 190, 544-550. Davis et al. 1993; Baumann, H., Ziegler, S.F., Mosley, B., Morella, K.K., Pajovic, S. and Gearing, D.p. (1993) Reconstitution of thè response to leukemia inhibitory factor, oncostatin M, and ciliary neurotrophic factor in hepatoma cella J. Biol . Chem., 268, 8414-8417.; Gearing, D.P., Ziegler, S.F., Comeau, M.R., Friend, D., Thoma, B., Cosman, D., Park, L. and Moaley, B. (1994) Proliferative responses and binding properties of hematopoietic cells transfected with low-affinity receptors for leukemia inhibitory factor, oncostatin M, and ciliary neurotrophic factor. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91, 1119-1123. Le azioni neutrofiche di CNTF sono mediate dalla sua subunità α-recettoriale che, al contrario del recettore LIF largamente distribuito (Gearing, D.P. (1993) The leukemia inhibitory factor and its receptor. Adv. Immunol., 53, 31-58. viene espresso quasi esclusivamente sulla superficie delle cellule neuronali (Ip et al., 1993) . Grazie al breve tempo di emivita ed ai deleteri effetti collaterali non-neuronali di CNTF in vivo (Dittrich, F., Thoenen, H. and Sendtner, M. (1994) Ciliary neurotrophic factor: pharmacokinetics and acute-phase response in rats. Ann. Neurol ., 35, 151-163.; Henderson, J.T., Seniuk, N.A. , Richardson, P.M., Gauldie, J. and Roder, J.C. (1994) Systemic administration of ciliary neurotrophic factor induces cachexia in rodente. J. Clin. Invest., 93, 2632-2638, i derivati specifici per CNTFRa che agiscono a bassi dosaggi farmaceutici possono essere vantaggiosi per applicazioni terapeutiche. Two unique features of this receptor complex are that its two transmembrane components constitute a functional receptor for LIF, and that gpl30 is present in all receptors of the CNTF-related cytokine subfamily. The high-affinity biological actions of CNTF depend on the ligand-specific and neuron-specific CNTFR subunit (Davis, S, Aldrich, T.H., Ip, N.Y., Stahl, N., Scherer, S., Farruggella, T., DiStefano, P.S., Curtis, R., Panayotatos, N., Gascan, H., Chevalier, S., and Yancopoulos, G.D. (1993) Relased forra of CNTF receptor a component as soluble raediator of CNTF responses. Scince, 259, 1736-1739 .; Ip, N.Y., McClain, J, Barrezueta, N.X., Aldrich, T.H., Pan, L, L., Li. Y., Wiegand, S.J., Friedman, B., Davis, S. and Yancopoulos, G.D. (1993) The a component of the CNTF receptor is required for signaling and defines potential CNTF targets in the adult and during development. Neuron, 10, 89-102. Furthermore, at high concentrations CNTF can elicit independent CNTF effects, presumably by activating receptors of other cytokines (Nesbitt, J.E. , Fuentes, N.L. and Fuller, G.M. (1993) Ciliary neurotrophic factor regulates fibrinogen gene expression in hepatocytes by binding to the inter leukin- 6 receptor. Biochem. Biophys. Res. Comraun., 190, 544-550. Davis et al. 1993; Baumann, H., Ziegler, S.F., Mosley, B., Morella, K.K., Pajovic, S. and Gearing, D.p. (1993) Reconstitution of the response to leukemia inhibitory factor, oncostatin M, and ciliary neurotrophic factor in hepatoma cella J. Biol. Chem., 268, 8414-8417 .; Gearing, D.P., Ziegler, S.F., Comeau, M.R., Friend, D., Thoma, B., Cosman, D., Park, L. and Moaley, B. (1994) Proliferative responses and binding properties of hematopoietic cells transfected with low -affinity receptors for leukemia inhibitory factor, oncostatin M, and ciliary neurotrophic factor. Proc. Born. Acad. Sci. USA, 91, 1119-1123. The neutrophic actions of CNTF are mediated by its α-receptor subunit which, unlike the widely distributed LIF receptor (Gearing, D.P. (1993) The leukemia inhibitory factor and its receptor. Adv. Immunol., 53, 31-58. Is expressed almost exclusively on the surface of neuronal cells (Ip et al., 1993). Thanks to the short half-life and deleterious non-neuronal side effects of CNTF in vivo (Dittrich, F., Thoenen, H. and Sendtner, M. ( 1994) Ciliary neurotrophic factor: pharmacokinetics and acute-phase response in rats. Ann. Neurol., 35, 151-163 .; Henderson, J.T., Seniuk, N.A., Richardson, P.M., Gauldie, J. and Roder, J.C. (1994) Systemic administration of ciliary neurotrophic factor induces cachexia in rodente. J. Clin. Invest., 93, 2632-2638, CNTFRa specific derivatives acting at low pharmaceutical dosages can be advantageous for therapeutic applications.
Panayotatos, N., Radziejewska, E., Acheson, A., Pearsall, D., Thadani, A. and Wong, V. (1993) Exchange of a single amino acid interconverts thè specific activity and gel mobility of human and rat ciliary neurotrophic factors. J. Biol. Chem, 268, 19000-19003, hanno mostrato che il CNTF di ratto ha, rispetto ad hCNTF, più elevata affinità per CNTFRa umano e più elevata attività biologica. Questi ricercatori hanno anche mostrato che ciò è dovuto alla sostituzione del residuo di glutammina nella posizione 63 di hCNTF con arginina della sequenza del ratto. Tuttavia, Panayotatos et al. (1994) hanno trovato che il CNTF di ratto è più attivo di hCNTF anche su cellule prive di CNTFRa, dove l'effetto di CNTF è mediato dal recettore LIF. Inoltre, hCNTF con sostituzione di glutammina con arginina alla posizione 63 è solo da 3 a 5 volte più attivo di hCNTF nei saggi biologici e di legame (Panayotatos et al., 1994). In tal modo esiste tuttora l'esigenza di molecole di hCNTF modificato-con più elevati e più specifici incrementi nell'affinità per CNTFRa, cioè con aumentate affinità e selettività per il recettore a rispetto ai componenti del recettore β. Panayotatos, N., Radziejewska, E., Acheson, A., Pearsall, D., Thadani, A. and Wong, V. (1993) Exchange of a single amino acid interconverts the specific activity and gel mobility of human and rat ciliary neurotrophic factors. J. Biol. Chem, 268, 19000-19003, showed that rat CNTF has, compared to hCNTF, higher affinity for human CNTFRa and higher biological activity. These researchers also showed that this is due to the replacement of the glutamine residue at position 63 of the hCNTF with arginine from the rat sequence. However, Panayotatos et al. (1994) found that rat CNTF is more active than hCNTF even on cells lacking CNTFRa, where the effect of CNTF is mediated by the LIF receptor. Furthermore, hCNTF with glutamine substitution with arginine at position 63 is only 3 to 5 times more active than hCNTF in biological and binding assays (Panayotatos et al., 1994). Thus there is still a need for modified hCNTF molecules - with higher and more specific increases in affinity for CNTFRa, i.e. with increased affinity and selectivity for the a receptor with respect to the β receptor components.
La presente invenzione descrive molecole di hCNTF modificato con migliorate proprietà sia di legame a CNTFRa, che di attività biologica e di specificità per il recettore. Si è trovato che queste molecole possono essere selezionate da una libreria di varianti di hCNTF esposte sulla superficie di fagi filamentosi. In precedenza, la tecnica di esposizione di proteine su fagi è stata usata per ingegnerizzare potenti inibitori di enzimi (Roberts, B.L., Markland, W., Ley, A.C., Kent, R.B., White, D.W., Guterman, S.K., and Ladner, R.C. (1992) Directed evolution of a protein: Selection of potent neutrophil elastase inhibitors displayed on M13 fusion phage. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 2429-2433. e antagonisti al recettore (Clackson, T. and Wells, J.A. (1994) In vitro selection from protein and peptide libraries. Trends Biotechnol., 12, 173-184, ma in questi studi non è stata riportata la selezione di molecole con migliorata attività agonistica. The present invention describes molecules of modified hCNTF with improved properties both of binding to CNTFRa, and of biological activity and specificity for the receptor. It has been found that these molecules can be selected from a library of hCNTF variants exposed on the surface of filamentous phages. Previously, the phage protein exposure technique was used to engineer potent enzyme inhibitors (Roberts, B.L., Markland, W., Ley, A.C., Kent, R.B., White, D.W., Guterman, S.K., and Ladner, R.C. (1992) Directed evolution of a protein: Selection of potent neutrophil elastase inhibitors displayed on M13 fusion phage. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 2429-2433. And receptor antagonists (Clackson, T. and Wells, J.A. (1994) In vitro selection from protein and peptide libraries. Trends Biotechnol., 12, 173-184, but the selection of molecules with improved agonistic activity was not reported in these studies.
In particolare, sono oggetto dell'invenzione varianti di hCNTF, caratterizzati per lo più dal fatto di essere varianti di hCNTF in cui almeno il residuo di glutammina (Gin) nella posizione 167 è sostituito con un residuo di amminoacido scelto dal gruppo comprendente Alanina (Ala), Istidina (His), Treonina (Thr) e Tirosina (Tyr). Varianti di hCNTF secondo l'invenzione, con ulteriori sostituzioni di residui amminoacidici rispetto alla proteina di tipo selvatico (SEQ ID NO: 1), sono indicati in tabella 1 con SEQ ID NO:2 fino a SEQ ID NO:22 (per semplicità sono state indicate solo le posizioni da 159 a 178). L'affinità di legame al recettore dei varianti secondo l'invenzione è stata determinata misurando la concentrazione di proteina necessaria per inibire al 50% il legame di hCNTF biotinilato al CNTFRa umano (IC50). Nell'ultima colonna di tabella 1 sono state riportate le affinità relative fra i singoli varianti secondo l'invenzione e la proteina hCNTF di tipo selvatico. In particular, variants of hCNTF are object of the invention, characterized mostly by the fact that they are variants of hCNTF in which at least the glutamine residue (Gin) in position 167 is replaced with an amino acid residue selected from the group comprising Alanine (Ala ), Histidine (His), Threonine (Thr) and Tyrosine (Tyr). Variants of hCNTF according to the invention, with further substitutions of amino acid residues with respect to the wild type protein (SEQ ID NO: 1), are indicated in table 1 with SEQ ID NO: 2 up to SEQ ID NO: 22 (for simplicity they are only positions 159 to 178 have been indicated). The binding affinity to the variant receptor according to the invention was determined by measuring the concentration of protein necessary to inhibit by 50% the binding of biotinylated hCNTF to human CNTFRa (IC50). In the last column of table 1 the relative affinities between the single variants according to the invention and the wild type hCNTF protein have been reported.
CNTF è caratterizzato dalla sua capacità di contribuire alla sopravvivenza di neuroni ciliari dissociati di embrioni di pollo E8. Come qui descritto, molecole modificate e purificate di hCNTF secondo 1'invenzione sono da 4 a 8 volte più potenti di hCNTF in questo saggio di attività neutrofica . CNTF is characterized by its ability to contribute to the survival of dissociated ciliary neurons of E8 chicken embryos. As described herein, modified and purified molecules of hCNTF according to the invention are 4 to 8 times more potent than hCNTF in this neutrophic activity assay.
Come qui descritto, le molecole modificate e purificate di hCNTF secondo l'invenzione sono da 15 a 20 volte più potenti di hCNTF nello stimolare, cellule di epatoma umano e cellule di eritroleucemia, in presenza ma non in assenza di CNTFRa. Questi risultati indicano che dette molecole, in aggiunta alla loro migliorata attività biologica, hanno migliorata specificità al recettore. As described herein, the modified and purified molecules of hCNTF according to the invention are 15 to 20 times more potent than hCNTF in stimulating, human hepatoma cells and erythroleukemia cells, in the presence but not in the absence of CNTFRa. These results indicate that said molecules, in addition to their improved biological activity, have improved receptor specificity.
Così, secondo l'invenzione, certe sostituzioni amminoacidiche nella proteina hCNTF portano alla creazione di proteine modificate che esibiscono rispetto ad hCNTF un migliorato legame al recettore di questo ultimo e pertano è lecito attendersi da esse migliorate proprietà terapeutiche . Thus, according to the invention, certain amino acid substitutions in the hCNTF protein lead to the creation of modified proteins which exhibit, with respect to hCNTF, an improved binding to the receptor of the latter and therefore it is reasonable to expect improved therapeutic properties from them.
Una persona esperta del ramo deve riconoscere che la combinazione di mutazioni nella molecola di hCNTF, che conferiscono una aumentata affinità di legame al recettore, con mutazioni che conferiscono proprietà antagonistiche, possono ragionevoImene portare a superantagonisti, cioè a molecole antagoniste con aumentata affinità al recettore, quali quelle descritte ad esempio in Savino, R., Ciapponi, L., Lahm, A., Cabibbo, A., Toniatti, C., Delmastro, P., Altamura, S., Ciliberto, G. (1994) EMBO J. 13, 5863-5870. A person skilled in the art must recognize that the combination of mutations in the hCNTF molecule, which confer increased binding affinity to the receptor, with mutations that confer antagonistic properties, may reasonably lead to superantagonists, i.e. antagonist molecules with increased receptor affinity, such as those described for example in Savino, R., Ciapponi, L., Lahm, A., Cabibbo, A., Toniatti, C., Delmastro, P., Altamura, S., Ciliberto, G. (1994) EMBO J . 13, 5863-5870.
Le molecole di CNTF modificato utili per mettere in pratica la presente invenzione possono essere preparate per clonazione ed espressione in sistemi di espressione procariotici o eucariotici. Il gene ricombinante risultante può essere espresso e purificato con qualsiasi numero di metodi che permettano la successiva formazione di una proteina stabile, biologicamente attiva. The modified CNTF molecules useful for practicing the present invention can be prepared by cloning and expression in prokaryotic or eukaryotic expression systems. The resulting recombinant gene can be expressed and purified by any number of methods that allow for the subsequent formation of a stable, biologically active protein.
La presente invenzione non si limita ai varianti sopra indicati. Si estende invece anche a molecole di DNA isolate e purificate che codificano per i varianti di hCNTF indicati in precedenza come SEQ ID NO: 2 fino a SEQ ID NO: 22. The present invention is not limited to the variants indicated above. Instead, it also extends to isolated and purified DNA molecules encoding the hCNTF variants previously indicated as SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 22.
E' anche oggetto della presente invenzione DNA ricombinante che comprende il DNA sopramenzionato legato in modo operativo ad una sequenza di controllo dell'espressione in detto DNA ricombinante sopra menzionato. La presente invenzione comprende inoltre un ospite unicellulare trasformato con il DNA ricombinante. L'ospite unicellulare secondo la presente invenzione può essere selezionato dal gruppo comprendente batteri, lieviti e altri funghi, cellule animali e cellule vegetali. The present invention also relates to recombinant DNA comprising the aforementioned DNA operatively linked to an expression control sequence in said recombinant DNA mentioned above. The present invention further comprises a single cell host transformed with the recombinant DNA. The single-celled host according to the present invention can be selected from the group comprising bacteria, yeasts and other fungi, animal cells and plant cells.
L'invenzione si estende infine a composizioni farmaceutiche che comprendono i varianti di hCNTF sopra menzionati con un adatto veicolo farmaceutico . The invention finally extends to pharmaceutical compositions which comprise the aforementioned hCNTF variants with a suitable pharmaceutical carrier.
Secondo la presente invenzione, le molecole di CNTF modificato prodotte come qui descritto, oppure loro ibridi o mutanti, possono essere usate per promuovere differenziazione, proliferazione o sopravvivenza in vitro o in vivo di cellule che rispondono a CNTF, incluse cellule che esprimono recettori della famiglia dei recettori CNTF/IL-6/ LIF, oppure cellule che esprimono il componente appropriato per la trasduzione del segnale. Mutanti o ibridi possono alternativamente antagonizzare differenziazione o sopravvivenza delle cellule. According to the present invention, the modified CNTF molecules produced as described herein, or their hybrids or mutants, can be used to promote differentiation, proliferation or survival in vitro or in vivo of cells that respond to CNTF, including cells expressing receptors of the family of CNTF / IL-6 / LIF receptors, or cells expressing the appropriate component for signal transduction. Mutants or hybrids can alternatively antagonize cell differentiation or survival.
La presente invenzione può essere usata per curare patologie di qualsiasi cellula che risponde a CNTF oppure al complesso CNTF/recettore di CNTF. Nelle forme di realizzazione preferite dell'invenzione, possono essere curate in conformità a questi metodi patologie di cellule che esprimono membri della famiglia recettoriale CNTF/IL-6/LIF . Esempi di queste cellule, pur senza essere limitate ad essi, sono: neuroni, astrociti, oligodendrociti, cellule di leucemia, cellule staminali ematopoietiche, megacariociti e loro progenitori, cellule DAI, osteoclasti, osteoblasti, epatociti, adipociti, cellule epiteliali renali, cellule staminali embrionali, cellule mesangiali renali, cellule T, cellule B, e così via. The present invention can be used to treat pathologies of any cell that responds to CNTF or to the CNTF / CNTF receptor complex. In preferred embodiments of the invention, pathologies of cells expressing members of the CNTF / IL-6 / LIF receptor family can be treated in accordance with these methods. Examples of these cells, although not limited to them, are: neurons, astrocytes, oligodendrocytes, leukemia cells, hematopoietic stem cells, megakaryocytes and their progenitors, DAI cells, osteoclasts, osteoblasts, hepatocytes, adipocytes, renal epithelial cells, stem cells embryonic, renal mesangial cells, T cells, B cells, and so on.
L'invenzione comprende ancora l'uso dei varianti di hCNTF per la preparazione di un farmaco per la terapia di malattie o patologie del sistema nervoso. Tali malattie o patologie includono malattie degenerative, quali degenerazioni retinali, malattie o patologie che coinvolgono il midollo spinale, i neuroni colinergici, i neuroni dell 'ippocampo oppure malattie o patologie che coinvolgono i neuroni motori. The invention still includes the use of hCNTF variants for the preparation of a drug for the therapy of diseases or pathologies of the nervous system. Such diseases or pathologies include degenerative diseases, such as retinal degenerations, diseases or pathologies involving the spinal cord, cholinergic neurons, hippocampal neurons or diseases or diseases involving motor neurons.
I varianti secondo la presente invenzione trovano applicazione anche nella cura di malattie o patologie che derivano da danni al sistema nervoso causati da trauma, operazione chirurgica, infarto, infezioni e tumori maligni o dall'esposizione ad agenti tossici. The variants according to the present invention also find application in the treatment of diseases or pathologies deriving from damage to the nervous system caused by trauma, surgery, heart attack, infections and malignant tumors or from exposure to toxic agents.
L'invenzione si estende anche ai coniugati dei varianti sopra menzionati con altre proteine, ad esempio con anticorpi contro transferrina per permettere il passaggio attraverso la barriera ematoencefalica, o con altre molecole, ad esempio con polietilenglicole per diminuire L'immunogenicità . The invention also extends to conjugates of the variants mentioned above with other proteins, for example with antibodies against transferrin to allow passage through the blood-brain barrier, or with other molecules, for example with polyethylene glycol to decrease immunogenicity.
Si è data finora della presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi verrà ora fornita una descrizione più particolareggiata di specifiche forme di realizzazione finalizzate a far meglio comprendere scopi, caratteristiche, vantaggi e modalità operative dell'invenzione. Up to now, a general description of the present invention has been given. With the help of the following examples, a more detailed description of specific embodiments will now be provided, aimed at better understanding the purposes, characteristics, advantages and operating methods of the invention.
Figura 1 rappresenta l'analisi elettroforetica di varianti secondo 1'invenzione mediante SDS-12,5% PAGE riducente. Figure 1 represents the electrophoretic analysis of variants according to the invention by means of reducing SDS-12.5% PAGE.
Figura 2 mostra l'attività di legame dei varianti del hCNTF secondo l'invenzione con il recettore a di hCNTF. Figure 2 shows the binding activity of the variants of the hCNTF according to the invention with the receptor a of hCNTF.
Figura 3 mostra l'effetto dei varianti secondo l'invenzione su cellule di epatoma umano (HepG2). Figura 4 mostra l'effetto dei varianti secondo l'invenzione su cellule di eritroleucemia umana TF-1. Figure 3 shows the effect of the variants according to the invention on human hepatoma cells (HepG2). Figure 4 shows the effect of the variants according to the invention on human TF-1 erythroleukemia cells.
Figura 5 rappresenta l'effetto dei varianti secondo l'invenzione sulla sopravvivenza in coltura di neuroni embrionali del ganglio ciliare di pollo in coltura. Figure 5 represents the effect of the variants according to the invention on the survival in culture of embryonic neurons of the ciliary ganglion of cultured chicken.
DEPOSITI DEPOSITS
Batteri E.coli BL21, trasformati rispettivamente con i plasmidi pRSET-MUT-A- hCNTF, pRSET-MUT-DH-hCNTF e pRSET-MUT- DAL -hCNTF, contenenti le sequenze nucleotidiche che codificano, rispettivamente per il variante MUT-A di hCNTF, che contiene la sequenza amminoacidica SEQ ID NO: 7, per il variante MUT-DH di hCNTF, che contiene la sequenza amminoacidica SEQ ID NO: 5, e per il variante MUT-DAL di hCNTF, che contiene la sequenza amminoacidica SEQ ID NO: 20, sono stati depositati il 5 maggio 1995 presso The National Collections of Industriai and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), Aberdeen Scotland, UK, con i numeri di accesso NCIMB 40724, NCIMB 40725 e NCIMB 40726 rispettivamente . E. coli BL21 bacteria, transformed respectively with the plasmids pRSET-MUT-A- hCNTF, pRSET-MUT-DH-hCNTF and pRSET-MUT- DAL -hCNTF, containing the nucleotide sequences encoding, respectively, for the variant MUT-A of hCNTF, which contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 7, for the MUT-DH variant of hCNTF, which contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 5, and for the MUT-DAL variant of hCNTF, which contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 20, were filed on May 5, 1995 with The National Collections of Industriai and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), Aberdeen Scotland, UK, under the access numbers NCIMB 40724, NCIMB 40725 and NCIMB 40726 respectively.
Esempla 1 Example 1
Produzione di una libreria di varianti di CNTF £ selezione di varianti di hCNIF ad alta affinità per il recettore Production of a CNTF variant library £ selection of hCNIF variants with high affinity for the receptor
Per analogia con l'ormone della crescita, il membro prototipo della superfamigìia delle citochine con α-eliche, è 'stato proposto che l'elica putativa D di CNTF contenga determinanti del legame con CNTFRa (Bazan, E. (1991) Neuron, 7, 197-208). Secondo predizioni di tipo strutturale (vedi l'articolo di Bazan precedentemente citato) l'elica D comprende i residui amminoacidici 157-180 di hCNTF. Per analizzare funzionalmente questa regione, sono state introdotte mutazioni casuali entro la sequenza di 20 amminoacidi dalla posizione 159 alla 178, usando mutagenesi "codon-based" ( Glaser, S.M., Yelton, D.E. e Huse, W.D. (1992) J. Immunol., 149, 3903-3913; Cormack, B.P. e Struhl, K. (1993) Science, 262, 244-248). By analogy with growth hormone, the prototype member of the cytokine superfamily with α-helices, it has been proposed that the putative helix D of CNTF contains determinants of binding to CNTFRa (Bazan, E. (1991) Neuron, 7 , 197-208). According to structural predictions (see Bazan's article previously cited) the helix D comprises the amino acid residues 157-180 of hCNTF. To functionally analyze this region, random mutations were introduced within the 20 amino acid sequence from position 159 to 178, using codon-based mutagenesis (Glaser, S.M., Yelton, D.E. and Huse, W.D. (1992) J. Immunol., 149, 3903-3913; Cormack, B.P. and Struhl, K. (1993) Science, 262, 244-248).
Un oligonucleotide degenerato corrispondente alla ragione mutagenizzata (nucleotidi 475-534), affiancata da regioni costanti 5' e 3' viene sintetizzato secondo Cormack, B.P. and Struhl, K. (1993) Regional codon randomization : Defining a TATA-binding protein surface required for RNA polymerase III transcription . Science, 262, 244-248. Viene usato un rapporto di accoppiamento codone mutante; codone di tipo selvatico di 10-15% : 85-90%, con codoni mutanti che hanno la sequenza (G/C)XX, dove X rappresenta una miscela equimolare dei quattro nucleotidi precursori. L'uso del codone G/CXX (per un primer antisenso) assicura la sintesi (senso) di tutti i 20 amminoacidi, mentre limita il numero totale di triplette a 32. Viene codificato solo il codone di stop amber (TAG) , che può essere soppresso in ceppi supE di E.coli. Per un rapporto di accoppiamento mutante/tipo selvatico di 10-15%, è stato calcolato che la frequenza prevista di sequenze che portano 0, 1, 2 o 3 sostituzioni casuali di codoni (Derbyshire, K.M., Salvo, J.J. and Grindley, N.D.F. (1986) A simple and efficient procedure for saturation mutagenesis using mixed oligodeoxynucleotides , Gene, 46, 145-152. è 4-12%, 14-27%, 23-29% e 24-19% rispettivamente. Per 20 codoni randomizzati , il numero di sequenze individuali con 1, 2 oppure 3 triplette mutate XXG/C è rispettivamente 640, 194.560 e 3,7 x 10<7 >Di qui, in una libreria contenente 10<7 >cloni individuali, circa il 70% dei quali ha tra 1 e 3 cambi di codoni, debbono essere rappresentate tutte le possibili sostituzioni, singole e doppie, come pure una proporzione importante di tutte le sostituzioni triple all'interno di una regione di 20 amminoacidi. A degenerated oligonucleotide corresponding to the mutagenized reason (nucleotides 475-534), flanked by constant regions 5 'and 3' is synthesized according to Cormack, B.P. and Struhl, K. (1993) Regional codon randomization: Defining a TATA-binding protein surface required for RNA polymerase III transcription. Science, 262, 244-248. A mutant codon coupling ratio is used; wild type codon of 10-15%: 85-90%, with mutant codons having the sequence (G / C) XX, where X represents an equimolar mixture of the four precursor nucleotides. The use of codon G / CXX (for an antisense primer) ensures the synthesis (sense) of all 20 amino acids, while limiting the total number of triplets to 32. Only the amber stop codon (TAG) is encoded, which can be suppressed in supE strains of E.coli. For a mutant / wildtype mating ratio of 10-15%, it was calculated that the predicted frequency of sequences leading to 0, 1, 2, or 3 random codon substitutions (Derbyshire, K.M., Salvo, J.J. and Grindley, N.D.F. ( 1986) A simple and efficient procedure for saturation mutagenesis using mixed oligodeoxynucleotides, Gene, 46, 145-152. Is 4-12%, 14-27%, 23-29% and 24-19% respectively. For 20 randomized codons, the number of individual sequences with 1, 2 or 3 mutated XXG / C triplets is respectively 640, 194,560 and 3.7 x 10 <7> Hence, in a library containing 10 <7> individual clones, approximately 70% of which have between 1 and 3 codon changes, all possible single and double substitutions must be represented, as well as an important proportion of all triple substitutions within a region of 20 amino acids.
L 'oligonucleotide mutato viene purificato mediante HPLC e usato come primer antisenso in amplificazione PCR del frammento di cDNA di hCNTF contenuto nel vettore fagemico pHen/\-hCNTF {Saggio, I., Paonessa, G., Gloaguen, I., Graziani, R., Di Serio, A. and Laufer, R. (1994) Nonradioactive binding assay for ciliary neurotrophic factor. Anal. Biochem., 221, 387-391. PCR viene eseguita per 25 cicli di 1 minuto a 94 °C, 5 minuti a 60°C e 2 minuti a 72°C. The mutated oligonucleotide is purified by HPLC and used as an antisense primer in PCR amplification of the hCNTF cDNA fragment contained in the phagemic vector pHen / \ - hCNTF {Saggio, I., Paonessa, G., Gloaguen, I., Graziani, R ., Di Serio, A. and Laufer, R. (1994) Nonradioactive binding assay for ciliary neurotrophic factor. Anal. Biochem., 221, 387-391. PCR is performed for 25 cycles of 1 minute at 94 ° C, 5 minutes at 60 ° C and 2 minutes at 72 ° C.
Il frammento amplificato è stato sostituito alla sequenza di tipo selvatico corrispondente nel vettore di espressione pHen/\ -hCNTF (Saggio, I., Gloaguen, I. e Laufer, R. (1995) Gene, 152, 35-39) . Il vettore risultante pHen/\-MUT -hCNTF contiene la sequenza codificante per hCNTF (randomizzata tra i residui 159 e 178), fusa a quella del dominio C-terminale della proteina pili di rivestimento del fago fd. La presenza di un codone di stop amber tra le sequenze di hCNTF e pili permette la produzione sia di particelle di fago che espongono hCNTF sia di citochina solubile (periplasmica) in ceppi di Escherichia coli soppressori o non -soppressori rispettivamente {Saggio, I., Paonessaa, G., Gloaguen, I., Graziani, R., Di Serio, A. e Laufer, R. (1994) Anal. Biochem, 221, 387-391; Saggio, I., Gloaguen, I. e Laufer, R. (1995) Gene, 152, 35-39). pHen/\ -MUT-hCNTF viene elettroporato nel ceppo TGl di E.coli e le cellule trasformate vengono distribuite su 20 piastre di Petri (di 15 cm di diametro) contenenti agar LB, glucosio 1% (w/v) ed ampicillina 50 μg/ml . I trasformanti (circa IO7 cloni indipendenti) vengono riuniti, risospesi in LB addizionato con ampicillina 50 μg/ mi e glicerolo 15% (v/v) e mantenuti a -70°C. The amplified fragment was substituted for the corresponding wild-type sequence in the pHen / \ -hCNTF expression vector (Saggio, I., Gloaguen, I. and Laufer, R. (1995) Gene, 152, 35-39). The resulting vector pHen / \ - MUT -hCNTF contains the coding sequence for hCNTF (randomized between residues 159 and 178), fused to that of the C-terminal domain of the phage coating pili protein fd. The presence of an amber stop codon between the hCNTF and pili sequences allows the production of both hCNTF-exposing phage particles and soluble (periplasmic) cytokine in suppressor or non-suppressor Escherichia coli strains respectively {Assay, I., Paonessaa, G., Gloaguen, I., Graziani, R., Di Serio, A. and Laufer, R. (1994) Anal. Biochem, 221, 387-391; Essay, I., Gloaguen, I. and Laufer, R. (1995) Gene, 152, 35-39). pHen / \ -MUT-hCNTF is electroporated into the TGl strain of E.coli and the transformed cells are spread on 20 Petri dishes (15 cm in diameter) containing LB agar, 1% (w / v) glucose and 50 μg ampicillin / ml. The transformants (about 10 7 independent clones) are combined, resuspended in LB added with ampicillin 50 μg / ml and glycerol 15% (v / v) and kept at -70 ° C.
L'analisi di restrizione enzimatica ha rivelato che 14 su 16' cloni contengono un inserto hCNTF delle dimensioni aspettate. L'analisi di sequenza del DNA di 11 cloni ha rivelato che due hanno delezioni entro la regione mutagenizzata; uno ha la sequenza di tipo selvatico e otto contengono tra 1 e 3 codoni mutati. Le modifiche codoniche osservate e le sostituzioni amminoacidiche risultanti appaiono essere casuali, con clustering non discernibili. La frequenza osservata (8/11) dei cloni con sostituzioni di codoni da 1 a 3 è in accordo con quanto aspettato. Restriction enzyme analysis revealed that 14 out of 16 'clones contain an hCNTF insert of the expected size. DNA sequence analysis of 11 clones revealed that two have deletions within the mutagenized region; one has the wild type sequence and eight contain between 1 and 3 mutated codons. The observed codon changes and the resulting amino acid substitutions appear to be random, with clustering not discernible. The observed frequency (8/11) of clones with codon substitutions from 1 to 3 is in agreement with what was expected.
Per produrre una libreria di mutanti di hCNTF esposti su fago, una aliquota della libreria batterica viene superinfettata con fago helper M13K07, e le particelle fagiche ricombinanti vengono prodotte e purificate mediante ultracentrifugazione con gradiente di densità di CsCl come descritto (Saggio et al., 1995). To produce a library of phage-exposed hCNTF mutants, an aliquot of the bacterial library is superinfected with phage helper M13K07, and the recombinant phage particles are produced and purified by CsCl density gradient ultracentrifugation as described (Saggio et al., 1995 ).
L'identità e l'integrità del costrutto di hCNTF mutagenizzato è confermato dall'analisi di sequenze del DNA della libreria di fagi corrispondente all'intera sequenza codificante per hCNTF, ai siti di clonaggio e alla sequenza leader adiacente. Si è trovato che la sequenza degli inserti della libreria è identica a quella di hCNTF di tipo selvatico anche nelle regioni randomizzate, in accordo con la frequenza teorica di mutazione di codone di solo 10-15% per ogni posizione . The identity and integrity of the mutagenized hCNTF construct is confirmed by the analysis of DNA sequences of the phage library corresponding to the entire coding sequence for hCNTF, the cloning sites and the adjacent leader sequence. It was found that the sequence of the library inserts is identical to that of wild type hCNTF even in the randomized regions, in agreement with the theoretical codon mutation frequency of only 10-15% for each position.
La libreria di varianti di hCNTF esposti su fago viene sottoposta a selezione per affinità su CNTFRa immobilizzato mediante una modifica della procedura di micropanning descritta in precedenza (Saggio et al., 1995) . In breve, CNTFRa umano solubile espresso in baculovirus (s-CNTFRa; 200 ng/ml) , e con un tag di epitopo myc, viene immobilizzato su piastre di polistirene (Falcon 1007) precedentemente rivestite con una soluzione di 20 μg/ml dell'anticorpo monoclonale 9E10 antimyc. Le piastre vengono incubate per una notte a 4°C con 10<12 >particelle fagiche/ml e 200 mg/ml del dominio extracellulare di gpl30 umano (s-gpl30) espresso in baculovirus. Dopo accurato lavaggio, il fago legato al recettore viene eluito, amplificato in E.coli TG1, e purificato mediante ultracentrifugazione con gradiente di CsCl. Il preparato risultante di fagi viene sottoposto ad ulteriori cicli di selezione per affinità come già descritto in precedenza. The library of hCNTF variants exposed on phage is subjected to affinity selection on immobilized CNTFRa by means of a modification of the micropanning procedure described above (Saggio et al., 1995). Briefly, soluble human CNTFRa expressed in baculovirus (s-CNTFRa; 200 ng / ml), and with a myc epitope tag, is immobilized on polystyrene plates (Falcon 1007) previously coated with a solution of 20 μg / ml of the monoclonal antibody 9E10 antimyc. Plates are incubated overnight at 4 ° C with 10 <12> phage particles / ml and 200 mg / ml of human gpl30 (s-gpl30) extracellular domain expressed in baculovirus. After careful washing, the phage bound to the receptor is eluted, amplified in E. coli TG1, and purified by ultracentrifugation with a CsCl gradient. The resulting phage preparation is subjected to further affinity selection cycles as previously described.
Cloni selezionati sono stati analizzati mediante sequenziamento di DNA. In parallelo, le forme secrete corrispondenti delle varianti di hCNTF sono state prodotte nello spazio periplasmico di un ceppo non soppressore di E. coli e sono state quantificate mediante ELISA usando un anticorpo diretto contro un epitopo di CNTF localizzato all'esterno della regione mutagenizzata (Rende, M., Muir, D., Ruoslahti, E., Hagg, T., Varon, S. e Manthorpe, M. (1992) Glia, 5, 25-32). Non vi sono differenze sostanziali tra le quantità di hCNTF, di tipo selvatico o mutante, recuperate dal periplasma batterico: ciò indica che le mutazioni selezionate non influenzano l'espressione o la secrezione della proteina. Le proteine secrete sono state sottoposte a saggio di legame al CNTFRa valutando la loro capacità di competere con hCNTF biotinilato per il legame a s-hCNTFRa (Saggio, I., Paonessa, G., Gloaguen, I., Graziani, R., Di Serio, A. e Laufer, R. (1994) Anal. Biochem, 221, 387-391), giungendo così ad una stima delle affinità di legame relative. Questi dati, insieme alle corrispondenti modifiche amminoacidiche, sono raccolti in tabella 1. Fra 56 proteine codificate dai cloni derivati dal secondo e terzo ciclo di selezione per affinità, sette non avevano sostituzioni amminoacidiche entro la sequenza randomizzata 159-178 e, di conseguenza, erano equipotenti a hCNTF nel legame con s-hCNTFRa. Quattro cloni avevano delezioni e davano origine a proteine inattive oppure poco espresse (dati non mostrati). Gli altri cloni codificavano 21 sequenze differenti, ciascuna delle quali con mutazioni da 1 a 3 e con IC50 da 3 a 20 volte inferiori a quello della citochina di tipo selvatico. Si è trovato che il residuo Glnl67 è stato sostituito da Ala, His, Tyr o Thr in 20 di queste 21 varianti. Infatti, la variante isolata con maggiore frequenza (17 isolati) è stata quella che porta una sostituzione Glnl67Ala. Questa proteina, da qui in poi designata anche MUT-A, inibisce il legame con s-hCNTFRa di hCNTF biotinilato con un IC50 nove volte inferiore a hCNTF. Selected clones were analyzed by DNA sequencing. In parallel, the corresponding secreted forms of hCNTF variants were produced in the periplasmic space of a non-suppressor strain of E. coli and quantified by ELISA using an antibody directed against a CNTF epitope located outside the mutagenized region (Rende , M., Muir, D., Ruoslahti, E., Hagg, T., Varon, S. and Manthorpe, M. (1992) Glia, 5, 25-32). There are no substantial differences between the amounts of hCNTF, wild type or mutant, recovered from the bacterial periplasm: this indicates that the selected mutations do not affect the expression or secretion of the protein. The secreted proteins were subjected to a CNTFRa binding assay evaluating their ability to compete with biotinylated hCNTF for binding to s-hCNTFRa (Saggio, I., Paonessa, G., Gloaguen, I., Graziani, R., Di Serio, A. and Laufer, R. (1994) Anal. Biochem, 221, 387-391), thus arriving at an estimate of the relative binding affinities. These data, together with the corresponding amino acid modifications, are collected in Table 1. Among 56 proteins encoded by clones derived from the second and third affinity selection rounds, seven had no amino acid substitutions within the randomized sequence 159-178 and, consequently, were equipotent to hCNTF in binding to s-hCNTFRa. Four clones had deletions and gave rise to inactive or poorly expressed proteins (data not shown). The other clones encoded 21 different sequences, each with mutations 1 to 3 and with IC50 3 to 20 times lower than that of the wild type cytokine. The Glnl67 residue was found to be replaced by Ala, His, Tyr or Thr in 20 of these 21 variants. Indeed, the most frequently isolated variant (17 isolates) was the one carrying a Glnl67Ala substitution. This protein, hereinafter also referred to as MUT-A, inhibits s-hCNTFRa binding of biotinylated hCNTF with an IC50 nine times lower than hCNTF.
Il solo variante senza sostituzione Glnl67 è (Vall70Arg, Hisl74Ala), che esibisce attività di legame tre volte più elevata del tipo selvatico. E' probabile che questo effetto sia conferito dalla sostituzione Vall70Arg, dato che Hisl74Ala causa una riduzione di tre volte nell'attività del mutante Glnl67Ala (vedi tabella 1). Le due varianti più potenti, (Serl66Asp, Glnl67His) indicata come MUT-DH, e (Serl66Asp, Glnl67Ala, Thrl69Leu) indicata come MUT-DAL, esibiscono valori di IC50 20 volte inferiori a quello di hCNTF. The only variant without substitution Glnl67 is (Vall70Arg, Hisl74Ala), which exhibits three times higher binding activity than the wild type. This effect is likely to be conferred by the Vall70Arg substitution, since Hisl74Ala causes a threefold reduction in the activity of the Glnl67Ala mutant (see Table 1). The two most potent variants, (Serl66Asp, Glnl67His) indicated as MUT-DH, and (Serl66Asp, Glnl67Ala, Thrl69Leu) indicated as MUT-DAL, exhibit IC50 values 20 times lower than that of hCNTF.
ESEMPIO Z EXAMPLE Z
Purificazione ≤. misura di legame al recettore, delle molecole di hCNTF modificato Purification ≤. measurement of receptor binding of modified hCNTF molecules
Le sequenze codificanti per hCNTF di tipo selvatico, MUT-A, MUT-DH e MUT-DAL vengono amplificate mediante PCR e subclonate come frammenti Nco-I-BamH I nel vettore di espressione pRSETSd (Schoepfer, R.W., Conroy, G., Whiting, P., Gore, M., e Lindstrom, J. (1990), Neuron 5, 393). L'identità di tutti i costrutti è stata confermata mediante sequenziamento del DNA dell'intera regione codificante per hCNTF. I plasmidi vengono trasformati nel ceppo BL21-DE3 di E.coli e purificati dai corpi di inclusione come descritto (Saggio et al., 1994), tranne che i batteri vengono fatti crescere in presenza di glucosio 1% (w/v) prima dell'induzione con IPTG, e che inibitori di proteasi (fluoruro di fenilmetilsolfonile 1 mM, leupeptina 10 Ug/ml) vengono inclusi nei tamponi di estrazione. L'identità di hCNTF viene confermata mediante analisi degli amminoacidi, che serve anche a quantif icare l'ammontare delle proteine. La concentrazione proteica dei varianti di hCNTF viene determinata da un saggio Biorad per le proteine, usando come standard hCNTF di tipo selvatico. Tutte le proteine ricombinanti sono risultate pure in misura superiore al 90%, come si è evidenziato con elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide (figura 1). La capacità di varianti di hCNTF di competere con hCNTF biotinilato per il legame con s-CNTFRa in presenza del dominio extracellulare solubile di gpl30 umana è stata determinata come descritto in precedenza (Saggio et al. 1994), tranne che la concentrazione di s-CNTFRa viene abbassata (usando 2 ng di recettore per l'immobilizzazione ed un volume finale di reazione di 250 μΐ). The sequences encoding wild-type hCNTF, MUT-A, MUT-DH and MUT-DAL are amplified by PCR and subcloned as Nco-I-BamH I fragments in the pRSETSd expression vector (Schoepfer, R.W., Conroy, G., Whiting , P., Gore, M., and Lindstrom, J. (1990), Neuron 5, 393). The identity of all constructs was confirmed by DNA sequencing of the entire region coding for hCNTF. The plasmids are transformed into the BL21-DE3 strain of E. coli and purified from the inclusion bodies as described (Saggio et al., 1994), except that the bacteria are grown in the presence of 1% (w / v) glucose prior to induction with IPTG, and that protease inhibitors (phenylmethylsulfonyl fluoride 1 mM, leupeptin 10 Ug / ml) are included in the extraction buffers. The identity of hCNTF is confirmed by amino acid analysis, which also serves to quantify the amount of proteins. The protein concentration of the hCNTF variants is determined by a Biorad assay for proteins, using wild-type hCNTF as the standard. All recombinant proteins were found to be more than 90% pure, as evidenced by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (Figure 1). The ability of hCNTF variants to compete with biotinylated hCNTF for binding to s-CNTFRa in the presence of the soluble extracellular domain of human gpl30 was determined as previously described (Saggio et al. 1994), except the concentration of s-CNTFRa is lowered (using 2 ng of receptor for immobilization and a final reaction volume of 250 μΐ).
Come si vede nella figura 2A, i valori di IC50 per MUT-DH, e MUT-DAL (0,8, 0,5 e 0,6 nM) sono rispettivamente 30 volte, 17 volte e 26 volte inferiori a quello della molecola di tipo selvatico (14 nM). Questi risultati sono in ragionevole accordo con quelli ottenuti usando preparazioni grezze di proteina, e confermano che la selezione per affinità porta all'isolamento di derivati di hCNTF con interazione al recettore sostanzialmente migliorata. As seen in Figure 2A, the values of IC50 for MUT-DH, and MUT-DAL (0.8, 0.5 and 0.6 nM) are respectively 30 times, 17 times and 26 times lower than that of the molecule of wild type (14 nM). These results are in reasonable agreement with those obtained using crude protein preparations, and confirm that affinity selection leads to the isolation of hCNTF derivatives with substantially improved receptor interaction.
Il saggio di legame descritto in precedenza è stato eseguito in presenza del dominio extracellulare di gpl30 umano <s-gpl30), che stabilizza il legame di hCNTF biotinilato (vedi articolo di Saggio ed altri, 1994, sopra menzionato) . Dato che s-gpl30 è anche presente durante il "library enrichment", si è voluto determinare se esso ha qualche effetto sull 'interazione recettoriale delle varianti selezionate. In assenza di s-gpl30, MUT-A, MUT-DH e MUT-DAL competono per il legame con s-hCNTFRa in modo rispettivamente 60 volte, 30 volte e 60 volte più potente di hCNTF (figura 2B). Questi risultati dimostrano che il forte legame delle varianti selezionate è dovuto ad aumentata affinità per la componente a-recettoriale, piuttosto che ad aumentata interazione con la sub-unità β-recettoriale gpl30. The binding assay described above was performed in the presence of the extracellular domain of human gpl30 <s-gpl30), which stabilizes the binding of biotinylated hCNTF (see article by Saggio et al., 1994, mentioned above). Since s-gpl30 is also present during library enrichment, we wanted to determine if it has any effect on the receptor interaction of the selected variants. In the absence of s-gpl30, MUT-A, MUT-DH and MUT-DAL compete for binding with s-hCNTFRa 60 times, 30 times and 60 times more potent than hCNTF, respectively (Figure 2B). These results demonstrate that the strong binding of the selected variants is due to increased affinity for the a-receptor component, rather than an increased interaction with the gpl30 β-receptor subunit.
F.SF.MPTO 2. F.SF.MPTO 2.
Attività biologiche delle varianti di CNTF in linee cellulari umane Biological activities of CNTF variants in human cell lines
L'attività biologica delle varianti selezionate è stata sottoposta a prova in due linee cellulari umane, TF-1 (eritroleucemia) e HepG2 (epatoma), che esprimono recettori funzionali LIF,- ma non CNTFRa (Davis, S., Aldrich, T.H., Ip, N.Y., Stahl, N., Scherer, S., Farruggella, T., DiSCefano, P.S., Curtis, R., Panayotatos, N., Gascan, H-, Chevalier, S. e Yancopoulos, G.D. (1993) Science, 259, 1736-1739; The biological activity of the selected variants was tested in two human cell lines, TF-1 (erythroleukemia) and HepG2 (hepatoma), which express functional LIF receptors - but not CNTFRa (Davis, S., Aldrich, T.H., Ip, N.Y., Stahl, N., Scherer, S., Farruggella, T., DiSCefano, P.S., Curtis, R., Panayotatos, N., Gascan, H-, Chevalier, S. and Yancopoulos, G.D. (1993) Science , 259, 1736-1739;
Baumann, H., Ziegler, S.F., Mosley, B., Morella, K.K., Pajovic, S. e Gearing, D.P. (1993) J. Biol. Chem. 268, 8414-8417). Nelle cellule con queste caratteristiche CNTF può innescare risposte biologiche attraverso due distinti meccanismi. Ad alte concentrazioni, la citochina è capace di attivare il recettore di LIF, probabilmente attraverso una interazione a bassa affinità con il complesso recettore β di LIF/gpl30 (Gearing, D.P., Ziegler, S.F., Comeau, M.R., Friend, D., Thoma, B., Cosman, D. Park, L. e Mosley, B. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci, USA., 91, 1119-1123). In presenza di CNTFRa solubile aggiunto, le cellule che portano il recettore di LIF diventano sensibili alle basse concentrazioni di CNTF grazie alla formazione di un complesso recettoriale ad alta affinità per il CNTF composto da CNTFRa, recettore β di LIF e gpl30 (Taga, T., Narazaki, M., Yasukawa, K., Saito, T., Miki, D., Hamaguchi, M., Davis, S., Shoyab, M., Yancopoulos,· S.G. e Kishimoto, T. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10998-11001; Davis, S., Aldrich, T.H., Ip, N.Y., Stahl, N., Scherer, S., Farruggella, T., DiStefano, P.S., Vurtis, R., Panayotatos, N., Gascan, H., Chevaiier, S. e Yancopoulos, G.D. (1993) Science, 259, 1736-1739; Panayotatos, N., Everdeen, D., Liten, A., Somogyi, R. e Acheson, A. (1994) Biochemistry, 33, 5813-5818; Bauman et al., 1993, già menzionato; Zhang, X.-G., Gu, J.-J., Lu, Z,-Y-, Yasukawa, K., Yancopoulos, G.D., Turner, K., Shoyab, M., Taga, T., Kishimoto, T., Bataille, R. e Klein, B. (1994) J. Exp. Med., 177, 1337-1342; Gearing et al., 1994, già menzionato). Questo sistema pertanto offre la possibilità di discriminare tra effetti biologici di varianti di hCNTF specifici e non specifici per CNTFRa. Baumann, H., Ziegler, S.F., Mosley, B., Morella, K.K., Pajovic, S. and Gearing, D.P. (1993) J. Biol. Chem. 268, 8414-8417). In cells with these characteristics CNTF can trigger biological responses through two distinct mechanisms. At high concentrations, the cytokine is capable of activating the LIF receptor, probably through a low affinity interaction with the LIF / gpl30 β receptor complex (Gearing, D.P., Ziegler, S.F., Comeau, M.R., Friend, D., Thoma , B., Cosman, D. Park, L. and Mosley, B. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci, USA., 91, 1119-1123). In the presence of added soluble CNTFRa, cells carrying the LIF receptor become sensitive to low concentrations of CNTF due to the formation of a high-affinity receptor complex for CNTF composed of CNTFRa, LIF β receptor and gpl30 (Taga, T. , Narazaki, M., Yasukawa, K., Saito, T., Miki, D., Hamaguchi, M., Davis, S., Shoyab, M., Yancopoulos, S.G. and Kishimoto, T. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10998-11001; Davis, S., Aldrich, T.H., Ip, N.Y., Stahl, N., Scherer, S., Farruggella, T., DiStefano, P.S., Vurtis, R. , Panayotatos, N., Gascan, H., Chevaiier, S. and Yancopoulos, G.D. (1993) Science, 259, 1736-1739; Panayotatos, N., Everdeen, D., Liten, A., Somogyi, R. and Acheson, A. (1994) Biochemistry, 33, 5813-5818; Bauman et al., 1993, already mentioned; Zhang, X.-G., Gu, J.-J., Lu, Z, -Y-, Yasukawa , K., Yancopoulos, G.D., Turner, K., Shoyab, M., Taga, T., Kishimoto, T., Bataille, R. and Klein, B. (1994) J. Exp. Med., 177, 1337 -1342; Gearing et al., 1994, formerly m mentioned). This system therefore offers the possibility of discriminating between biological effects of hCNTF variants specific and non-specific for CNTFRa.
1) Cellule HepG2 rispondono a CNTF aumentando la produzione di proteine di fase acuta (Schooltink, H., Stoyan, T., Roeb, E., Heinrich, P.C. e Rose-John, S (1992) FEBS Lett., 314, 280-284; Bauman et al., 1993, già menzionato in precedenza) . 1) HepG2 cells respond to CNTF by increasing the production of acute phase proteins (Schooltink, H., Stoyan, T., Roeb, E., Heinrich, P.C. and Rose-John, S (1992) FEBS Lett., 314, 280 -284; Bauman et al., 1993, already mentioned above).
Monolayers confluenti di cellule di epatoma umano HepG2 in piastre per colture cellulari a 24 pozzetti sono state poste in minimal essential medium privo di siero contenente dexametasone 1 μΜ, (Baumann et al., 1993), e trattati per 24 ore con hCNTF o suoi varianti purificati. La quantità di aptoglobina secreta nel mezzo di coltura è stata determinata mediante ELISA. Confluent monolayers of HepG2 human hepatoma cells in 24-well cell culture plates were placed in minimal essential serum-free medium containing 1 μΜ dexamethasone, (Baumann et al., 1993), and treated for 24 hours with hCNTF or its variants purified. The amount of haptoglobin secreted into the culture medium was determined by ELISA.
Le concentrazioni di citochina necessarie per provocare il 50% della stimolazione massima di produzione di aptoglobina in cellule HepG2 (EC50) sono state determinate in funzione di diverse concentrazioni di s-hCNTFRa aggiunto. L'aggiunta di s-hCNTFRa porta ad una riduzione dosedipendente dei valori di EC50 per hCNTF e MUT-DH (figura 3A). L'entità del cambiamento di potenza dipende dalla risposta delle citochine alla componente α-recettoriale (Panayotatos ed altri, 1994, già citato) . Per hCNTF, EC50 si riduce di dieci volte per aggiunta di 4 ng/ml di s-hCNTFRa (da 116 ± 32 a 10 ± 1 ng/ml). Il cambiamento di potenza per MUT-DH è più pronunciato (da 143 ± 49 a 0,6 ± 0,06 ng/ml; 200 volte), fatto questo che riflette la migliorata interazione di questa variante con il recettore a (figura 3A). The cytokine concentrations required to cause 50% of the maximum stimulation of haptoglobin production in HepG2 cells (EC50) were determined as a function of different concentrations of added s-hCNTFRa. The addition of s-hCNTFRa leads to a dose-dependent reduction of the EC50 values for hCNTF and MUT-DH (Figure 3A). The magnitude of the change in potency depends on the response of cytokines to the α-receptor component (Panayotatos et al, 1994, already cited). For hCNTF, EC50 is reduced tenfold by adding 4 ng / mL of s-hCNTFRa (116 ± 32 to 10 ± 1 ng / mL). The change in potency for MUT-DH is more pronounced (143 ± 49 to 0.6 ± 0.06 ng / ml; 200 times), reflecting the improved interaction of this variant with the a receptor (Figure 3A) .
Per confrontare le attività biologiche relative dei varianti sulle risposte di cellule HepG2 sia dipendenti dal recettore · a che indipendenti da esso, sono stati fatti esperimenti sia in assenza che in presenza di una concentrazione fissa (0,8 ng/ml) di s-hCNTFRa. Come si vede dalla figura 3B, tutti gli analoghi sottoposti a prova evocano incrementi, dosedipendenti e saturabili, nella quantità di aptoglobina secreta nel mezzo di coltura delle cellule HepG2. In assenza di recettore a esogeno, MUT-A, MUT-DH e MUT-DAL esibiscono potenze simili a quella di hCNTF di tipo selvatico (figura 3B). Questo risultato mostra che l'azione biologica di hCNTF indipendente da CNTFRoc non viene potenziata da sostituzioni amminoacidiche che esaltano l'interazione con la subunità recettoriale a. Al contrario, le varianti erano da 13 a 20 volte più potenti di hCNTF quando venivano sottoposte a prova in presenza di s-hCNTFRa (figura 3C). Questi risultati mostrano che gli aumenti di attività di legame al recettore dei varianti di hCNTF si traducono in incrementi di potenza biologica e selettività al recettore a. To compare the relative biological activities of the variants on both receptor-dependent and receptor-independent HepG2 cell responses, experiments were performed both in the absence and in the presence of a fixed concentration (0.8 ng / ml) of s-hCNTFRa. . As can be seen from Figure 3B, all the analogues tested evoke dose-dependent and saturable increases in the amount of haptoglobin secreted in the HepG2 cell culture medium. In the absence of exogenous receptor a, MUT-A, MUT-DH and MUT-DAL exhibit potencies similar to that of wild-type hCNTF (Figure 3B). This result shows that the biological action of hCNTF independent of CNTFRoc is not enhanced by amino acid substitutions that enhance the interaction with the receptor subunit a. In contrast, the variants were 13 to 20 times more potent than hCNTF when tested in the presence of s-hCNTFRa (Figure 3C). These results show that increases in receptor binding activity of hCNTF variants result in increases in biological potency and selectivity at the a receptor.
2) Cellule TF-1 2) TF-1 cells
Risultati simili si ottengono con la linea cellulare di eritroleucemia TF-l. Similar results are obtained with the TF-1 erythroleukemia cell line.
Cellule TF-1 sono state clonate mediante "limiting dilution" ed un clone che esibisce bassa sopravvivenza in assenza del fattore di crescita aggiunto viene isolato ed usato per tutti gli studi ulteriori. Per il saggio di sopravvivenza, le cellule vengono lavate tre volte con RPMI 1640 e piastrate ad una densità di 25.000 cellule/pozzetto in piastre per colture cellulari a 24 pozzetti contenenti 0,5 mi di mezzo di coltura (RPMI 1640, siero di cavallo 3%, glutammina 2 mM, penicillina 100 unità/ml, streptomicina 100 Ug/ml). Le cellule vengono trattate per 3 giorni con diverse concentrazioni di CNTF, di tipo selvatico o mutante, purificato, marcate per 3 ore con 0,5 μCί/ml di [metil-<3>H]timidina, e raccolte su filtri a fibre di vetro (piastre a 96 pozzetti Packard GF/C Unifilter). I filtri vengono lavati e la radioattività associata alle cellule viene determinata in un contatore a scintillazione Packard TopCount . TF-1 cells were cloned by "limiting dilution" and a clone exhibiting low survival in the absence of added growth factor is isolated and used for all further studies. For the survival assay, cells are washed three times with RPMI 1640 and plated at a density of 25,000 cells / well in 24-well cell culture plates containing 0.5 ml of culture medium (RPMI 1640, horse serum 3 %, glutamine 2 mM, penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 Ug / ml). The cells are treated for 3 days with different concentrations of purified CNTF, wild type or mutant, labeled for 3 hours with 0.5 μCί / ml of [methyl- <3> H] thymidine, and collected on fiber filters of glass (Packard GF / C Unifilter 96-well plates). The filters are washed and the cell-associated radioactivity is determined in a Packard TopCount scintillation counter.
CNTF stimola la sopravvivenza di cellule TF-l mantenute in assenza di altri fattori di crescita (Taga T., Narazaki, M., Yasukawa, K., Saito, T., Miki, D., Hamaguchi, M. Davis, S., Shoyab, M., Yancopoulos, G.D. e Kishimoto, T (1992) Proc. CNTF stimulates the survival of TF-l cells maintained in the absence of other growth factors (Taga T., Narazaki, M., Yasukawa, K., Saito, T., Miki, D., Hamaguchi, M. Davis, S. , Shoyab, M., Yancopoulos, G.D. and Kishimoto, T (1992) Proc.
Nati. Acad.Sci. USA, 89, 10998-11001; Davis, S., Aldrich, T.H., Ip, N.Y., Stahl, N., Scherer, S., Farruggell, T., DiStefano, P.S., Curtis, R., Panayotatos, N., Gascan, H., Chevalier, S. e Yancopoulos, G.D. (1993) Science, 259, 1736-1739). L'aggiunta di s-hCNTFRa porta a riduzioni di 7 volte e 110 volte i valori di EC3⁄4o per hCNTF e MUT-DH, rispettivamente (figura 4A). In assenza di recettore a non vi sono significative differenze tra le potenze di hCNTF, MUT-A, MUT-DH e MUT-DAL (figura 4B). Al contrario, le varianti sono da 15 a 20 volte più attive di hCNTF quando vengono sottoposte a prova in presenza di 8 ng/ml di shCNTFRa (figura 4C). Born. Acad.Sci. USA, 89, 10998-11001; Davis, S., Aldrich, T.H., Ip, N.Y., Stahl, N., Scherer, S., Farruggell, T., DiStefano, P.S., Curtis, R., Panayotatos, N., Gascan, H., Chevalier, S . and Yancopoulos, G.D. (1993) Science, 259, 1736-1739). The addition of s-hCNTFRa leads to 7-fold and 110-fold reductions in EC3⁄4o values for hCNTF and MUT-DH, respectively (Figure 4A). In the absence of a receptor there are no significant differences between the potencies of hCNTF, MUT-A, MUT-DH and MUT-DAL (Figure 4B). In contrast, variants are 15 to 20 times more active than hCNTF when tested in the presence of 8 ng / mL of shCNTFRa (Figure 4C).
ESEMPIO 4. EXAMPLE 4.
Attività neurotrofica d≤i varianti di hCNTF Neurotrophic activity of hCNTF variants
Il saggio biologico del neurone ciliare di pollo, il sistema di prova classico per l'attività neurotrofica di CNTF (Manthorpe, M., Louis, J.C., Hagg, T. e Varon, S. (1993) In Loughlin, S.E. e Fallon, J.H., (eds.), Neurotrophic factors. Academic Press, San Diego, CA, pp . 443-473. Sendtner, M., Carroll, P., Holtmann, B., Hughes, R.A. e Thoenen, H. (1994) J. Neurobiol., 25, 1436-1453), è stato usato per confrontare gli effetti neuronali di hCNTF, MUT-A, MUT-DH e MUT-DAL. Come si vede nella figura 5, un trattamento di 20 ore di neuroni embrionali del gang1ione ciliare di pollo con hCNTF porta a un incremento dosedipendente e saturabile nel numero di cellule sopravvissute, con un EC50 di 0,5 ng/ml. MUT-A, MUT-DH e MUT-DAL esibiscono attività neurotrofica da 4 a 8 volte più alta di hCNTF (figura 5). The Chicken Ciliary Neuron Biological Assay, the Classical Test System for CNTF Neurotrophic Activity (Manthorpe, M., Louis, J.C., Hagg, T., and Varon, S. (1993) In Loughlin, S.E. and Fallon, J.H., (eds.), Neurotrophic factors. Academic Press, San Diego, CA, pp. 443-473. Sendtner, M., Carroll, P., Holtmann, B., Hughes, R.A. and Thoenen, H. (1994) J. Neurobiol., 25, 1436-1453), was used to compare the neuronal effects of hCNTF, MUT-A, MUT-DH and MUT-DAL. As seen in Figure 5, a 20-hour treatment of embryonic chicken ciliary gang1ion neurons with hCNTF leads to a dose-dependent and saturable increase in the number of surviving cells, with an EC50 of 0.5 ng / ml. MUT-A, MUT-DH and MUT-DAL exhibit neurotrophic activity 4 to 8 times higher than hCNTF (Figure 5).
(1) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 1: (1) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 1:
(1) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (1) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: hCNTF di tipo selvatico (A) NAME: wild type hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 1: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Ser Gin Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Ser Gin Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(2) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 2: (2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 2:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Glnl67Thr) hCNTF (A) NAME: (Glnl67Thr) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 2: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Ser Thr Trp Thr Val Arg Ser Ile His <1 >5 IO 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Ser Thr Trp Thr Val Arg Ser Ile His <1> 5 IO 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(3) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 3: (3) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 3:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Lysl60Gln/Glnl67Thr) hCNTF (A) NAME: (Lysl60Gln / Glnl67Thr) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 3: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Leu Gin Val Leu Gin Giu Leu Ser Thr Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Gin Val Leu Gin Giu Leu Ser Thr Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(4) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 4: (4) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 4:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Glnl67Tyr) hCNTF (A) NAME: (Glnl67Tyr) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 4: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Leu Lvs Val Leu Gin GIu Leu Ser Tyr Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lvs Val Leu Gin GIu Leu Ser Tyr Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
<'>20 <'> 20
(5) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 5: (5) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 5:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Serl66Asp/Glnl67His) hCNTF (A) NAME: (Serl66Asp / Glnl67His) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 5: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Asp His Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Asp His Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(6) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 6: (6) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 6:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Glnl63Ser/Glnl67His) hCNTF (A) NAME: (Glnl63Ser / Glnl67His) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 6: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Leu Lys Val Leu Ser Giu Leu Ser His Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Ser Giu Leu Ser His Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(7) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 7: (7) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 7:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Glnl67Ala) hCNTF (A) NAME: (Glnl67Ala) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 7: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(8) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 8: (8) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 8:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Serl66Ala/Glnl67Ala) hCNTF (A) NAME: (Serl66Ala / Glnl67Ala) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 8: Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Ala Ala Trp Thr Val Arg Se r Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Ala Ala Trp Thr Val Arg Se r Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(9) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 9: (9) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 9:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Seri 66Gly/Glnl67 Ala) hCNTF (A) NAME: (Seri 66Gly / Glnl67 Ala) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 9: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Gly Ala Trp Thr Val Ara Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Gly Ala Trp Thr Val Ara Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(10) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 10: (10) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 10:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Serl66Asn/Glnl67Ala) hCNTF (A) NAME: (Serl66Asn / Glnl67Ala) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 10: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Asn Ala Trp Thr Val Arg Se r Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Asn Ala Trp Thr Val Arg Se r Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(11) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 11: (11) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 11:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Seri 66His/Gln 167 Aia) hCNTF (A) NAME: (Seri 66His / Gln 167 Aia) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 11: Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu His Ala Trp Thr Val Arg Ser He His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu His Ala Trp Thr Val Arg Ser He His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(12) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 12: (12) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 12:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Serl66Asp/Glnl67Ala) hCNTF (A) NAME: (Serl66Asp / Glnl67Ala) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 12: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Asp Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Asp Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(13) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 13: (13) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 13:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Vall61Leu/Glnl67Ala) hCNTF (A) NAME: (Vall61Leu / Glnl67Ala) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 13: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
Leu Lys Leu Leu Gin Giu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Leu Leu Gin Jun Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(14) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 14: (14) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 14:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (LysI60GIn/GInl67Ala) hCNTF (A) NAME: (LysI60GIn / GInl67Ala) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 14: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Leu Gin Val Leu Gin Giu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Gin Val Leu Gin Jun Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(15) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 15: (15) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 15:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Glnl67AIa/Hisl74Ala) hCNTF (A) NAME: (Glnl67AIa / Hisl74Ala) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 15: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Ser Ala Tre Thr Val Arg Ser Ile Ala 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Ser Ala Tre Thr Val Arg Ser Ile Ala 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(16) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 16: (16) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 16:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ϋ) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ϋ) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Glnl67Ala/Argl77Leu) hCNTF (A) NAME: (Glnl67Ala / Argl77Leu) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 16: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Leu Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Leu Phe
20 20
(17) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 17: (17) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 17:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Glnl67Ala/Thrl69Ser) hCNTF (A) NAME: (Glnl67Ala / Thrl69Ser) hCNTF
(B) ALTRE'INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 17: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Ser Ala Trp Ser Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Ser Ala Trp Ser Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(18) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 18: (18) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 18:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Glnl67AIa/Thrl69Leu) hCNTF (A) NAME: (Glnl67AIa / Thrl69Leu) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ED NO: 18: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ AND NO: 18:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Ser Ala Trp Leu Val Arg Ser Ile His 1 5 i o 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Ser Ala Trp Leu Val Arg Ser Ile His 1 5 i o 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(19) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 19: (19) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 19:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Glnl67Ala/Thrl69Leu7Phel78Ile) hCNTF (B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (A) NAME: (Glnl67Ala / Thrl69Leu7Phel78Ile) hCNTF (B) OTHER INFORMATION: sequence of hCNTF from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 19: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Ser Ala Trp Leu Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Ile Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Ser Ala Trp Leu Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Ile
20 20
(20) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 20: (20) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 20:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Serl66Asp/Glnl67Ala/Thrl69Leu) hCNTF (B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (A) NAME: (Serl66Asp / Glnl67Ala / Thrl69Leu) hCNTF (B) OTHER INFORMATION: sequence of hCNTF from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 20: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Asp Ala Trp Leu Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Asp Ala Trp Leu Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
(21) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 21: (21) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 21:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Serl66Asp/Glnl67Ala/Argl77Phe) hCNTF (B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (A) NAME: (Serl66Asp / Glnl67Ala / Argl77Phe) hCNTF (B) OTHER INFORMATION: sequence of hCNTF from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 21: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Asp Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Asp Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile His
1 5 10 15 Asp Leu Phe Phe 1 5 10 15 Asp Leu Phe Phe
20 20
(22) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO: 22: (22) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 22:
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (i) FEATURES OF THE SEQUENCE:
(A) LUNGHEZZA: 20 amminoacidi (A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TIPO: amminoacidica (B) TYPE: amino acid
(C) NUMERO CATENE: singola (C) NUMBER OF CHAINS: single
(D) CONFIGURAZIONE: sconosciuta (D) CONFIGURATION: unknown
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ii) TYPE OF MOLECULE: protein
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI: (ix) ADDITIONAL FEATURES:
(A) NOME: (Vall70Arg/Hisl74Ala) hCNTF (A) NAME: (Vall70Arg / Hisl74Ala) hCNTF
(B) ALTRE INFORMAZIONI: sequenza di hCNTF dalla posizione 159 alla posizione 178 (B) OTHER INFORMATION: hCNTF sequence from position 159 to position 178
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 22: (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
Leu Lys Val Leu Gin Giu Leu Ser Gin Tip Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe Leu Lys Val Leu Gin Jun Leu Ser Gin Tip Thr Val Arg Ser Ile His 1 5 10 15 Asp Leu Arg Phe
20 20
Claims (16)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT95RM000380A IT1278094B1 (en) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | Variants of human ciliar neurotrophic factor (hCNTF) with improved receptor binder affinity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT95RM000380A IT1278094B1 (en) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | Variants of human ciliar neurotrophic factor (hCNTF) with improved receptor binder affinity |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITRM950380A0 ITRM950380A0 (en) | 1995-06-07 |
| ITRM950380A1 true ITRM950380A1 (en) | 1996-12-07 |
| IT1278094B1 IT1278094B1 (en) | 1997-11-17 |
Family
ID=11403418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT95RM000380A IT1278094B1 (en) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | Variants of human ciliar neurotrophic factor (hCNTF) with improved receptor binder affinity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT1278094B1 (en) |
-
1995
- 1995-06-07 IT IT95RM000380A patent/IT1278094B1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1278094B1 (en) | 1997-11-17 |
| ITRM950380A0 (en) | 1995-06-07 |
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