ITRM930361A1 - Metodologia per la produzione di fagi filamentosi che espongono sulla superficie del capside peptidi capaci di legare la biotina, e fagi filamentosi e peptidi cosi' ottenibili. - Google Patents

Metodologia per la produzione di fagi filamentosi che espongono sulla superficie del capside peptidi capaci di legare la biotina, e fagi filamentosi e peptidi cosi' ottenibili. Download PDF

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ITRM930361A1
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Isabella Saggio
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Angeletti P Ist Richerche Bio
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Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo "METODOLOGIA PER LA PRODUZIONE DI FAGI FILAMENTOSI CHE ESPONGONO SULLA SUPERFICIE DEL CAPSIDE PEPTIDI CAPACI DI LEGARE LA BIOTINA, E FAGI FILAMENTOSI E PEPTIDI COSI' OTTENIBILI?
DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto una metodologia in base alla quale, usando una proteina altamente biotinilata, ? possibile selezionare fagi capaci di legare la biotina.
Come ? noto, la biotina ? una piccola molecola (PM 244) che pu? essere coniugata a diverse macromolecole senza alterarne dimensioni, caratteristiche fisiche e attivit? biologica. La biotina lega con alta affinit? sia l'avidina che la streptavidina . Questa interazione viene utilizzata in diverse applicazioni tecnologiche per il rilevamento e la purificazione di molecole biotinilate .
L'uso di avidina e/oppure streptavidina, nonostante l'elevata attivit? di queste molecole per la biotina, presenta comunque alcuni svantaggi. Gli inconvenienti pi? importanti possono essere riassunti come segue. In primo luogo, l'avidina lega in modo non specifico diversi tipi cellulari, pu? inoltre venire internalizzata , il che pu? limitarne l'uso in metodologie citochimiche. In secondo luogo, la dissociazione del legame avidina/biotina richiede condizioni molto drastiche, il che ne limita l'uso nella purificazione per affinit?. Sono stati prodotti, come reagenti alternativi, anticorpi anti-biotina; ma anche questi possono dare origine a fenomeni di legame non specifici.
Per tutte le ragioni sopra evidenziate, esiste nello specifico settore 1'esigenze di un nuovo tipo di reagente, capace di legare la biotina senza dover lamentare gli inconvenienti e le limitazioni sopra menzionate.
La metodologia secondo la presente invenzione consente di produrre un nuovo tipo di reagente che pu? offrire alcuni vantaggi che risulteranno evidenti nel seguito.
E' pertanto oggetto della presente invenzione una metodologia per l'isolamento di fagi filamentosi capaci di legare la biotina, caratterizzato essenzialmente dalle seguenti operazioni :
- biotinilazione di una proteina usata per lo screening di una libreria fagica in cui vengono espressi sulla superficie del capside oligopeptidi codificati da inserti oligonucleotidici a sequenza casuale, introdotti in un gene codificante per il capside fagico con tecniche di manipolazione genetica;
- screening della libreria suddetta con la proteina biotinilata; e
- isolamento di fagi capaci di legare la biotina .
Il gene codificante per il capside fagico, con inserti oligonucleotidici a sequenza casuale, pu? essere il gene che codifica per la proteina pVIII oppure per la proteina pili del capside fagico.
In una specifica forma di realizzazione dell'invenzione, gli oligonucleotidi a sequenza casuale sono inseriti nel gene codificante per la proteina pVIII, usando come vettore di espressione il plasmide pC89, dal sito di riconoscimento per l'enzima di restrizione EcoRI a quello per l'enzima di restrizione BamHI . In questo caso gli oligonucleotidi descritti possono avere la sequenza SEQ. ID.NO.1.
La presente invenzione non si limita alla metodologia per l'isolamento di fagi filamentosi capaci di legare la biotina come precedentemente descritto. Si estende invece anche ai fagi caratterizzati dal fatto che espongono sulla superficie del capside oligopeptidi che conferiscono al fago la capacit? di legare la biotina e dal fatto che sono ottenibili nel corso della metodologia descritta in precedenza.
In una forma di realizzazione, il peptide inserito nella proteina del capside fagico che conferisce la capacit? di legare la biotina, comprende la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO.2. In questo caso, il peptide che conferisce al fago la capacit? di legare la biotina pu? essere inserito nella proteina pVIII.
La proteina ricombinante pVIII, in un'altra variante dell'invenzione, pu? comprendere la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO.3.
In un'ulteriore variante dell'invenzione la proteina ricombinante matura pVIII pu? comprendere, fra 1'amminoacido n.3 (Gly) e 1'amminoacido n.5 (Asp), la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO.4. In questo caso, la proteina ricombinante pu? comprendere una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo comprendente SEQ.ID.N0.5, SEQ.ID.N0.6 e SEQ.ID.NO. 7. La sequenza amminoacidica che comprende la sequenza SEQ.ID.NO.5 pu? consistere nella sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO.8.
L'invenzione si estende anche ai peptidi capaci di legare la biotina che comprendono la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO. 2, la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO. 3, oppure la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO.4.
I peptidi capaci di legare la biotina, che comprendono la SEQ.ID.NO.4, possono comprendere una sequenza scelta dal gruppo comprendente le sequenze amminoacidiche SEQ.ID.NO. 5, SEQ.ID.NO. 6 e SEQ.ID.NO. 7.
In una forma di realizzazione particolare, il peptide capace di legare la biotina che comprende la sequenza SEQ. ID.NO.5 secondo la presente invenzione, pu? consistere nella sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO.8.
I fagi filamentosi secondo la presente invenzione possono essere usati per il rilevamento di molecole biotinilate in tecniche scelte per esempio dal gruppo comprendente ELISA, Western, Southern, e Northern blotting, istochimica e saggi di legame a recettori.
E' anche possibile l'uso di fagi filamentosi secondo la presente invenzione per la purificazione di molecole biotinilate.
Come i fagi filamentosi secondo la presente invenzione, anche i peptidi secondo la presente invenzione possono essere impiegati per il rilevamento di molecole biotinilate in tecniche scelte per esempio dal gruppo comprendente ELISA, Western, Southern e Northern blotting, istochimica e saggi di legame a recettori, oppure per la purificazione di molecole biotinilate.
Si ? data finora dei ritrovati oggetto della presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi verr? ora fornita una descrizione particolareggiata di specifiche forme di realizzazione dell'invenzione finalizzate a far meglio comprendere i suoi scopi, le sua caratteristiche, i suoi vantaggi e le sue modalit? di applicazione.
La figura 1, in forma di istogramma, mostra il legame di proteine biotinilate a fagi selezionati secondo la presente invenzione e immobilizzati su plastica .
La figura 2, in forma di istogramma, mostra il legame di fagi, selezionati secondo l'invenzione, a proteine biotinilate e immobilizzate su plastica.
La figura 3 mostra, in forma di istogramma, il rilevamento di proteine immobilizzate su plastica tramite un ligando biotinilato.
La figura 4 mostra la curva relativa all'inibizione del legame di , streptoavidina, marcata con 12 5 ad albumina serica bovina (BSA) biotinilata, immobilizzata su plastica, con quantit? crescenti del peptide con sequenza SEQ.ID.NO. 8.
DEPOSITI
Batteri Xll-Blue - trasformati con il plasmide pC89 che contiene, dal sito di riconoscimento per l'enzima di restrizione EcoRI a quello per l'enzima di restrizione BamHI, la sequenza nucleotidica che codifica per la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO.5 - sono stati depositati in data 26/5/93 presso The National Collections of Industriai and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), Aberdeen Scozia, UK, con il numero di accesso NCIMB 40561.
Esempio 1
Procedimento per l'isolamento di faci capaci di legare la biotina
1) Biotinilazione di una proteina usata per lo screening di una libreria fagica
Una linea cellulare producente mAb 35, un anticorpo monoclonale di ratto diretto contro il recettore per l 'acetilcolina, ? stata ottenuta dalla American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA). L'anticorpo ? stato precipitato con l'aggiunta al mezzo'di coltura, privo di siero, di un uguale volume di una soluzione satura di solfato di ammonio. Dopo incubazione di 4 ore a 4?C, il precipitato viene recuperato in seguito a centrifugazione, e viene dializzato in modo esaustivo contro Tris-HCl 10 mM, pH 8,0.
La biotinilazione viene realizzata secondo una modifica del metodo di Parmley e Smith (1998) [Gene 73, 305-318], ovvero utilizzando un rapporto di 4 volte maggiore del reagente rispetto alla proteina. Il mAB 35 (6 nmoli) ? stato incubato con soliosuccinimidil-6- (biotinammido)esanoato (NHS-LS-biotin Pierce, 360 nmoli) in bicarbonato di sodio 0,1 M, pH 8,2, per 2 ore a temperatura ambiente. Viene aggiunta etanolammina 1 M, pH 9 (0,5 mi) e l'incubazione continua per altre 2 ore a temperatura ambiente. A seguito dell'aggiunta di BSA ad una concentrazione finale di 1 mg/ml, il prodotto viene concentrato su un "Centricon 30 ultrafilter " (Amicon), e il retentato viene lavato tre volte con Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 (TBS).
2) Screening di una libreria peptidica espressa su fago con mAB 35 biotinilato
La libreria fagica ? stata costruita [Luzzago ed al. (1993) Gene], usando un vettore di espressione plasmidico pC89 modificato [Felici ed al. (1991) J. Mol . Biol. 222, 301], il quale contiene il gene codificante per la principale proteina di rivestimento MI3. La proteina pVIII ricombinante espressa sulla superficie dei fagi contiene inserti nonapeptidici fiancheggiati da due residui di cisteina. Tre fagi in grado di legare mAB 35 biotinilato sono stati isolati con tre cicli di "biopanning" (Parmley e Smith, opera citata), utilizzando concentrazioni di anticorpo biotinilato di 1000, 10 e 1 nM rispettivamente. L'amplificazione, la propagazione e la purificazione dei fagi sono state eseguite come descritto da Felici ed al. (opera citata). I suddetti fagi non legano la variante non biotinilata dell'anticorpo (vedi esempio 2, figura 1). Essi presentano i seguenti inserti peptidici all'interno della proteina pVIII :
SEQ.ID.NO.5 (fago numero 1);
SEQ.ID.NO.6 (fago numero 2); e
SEQ.ID.NO.7 (fago numero 3).
Le sequenze indicate sono codificate da sequenze nucleotidiche inserite nel vettore plasmidico di espressione pC89, contenente il gene di pVIII, dal sito di riconoscimento per l'enzima di restrizione EcoRI a quello per BamHI.
Esempio 2
Uso dei faqi selezionati immobilizzati su fase solida per il legame di molecole biotinilate Piastre in polistirene a 96 pozzetti (Probind, Falcon) sono state ricoperte con 4 x 10?*?^ particelle fagiche purificate in cloruro di cesio, diluite in 35 ?? di TBS e lasciate durante la notte a 4?C. I pozzetti sono stati quindi lavati con la seguente soluzione: TBS con latte secco non-grasso a 5% e con Tween 20 allo 0,05% (soluzione A), quindi incubati con la soluzione A per 90' a temperatura ambiente e lavati tre volte con TBS contenente Tween 20 allo 0,5% (v/v) (TBS-Tween). Gli anticorpi o le proteine biotinilate da esaminare, diluite in 50 ?? di Triton X-100 allo 0,5% (v/v), BSA 1 mg/ml in PBS, vengono aggiunti nei pozzetti e lasciati ad incubare durante la notte a 4?C. Dopo 5 lavaggi con TBS-Tween, i pozzetti vengono incubati 4 ore a 4?C con 50 ?? di TBS contenente BSA 1 mg/ml e, oppure avidina coniugata a fosfatasi alcalina (Jackson Immunoresearch Labs), 1:1000 (v/v), per rilevare proteine biotinilate, o un anticorpo diretto contro IgG di ratto coniugato a fosfatasi alcalina (Calbiochem), 1:1000 (v/v), per rilevare mAb 35. I pozzetti vengono quindi lavati 5 volte con TBS-Tween e sviluppati a 37?C con p-nitrofenilfosfato 1 mg/ml in idrocloruro di dietanolammina 1M, pH 9,8. L 'assorbenza a 405 nm viene determinata con un lettore per micropiastre Biorad.
I tre fagi come da esempio 1, sono in grado di legare mAb 35 (1 nM), solo nella sua forma biotinilata. Essi sono capaci inoltre di legare t^iroglobulina biotinilata (1 nM), albumina serica bovina biotinilata (10 nM), e IgG umane biotinilate (1 nM) come mostrato nella figura 1.
Esempio 3
Uso dei fagi selezionati per il rilevamento di molecole biotinilate immobilizzate su fase solida Piastre di polistirene a 96 pozzetti vengono ricoperte con proteine biotinilate diluite in bicarbonato di sodio 50 mM, pH 9,5. A seguito di lavaggi e incubazioni con la soluzione A, come da esempio 2, i pozzetti vengono incubati una notte a 4?C con i fagi diluiti in 50 ?? di Triton X-100 (v/v), BSA 1 mg/ml in PBS. I pozzetti vengono quindi lavati 5 volte con TBS-Tween, ed incubati 2 ore a 4?C con 100 ?? di antisiero policlonale diretto contro il fago M13, diluito nella soluzione A. Dopo 5 lavaggi, come sopra, i pozzetti vengono incubati 2 ore a 4?C con anticorpi di capra diretti contro IgG di coniglio coniugati con fosfatasi alcalina (Calbiochem), diluiti nella soluzione A. Lavaggi e sviluppo dei pozzetti vengono quindi eseguiti come descritto nell'esempio 2.
I tre fagi leganti la biotina (numero 1, 2 e 3) sono stati usati per il rilevamento di: mAb 35 biotinilato (10 ng), IgG umane biotinilate (5 ng), tiroglobulina bovina biotinilata (5 ng) , un anticorpo di capra diretto contro IgG di ratto biotinilato (100 ng) e BSA biotinilata (100 ng), come mostrato nella figura 2. I suddetti fagi non legano le stesse proteine non biotinilate.
Esempio 4
Uso dei fagi selezionati per il rilevamento di proteine immobilizzate su fase solida tramite un ligando biotinilato
Piastre in polistirene a 96 pozzetti sono state ricoperte, come descritto nell'esempio 3, con 130 ng di antisiero di capra diretto con IgG umane (Calbiochem) o con 20 ng di recettore per 1 'acetilcolina di torpedine purificato per affinit? {dono della Unit? de Neurobiologie Mol?culaire, Instituto Pasteur, Parigi). A seguito di lavaggi e incubazione nella soluzione A, come da esempio 3, i pozzetti contenenti anti-IgG umane sono stati incubati 2 ore, a temperatura ambiente, con IgG umane biotinilate o non biotinilate 1 nM; quelli contenenti il recettore sono stati invece incubati con mAb 35 biotinilato 1 nM. Dopo cinque lavaggi con TBS-Tween, i pozzetti sono stati incubati 2 ore, a temperatura ambiente, con il fago n. 1 (come da esempio 1) alla concentrazione di 2 x 1019 particelle/ml soluzione A. Lavaggi e rilevamento del fago sono stati eseguiti come da esempio 3. Come mostrato nella figura 3, il fago numero 1 pu? essere utilizzato per il rilevamento di proteine immobilizzate su fase solida usando come tramite un ligando biotinilato. Il fago n. 1 non ? in grado di rilevare le proteine immobilizzate, quando viene usato come tramite lo stesso ligando non biotinilato .
Esempio 5
Dimostrazione della capacit? del peptide con sequenza SEQ.XD.NQ.8 di legare la biotina Piastre di polistirene a 96 pozzetti sono state ricoperte con 20 ng di BSA biotinilata in bicarbonato di sodio 50 mM, pH 9,6. I pozzetti vengono lavati 5 volte con PBS ed incubati 1 ora a temperatura ambiente con BSA 3 mg/mi in PBS. Questi sono stati quindi preincubati 1 ora a temperatura ambiente con 40 ?? di Hepes 0,2 M, NaCl 2 M, BSA 1 mg/ml, pH 7, in presenza od assenza del peptide con sequenza SEQ.ID.N0.8. Vengono quindi aggiunti ai pozzetti 10 ?? della stessa soluzione contenenti 8 fmoli (40000 cpm) di [ ]streptavidina (Amersham) ; l'incubazione viene effettuata per una notte a 4?C. Dopo 5 lavaggi con PBS, la [l^ IJstrepavidina legata viene solubilizzata per aggiunta di NaOH 0,2 N, SDS 1% e quindi contata in un contatore di radiazione
Come mostrato nella figura 4, il peptide in questione ? in grado di inibire il legame della streptavidina marcata al composto biotinilato con una ICgQ di 50 ??.
LISTA DI SEQUENZE
INFORMAZIONI GENERALI
(i) DEPOSITANTE: ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE P. ANGELETTI S.p.A. (ii) TITOLO DELL'INVENZIONE: METODOLOGIA PER
LA PRODUZIONE DI FAGI FILAMENTOSI CHE
ESPONGONO SULLA SUPERFICIE DEL CAPSIDE
PEPTIDI CAPACI DI LEGARE LA<'>BIOTINA; E
FAGI FILAMENTOSI E PEPTIDI COSI' OTTENIBILI (iii) NUMERO DELLE SEQUENZE: 8
(iv) INDIRIZZO DI CORRISPONDENZA:
(A) DESTINATARIO: Societ? Italiana Brevetti (B) UBICAZIONE: Piazza di Pietra, 39
(C) CITTA': Roma
(D) PAESE: Italia
(E) CAP: 00186
(viii) INFORMAZIONI SUL CONSULENTE BREVETTUALE (A) NOME: DI CERBO, Mario (Dr)
(B) NUMERO DI REGISTRAZIONE ORDINE: 455
(C) RIFERIMENTO: RM/O 90041/MDC
(IX) INFORMAZIONI PER TELECOMUNICAZIONI
(A) TELEFONO: 06/6785941
(B) TELEFAX: 06/679492
(C) TELEX: 612287 ROPAT
(1) INFORMAZIONI SULLA-SEQ.ID.NO.:1
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 45 paia di basi
(B) TIPO: nucleotidica
(C) NUMERO CATENE: singola
(D) CONFIGURAZIONE: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA : DNA
(iii) IPOTETICA : no
(iv) ANTISENSO : no
(v) TIPO DI FRAMMENTO: interno
(vii) FONTE IMMEDIATA
(A) SINTESI: sintesi a partire da nucleotidi (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:
(A) NOME: oligonucleotide
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ.ID.NO.il GAATTCTGCN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNTGCG GGGAT 45 in cui N pu? essere qualsiasi nucleotide
(2) INFORMAZIONI SULLA SEQ.ID.NO.: 2
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 6 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO CATENE: singola
(D) CONFIGURAZIONE: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina ricombinante (iii) IPOTETICA: s?
(V) TIPO DI FRAMMENTO: interno
(vii) FONTE IMMEDIATA
(A) LIBRERIA: di peptidi ricombinanti su fago (B) clone: fagico
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: peptide
(B) METODO DI IDENTIFICAZIONE: selezione con proteina biotinilata
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ.ID.NO.: 2 Trp Xxx Pro Pro Phe Yyy
1 5
in cui Xxx ? un qualsiasi amminoacido che non pregiudica la capacit? di legare la biotina; e Yyy ? Lys oppure Arg
(3) INFORMAZIONI SULLA SEQ.ID.NO.: 3
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 11 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO CATENE: singola
(D) CONFIGURAZIONE: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina ricombinante
(iii) IPOTETICA: s?
(v) TIPO DI FRAMMENTO: interno
(vii) FONTE IMMEDIATA
(A) LIBRERIA: di peptidi ricombinanti su fago (B) CLONE: fagico
(ix),CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: peptide
(B) METODO DI IDENTIFICAZIONE: selezione con proteina biotinilata
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ.ID.NO.: 3 Cys Xxx Trp Xxx Pro Pro Phe Yyy Xxx Xxx Cys
1 5 10
in cui Xxx ? un qualsiasi amminoacido che non pregiudica la capacit? di legare la biotina; e
Yyy ? Lys oppure Arg
(4) INFORMAZIONI SULLA SEQ.ID.NO.: 4
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 14 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO CATENE: singola
(D) CONFIGURAZIONE: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina ricombinante (iii) IPOTETICA: s?
(v) TIPO DI FRAMMENTO: interno
(vii) FONTE IMMEDIATA
(A) LIBRERIA: di peptidi ricombinanti su fago (B) CLONE: fagico
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: peptide
(B) METODO DI IDENTIFICAZIONE: selezione con proteina biotinilata
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQ.ID.NO.: 4
Giu Phe Cys Xxx Trp Xxx Pro Pro Phe Yyy Xxx Xxx Cys Gly 1 5 10
in cui Xxx ? un qualsiasi amminoacido che non pregiudica la capacit? di legare la biotina; e
Yyy ? Lys oppure Arg
(5) INFORMAZIONI SULLA SEQ.ID.NO.: 5
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 14 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO CATENE: singola
(D) CONFIGURAZIONE: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina ricombinante (iii) IPOTETICA: s?
(v) TIPO DI FRAMMENTO: interno
(vi) FONTE IMMEDIATA
(A) LIBRERIA: di peptidi ricombinanti su fago (B) CLONE: fagico
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: peptide
(B) METODO DI IDENTIFICAZIONE: selezione con proteina biotinilata
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ.ID.NO.: 5
(6) INFORMAZIONI SULLA SEQ.ID.NO.: 6
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 11 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO CATENE: singola
(D) CONFIGURAZIONE: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina ricombinante
(iii ) IPOTETICA: s?
(v) TIPO DI FRAMMENTO: interno
(vii) FONTE IMMEDIATA
(A) LIBRERIA: di peptidi ricombinanti su fago (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: peptide
(C) METODO DI IDENTIFICAZIONE : selezione con proteina biotinilata
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ.ID.NO.: 6 Giu Phe Cys Asn Trp Thr Pro Pro Phe Lys Thr Arg Cys Gly 1 5 10
(7) INFORMAZIONI SULLA SEQ.ID.NO.: 7
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 14 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO DI CATENE: singola
(D) CONFIGURAZIONE: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina ricombinante
(iii) IPOTETICA: s?
(v) TIPO DI FRAMMENTO: interno
(vii) FONTE IMMEDIATA
(A) LIBRERIA: di peptidi ricombinanti su fago (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: peptide
(C) METODO DI IDENTIFICAZIONE: selezione con proteina biotinilata
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ.ID.NO.: 7 Giu Phe Cys Ser Trp Arg Pro Pro Phe Arg Ala Val Cys Gly 1 5 10
(8) INFORMAZIONI SULLA SEQ.ID.NO.: 8
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 21 amminoacidi
(B) TIPO: amminoacidica
(C) NUMERO CATENE: singola
(D) CONFIGURAZIONE: lineare
(ii ) TIPO DI MOLECOLA: peptide sintetico
(iii) IPOTETICA: s?
(v) TIPO DI FRAMMENTO: interno
(vii) FONTE IMMEDIATA
(A) LIBRERIA: di peptidi ricombinanti su fago (ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI
(A) NOME: peptide
(C) METODO DI IDENTIFICAZIONE:

Claims (5)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodologia per l'isolamento di fagi filamentosi capaci di legare la biotina, caratterizzata essenzialmente dalle seguenti operazioni : - biotinilazione di una proteina usata per lo screening di una libreria fagica in cui vengono espressi sulla superficie del capside oligopeptidi codificati da inserti oligonucleotidi a sequenza casuale, introdotti in un gene codificante per il capside fagico con tecniche di manipolazione genetica ; - screening della libreria di cui sopra con la proteina biotinilata; e - isolamento di fagi capaci di legare la biotina .
  2. 2. Metodologia per l'isolamento di fagi filamentosi capaci di legare la biotina come da rivendicazione 1, in cui il gene codificante per il capside fagico, con inserti oligonuleot idici a sequenza casuale, ? il gene che codifica per la proteina pVIII oppure per la proteina pili del capside fagico.
  3. 3. Metodologia per l'isolamento di fagi filamentosi capaci di legare la biotina come da rivendicazione 1 o 2, in cui gli oligonucleotidi a sequenza casuale sono inseriti nel gene codificante per la proteina pVIII, usando come vettore di espressione il plasmide pC89, dal sito di riconoscimento per l'enzima di restrizione EcoRI a quello per l'enzima di restrizione BamHI.
  4. 4. Metodologia per l'isolamento di fagi filamentosi capaci di legare la biotina come da rivendicazione 3, in cui gli oligonucleotidi inseriti hanno la sequenza SEQ.ID.NO. 1. 5. Fagi filamentosi, caratterizzati dal fatto che espongono sulla superficie del capside oligopeptidi che conferiscono al fago la capacit? di legare la biotina e dal fatto che sono ottenibili con la metodologia secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4. 6. Fagi filamentosi come rivendicazione 5, in cui il peptide inserito nella proteina del capside fagico, che conferisce la capacit? di legare la biotina, comprende la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO. 2. 7. Fagi filamentosi come da rivendicazione 6, in cui il peptide che conferisce al fago la capacit? di legare la biotina ? inserito nella proteina pVIII. 8. Fagi filamentosi come da rivendicazione 7, in cui la proteina ricombinante pVIII comprende la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO.3. 9. Fagi filamentosi come da rivendicazione 8, in cui la proteina ricombinante matura pVIII comprende, fra 1'amminoacido n.3 (Gly) e 1'amminoacido n.5 (Asp), la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO. 4. 10. Fagi filamentosi come da rivendicazione 9, in cui la proteina ricombinante comprende una sequenza amminoacidica scelta dal gruppo comprendente SEQ.ID.NO. 5, SEQ. ID.NO.6 e SEQ.ID.NO. 7. 11. Peptidi capaci di legare la biotina, che comprendono la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO.2. 12. Peptidi come da rivendicazione 11, che comprendono la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO.3. 13. Peptidi come da rivendicazione 12, che comprendono la sequenza amminoacidica SEQ.ID.NO.4. 14. Peptidi come da rivendicazione 13, che comprendono una sequenza scelta dal gruppo comprendente le sequenze amminoacidiche SEQ.ID.NO.
  5. 5, SEQ.ID.NO.6 e SEQ.ID.NO.7. 15. Peptide come da rivendicazione 14, in cui la sequenza amminoacidica che comprende la sequenza SEQ.ID.NO. 5 consiste nella sequenza amminoacidica SEQ. ID.NO.8. 16. Uso dei fagi filamentosi, come da rivendicazioni da 5 a 10, per il rilevamento di molecole biotinilate in tecniche scelte ad esempio dal gruppo comprendente ELISA, Western, Southern e Northern blotting, istochimica e saggi di legame a recettori . 17. Uso dei fagi filamentosi, come da rivendicazioni da 5 a 10, per la purificazione di molecole biotinilate. 18. Uso dei peptidi, come da rivendicazioni da 11 a 15, per il rilevamento di molecole biotinilate in tecniche scelte ad esempio dal gruppo comprendente: ELISA, Western, Southern e Northen blotting, istochimica e saggi di legame a recettori . 19. Uso dei peptidi, come da rivendicazioni da 11 a 15 per la purificazione di moleci biotinilate
ITRM930361A 1993-06-01 1993-06-01 Metodologia per la produzione di fagi filamentosi che espongono sulla superficie del capside peptidi capaci di legare la biotina, e fagi filamentosi e peptidi cosi' ottenibili. IT1261693B (it)

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