ITRM930384A1

ITRM930384A1 - PROTEINS THAT CATALIZE THE FUNCTIONAL STRUCTURING PROCESS OF PROTEIN MOLECULES, PROCEDURE FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USES.

Info

Publication number: ITRM930384A1
Application number: IT000384A
Authority: IT
Inventors: Simonetta Bartolucci; Rosa Mario De; Anna Maria Guagliardi; Mose Rossi
Original assignee: Consiglio Nazionale Ricerche
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1993-06-11
Publication date: 1994-12-11
Also published as: WO1994029441A1; ITRM930384A0; AU6981794A; IT1261917B

Description

DESCRIZIONE DESCRIPTION

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione dal titolo: "Proteine che catalizzano il processo di strutturazione funzionale di molecole proteiche, procedimento per la loro produzione e loro usi". accompanying a patent application for an invention entitled: "Proteins that catalyze the functional structuring process of protein molecules, process for their production and their uses".

La presente invenzi?ne concerne proteine che catalizzano il processo di strutturazione funzionale di molecole proteiche, procedimento per la loro produzione e loro usi. The present invention relates to proteins which catalyze the functional structuring process of protein molecules, the process for their production and their uses.

Pi? in particolare l'invenzione si riferisce a proteine che catalizzano il processo di "folding" di molecole proteiche, ovvero di conferimento della corretta struttura terziaria e quaternaria, ripristinandone la conformazione biologicamente attiva, da utilizzarsi nella produzione biotecnologica di proteine ricombinanti, in campo medico, cosmetico ed alimentare. Pi? in particular, the invention refers to proteins that catalyze the process of "folding" of protein molecules, or conferring the correct tertiary and quaternary structure, restoring their biologically active conformation, to be used in the biotechnological production of recombinant proteins, in the medical field, cosmetic and food.

Una proteina non ? attiva biologicamente se non si trova nella sua conformazione nativa, determinata primariamente dalla sua sequenza amminoacidica. Tale conformazione nativa, che rappresenta la struttura termodinamicamente pi? stabile della proteina, viene assunta dalla catena polipeptidica durante o immediatamente dopo (a sua sintesi sulla catena di ribosomi. A protein not? biologically active if it is not found in its native conformation, determined primarily by its amino acid sequence. This native conformation, which represents the thermodynamically pi? stable protein, it is taken up by the polypeptide chain during or immediately after (at its synthesis on the ribosome chain.

?' stato dimostrato (Gething M. and Sambrook Y., Nature 355, 33-45, 1992) che questo processo in vivo ? spesso catalizzato da proteine denominate "chaperonine" che, legandosi alla catena polipeptidica nascente, ne facilitano il processo di riawolgimento (folding) e, pertanto, l'assunzione della conformazione biologicamente attiva. L'azione catalitica delle chaperonine ? ATP dipendente, essendo questo trifosfato coinvolto nei processo di distacco della chaperonina dalla catena proteica (Sadis S., and Hightower, Biochemistry, 31 , 9406-9412, 1992). Numerose proteine stabilizzano la loro conformazione attiva mediante ponti disolfuro, generati dalla ossidazione di coppie di residui di cisteina all'interno della stessa catena polipeptidica o fra catene differenti. Attualmente si conoscono numerosi sistemi enzimatici in grado di catalizzare la formazione di ponti disoifurici sulle catene polipeptidiche. Il sistema pi? caratterizzato ? quello della proteina disolfuro isomerasi (PDI) (Freedman R.B. et al., Biochem. Soc. Symp., 55, 167-192, 1989). La PDI, isolata da numerosi tessuti di vertebrati, ? un omodimero di 2 x 57.000 Da, con un punto isoelettrico (pi) molto acido. La proteina ? molto abbondante a livello epatico, dove rappresenta circa lo 0,4 % delle proteine estraibili. Numerose proteine sono substrato per la PDI, che ? in grado di catalizzare la formazione, la riduzione e la isomerizzazione di ponti disoifurici, in funzione delle condizioni redox dell'ambiente di reazione. L'attivit? enzimatica della PDI viene dosata seguendo il processo di rinaturazione della ribonucleasi A "scrambled" (srRNAsi). La srRNAsi ? una ribonucleasi contenente ponti disolfurici in posizione non corretta, ottenuta riossidando chimicamente la ribonucleasi ridotta in presenza di alte concentrazioni di urea, che impediscono alla catena polipeptidica di assumere la conformazione attiva, termodinamicamente pi? favorevole, che viene stabilizzata da specifici ponti disolfurici intramolecolari. Recentemente ? stato proposto che la POI ? coinvolta in differenti processi di modificazione di proteine (Obata T. et al., J. Biol. Chem., 263, 782-785, 1988; Wetterau J. et al., J. Biol. Chem., 265, 9800-9807, 1990; Koivu J. et al., J. Biol. Chem., 262, 6447-6449, 1987; Geetha-Habib M. et al.. Celi, 54, 1053-1060, 1988). La struttura primaria della PDI ? caratterizzata da due regioni omologhe, simili ai sito attivo della tioredossina (TH). Questo ? caratterizzato dalla presenza di due residui di cisteina in posizione vicinale che originano un sito redox ditiolico/disolfurico. La TH ? una piccola proteina acida con un peso molecolare di circa 1 2.000 Da, isolata da procarioti, lieviti, piante e cellule di mammiferi (Holmgren A., J. Biol. Chem., 264, 13963-13966, 1989). La TH ? una proteina multifunzionale, che catalizza la riduzione di disolfuri e partecipa ad altri processi redox. E' stato dimostrato (Pigiet V.P. and Schuster B.J., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 7643-7647, 1986) che la TH ? in grado di rinaturare sia la srRNAsi, che la ribonucleasi denaturata e ridotta (rdRNAsi). Questi dati suggeriscono che la TH possa avere in vivo un ruolo nel "folding" delie proteine cellulari. Di recente si ? dimostrato (Lundstrom J. and Holmgren A., J. Biol. Chem., 265, 91 14-9120, 1990) che la PDI funge da substrato per la tioredoxina reduttasi, in analogia con la TH, ed ha un'attivit? del tipo della TH, confermando ulteriormente le analogie funzionali, oltre che strutturali, tra queste due proteine. Una terza categoria di enzimi coinvolti nel processo redox di gruppi SH ? quella delle sulfidril ossidasi, enzimi che, a differenza della PDI, non catalizzano l'interscambio di ponti disolfurici. Janolino V.G. and Swaigood H.E (Arch. Biochem. Biophys., 258, 265-271 , 1987) descrivono una sulfidril ossidasi, isolata dal latte bovino. Quest'enzima ? una metalloglicoproteina, in grado di catalizzare l'ossidazione di gruppi tiolici in composti a basso peso molecolare, come il glutatione, la cisteina, il 2? mercaptoetanolo, il ditiotreitolo, ed in proteine ridotte. Un'altra sulfidril ossidasi solubile, capace di catalizzare la formazione di ponti disolfurici ? stata isolata dall?apparato riproduttivo maschile dei mammiferi (Ostrowski M.C. and Kistler W.S., Biochemistry, 19, 2639-2645, 1980). ? ' it has been shown (Gething M. and Sambrook Y., Nature 355, 33-45, 1992) that this process in vivo? often catalyzed by proteins called "chaperonins" which, by binding to the nascent polypeptide chain, facilitate the process of rewinding (folding) and, therefore, the assumption of the biologically active conformation. The catalytic action of chaperonins? ATP dependent, as this triphosphate is involved in the detachment process of chaperonin from the protein chain (Sadis S., and Hightower, Biochemistry, 31, 9406-9412, 1992). Numerous proteins stabilize their active conformation by means of disulfide bridges, generated by the oxidation of pairs of cysteine residues within the same polypeptide chain or between different chains. Numerous enzymatic systems are currently known which are capable of catalyzing the formation of disoifuric bridges on polypeptide chains. The system pi? characterized? that of the protein disulfide isomerase (PDI) (Freedman R.B. et al., Biochem. Soc. Symp., 55, 167-192, 1989). PDI, isolated from numerous vertebrate tissues,? a homodimer of 2 x 57,000 Da, with a very acidic isoelectric point (pi). The protein? very abundant in the liver, where it represents about 0.4% of extractable proteins. Numerous proteins are substrates for PDI, which? able to catalyze the formation, reduction and isomerization of disoifuric bridges, as a function of the redox conditions of the reaction environment. The activity? enzyme of the PDI is determined following the renaturation process of the "scrambled" ribonuclease A (srRNase). The srRNAsi? a ribonuclease containing disulfide bridges in an incorrect position, obtained by chemically re-oxidizing the reduced ribonuclease in the presence of high concentrations of urea, which prevent the polypeptide chain from assuming the active conformation, thermodynamically pi? favorable, which is stabilized by specific intramolecular disulfide bridges. Recently ? been proposed that the POI? involved in different protein modification processes (Obata T. et al., J. Biol. Chem., 263, 782-785, 1988; Wetterau J. et al., J. Biol. Chem., 265, 9800-9807 , 1990; Koivu J. et al., J. Biol. Chem., 262, 6447-6449, 1987; Geetha-Habib M. et al .. Cell, 54, 1053-1060, 1988). The primary structure of the POI? characterized by two homologous regions, similar to the active site of thioredoxin (TH). This ? characterized by the presence of two cysteine residues in a vicinal position that originate a dithiol / disulfide redox site. The TH? a small acid protein with a molecular weight of about 1 2,000 Da, isolated from prokaryotes, yeasts, plants and mammalian cells (Holmgren A., J. Biol. Chem., 264, 13963-13966, 1989). The TH? a multifunctional protein, which catalyzes the reduction of disulfides and participates in other redox processes. It has been shown (Pigiet V.P. and Schuster B.J., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 7643-7647, 1986) that TH? capable of renaturating both srRNase and denatured and reduced ribonuclease (rdRNase). These data suggest that TH may play a role in the "folding" of cellular proteins in vivo. Recently yes? demonstrated (Lundstrom J. and Holmgren A., J. Biol. Chem., 265, 91 14-9120, 1990) that PDI acts as a substrate for thioredoxin reductase, in analogy with TH, and has an activity? of the TH type, further confirming the functional as well as structural similarities between these two proteins. A third category of enzymes involved in the redox process of SH groups? that of sulfhydryl oxidase, enzymes which, unlike PDI, do not catalyze the interchange of disulfide bridges. Janolino V.G. and Swaigood H.E (Arch. Biochem. Biophys., 258, 265-271, 1987) describe a sulfhydryl oxidase, isolated from bovine milk. This enzyme? a metalloglycoprotein, able to catalyze the oxidation of thiol groups in low molecular weight compounds, such as glutathione, cysteine, 2? mercaptoethanol, dithiothreitol, and in reduced proteins. Another soluble sulfhydryl oxidase, capable of catalyzing the formation of disulfide bridges? been isolated from the male reproductive system of mammals (Ostrowski M.C. and Kistler W.S., Biochemistry, 19, 2639-2645, 1980).

Gli autori della presente invenzione hanno evidenziato, per la prima volta in procarioti, la presenza di un'attivit? enzimatica in grado di dare luogo a processi redox a carico di residui SH (disuifide bond-forming enzyme; DBFE), che consentono la rinaturazione di sistemi modello come la rdRNasi (Guagliardi A., Cerchia L, De Rosa M., Rossi M. and Bartolucci S., FEBS Lett., 303, 27-30, 1992), ed hanno purificato una proteina con tali caratteristiche catalitiche dal citosol deU'archeobatterio termoacidofiio estremo Sulfolobus solfataricus, ceppo MT4. The authors of the present invention have highlighted, for the first time in prokaryotes, the presence of an activity? enzymatic capable of giving rise to redox processes involving SH residues (disuifide bond-forming enzyme; DBFE), which allow the renaturation of model systems such as rdRNase (Guagliardi A., Cerchia L, De Rosa M., Rossi M. and Bartolucci S., FEBS Lett., 303, 27-30, 1992), and purified a protein with such catalytic characteristics from the cytosol of the extreme thermoacidic archaeo-bacterium Sulfolobus solfataricus, strain MT4.

Tuttavia gli enzimi sino ad ora isolati sono essenzialmente enzimi mesofili e come tali, quindi, instabili anche per brevi periodi di tempo a temperature moderate ed a concentrazioni operative particolari (mezzo non strettamente acquoso, presenza di agenti caotropici, ecc). However, the enzymes isolated up to now are essentially mesophilic enzymes and as such, therefore, unstable even for short periods of time at moderate temperatures and at particular operating concentrations (medium not strictly aqueous, presence of chaotropic agents, etc.).

Gii autori della presente invenzione hanno identificato e caratterizzato un nuovo enzima altamente stabile, isolato dall'archeobatterio acidotermofilo Sulfolobus solfataricus, ceppo DSM 1617 (Germania), in grado di catalizzare il processo di folding di proteine con un meccanismo di azione diverso da quello degli enzimi noti dalla tecnica anteriore. Infatti quest'enzima ? in grado di catalizzare il folding di una proteina con un meccanismo, ATP dipendente, e anche di stabilizzarne successivamente la struttura mediante la formazione di ponti disolfurici, qualora siano presenti residui sulfidrilici. Pertanto l'enzima comprende due distinte attivit? catalitiche, entrambi determinanti per il processo di corretto folding di una proteina. The authors of the present invention have identified and characterized a new highly stable enzyme, isolated from the acidothermophilic archaeo-bacterium Sulfolobus solfataricus, strain DSM 1617 (Germany), capable of catalyzing the protein folding process with a mechanism of action different from that of enzymes. known from the prior art. Indeed this enzyme? able to catalyze the folding of a protein with an ATP-dependent mechanism and also to subsequently stabilize its structure through the formation of disulfide bridges, if sulfhydryl residues are present. Therefore the enzyme includes two distinct activities? catalytic, both crucial for the correct folding process of a protein.

Per queste sue peculiari caratteristiche l'enzima dell'invenzione ? suscettibile di importanti applicazioni in campo industriale ed in particolare nel settore medico, alimentare e cosmetico. Nel campo della produzione industriale di proteine ricombinanti, in cui la formazioni di corpi inclusi limita fortemente le rese dei processi, l'enzima dell'invenzione ha notevoli potenzialit? applicative. Infatti spesso le proteine espresse, a causa di una non corretta organizzazione della loro struttura secondaria, risultano prive delle loro propriet? biologiche e si presentano come dei corpuscoli difficilmente solubilizzabili. Il trattamento dei corpi inclusi con l'enzima dell'invenzione consente di avere alte rese nella produzione di enzimi per via ricombinante. Sempre in campo industriale l'enzima dell'invenzione rende possibile la rigenerazione di enzimi immobilizzati, che hanno perduta la loro efficienza catalitica per un non corretto folding legato all'impiego in processo. In campo medico le propriet? dell'enzima dell?invenzione ne rendono interessante l?impiego in quelle patologie, come il morbo di Alzheimer, che hanno le loro basi molecolari in un non corretto folding di proteine. In campo cosmetico l'enzima dell'invenzione consente di intervenire positivamente nei processi di invecchiamento della pelle e nel trattamento dei capelli. In campo alimentare l'interesse per l'enzima dell'invenzione ? legato al miglioramento delle caratteristiche reologiche degli impasti delle farine di grano, connesso con l'ottimizzazione del processo di folding e di reticolazione intermolecolare ponti disolfurici durante la preparazione degli impasti, la loro lievitazione e cottura. Due to these peculiar characteristics, the enzyme of the invention? susceptible of important applications in the industrial field and in particular in the medical, food and cosmetic sectors. In the field of the industrial production of recombinant proteins, in which the formation of inclusion bodies strongly limits the yields of the processes, the enzyme of the invention has considerable potential. applications. In fact, often the expressed proteins, due to an incorrect organization of their secondary structure, are devoid of their properties. biological and appear as corpuscles that are difficult to dissolve. The treatment of the included bodies with the enzyme of the invention allows to have high yields in the production of enzymes by recombinant route. Still in the industrial field, the enzyme of the invention makes it possible to regenerate immobilized enzymes, which have lost their catalytic efficiency due to incorrect folding linked to use in the process. In the medical field, the properties? of the enzyme of the invention make it interesting to use it in those pathologies, such as Alzheimer's disease, which have their molecular basis in an incorrect folding of proteins. In the cosmetic field, the enzyme of the invention makes it possible to positively intervene in the aging processes of the skin and in the treatment of hair. In the food sector, interest in the enzyme of the invention? linked to the improvement of the rheological characteristics of the doughs of wheat flour, connected with the optimization of the folding and intermolecular cross-linking process disulfide bridges during the preparation of the dough, their leavening and baking.

Forma pertanto oggetto della presente invenzione una proteina caratterizzata dai fatto di: Therefore, the subject of the present invention is a protein characterized by the fact of:

- catalizzare il processo di refolding funzionale di proteine e peptidi; - catalyze the functional refolding process of proteins and peptides;

- comprendere ia seguente sequenza amminoacidica: - include the following amino acid sequence:

o un frammento o una sequenza omologa ad essa, che mantenga ia capacit? di catalizzare detto processo di refolding funzionale di proteine e peptidi. or a fragment or a sequence homologous to it, which maintains the capacity? to catalyze said functional refolding process of proteins and peptides.

In una forma preferita di attuazione detta proteina ? purificata da batteri, preferibilmente appartenenti ai genere Su/fo/obus, preferibilmente alla specie Suffobbus solfataricus, pi? preferibilmente al ceppo DSM 1617. In a preferred embodiment said protein? purified from bacteria, preferably belonging to the genus Su / fo / obus, preferably to the species Suffobbus solfataricus, pi? preferably to the DSM 1617 strain.

Alternativamente detta proteina deriva da sintesi chimica. Alternatively, said protein derives from chemical synthesis.

Costituisce ulteriore oggetto dell?invenzione l?uso di proteine secondo l'invenzione nei procedimenti di preparazione di proteine e peptidi secondo le tecniche del DNA ricombinante; o per il processo di refolding funzionale di enzimi immobilizzati. A further object of the invention is the use of proteins according to the invention in the processes of preparation of proteins and peptides according to the techniques of recombinant DNA; or for the functional refolding process of immobilized enzymes.

Ulteriore uso ? quello per la preparazione di composizioni farmaceutiche, preferibilmente per la terapia del morbo di Alzheimer; alternativamente per la preparazione di prodotti per il settore alimentare; alternativamente per la preparazione di composizioni in campo cosmetico. Further use? that for the preparation of pharmaceutical compositions, preferably for the therapy of Alzheimer's disease; alternatively for the preparation of products for the food sector; alternatively for the preparation of compositions in the cosmetic field.

La presente invenzione verr? ora descitta in suoi esempi esplicativi, ma non limitativi. The present invention will come now described in its explanatory, but not limiting, examples.

ESEMPIO 1 Procedura per l'estrazione e purificazione dell'enzima? EXAMPLE 1 Procedure for the extraction and purification of the enzyme?

a) Estrazione della proteina a) Extraction of the protein

Cellule di Sulfolobus soffataricus, ceppo DSM 1617, sono cresciute come riportato da Ammendola et al; Biochemistry 1992, 31 , 12514. 100 g di batteri, sospesi in 40 mi di 20 mM Tris-HCI pH 8, contenente 0.2 M NaCI e 5% glicerolo, sono lisati per decompressione istantanea mediante bomba di Parr. L'omogenato, chiarificato per centrifugazione a 160,000 gravit? per 90 min a 4?C, contiene circa 5 g di proteine. Sulfolobus soffataricus cells, DSM 1617 strain, grew as reported by Ammendola et al; Biochemistry 1992, 31, 12514. 100 g of bacteria, suspended in 40 ml of 20 mM Tris-HCI pH 8, containing 0.2 M NaCl and 5% glycerol, are lysed by instant decompression by Parr bomb. The homogenate, clarified by centrifugation at 160,000 gravity? for 90 min at 4 ° C, contains about 5 g of protein.

b) Purificazione su DEAE Sepharose Fast Flow (Pharmacia) b) Purification on DEAE Sepharose Fast Flow (Pharmacia)

L?omogenato (400 mg), dializzato esaurientemente in tubi da dialisi Spectra/Por con un cut-off di 6,000 contro 100 volumi di Tris-HCI 10 mM, pH 8.4 (Tampone A), viene successivamente caricato su una colonna (2.5 x 20 cm) di DEAE Sepharose Fast Flow (Pharmacia) equilibrata a 4?C con il tampone A ed eiuita con lo stesso tampone ad un flusso di 40 ml/h. La frazione attiva (50 mg), concentrata per centrifugazione sotto vuoto viene esaurientemente dializzata contro tampone A. The homogenate (400 mg), thoroughly dialyzed in Spectra / Por dialysis tubes with a cut-off of 6,000 versus 100 volumes of 10 mM Tris-HCI, pH 8.4 (Buffer A), is then loaded onto a column (2.5 x 20 cm) of DEAE Sepharose Fast Flow (Pharmacia) equilibrated at 4 ° C with buffer A and ejected with the same buffer at a flow of 40 ml / h. The active fraction (50 mg), concentrated by centrifugation under vacuum, is thoroughly dialyzed against buffer A.

c) Purificazione su Mono Q FPLC c) Purification on Mono Q FPLC

Aliquote di 20 mg di proteina sono purificate su una colonna Mono Q (Pharmacia, 0.5 x 5 cm) equilibrata contro tampone A ed eiuita con lo stesso tampone ad un flusso di 1 ml/min. La frazione attiva (6 mg), concentrata per centrifugazione sotto vuoto viene esaurientemente dializzata contro tampone A. Aliquots of 20 mg of protein are purified on a Mono Q column (Pharmacia, 0.5 x 5 cm) equilibrated against buffer A and ejected with the same buffer at a flow of 1 ml / min. The active fraction (6 mg), concentrated by centrifugation under vacuum, is thoroughly dialyzed against buffer A.

d) Purificazione su Superdex 75 FPLC d) Purification on Superdex 75 FPLC

Aliquote di 6 mg di proteina sono purificate su una colonna Superdex (Pharmacia, 2.6 x 60 cm) equilibrata contro tampone A ed eiuita con lo stesso tampone contenente 0.2 M NaCI ad un flusso di 2 ml/min. La frazione attiva (0.3 mg), concentrata per centrifugazione sotto vuoto viene esaurientemente dializzata contro tampone A. Aliquots of 6 mg of protein are purified on a Superdex column (Pharmacia, 2.6 x 60 cm) equilibrated against buffer A and ejected with the same buffer containing 0.2 M NaCl at a flow of 2 ml / min. The active fraction (0.3 mg), concentrated by centrifugation under vacuum, is thoroughly dialyzed against buffer A.

e) Elettroforesi su gel di poliacrilammide della proteina purificata e) Polyacrylamide gel electrophoresis of the purified protein

L'analisi elettroforetica del campione ottenuto dalla gel filtrazione eseguita a pH 4,5 secondo il metodo di Reisfeld et al (Nature, 1962, 195, 281 ), ha rivelato la presenza di una sola banda proteica, il che dimostra la omogeneit? della preparazione proteica utilizzata. The electrophoretic analysis of the sample obtained from the gel filtration performed at pH 4.5 according to the method of Reisfeld et al (Nature, 1962, 195, 281), revealed the presence of only one protein band, which demonstrates the homogeneity? of the protein preparation used.

f) Elettroforesi su gel di poiiacrilammide contenente SOS f) Electrophoresis on polyacrylamide gel containing SOS

La determinazione del peso molecolare dell'enzima viene effettuata per elettroforesi su acriiammide in SDS, come descritto da Laemmli 1970, Nature, 227, 680. Si impiega una concentrazione dei 5% per lo stacking gel e del 15% per il gel di separazione. Per la calibrazione dei peso molecolare si impiega un kit di calibrazione nell' intervallo 16.9-2.5 kDA (Sigma), rivelando le proteine con il silver staining kit (Sigma). L'elettroforesi rivela l'esistenza di una sola banda che possiede, in base alla sua mobilit?, un peso di 6200 300 Da. The determination of the molecular weight of the enzyme is carried out by electrophoresis on acryamide in SDS, as described by Laemmli 1970, Nature, 227, 680. A concentration of 5% is used for the stacking gel and 15% for the separation gel. A calibration kit in the range 16.9-2.5 kDA (Sigma) is used for molecular weight calibration, detecting proteins with the silver staining kit (Sigma). Electrophoresis reveals the existence of a single band which, based on its mobility, has a weight of 6200 300 Da.

ESEMPIO 2 Determinazione della sequenza amminoacidica. EXAMPLE 2 Determination of the amino acid sequence.

La sequenza amminoacidica a partire dail'ammino terminale ? stata determinata con un sequenziatore dell'Applied Biosystem Mod. 477A, in linea con un analizzatore delle feniltioidantoine Mod 120 A, seguendo le indicazioni del fabbricante. Il sequenziamento ? stato condotto per 63 cicli fornendo residui identificabili e determinando cosi l'intera sequenza della proteina che ? la seguente: The amino acid sequence starting from the terminal amino? was determined with an Applied Biosystem Mod. 477A sequencer, in line with a Mod 120 A phenylthiohydantoin analyzer, following the manufacturer's instructions. The sequencing? been conducted for 63 cycles providing identifiable residues and thus determining the entire sequence of the protein which? the following:

Da un'analisi della proteina si nota che i'amminoacido NH2 terminale ? una alanina, quello COOH terminale una lisina; inoltre la proteina non ha cisteine, contiene un solo triptofano ed ? di natura essenzialmente basica. La proteina comprende 63 amminoacidi, con un peso molecolare prevedibile in 7000 Da, in buon accordo con il valore di 6200 Da, determinato mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in SDS. Le lisine in posizione 4 e 6 sono monometilate, come risulta dai tempi di ritenzione dei corrispondenti derivati feniltioidantoinici. I sei residui, dalla glicina-36 alla glicina-41 , in analogia con i dati riportati in letteratura per altre proteine che interagiscono con ???? {Saraste M., Sibbaid P.R. and Wittinghofe A., Trends in Biochem. Sci; 1 5, 430-434, 1990), rappresentano verosimilmente il sito di interazione con ????. La sequenza complessiva della proteina dell'invenzione non presenta nessun evidente grado di omologia con le chaperonine. An analysis of the protein shows that the terminal NH2 amino acid? an alanine, the terminal COOH a lysine; also the protein has no cysteines, it contains only one tryptophan and? essentially basic in nature. The protein comprises 63 amino acids, with a predictable molecular weight of 7000 Da, in good agreement with the value of 6200 Da, determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The lysines in position 4 and 6 are monomethylated, as shown by the retention times of the corresponding phenylthiohydantoin derivatives. The six residues, from glycine-36 to glycine-41, in analogy with the data reported in the literature for other proteins that interact with ???? {Saraste M., Sibbaid P.R. and Wittinghofe A., Trends in Biochem. Ski; 1 5, 430-434, 1990), probably represent the site of interaction with ????. The overall sequence of the protein of the invention does not show any evident degree of homology with the chaperonins.

Recentemente ? stato riportato l'isolamento da un differente ceppo di S. soifataricus, contrassegnato con la sigla MT-4, di una proteina avente la sequenza amminoacidica dell'enzima oggetto dell'invenzione, per la quale ? riportata come unica attivit? biologica la capacit? di catalizzare l'idrolisi di RNA (Fusi P., Tedeschi G., Aliverti A., Ronchi S., Tortora P., and Guerritore A., EJB, 21 1 , 305-310,1993) . Una tale attivit? enzimatica non risulta invece presente nella proteina isolata dai S. solfataricus, ceppo DSM 1617, oggetto della presente invenzione. Recently ? the isolation from a different S. soifataricus strain, marked with the initials MT-4, of a protein having the amino acid sequence of the enzyme object of the invention, for which? reported as the only activity? biological capacity to catalyze RNA hydrolysis (Fusi P., Tedeschi G., Aliverti A., Ronchi S., Tortora P., and Guerritore A., EJB, 21 1, 305-310,1993). Such an activity? enzymatic, on the other hand, is not present in the protein isolated from S. solfataricus, strain DSM 1617, object of the present invention.

ESEMPIO 3 Riossidazione e rinaturazione enzimatica di ribonucleasi ridotta e denaturata EXAMPLE 3 Reoxidation and enzymatic renaturation of reduced and denatured ribonuclease

L'attivit? rinaturante deil'enzima dell'invenzione viene saggiata utilizzando come substrato la ribonucleasi (RNAsi) ridotta e denaturata (rdRNAsi). La rdRNAsi viene inizialmente preparata a partire da RNAsi seminale bovina (20 mg), disciolta in 0.2 M Tris-HCI, pH 9.0, contenente 6 M cloruro di guanidinio e 0.28 M 2-mercaptoetanolo. La miscela, sottoposta ad un flusso di azoto, viene tappata ed incubata a 37 ?C per una notte ai buio. I reattivi sono allontanati mediante cromatografia per esclusione molecolare su Sephadex G-25 Superfine (1 x 36,5 cm), eluita con 0.01 M HCI (degassato e trattato con un flusso di azoto) al flusso di 1 2 mf/h. Le frazioni contenenti la rdRNAsi sono riunite, trattate con un flusso di azoto e conservate a -20 ?C. La resa rispetto al materiale di partenza ? del 50 %. La completa riduzione della RNAsi (7.4 moli SH/mole RNAsi) viene verificata mediante reazione di Ellman (Ellman G.L. Arch. Biochem. Biophis., 82, 70-77 1954). The activity? The renaturant of the enzyme of the invention is tested using the reduced and denatured ribonuclease (RNase) (rdRNase) as substrate. The rdRNase is initially prepared starting from bovine seminal RNase (20 mg), dissolved in 0.2 M Tris-HCI, pH 9.0, containing 6 M guanidinium chloride and 0.28 M 2-mercaptoethanol. The mixture, subjected to a flow of nitrogen, is capped and incubated at 37 ° C for one night in the dark. The reactants are removed by molecular exclusion chromatography on Sephadex G-25 Superfine (1 x 36.5 cm), eluted with 0.01 M HCI (degassed and treated with a nitrogen flow) at a flow of 1 2 mf / h. The fractions containing the rdRNase are pooled, treated with a stream of nitrogen and stored at -20 ° C. The yield compared to the starting material? 50%. The complete reduction of RNase (7.4 mole SH / mole RNase) is verified by the Ellman reaction (Ellman G.L. Arch. Biochem. Biophis., 82, 70-77 1954).

In presenza deH'enzima dell'invenzione viene determinata la riossidazione e la riattivazione della rdRNAsi. La riossidazione della rdRNAsi viene seguita determinando la concentrazione residua dei gruppi tiolici con il metodo di Ellman. La reazione di titolazione dei gruppi SH ? effettuata mediante reazione con 0.1 mM DTNB, in 0.1 M sodio fosfato, pH 7.0, 10 mM EDTA. L'assorbimento a 412 nm di questa soluzione viene misurato a 5-10 min e la concentrazione dei gruppi tiolici ? calcolata sulla base di un coefficiente di estinzione dell'anione tiobenzoato pari a 13,600 cm"1 M'1. Un dosaggio tipo del processo di riossidazione della rdRNAsi, catalizzato dail'enzima dell'invenzione, ? di seguito riportato. Una soluzione 50 mM di sodio fosfato, pH 8.0, contenente 15 ?? rdRNAsi e l'enzima dell'invenzione (volume finale 0.5 mi) ? incubata a 30, 45 o 55 ?C in fiala di vetro sigillata. Una miscela identica, ma contenente tampone al posto dell'enzima dell'invenzione, costituisce il controllo, che misura la riossidazione spontanea dei gruppi sulfidrilici. Ai tempi desiderati la concentrazione dei gruppi sulfidrilici viene determinata con il metodo di Ellman. su aliquote di campione prelevate sotto agitazione dalle miscele incubate. Mentre il processo di riossidazione spontanea in 6 ore raggiunge un suo massimo che non supera il 33%, in presenza deH'enzima dell'invenzione tale tempo ? sufficiente per ottenere una riossidazione della rdRNasi del 90%. In the presence of the enzyme of the invention, reoxidation and reactivation of rdRNase are determined. The reoxidation of rdRNase is followed by determining the residual concentration of the thiol groups with the Ellman method. The titration reaction of the SH? carried out by reaction with 0.1 mM DTNB, in 0.1 M sodium phosphate, pH 7.0, 10 mM EDTA. The absorption at 412 nm of this solution is measured at 5-10 min and the concentration of the thiol groups? calculated on the basis of an extinction coefficient of the thiobenzoate anion equal to 13,600 cm "1 M'1. A standard assay of the reoxidation process of rdRNase, catalyzed by the enzyme of the invention, is reported below. A 50 mM solution of sodium phosphate, pH 8.0, containing 15 ?? rdRNase and the enzyme of the invention (final volume 0.5 ml) is incubated at 30, 45 or 55 ° C in a sealed glass vial. An identical mixture, but containing buffer instead of The enzyme of the invention constitutes the control, which measures the spontaneous reoxidation of the sulfhydryl groups. At the desired times the concentration of the sulfhydryl groups is determined by the Ellman method on sample aliquots taken under stirring from the incubated mixtures. spontaneous reoxidation in 6 hours reaches a maximum which does not exceed 33%, in the presence of the enzyme of the invention this time is sufficient to obtain a reoxidation of the rdRNase of 90%.

La riattivazione della rdRNAsi catalizzata dall?enzima dell'invenzione ? effettuata saggiando il ripristino dell'attivit? ribonucleasica con il metodo di Kunitz (Kunitz M., J. Biol. Chem., 164, 563,1946), seguendo la diminuzione di assorbimento a 300 nm di una soluzione 0.5 mg/ml di RNA in 50 mM sodio acetato, pH 5.2 (volume finale 1 mi) a 30?C (lettura contro aria). L'attivit? ribonucleasica viene dosata anche seguendo l'aumento di assorbimento a 260 nm di una soluzione contenente 100 di RNA in 50 mM Tris-HCI, pH 7.8, 25 mM KCI, 5 mM MgCl2 (volume finale 1 mi) a 30? C (lettura contro aria). In una procedura standard si opera come di seguito riportato. Due miscele identiche (il controllo e la miscela contenente l'enzima dell'invenzione) identiche a quelle in precedenza descritte per il saggio di riossidazione della rdRNAsi sono incubate a 30? C. Ai tempi desiderati, l?attivit? ribonucleasica viene dosata su aliquote prelevate da ciascuna miscela. La percentuale di rinaturazione nella miscela di controllo (in assenza di enzima) e in quella contenete il catalizzatore, viene calcolata rispetto alla velocit? di catalisi di una soluzione di RNAsi nativa nelle stesse condizioni di saggio. Mentre il processo di rinaturazione spontanea in 6 ore raggiunge un suo massimo che non va al di l? del 4%, in presenza dell?enzima dell'invenzione un tale tempo ? sufficiente per ottenere una rinaturazione della rdRNAsi del 40%. The reactivation of rdRNase catalyzed by the enzyme of the invention? carried out by testing the restoration of the activity? ribonuclease with the method of Kunitz (Kunitz M., J. Biol. Chem., 164, 563,1946), following the decrease in absorption at 300 nm of a solution of 0.5 mg / ml of RNA in 50 mM sodium acetate, pH 5.2 (final volume 1 ml) at 30 ° C (reading against air). The activity? ribonuclease is also dosed following the increase in absorption at 260 nm of a solution containing 100 of RNA in 50 mM Tris-HCI, pH 7.8, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2 (final volume 1 ml) at 30? C (reading against the air). In a standard procedure we operate as follows. Two identical mixtures (the control and the mixture containing the enzyme of the invention) identical to those previously described for the reoxidation assay of rdRNase were incubated at 30? C. At the desired time, the activity? ribonuclease is dosed on aliquots taken from each mixture. The percentage of renaturation in the control mixture (in the absence of enzyme) and in that containing the catalyst, is calculated with respect to the speed? catalysis of a native RNase solution under the same test conditions. While the spontaneous renaturation process in 6 hours reaches a maximum that does not go beyond? of 4%, in the presence of the enzyme of the invention such a time? sufficient to achieve 40% rdRNase renaturation.

ESEMPIO 4 Riossidazione enzimatica della RNAsi scrambled EXAMPLE 4 Enzymatic reoxidation of scrambled RNase

L?attivit? dell'enzima dell' invenzione viene determinata utilizzando la RNAsi scrambled (srRNAsi) come substrato. La srRNAsi viene preparata come di seguito riportato. In una procedura tipo una soluzione di 2 mg/ml di rdRNAsi, preparata come descritto nell'ESEMPIO 3, viene diluita a 0.5 mg/ml con 0.1 M HC1 ed addizionata con 4 M cloruro di guanidinio (aggiunto per pesata); il pH viene portato ad 8.5 con 1 M Tris e la soluzione viene lasciata esposta ail'aria per 4 giorni a temperatura ambiente, al buio. Il saie viene rimosso mediante cromatografia su Sephadex G-25 Superfine, come gi? descritto; il picco proteico viene concentrato su SAVANT e conservato a -20 ?C. La resa rispetto al materiale di partenza ? del 100%. The activity of the enzyme of the invention is determined using scrambled RNase (srRNase) as substrate. The srRNase is prepared as follows. In a typical procedure a solution of 2 mg / ml of rdRNase, prepared as described in EXAMPLE 3, is diluted to 0.5 mg / ml with 0.1 M HCl and added with 4 M guanidinium chloride (added for weighing); the pH is brought to 8.5 with 1 M Tris and the solution is left exposed to air for 4 days at room temperature, in the dark. The saie is removed by chromatography on Sephadex G-25 Superfine, as already? described; the protein peak is concentrated on SAVANT and stored at -20 ° C. The yield compared to the starting material? 100%.

La reazione di riossidazione della rdRNAsi, catalizzata daH'enzima dell'invenzione, ? seguita mediante la reazione di Ellman, secondo un protocollo sperimentale analogo a quello in precedenza riportato nell'ESEMPIO 3. La srRNAsi riossidata non presenta alcuna attivit? ribonucleasica. Mentre il processo di riossidazione spontanea in 6 ore raggiunge un suo massimo che non va al di l? del 3%, in presenza dell'enzima dell'invenzione un tale tempo ? sufficiente per ottenere una riossidazione della srRNAsi del 30%. The reoxidation reaction of rdRNase, catalyzed by the enzyme of the invention,? followed by the Ellman reaction, according to an experimental protocol similar to that previously reported in EXAMPLE 3. The reoxidated srRNase does not show any activity? ribonuclease. While the spontaneous reoxidation process in 6 hours reaches a maximum that does not go beyond? of 3%, in the presence of the enzyme of the invention such a time? sufficient to obtain a reoxidation of srRNase of 30%.

ESEMPIO 5 Rinaturazione enzimatica dell'alcool deidrogenasi da fegato di cavallo e da S. soifataricus EXAMPLE 5 Enzymatic renaturation of alcohol dehydrogenase from horse liver and S. soifataricus

L'attivit? deH'enzima dell'invenzione viene determinata utilizzando come substrato l'alcool deidrogenasi denaturata isolata da fegato di cavallo (HLADH) e da S. soifataricus (SsADH). In una procedura tipo, l'ADH viene denaturata completamente incubando 6 mg di ciascun enzima, HLADH e SsADH, in 3 M cloruro di guanidinio a 37?C per 12 h. L'attivit? enzimatica viene dosata per la HLADH a 35 ?C e per la SsADH a 60?C in una miscela di saggio 25 mM tampone barbital, pH 8.0, 2 mM NAD, 5 mM alcool benzilico, seguendo la scomparsa del coenzima ridotto a 340 nm con uno spettrofotometro DSM-100 fornito di una cella termostatata. La maturazione dei due enzimi ? determinata, in assenza ed in presenza dell'enzima dell'invenzione, diluendo 30 ?g di ciascun enzima denaturato in cloruro di guanidinio con 6 mi di tampone sodio fosfato 0.1 M, pH 8.0, 5 ?? in cloruro di zinco. La maturazione viene seguita nel tempo mantenendo le soluzioni a 25 ?C per la HLADH ed a 50 ?C per la SsADH. La percentuale di maturazione viene calcolata rispetto ai valore che avrebbe la stessa quantit? di enzima prima del processo di denaturazione. Nel saggio di rinaturazione per 30 ?g di enzima denaturato si aggiungono 2 ?^ dell'enzima dell'invenzione, in assenza ed in presenza di ATP 0.5 mM. L'HLADH e la SsADH, nelle condizioni di rinatura zione spontanea in precedenza descritte recuperano al massimo rispettivamente il 18 ed il 25% della loro originaria attivit? catalitica. L'aggiunta dell'enzima dell'invenzione e di ATP nella miscela di rinaturazione determina un forte aumento della percentuale di rinaturazione, che passa al 50 ed al 65% rispettivamente per la HLADH e SsAOH. In assenza di ATP il processo di rinaturazione ? minore. The activity? of the enzyme of the invention is determined using as substrate denatured alcohol dehydrogenase isolated from horse liver (HLADH) and from S. soifataricus (SsADH). In a typical procedure, ADH is completely denatured by incubating 6 mg of each enzyme, HLADH and SsADH, in 3M guanidinium chloride at 37 ° C for 12 h. The activity? enzymatic is determined for HLADH at 35 ° C and for SsADH at 60 ° C in a mixture of 25 mM barbital buffer, pH 8.0, 2 mM NAD, 5 mM benzyl alcohol, following the disappearance of the reduced coenzyme at 340 nm with a DSM-100 spectrophotometer equipped with a thermostated cell. The maturation of the two enzymes? determined, in the absence and in the presence of the enzyme of the invention, by diluting 30? g of each denatured enzyme in guanidinium chloride with 6 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 8.0.5? in zinc chloride. The maturation is followed over time by keeping the solutions at 25 ° C for the HLADH and at 50 ° C for the SsADH. Is the percentage of maturation calculated with respect to the value that the same quantity would have? of enzyme before the denaturation process. In the renaturation assay for 30 µg of denatured enzyme 2 µl of the enzyme of the invention are added, in the absence and in the presence of 0.5 mM ATP. HLADH and SsADH, in the spontaneous renaturation conditions previously described, recover at most 18 and 25% of their original activity, respectively. catalytic. The addition of the enzyme of the invention and of ATP in the renaturation mixture determines a strong increase in the renaturation percentage, which passes to 50 and 65% respectively for HLADH and SsAOH. In the absence of ATP, the renaturation process? minor.

ESEMPIO 6 Rinaturazione di SsADH immobilizzata su Sepharose. EXAMPLE 6 Renaturation of SsADH immobilized on Sepharose.

L'attivit? deifenzima dell'invenzione viene determinata utilizzando come substrato SsADH immobilizzata su Sepharose e denaturata. La SsADH ? immobilizzata legandola covalentemente a 4?C al Sepharose 4B attivato con bromuro di cianogeno, 100 mg/ml di matrice, secondo la tecnica di Axen et al. (R. Axen, J. Porath and S. Ernback, Nature 214, 1302, 1967) in 0.1 M tampone fosfato, pH 8.0. 5.0 mg di SsADH sono fatti reagire per tutta la notte con 1 0 mi di Sepharose attivato, i rimanenti gruppi reattivi sono bloccati con 0. 1 etanolammina ed il campione ? esaurientemente lavato con 0.05 M tampone fosfato pH 7.5. Da una determinazione differenziale delle proteine si evince che la quantit? di enzima legato covalentemente ? di 3.1 mg/10 mi di Sepharose. L'attivit? dell'enzima, misurata dopo la centrifugazione delia sospensione con la tecnica prima descritta, mostra un?attivit? pari a 1.2 unit?/ml di gei. Due campioni di 0.2 mi della resina sono stati centrifugati e sospesi in 1 mi di soluzione di guanidina idrocloruro 2.4 M e tenuti per una notte a 37 ?C. Dopo 16 h non si rileva pi? alcuna attivit?, per cui l'enzima risulta denaturato. Le sospensioni sono poi centrifugate e lavate per tre volte con 1 mi di 0.1 M tampone fosfato a pH 8.0. I due campioni di resina sono sospesi in 1 mi di tampone di rinaturazione, 0.1 M fosfato, pH 8.0, 5uM ZnCl2, ed in uno di essi si aggiungono 6 jifl dell'enzima dell'invenzione ed ATP e Mg<+ >per una concentrazione finale 0.5 mM. Sia il campione contenente l'enzima dell'invenzione che il controllo sono mantenuti a 50?C, prendendo nei tempo aliquote di 0.1 mi, su cui viene misurata l'attivit? della SsADH. Dopo 2 h, in assenza dell'enzima dell'invenzione, la SsADH immobilizzata riguadagna solo il 17% dell'attivit? iniziale, mentre nello stesso tempo in presenza deH'enzima dell'invenzione si osserva un 78% di rinaturazione. The activity? The enzyme of the invention is determined using as substrate SsADH immobilized on Sepharose and denatured. The SsADH? immobilized by ligating it covalently at 4? C to Sepharose 4B activated with cyanogen bromide, 100 mg / ml of matrix, according to the technique of Axen et al. (R. Axen, J. Porath and S. Ernback, Nature 214, 1302, 1967) in 0.1 M phosphate buffer, pH 8.0. 5.0 mg of SsADH are reacted overnight with 10 ml of activated Sepharose, the remaining reactive groups are blocked with 0. 1 ethanolamine and the sample? thoroughly washed with 0.05 M phosphate buffer pH 7.5. From a differential determination of proteins it is clear that the quantity? covalently bound enzyme? of 3.1 mg / 10 ml of Sepharose. The activity? of the enzyme, measured after centrifugation of the suspension with the technique described above, shows an activity? equal to 1.2 unit? / ml of gei. Two 0.2 ml samples of the resin were centrifuged and suspended in 1 ml of 2.4 M guanidine hydrochloride solution and kept overnight at 37 ° C. After 16 h is not detected more? any activity, for which the enzyme is denatured. The suspensions are then centrifuged and washed three times with 1 ml of 0.1 M phosphate buffer at pH 8.0. The two resin samples are suspended in 1 ml of renaturation buffer, 0.1 M phosphate, pH 8.0, 5uM ZnCl2, and in one of them 6 jifl of the enzyme of the invention and ATP and Mg <+> are added for a concentration final 0.5 mM. Both the sample containing the enzyme of the invention and the control are kept at 50 ° C, taking aliquots of 0.1 ml over time, on which the activity is measured. of the SsADH. After 2 h, in the absence of the enzyme of the invention, the immobilized SsADH regains only 17% of the activity. initial, while at the same time in the presence of the enzyme of the invention a 78% of renaturation is observed.

ESEMPIO 7 Corpi inclusi EXAMPLE 7 Bodies included

Corpi inclusi formatisi in seguito ad iperespressione in E. coli della SsADH sono stati isolati mediante lisi cellulare con lisozima, centrifugazione del Usato a 6000 x g per 5 min e successiva centrifugazione a 15,000 x g per 30 min: Il pellet ? stato solubilizzato in 3 M cloruro di guanidinio a 37 ?C per 5 ore ad una concentrazione di 10 mg/ml. La soluzione ? successivamente diluita 300 volte (33 ?g/ml) in tampone sodio fosfato 0.1 M pH 8.0, 5 ?? cloruro di zinco in presenza di 5 ?g/ml dell'enzima dell'invenzione. Questa miscela di rinaturazione ? stata incubata a 40? C per 1 ora con un recupero dell'attivit? deil'80% calcolato in base all'attivit? specifica nota della SsADH nativa. Se la rinaturazione ? condotta in assenza dell'enzima si ottiene un recupero del 23%. Inclusion bodies formed following overexpression of SsADH in E. coli were isolated by cell lysis with lysozyme, centrifugation of the Used at 6000 x g for 5 min and subsequent centrifugation at 15,000 x g for 30 min: The pellet? been solubilized in 3M guanidinium chloride at 37 ° C for 5 hours at a concentration of 10 mg / ml. The solution ? subsequently diluted 300 times (33? g / ml) in 0.1 M sodium phosphate buffer pH 8.0, 5 ?? zinc chloride in the presence of 5 µg / ml of the enzyme of the invention. This renaturation blend? been incubated at 40? C for 1 hour with a recovery of the activity? deil'80% calculated based on the activity? specific note of native SsADH. If the renaturation? conducted in the absence of the enzyme, a recovery of 23% is obtained.

ESEMPIO 8 Parametri cinetici dell'enzima - DH. temo, ott. etc. EXAMPLE 8 Kinetic parameters of the enzyme - DH. I'm afraid, Oct. etc.

L'enzima mostra una stabilit? di oltre 2 ore se incubato a 80? C, con un pH ottimale di 7.2 in tampone fosfati 0.1 M, ed una temperatura ottimale dipendente dal substrato proteico. Sono state ottenute rinaturazioni di diverse proteine in un intervallo di temperature che va da 30 a 70? C. Does the enzyme show stability? more than 2 hours if incubated at 80? C, with an optimal pH of 7.2 in 0.1 M phosphate buffer, and an optimal temperature dependent on the protein substrate. Have several proteins been renaturated in a temperature range from 30 to 70? C.

La presente invenzione ? stata descr?tta, a titolo illustrativo ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, ma ? da intendersi che variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti nei ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione. The present invention? has been described, for illustrative but not limitative purposes, according to its preferred embodiments, but it has been described. it is to be understood that variations and / or modifications may be made by those skilled in the art without thereby departing from the relative scope of protection.

Claims

CLAIMS 1. Protein characterized by the fact of: - catalyze the functional refoiding process of proteins and peptides; - include the following amino acid sequence: NH2-A-T-V-K-F-K-Y-K-G-E-E-K-E-V-D-I-S-K-I-K-K-V-W-R-V-G-K-l-M-I-S-F-TY-D-E-G-G-G-K-T-K-G-K-E-K-L-K-V-K-V-K-L-K 0 a fragment or a sequence homologous to it, which maintains the capacity? to catalyze said functional refoiding process of proteins and peptides.

2. Protein according to claim 1 characterized in that it is purified from bacteria.

3. Protein according to claim 2 characterized in that said bacteria belong to the genus Sulfoiobus, preferably to the species Sulfoiobus solfataricus, more? preferably to the DSM 1617 strain.

4. Protein according to claim 1 characterized in that it derives from chemical synthesis.

Use of the proteins according to any one of the preceding claims in the processes of preparation of proteins and peptides according to the techniques of recombinant DNA.

6. Use of the proteins according to any one of claims 1 to 4 for the functional refoiding process of immobilized enzymes.

7. Use of the proteins according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of pharmaceutical compositions, preferably for the therapy of Alzheimer's disease.

Use of the proteins according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of products of the food sector.

Use of the proteins according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of compositions in the cosmetic field.