ITRM20110648A1 - Materiali elettroattivi per applicazioni biomediche - Google Patents

Description

Descrizione dell’invenzione avente per titolo: Materiali elettroattivi per applicazioni biomediche

Settore tecnico

La presente invenzione si riferisce al settore della medicina, in particolare al settore della rigenerazione ossea guidata per mezzo di matrici di dimensione micrometrica o nanometrica, più in particolare alla rigenerazione ossea localizzata per mezzo di elettrostimolazione. La presente invenzione si riferisce a materiali compositi biocompatibili utili con duplice ruolo sia come ausili sia come sostitutivi nella rigenerazione del tessuto osseo. La presente invenzione trova particolare applicazione nelle patologie a carico del sistema scheletrico, ivi comprese le articolazioni.

La presente invenzione si applica anche al settore della medicina rigenerativa. In particolare a carico del tessuto osseo e/o dei tessuti articolari.

Sfondo dell’invenzione

Le patologie del tessuto osseo sono di diversa natura, sia di tipo cronico, ad esempio l’osteoporosi, sia di tipo acuto, ad esempio traumi di diversa intensità fino alla frattura. Allo stesso modo, il tessuto cartilagineo soffre di patologie croniche, del tipo infiammatorio e degenerativo, o acute, ad esempio traumi di varia natura.

Lo scopo à ̈ di riparare il tessuto o per lo meno ridurre o attenuare la sua degenerazione. È noto da molto tempo che la stimolazione elettrica può accelerare la guarigione dell’osso e del tessuto connettivo (US2008/0039901 A1 J.W. Kronberg, S.L. Gordon, T. Ganey, R. J. Fitzsimmons), ed à ̈ stato studiato il tipo di stimolazione elettrica adatto allo scopo (Shijun Shao, Shaobing Zhou, Long Li, Jinrong Li, Chao Luo, Jianxin Wang, Xiaohong Li, Jie Weng. Biomaterials 32 (2011) 2821-2833; K. Yonemori, S. Matsunaga, Y. Ishidou, S. Maeda, H. Yoshida. Bone 19 (1996) 173-180; Hans-Peter Wiesmann, Mareke Hartig, Udo Stratmann, Ulrich Meyer, Ulrich Joos. Biochimica et Biophysica Acta 1538 (2001) 28-37; In Sook Kim, Jong Keun Song, Yu Lian Zhang, Tae Hyung Lee, Tae Hyung Cho, Yun Mi Song, Do Kyun Kim, Sung June Kim, Soon Jung Hwang. Biochimica et Biophysica Acta 1763 (2006) 907– 916).

Sono noti diversi materiali naturali, sintetici o semisintetici che svolgono una importante funzione nella rigenerazione osteoarticolare, tra i quali una categoria particolarmente studiata à ̈ quella dei materiali osteointegrabili biomimetici. Uno dei materiali più usati à ̈ la idrossiapatite, la quale tuttavia non ha una bioattività specifica e quindi, non interagisce con le cellule. Per ovviare a tale ostacolo, à ̈ stata proposta una idrossiapatite in forma di nanoparticelle decorata con un monosaccaride (α-propargyl glucoside) (L. Russo, E. Landi, A. Tampieri, A. Natalello, S.M. Doglia, L. Gabrielli, L. Cipolla, F. Nicotra. Carbohydrate Research 346 (2011) 1564-1568). Un ulteriore miglioramento à ̈ dato da uno scaffold a base di idrossiapatite sostituita con lo stronzio (E. Landi, A. Tampieri, G. Celotti, S. Sprio, M. Sandri, G. Logroscino. Acta Biomaterialia 3 (2007) 961-969).

Un altro interessante materiale osteointegrabile à ̈ il “biovetro†(T.J. Brunner, R.N. Grass, W. J. Stark. Chem. Commun. (2006) 1384–1386), vetro composto da SiO2, Na2O, CaO e P2O5in diverse proporzioni. I biovetri mostrano eccellente osteoconduttività, bioattività e biodegradabilità controllata; tuttavia, hanno proprietà meccaniche inferiori alle apatiti e alle apatiti sostituite (Qizhi Z. Chen, Ian D. Thompson, Aldo R. Boccaccini. Biomaterials 27 (2006) 2414–2425).

Lo stato dell’arte ha prodotto numerosi materiali atti alla elettrostimolazione, tra cui i polimeri organici elettroconduttori (N.K. Guimard, N. Gómez, C.E. Schmidt. Progress in Polymer Science 32 (2007) 876-921).

Il polipirrolo trova una ampia serie di applicazioni, si veda ad esempio A. RamanaviÄ ius, A. KauÅ¡aite, A. RamanaviÄ iené. Sensors and Actuators B 111-112 (2005) 532-539, per quanto riguarda i biosensori e A. RamanaviÄ iené, W. Schuhmann, A. RamanaviÄ ius. Coll. Surf. B. Biointerf.48 (2006) 159-166 anche per le applicazioni in immunodiagnostica.

Il polipirrolo, similmente ad altri polimeri elettroconduttori, si ottiene dalla ossidazione del monomero in mezzo acquoso o organico. L’ossidazione del pirrolo avviene grazie l’impiego di un segnale elettrico (elettropolimerizzazione) o di un agente ossidante (polimerizzazione chimica). L’ossidazione crea una catena di polipirrolo policationica la cui carica à ̈ compensata dagli anioni (specie droganti) presenti in soluzione. Nella polimerizzazione chimica, la natura dell’agente ossidante e la sua concentrazione nella soluzione di sintesi giocano un ruolo chiave nella morfologia del polimero ottenuto, rugosa e porosa oppure liscia e compatta come dimostrato dalle analisi realizzate con il microscopio elettronico a scansione e/o microscopio a forza atomica (Jong Hyeok Park, Byung-Woo Kim, YoungChang Nho. Electrochemical and Solid-State Letters 11 (2008) A68-A71; S.K. Saha, Y.K. Su, C.L. Lin, D.W. Jaw. Nanotechnology 15 (2004) 66-69). Gli agenti ossidanti comunemente usati per il pirrolo sono a base di Fe<3+>, ad esempio tricloruro di ferro (FeCl3), perclorato di ferro (Fe(ClO4)3. Alternativamente si possono usare agenti ossidanti a base di anioni come persolfato, permanganato o dicromato, ad esempio ammonio persolfato ((NH4)2S2O8), sodio persolfato (Na2S2O8), sodio dicromato Na2Cr2O7. Un valido agente ossidante à ̈ anche il perossido di idrogeno (H2O2). Questi agenti ossidanti sono caratterizzati da un elevato potenziale standard di riduzione riportato in Tabella 1. Gli agenti ossidanti sono in grado di controllare la cinetica del processo di polimerizzazione e di conseguenza la morfologia dei campioni a base di polipirrolo ottenuti. Ad esempio il (NH4)2S2O8e perossido di idrogeno inducono un processo veloce di polimerizzazione e di conseguenza i polimeri ottenuti mostrano una morfologia rugosa e ampia porosità. Al contrario, FeCl3,agente ossidante con un basso potenziale di riduzione favorisce la formazione di film con morfologia ordinata e caratterizzata da superficie lisce e compatte.

Tabella 1. Potenziale di riduzione (rispetto l’elettrodo normale di idrogeno, vs NHE) dei principali agenti ossidanti per il pirrolo (Handbook of Chemistry and Physics, 63rd edition, Editor R.C. Weast. CRC Press Inc., Florida, 1984)

Agente ossidante Coppia redox Potenziale di riduzione (V, vs NHE)

(NH4)2S2O8S2O8<2->/SO4<2->2,0

H2O2H2O2/H2O 1,776

Na2Cr2O7(Cr2O7)<2->/Cr<3+>1,33

FeCl3Fe<3+>/Fe<2+>0,770

Altri fattori che influiscono sulle proprietà chimiche, chimico-fisiche e morfologiche dei polimeri elettroconduttori sono la temperatura di sintesi, il tempo di polimerizzazione, la natura chimica e la concentrazione della specie drogante, la natura del solvente ed eventuale presenza di tensioattivi (Chandrasekaran Saravanan, Srinivasan Palaniappan, Fréderic Chandezon. Materials Letters 62 (2008) 882-885; Meng-Yi Bai, Younan Xia. Macromolecular Rapid Communications 31 (2010) 1863-1868).

Un sistema transdermico di rilascio di farmaci à ̈ descritto in WO02/13671, a nome Pharmacia Corporation e University of Florida. Uno degli elementi essenziali à ̈ costituita dal polipirrolo che à ̈ in grado di rilasciare un farmaco (agente drogante) in seguito ad uno stimolo elettrico esterno.

La domanda di brevetto US20040131651, a nome S. Panero, G. Abbati, D. Renier, V. Crescenzi, descrive biomateriali compositi costituiti da acido ialuronico e suoi derivati in combinazione con polimeri elettroconduttivi. Tali compositi sono a base di polipirrolo e acido ialuronico o suoi derivati sotto forma di membrane, tessuti, garze, canali guida o spugne. Tali sistemi sono proposti per la rigenerazione di tessuto nervoso e osseo.

Il brevetto US 6.602.932, a nome North Carolina State University, descrive in termini molto generici un sistema di nanoparticelle rivestite da un guscio polimerico all’interno del quale posso essere caricati proteine e/o peptidi. Tra le varie possibilità, la nanoparticella ha un guscio di polipirrolo, mentre la menzione del principio attivo rimane molto generica. Il brevetto fornisce anche esempi di nanoparticelle di oro rivestite da polipirrolo, provate con test di rilascio di agenti coloranti o qualche enzima secondo modelli semplici.

La ricerca di materiali per la integrazione e sostituzione ossea ha portato a molte soluzioni.

Nanoparticelle di polimeri biocompatibili, in particolare il poli(DL-lattide-co-glicolide) sono state funzionalizzate con eparina per adsorbimento fisico e combinate con un gel di fibrina utile per la loro veicolazione. Il complesso à ̈ stato poi caricato con BMP-2 (Bone Morphogenetic Protein-2), rivelandosi un promettente candidato come matrice di rigenerazione ossea (Y.-I. Chung, K.-M. Ahn, S.-H. Jeon, S.-Y. Lee, J.-H. Lee, G. Tae, J. Controlled Release 121 (2007) 91–99).

Un altro sistema osteointegrabile e biodegradabile à ̈ riportato nei brevetti US20070248675 e US20070053870, a nome Gwangju Institute of Science and Technology, che descrivono un composito nanoparticella-proteina-idrogel. La matrice comprende una nanoparticella a base di un polimero biodegradabile, un glicosaminoglicano fisiadsorbito, una proteina (fattore di crescita) che interagisce con il glicosaminoglicano grazie alle interazioni elettrostatiche tra gruppi carichi e legami di idrogeno tra gruppi polari; e infine una matrice di idrogel che ne aumenta la bioaffinità. Questo composto funziona da sistema di rilascio controllato della proteina a seconda della natura e concentrazione del glicosaminoglicano.

Una interessante combinazione tra il polipirrolo, polimero conduttore utilizzato nella elettrostimolazione ossea, e i glicosaminoglicani, molecole importanti nella fisiologia della matrice extracellulare, à ̈ descritta in J. Serra Moreno, S. Panero, M. Artico, P. Filippini, Bioelectrochemistry 72 (2008) 3–9. In questo lavoro à ̈ descritta la preparazione di un film costituito da polipirrolo drogato con condroitina solfato A, che presenta una buona risposta a test di adesione cellulare in vitro effettuato su colture di fibroblasti di polmone umano. Tali film sono stati ulteriormente studiati con una più ampia varietà di polisaccaridi, studiandone la loro funzione come substrati per la crescita di osteoblasti (J. Serra Moreno, S. Panero, S. Materazzi, A. Martinelli, M. G. Sabbieti, D. Agas, G. Materazzi, J. Biomed. Mater. Res. 88A (2009) 832–840).

In un settore tecnico completamente diverso da quello cui si riferisce la presente invenzione, la domanda US2003022574, a nome The Procter & Gamble Company, descrive un sistema deodorizzante comprendete silice reticolata con chitosano, altri aminopolisaccaridi, dove l’agente reticolante à ̈ un acido multibasico.

È noto che i glicosaminoglicani, a cui appartengono eparina, acido ialuronico e condroitina solfato A, svolgono un importante ruolo nel trattenere il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-2) e il BMP-2, biomolecole di primaria importanza per lo sviluppo ed il rimodellamento dell’osso (Y.-I. Chung, K.-M. Ahn, S.-H. Jeon, S.-Y. Lee, J.-H. Lee, G. Tae, J. Controlled Release 121 (2007) 91–99).

È noto che l’eparina svolge un importante ruolo fisiologico nella matrice extracellulare (Extracellular Matrix o ECM) (M. O. Pentikäinen, K. Öörni, P. T. Kovanen. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21 (2001) 1902-1908). La matrice extracellulare à ̈ un importante substrato in grado di accumulare e trattenere le varie proteine di cui sopra (BMP-2, FGF-2) e di renderle disponili, secondo necessità, a seguito di stimoli extracellulari o derivanti dalla matrice stessa. In quest’ultimo caso i filamenti actina degli osteoblasti interagendo con l’integrina- proteina di giunzione cellula-matrice- inducono una modificazione della matrice ed il conseguente rilascio delle proteine in questione. Inoltre, l’eparina ha un ruolo antinfiammatorio come ben riportato da Edward Young in Thrombosis Research 122 (2008) 743–752.

Pertanto, Ã ̈ necessario fornire al soggetto che soffre di una patologia del tessuto osseo, compresi traumi e fratture, un utile sistema per il trattamento di tale patologia. La somministrazione potrebbe avvenire per via sistemica, o direttamente tramite iniezione in situ o per via transdermica. Il rilascio del principio attivo potrebbe essere consentito da una variazione del pH o temperatura tenendo conto che spesso, a seguito di un processo infiammatorio, si verifica un aumento della temperatura locale dovuto all'aumentata vascolarizzazione e diminuzione del pH per formazione dell'essudato che ha un pH acido per la presenza di acido lattico.

In particolare, può essere necessario fornire un sistema osteointegrabile che garantisca la somministrazione di uno o più glicosaminoglicani, che interagendo con i fattori di crescita endogeni dell’osso e della cartilagine, svolgano un ruolo importante nel rimodellamento dell’osso.

Più in particolare, à ̈ necessario fornire una matrice che consenta di prolungare la biodisponibilità del glicosaminoglicano, diminuendo o evitando in modo sostanziale la sua completa degradazione.

Attualmente la medicina rigenerativa trova delle problematiche ancora da risolvere. I principali sono di seguito descritti:

a) Uso di trapianto autologo.

b) Fenomeni di rigetto legato alla incompatibilità nel trapianto eterologo

c) Limitata efficacia dei substrati convenzionali nel risolvere serie lesioni ossee derivanti da processi cancerogeni, osteoporosi o nel caso di età avanzata del paziente.

d) Limitata adattabilità (versatilità) dei dispositivi di mercato ad essere utilizzati per il riempimento di ossa lese.

e) Necessità di strutture ospedaliere per ricorrere a trattamenti invasivi

Questi problemi non sono ancora stati completamente risolti dallo stato dell’arte.

È stato ora trovato che ricoprendo con un polimero elettroconduttore farmaceuticamente accettabile una particella di un materiale ceramico osteointegrabile, sulla quale à ̈ legato covalentemente un glicosaminoglicano, si risolvono alcune delle problematiche sopra menzionate.

La presente invenzione risolve numerosi problemi tecnici che possono essere così riassunti: a) L’invenzione non si basa sulle caratteristiche e proprietà dei singoli materiali ma sulla possibilità di una loro combinazione che consente di preparare una matrice semisintetica, funzionalizzata, composita, microstrutturata ed elettroconduttrice la quale può essere opportunamente dotata di proprietà biologiche.

b) Ricopertura diretta delle particelle con un ulteriore strato a base di un polimero elettroconduttore, ricopertura che può essere condotta attraverso una sintesi mirata (chimica o enzimatica). La ricopertura rappresenta un punto fondamentale poichà ̈ assicura il rallentamento del turnover delle molecole di interesse mediante la protezione in superficie del carrier con un ulteriore film poroso e stabile in ambienti aggressivi.

c) Possibilità di immobilizzare una seconda molecola bioattiva (glicosaminoglicano o profarmaco) nella superficie protettiva.

d) Proprietà elettroconduttrici impartite dal polimero elettroconduttore impiegato come film protettivo aderente alla superficie delle particelle, capace di rispondere a stimolazioni elettriche o magnetiche esogene ed interagire con l’ambiente.

e) L’azione combinata tra i componenti inorganici, organici e biologici conferisce una ottima biocompatibilità e osteointegrazione della matrice e quindi, assicura un’eccellente risposta cellulare.

f) La natura microstrutturata dei costituenti permette versatilità di disegno costruttivo, riproducibilità di fabbricazione, standardizzazione del processo sintetico e uso di idonee materie prime di qualità e a basso costo.

g) La matrice con finalità terapeutiche può essere somministrata ai pazienti in regime di day-hospital.

h) La matrice à ̈ in grado di agire per la riparazione di lesioni ossee critiche (trattamento mirato alla cura di particolari patologie ad esempio tumore del tessuto osseo)

i) Il materiale può essere adattato a trattamenti mirati

Oggetto dell’invenzione

Pertanto, à ̈ un oggetto della presente invenzione una particella comprendente un nucleo di specifico materiale ceramico osteoinduttivo (inteso come: materiale capace di stimolare lo sviluppo di cellule responsabili della formazione dell’osso a partire da cellule primitive, nondifferenziate e pluripotenti) e osteointegrabile (inteso come: materiale che facilita una connessione strutturale diretta e funzionale, di estensione inferiore a 100 µm, tra l’osso vivo e la superficie dell’impianto senza tessuto connettivo apparente) legato covalentemente con un primo glicosaminoglicano, caratterizzata dal fatto che detta particella comprende ulteriormente un film superficiale poroso e stabile in ambienti aggressivi di un polimero elettroconduttore farmacologicamente accettabile. La porosità del film, micro- e macrometrica, dipende dal percorso di sintesi impiegato.

Il film polimerico esterno conferisce all’invenzione l’ulteriore punto di interesse. Infatti, il film di polimero elettroconduttore ha una porosità modulabile a seconda dall’agente ossidante impiegato nella sintesi. Di conseguenza, à ̈ possibile controllare la velocità di rilascio delle molecole farmacologicamente attive. Ad esempio, à ̈ possibile garantire un rapido rilascio di una eventuale specie drogante esterna e uno lento del glicosaminoglicano presente all’interno della particella. Si preferisce il perossido di idrogeno quale agente ossidante perché favorisce la formazione di un film di polipirrolo nano- e microporoso senza indurre processi di degradazione degli altri componenti presenti nella soluzione di sintesi. La microporosità à ̈ facilmente osservabile al microscopio elettronico a scansione.

Il nucleo di materiale ceramico osteoinduttivo comprende materiali noti nel settore ed esemplificati nella seguente Tabella 2.

Tabella 2

Materiali osteointegrabili

Beta-fosfato tricalcico (TCP) Metsger DS, Driskell TD, Paulsrud JR. J Am Dent Assoc.1982 Dec; 105(6):1035-8.

Collagene Xiao JD, Zhu TB, Du JY, Gao L. J Tongji Med Univ.

1987;7(4):214-8, 232

Idrossiapatite (HA) Yamazaki Y. Kokubyo Gakkai Zasshi. 1984 Dec;51(4):735

Idrossiapatite-polimetilmetacrilato Sugino A, Ohtsuki C, Miyazaki T. J Biomater Appl. (HA-PMMA) 2008 Nov;23(3):213-28

Osso bovino inorganico Felice P, Piattelli A, Iezzi G, Degidi M, Marchetti C.

Int J Periodontics Restorative Dent. 2010 Dec;30(6):583-91.

Solfato di calcio Pecora G, Andreana S, Margarone JE 3rd, Covani U, Sottosanti JS. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.1997 Oct;84(4):424-9

Policaprolattone idrossiapatite o beta- Polini A Pisignano D. Parodi M Quarto R. Scaglione fosfato tricalcico S. PLOS ONE October 2011 Volume 6 Issue 10 e262111-8

Idrossiapatite-collagene Yunoki S Sugiura H Ikoma T Kondo E Yasuda K Tanaka J. Biomed Mater. 2011 Feb 6(1):015012. Epub 2011 Jan 18

Legno trattato termicamente Rekola J Aho AJ Gunn J Matinlinna J Hirvonen J Viitaniemi P Vallittu PK. Acta Biomater. 2009 Jun

5(5):1596-604

Madreperla-acido polilattico Liu JB Chen JT. Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao.2002

Mar 22(3):236-8

Idrossiapatite o calcio fosfato Rich J Tuominen J Kylmä J Seppälä J Nazhat SN bibasico-poli(estere-uretano) a base Tanner KE. J Biomed Mater Res.200263(3):346-53 di acido lattico

Organoapatite Hwang JJ Jaeger K Hancock J Stupp SI. J Biomed Mater Res.1999 Dec 1547(4):504-15

TCP-CPLA (copoli-L-lattide) Kikuchi M Tanaka J Koyama Y Takakuda K. J Biomed Mater Res.199948(2):108-10

Ceramica vetrosa apatite-wollastonite Kawanabe K Iida H Matsusue Y Nishimatsu H Kasai R Nakamura T. Acta Orthop Scand. 1998 Jun

69(3):237-42

Organoapatiti Stupp SI Hanson JA Eurell JA Ciegler GW Johnson A. J Biomed Mater Res.1993 Mar 27(3):301-1

Altri materiali sono descritti in WO2002/076522, EP1120122, EP1044694, EP0366029, EP0331071, EP2308519.

È un oggetto della presente invenzione un procedimento per la preparazione di detta particella.

È un oggetto della presente invenzione una particella come quella sopra menzionata che comprende ulteriormente un glicosaminoglicano o un profarmaco immobilizzato elettrostaticamente che agisce da agente drogante per detto film superficiale.

È un oggetto della presente invenzione un procedimento per la preparazione di detta particella.

È un oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente una quantità efficace di dette particelle come principio attivo.

È un oggetto della presente invenzione una matrice, ovvero una fase continua, osteoconduttiva e osteointegrabile comprendente una pluralità di dette particelle.

È un oggetto della presente invenzione detta particella per uso nel trattamento di malattie dell’osso e delle articolazioni. Detta particella à ̈ compresa in una composizione farmaceutica, in una matrice, in un materiale elettroattivo.

Questi e altri oggetti dell’invenzione saranno descritti in dettaglio anche per mezzo di esempi e figure.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Figura 1: Misura DLS di particelle di silice in acqua ottenute dalla sintesi di Stöber.

Figura 2. Spettro di diffrazione ai raggi X della polvere di stronzio-idrossiapatite (Sr-HAP).

Figura 3. Misura DLS della silice funzionalizzata superficialmente con un distanziatore.

Figura 4. Misura DLS relativa al sistema ibrido ceramico-glicosaminoglicano (SiO2/GAG).Figura 5. Grafico della misura DLS della particella completa ceramico-glicosaminoglicanopolimero (SiO2/Hep/PPy-Hep).

Figura 6: Grafico del trattenimento dell’FGF-2 da parte delle particelle SiO2/Hep.

Per gli scopi della presente invenzione, con il termine “particella†si intende una particella di dimensione tale da poter essere somministrata a un animale, in particolare un soggetto umano, e da poter essere formulata in una composizione farmaceutica, oppure di costituire in una pluralità di tali particelle una matrice atta ad essere inoculata nel tessuto osseo o nel tessuto cartilagineo di un soggetto. Detta matrice può anche essere atta a costituire un substrato per la coltivazione e crescita di cellule del tessuto osseo o cartilagineo o precursori di dette cellule.

Per gli scopi della presente invenzione, con il termine “matrice†si intende quanto correntemente compreso dall’esperto del settore. In particolare, si tratta di una pluralità di particelle della presente invenzione disperse in un mezzo continuo fisiologicamente accettabile, quali gli idrogeli usati nella tecnica farmaceutica. A titolo di esempio di matrice, si citano i summenzionati US20070248675 e US20070053870.

Per gli scopi della presente invenzione, con il termine “materiale elettroattivo†, si intende un materiale microstrutturato composito inorganico-organico comprendente la matrice di cui sopra. Detto materiale elettroattivo à ̈ utile come medicamento in una patologia dell’osso o delle articolazioni, in particolare osteoporosi, un processo infiammatorio e un trauma.

In particolare, la particella secondo l’invenzione ha una dimensione al di sotto di 1 micrometro (1 Î1⁄4m). In alcuni contesti, detta particella può essere definita come “particella micrometrica†. La particella (questo termine sarà definito con maggiore precisione di seguito) à ̈ compresa tra qualche decina fino a qualche centinaio di nanometri (nm) e pertanto, in alcuni contesti, detta particella può essere definita come nanoparticella.

Per gli scopi della presente invenzione, con il termine “materiale ceramico osteoinduttivo e osteointegrabile†si intende un materiale solido inorganico non metallico. In particolare un materiale compatibile con gli usi terapeutici previsti nella presente invenzione, non tossico, e che venga accettato, nel senso di non rigettato, dal tessuto osseo o cartilagineo di un soggetto animale, quando messo a contatto con tale tessuto. Il termine “osteoinduttivo†descrive un materiale in grado di stimolare lo sviluppo di cellule responsabili della formazione dell’osso a partire da cellule primitive, non-differenziate e pluripotenti. Il termine “osteointegrabile†si riferisce anche, ma non esclusivamente, al fatto che, per certe realizzazioni dell’invenzione, il materiale ceramico diventa parte integrante del tessuto osseo (definizioni secondo T. Albrektsson, C. Johansson, Eur. Spine J.10 (2001)S96–S101).

Per gli scopi della presente invenzione, con il termine “funzionalizzato†o “funzionalizzata†si intende che un elemento dell’invenzione (ad esempio il nucleo ceramico) presenta uno o più gruppi funzionali chimici, anche diversi tra loro, in grado di formare uno o più legami chimici o di interagire elettrostaticamente con un altro elemento dell’invenzione (ad esempio un glicosaminoglicano). Nel caso della creazione di un legame chimico esso à ̈ descritto esplicitamente come legame covalente. Detto legame può essere stabile o labile e può essere suscettibile di scissione per via chimica o enzimatica tale da romperlo e causare la separazione di detti elementi dell’invenzione. Convenientemente, il nucleo ceramico à ̈ funzionalizzato mediante una catena distanziatrice, come illustrato di seguito.

Per gli scopi della presente invenzione, per “polimero elettroconduttore farmacologicamente accettabile†si intende un polimero biocompatibile con il soggetto animale o con la cellula o il tessuto che viene a contatto con detto polimero, senza indurre fenomeni tossici o sostanzialmente dannosi per detto soggetto o detta cellula, ovvero detto contatto non compromette le funzioni vitali di detto soggetto o detta cellula o detto tessuto. Per “polimero elettroconduttore†si intende un polimero in grado di condurre una corrente elettrica e che immobilizza un glicosaminoglicano o profarmaco (definiti agenti droganti) sfruttando le interazioni elettrostatiche tra le catene polimeriche e detto glicosaminoglicano o profarmaco.

Per gli scopi della presente invenzione, per “principio attivo†si intende un farmaco nel senso comune del termine, in particolare per il trattamento delle patologie che interessano l’osso o l’articolazione.

Per gli scopi della presente invenzione, per “profarmaco†si intende un farmaco come inteso sopra, ma compreso nella particella qui descritta. Il termine profarmaco à ̈ qui inteso come il farmaco compreso nella particella e che sarà rilasciato dalla stessa nel soggetto trattato.

Ove non altrimenti specificato, gli altri termini tecnici usati nella presente invenzione hanno il significato corrente attribuito loro dall’esperto nel settore cui l’invenzione si riferisce.

Le componenti di una articolazione quale (ed in particolare di ) una diartrosi sono: la capsula, la sinovia, la cavità articolare, i legamenti, il periostio, il tessuto osseo sottostante la cartilagine articolare. In sintesi, le articolazioni sono dispositivi giunzionali tra capi ossei interconnessi tramite i tessuti connettivi.

La presente invenzione fornisce un biomateriale microstrutturato di natura composita inorganica-organica, che può essere utilizzato nella cura di patologie ricorrenti nel tessuto osseo, quale osteoporosi, processi infiammatori di varia natura e traumi.

Tale biomateriale, qui anche denominato sistema bioibrido, à ̈ somministrato a un soggetto animale, in particolare un essere umano, in una quantità efficace per espletare l’azione terapeutica. Detta quantità efficace può essere determinata dall’esperto del settore, alla luce della descrizione che segue, mediante normali metodi di sperimentazione preclinica e clinica.

L’elemento fondamentale della presente invenzione à ̈ una particella comprendente un nucleo di materiale ceramico osteointegrabile legato covalentemente con un primo glicosaminoglicano, caratterizzata dal fatto che detta particella comprende ulteriormente un film superficiale di un polimero elettroconduttore farmacologicamente accettabile.

In una sua realizzazione, la particella della presente invenzione à ̈ rappresentata dalla seguente formula

dove C Ã ̈ detto ceramico, L Ã ̈ una catena distanziatrice, G Ã ̈ detto glicosaminoglicano, caratterizzata dal fatto che detta particella comprende ulteriormente un film superficiale di un polimero elettroconduttore farmacologicamente accettabile.

In una sua particolare realizzazione, la particella della presente invenzione à ̈ rappresentata dalla seguente formula

C-Q-L-Q’-G,

dove C, L e G sono come definiti sopra e Q e Q’, uguali o diversi fra loro, sono dei gruppi chimici idrolizzabili, in particolare in vivo. Q e Q’ possono essere gruppi estere, ammidi, anilidi, caratterizzata dal fatto che detta particella comprende ulteriormente un film superficiale di un polimero elettroconduttore farmacologicamente accettabile.

Il materiale ceramico osteointegrabile à ̈ di tipo noto e comprende materiali ceramici in uso in medicina che sono compatibili con il tessuto osseo e/o cartilagineo. Tale materiale à ̈ biocompatibile, non tossico e atto a ricostituire il tessuto osseo e/o cartilagineo.

Detto materiale ceramico à ̈ preferibilmente scelto tra i materiali elencati nella summenzionata Tabella 2, più preferibilmente nel gruppo che consiste di SiO2, TiO2, silice, un’apatite, una idrossiapatite e i loro sostituti (tra i principali sostituti della idrossiapatite vi sono ad esempio, anioni silicati o carbonati che sostituiscono parzialmente gli ioni fosfato; cationi di stronzio o magnesio che sostituiscono parzialmente i cationi di calcio, come ad esempio descritto in WO2007/045954), in particolare stronzio-idrossiapatite; un biovetro ad elevata compatibilità. Tutti questi materiali sono noti nell’arte e non necessitano di ulteriori descrizioni. Solo a mero scopo di informazione, la idrossiapatite e il suo utilizzo nella riparazione del tessuto osseo sono descritti in J. Biomed. Mater. Res. 51 (2000) 491-499, la stronzio-idrossiapatite à ̈ descritta nel summenzionato Acta Biomaterialia 3 (2007) 961-969. Per quanto riguarda i vetri ad elevata compatibilità, noti anche come “biovetri†(si veda ad esempio Qizhi Z. Chen, Ian D. Thompson, Aldo R. Boccaccini. Biomaterials 27 (2006) 2414–2425; Donglu Shi, Biomaterials and Tissue Engineering , Springer, 2004; T.J. Brunner, R.N. Grass, W. J. Stark. Chem. Commun. (2006) 1384–1386)

Secondo la presente invenzione, detta particella à ̈ funzionalizzata con un glicosaminoglicano. Preferibilmente detto glicosaminoglicano à ̈ scelto nel gruppo che consiste di eparina, condroitina solfato A, condroitina solfato B, condroitina solfato C, condroitina solfato D, condroitina solfato E, chitina, chitosano e suoi derivati chimici (derivati tratti dalla modificazione dei gruppi ossidrili in eteri, dei gruppi amminici in ammine secondarie, terziare oppure in gruppi ammidici capaci di legare catene alifatiche lineari o ramificate), e acido ialuronico e suoi derivati (ad esempio i derivati nominati in US20040131651).

La catena distanziatrice (L) à ̈ una catena alchilica di opportuna lunghezza tale per cui il nucleo di ceramico à ̈ funzionalizzato con il glicosamminoglicano. Tipicamente, la catena comprende da 1 a 20 atomi di carbonio, preferibilmente à ̈ lineare e satura. Catene più lunghe possono essere utilizzate. La catena reca alle sue estremità opportuni gruppi funzionali che consentono di creare un legame chimico stabile, preferibilmente covalente, con il nucleo ceramico (C) e il glicosaminoglicano (G). La scelta di questi gruppi rientra nelle conoscenze generali dell’esperto dell’arte e non necessitano di una particolare descrizione. Nel seguito, saranno fornite alcuni esempi di realizzazione dell’invenzione con diverse catene.

Il polimero elettroconduttore farmacologicamente accettabile à ̈ di tipo noto (Tabella 3).

Tabella 3.

Polimeri elettroconduttori e loro applicazione (tratta da N.K. Guimard, N. Gómez, C.E.

Schmidt. Progress in Polymer Science 32 (2007) 876-921)

Applicazione Descrizione della applicazione<Polimeri elettroconduttori>proposti

Polipirrolo (PPy) e derivati Ingegneria Scaffolds biocomaptibile e biodegradabile Polianilina (PANI) Tessutale contenenti stimuli per la rigenerazione di Politiofene (PT) e derivati, tra tessuti cui polietilentiofene (PEDOT)

Elettrodi per Elettrodi impiantabili per la registrazione o

euroni, primariamente nel PPy

neuroni stimulazione di n

cervello PEDOT

Dispositivi contenenti biomolecole come PPy

Biosensori agenti sensibili, integrati con elementi PANI

transduttori PT, PEDOT Rilascio di Dispositivi per l’immagazzinamento e PPy

farmaci rilascio controllato di farmaci PEDOT

PPy

Bioattuatori Dispositivi impiegati come muscoli artificiali PANI

Compositi di Polimeronanotubi di carbonio

Grazie alla particella della presente invenzione, la biodisponibilità del glicosaminoglicano immobilizzato (fisioadsorbito) su di essa si mantiene per oltre tre mesi prima di seguire il naturale processo enzimatico di degradazione. Poiché à ̈ noto che nei sistemi in vivo le molecole biologiche sono fisiologicamente soggette a rapida idrolisi e successiva degradazione delle catene polimeriche, la presente invenzione presenta il vantaggio di rallentare il turnover delle molecole di interesse mediante la protezione in superficie del carrier bioibrido con un ulteriore film elettroconduttore poroso e stabile in ambienti aggressivi, ovvero in presenza di enzimi oppure di pH localmente alterati.

Tra i materiali ceramici secondo la presente invenzione, à ̈ preferita la silice, oppure la stronzio-idrossiapatite, entrambe ottenute da un percorso di sintesi sol-gel che permette il controllo delle dimensioni delle particelle e di modificare la chimica superficiale potenziando la loro bioattività.

Tra i glicosaminoglicani secondo la presente invenzione, sono preferiti l’eparina, la condroitina solfato A e l’acido ialuronico.

Tra i polimeri elettroconduttori secondo la presente invenzione, à ̈ preferito il polipirrolo (PPy), oppure il poli(3,4-etilenediossitiofene). Si utilizza il PPy quale film protettivo perché questo polimero à ̈ facilmente processabile e può essere direttamente deposto sulla superficie delle particelle. Inoltre le caratteristiche morfologiche del polipirrolo (sviluppo superficiale e porosità) possono essere modulate in maniera ottimale attraverso percorsi sintetici opportuni, come ad esempio la sintesi enzimatica (A. RamanaviÄ iené, W. Schuhmann, A. RamanaviÄ ius. Coll. Surf. B. Biointerf. 48 (2006) 159-166) o chimica, che sono in grado di conferire al sistema buone proprietà meccaniche, elevata bioaffinità, resistenza chimica e lenta degradazione. Inoltre le proprietà elettroconduttrici impartite dal PPy, aderente alla superficie delle microsfere, conferiscono al sistema multifasico caratteristiche uniche oltre alla possibilità di interagire e rispondere a stimolazioni elettriche (A. RamanaviÄ ius, A. KauÅ¡aite, A. RamanaviÄ iené. Sensors and Actuators B 111-112 (2005) 532-539) o magnetiche esogene.

Un altro polimero preferito à ̈ il poli(3,4-etilenediossitiofene (PEDOT) (Mohammad Reza Abidian, Dong-Hwan Kim, David C. Martin. Adv Mater.18 (2006) 405-409; Y. H. Xiao, C. M. Li, M.-L. Toh, R. Xue. J. Applied Electrochemistry 38 (2008) 1735-1741)

In un altro aspetto della presente invenzione, che ne costituisce un ulteriore oggetto, Ã ̈ la particella qui descritta, che grazie alla ricopertura polimerica funziona da veicolo per il rilascio controllato di una molecola biologicamente attiva (profarmaco). In tal modo, Ã ̈ possibile esaltare i meccanismi di azione di detto profarmaco in presenza del glicosaminoglicano.

In una realizzazione dell’invenzione, il profarmaco à ̈ utile nel trattamento di patologie del tessuto osseo e/o cartilagineo, ad esempio un farmaco un antiinfiammatorio (ad esempio i farmaci anti-infiammatori non steroidei – FANS - opportunamente in forma anionica), un osteoinducente (ad esempio BMP, fattori di crescita, piastrine) un farmaco antitumorale, in particolare per il trattamento del tumore osseo (bifosfonati, metotressato, si veda anche Holland-Frei Cancer Medicine, Ultima edizione).

In un’altra realizzazione dell’invenzione, detta biomolecola può essere un secondo glicosaminoglicano, che può essere uguale al primo glicosaminoglicano legato covalentemente sulla superficie della particella ceramica, e ricoperto dal polimero elettroattivo. In questa realizzazione, ad esempio nel caso dell’eparina, la particella secondo la presente invenzione funziona da veicolo per il rilascio del glicosaminoglicano con una cinetica complessa: rilascio immediato per il glicosaminoglicano adsorbito (agente drogante) sulla superficie del polimero elettroconduttore e rilascio ritardato per il glicosaminoglicano legato covalentemente sulla superficie della particella.

Numerosi lavori presenti in letteratura confermano il ruolo della stimolazione elettrica nell’indurre la proliferazione, la differenziazione e la citocinesi di cellule in studi condotti in vitro (Sook Kim, Jong Keun Song, Yu Lian Zhang, Tae Hyung Lee, Tae Hyung Cho, Yun Mi Song, Do Kyun Kim, Sung June Kim Soon Jung Hwang. Biochimica et Biophysica Acta 1763 (2006) 907–916). Oltre ai fattori biochimici e, in alcuni casi, alla stimolazione meccanica, la stimolazione elettrica migliora la crescita cellulare perché mima in vivo il comportamento di un microambiente. Nel caso degli osteoblasti migliora la loro proliferazione e l’attività ALP, favorendo i processi di biomineralizzazione (Hans-Peter Wiesmann, Mareke Hartig, Udo Stratmann, Ulrich Meyer, Ulrich Joos. Biochimica et Biophysica Acta 1538 (2001) 28-37).

Pertanto la presente invenzione à ̈ utilizzabile anche in metodi di proliferazione, differenziazione e citocinesi di cellule, in particolare osteoblasti. In particolare, la presente invenzione prevede l’uso della particella qui descritta o della matrice comprendente una pluralità di dette particelle come supporto in un metodo per la crescita e il differenziamento di osteoblasti.

Una prima realizzazione preferita dell’invenzione comprende una particella in cui detto materiale ceramico osteointegrabile à ̈ silice.

Una seconda realizzazione preferita dell’invenzione comprende una particella in cui detto materiale ceramico osteointegrabile à ̈ idrossiapatite o idrossiapatite sostituita, in particolare stronzio-idrossiapatite.

In detta prima o seconda realizzazione preferita, il glicosaminoglicano à ̈ scelto nel gruppo costituito da eparina, condroitina solfato A e acido ialuronico.

Nelle realizzazioni preferite dell’invenzione, à ̈ preferito il polipirrolo.

Come detto sopra, i materiali ceramici utilizzati nella presente invenzione sono noti all’esperto del settore, sia per quanto riguarda il loro reperimento, dato che sono normalmente disponibili in commercio, sia per quanto riguarda la loro preparazione.

In via esemplificativa, le particelle di silice possono essere ottenute eseguendo la sintesi di Stöber (W. Stöber, A. Fink, E. Bohn, Journal of Colloid and Interface Science, Volume 26, pages 62-69) utilizzando ad esempio etanolo (EtOH), tetraetil ortosilicato (TEOS) [(EtO)3-Si-OEt], acqua (H2O) e ammoniaca (NH3) (Schema 1).

i) NH3+ H2O NH4<+>+ OH-ii) (EtO)3-Si-OEt H2O (EtO)3-Si-OH EtOH

iii) (EtO)3-Si-OH OH<->(EtO)3-Si-O<->+ H2O

iv) (EtO)3-Si-OEt Si-OH (EtO)3-Si-O-Si-(OEt)3+ EtOH

v) (EtO)3-Si-OH (EtO)3-Si-OH (EtO)3-Si-O-Si-(OEt)3+ H2O

Schema 1: Sintesi di Stöber

Variando le proporzioni tra i componenti à ̈ possibile controllare le dimensioni di SiO2(Tabella 4).

Tabella 4.

EtOH TEOS NH3H2O SiO2

50-200 ml 2-6 ml 2-15 ml 0-5 ml 30-600 nm

Un altro substrato strutturante, come anche à ̈ definito il materiale ceramico osteointegrabile della presente invenzione, preferito à ̈ la idrossiapatite sostituita con lo Stronzio (Sr-HAP) (WO2007/045954 A1; E. Landi, A. Tampieri, G. Celotti, S. Sprio, M. Sandri, G. Logroscino. Acta Biomaterialia 3 (2007) 961-969). La sua sintesi prevede un percorso di neutralizzazione di una sospensione acquosa di idrossido di calcio Ca(OH)2, (ad esempio a una concentrazione compresa tra 0,4 M e 3,5 M) con una soluzione acquosa di acido fosforico H3PO4, (ad esempio a una concentrazione tra 0,3 M e 2,8 M) aggiungendo nitrato di stronzio Sr(NO3)2(ad esempio a una concentrazione tra 0,15 M e 1,5 M) come fonte di cationi droganti. Il prodotto di reazione si mantiene in sospensione a una temperatura compresa fra 20 e 40°C, ad esempio a 37°C per un intervallo di tempo compreso fra 1 e 3 ore, ad esempio 2 ore, e successivamente senza agitazione né riscaldamento per un ulteriore intervallo di tempo compreso fra 2 e 30 ore, ad esempio 24 ore. Il precipitato si separa, ad esempio per centrifugazione e si lava con un opportuno mezzo, ad esempio acqua, per un numero sufficiente di volte.

La dimensione delle particelle di stronzio-idrossiapatite à ̈ stata uniformata eseguendo un trattamento meccanico con il mulino a palle. Si inseriscono le polveri di ceramico sintetizzato, da 100 a 200 mg, all’interno della giara di agata (20 ml) con 3 palle di agata. Si realizzano percorsi di macinazione, da 12 a 24 cicli, alla velocità tra 400 e 500 rpm, ognuno di 15 minuti con 5 minuti di intervallo .

La modificazione delle particelle di materiale ceramico osteointegrabile (nella presente invenzione espressa anche con il termine “funzionalizzazione†) avviene, come già spiegato sopra, instaurando un legame chimico, quale sia la sua natura, tra un gruppo funzionale chimico presente sulla superficie della particella e un gruppo funzionale chimico del glicosaminoglicano.

Nel caso di una realizzazione preferita dell’invenzione, in cui la particella di materiale ceramico à ̈ silice o stronzio-idrossipapatite, la funzionalizzazione à ̈ stata eseguita sfruttando la presenza di gruppi ossidrilici (-Si-OH; -Ca-OH) in superficie.

I presenti inventori hanno affrontato il problema di ancorare un oggetto grande, il glicosaminoglicano, a una superficie piccola, la particella. A tal scopo, la presente invenzione prevede che la funzionalizzazione della particella con il glicosamminglicano avvenga tramite una catena alifatica che ha funzione di spaziatore e che consenta di modulare la dimensione media delle particelle funzionalizzate, e di rilasciare in modo programmato il glicosaminoglicano dalla particella a seconda della sua natura chimica. Tale catena spaziatrice deve contenere dei gruppi terminali bioaffini (amminici, carbossilici, alcolici).

Vi sono numerosi esempi nella letteratura, brevettuale e non brevettuale, di catene spaziatrici che possono essere usate per gli scopi della presente invenzione, purché assicurino una corretta funzionalizzazione della particella con il glicosaminoglicano e sia bioaffine.

In una realizzazione preferita dell’invenzione, la particella, qui esemplificata con silice oppure idrossiapatite, à ̈ funzionalizzata come descritto nello Schema 2.

O-Si-Ri-NH

(EtO)-Si-Ri-NH2 O-Si-Ri-NH

HO H2N-Ri-Si-O

(composto formula I)

HzN-Ri-Si-0 O-Si-R1-NH;

HO

HzN-Rz-Si-O O-Si-Ri-NH

HO OH O-Si-Ri-NH

Anidride Succinica (composto formula II)

0-Si-R N H-CO-Rz-COOH

HOOC-R2-CO-NH-Ri-Si-O 0-Si-R N H-CO-Rz-COOH

O-Si-Ri-N H-CO-Rz-COOH

Schema 2. Modificazione superficiale delle microsfere di silice.

Ri: CH2CH2CH2per l’APTS ; R2: CH2CH2per l’anidride succinica.

La modificazione delle particelle, che nelle realizzazioni preferite dell’invenzione sono di silice o di stronzio-idrossiapatite, à ̈ stata eseguita sfruttando la presenza di gruppi ossidrilici (-SiOH; -Ca-OH) in superficie che possono reagire con un composto di formula (I) (EtO)3-Si-R1-NH2, dove R1à ̈ una catena alifatica costituita da 1 a 4 atomi di carbonio (Nota: la lunghezza della catena alifatica definisce la polarità della molecola e la sua bioaffinità per la membrana cellulare). È preferito il gruppo etile, perché buon gruppo uscente e il prodotto di reazione à ̈ l’etanolo non tossico. Si preferiscono le catene lineari per il minor ingombro sterico. Nello schema 2, la particella, sulla quale sono esposti gruppi –OH liberi, à ̈ fatta reagire con il composto di formula (I) in cui R1à ̈ –(CH2)3- (3-amminopropiltrietossisilano, APTS). Il ruolo del composto di formula (I) à ̈ quello di agganciare una catena spaziatrice su SiO2oppure su Sr-HAP capace in seguito di essere ulteriormente modificata. A seconda della lunghezza della catena alifatica varia la dimensione finale della particella.

Successivamente, si procede alla creazione di un legame ammidico con una anidride di un acido carbossilico (composto formula II) avente da 3 a 8 atomi di carbonio (quindi R2à ̈ una catena di atomi di carbonio avente da 1 a 6 atomi di carbonio), la cui catena può essere satura. Esempi sono l’anidride dell’acido etanoico, propanoico, butanoico, pentanoico, esanoico, eptanoico, ottanoico. Preferite sono l’anidride succinica, anidride glutarica e anidride maleica. Alternativamente all’anidride di un acido carbossilico, si può impiegare un estere carbonato (composto formula III,) avente da 1 a 6 atomi di carbonio (la lunghezza di R3). Esempi di esteri carbonati sono il dimetil carbonato, dietil carbonato, dipropil carbonato e di-tert-butil dicarbonato. Preferito à ̈ il di-tert-butil dicarbonato (Schema 3). Questa ultima reazione può avvenire in presenza di idrogenocarbonato di sodio (NaHCO3) in soluzione acquosa-organica oppure in una soluzione di 1,1,1,3,3,3-esafluoropropanolo (HFIP).

0-Si-R NH2

OHHOOH (EtO)3-Si-R1-NH2-Si-R^NH,

<HO>(composto formula I)<HN-R1-Si-O>

HzN-Ri-Si-O — f O-Si-Ri-NHz

HO<OH>H2N-R1-Si-O O-Si-R1-NH2

HO OH OH O-Si-Rz-NH2

R3O-CO-OR3

(composto formula

O-Si-R1-N H-CO-OR3

R3O-CO-N H-R1-Si-O O-Si-R1-NH-CO-OR3

O-Si-R1-N H-CO-OR3

Schema 3. Modificazione superficiale delle particelle.

Ri: CH2CH2CH2per l’APTS ; R3: C(CH3)3per di-tert-butil dicarbonato.

Inoltre, il composto di formula III permette di definire un altro percorso di modificazione della particella. In questo caso, l’estere carbonato può reagire direttamente con i gruppi ossidrilici presenti sulla superficie della particella creando dei gruppi ammidici, oltre a un buon gruppo uscente tert-butil ossicarbonato (Schema 4). La reazione eseguita a temperatura ambiente necessita di uncatalizzatore, ad esempio il tricloruro di bismuto (BiCI3) in piccola concentrazione (ad esempio 5 mol%).

O-CO-OR3

OHOH 3R3O-CO-O O-CO-OR3HO R3O-CO-OR

(composto formula III)

R3O-CO-O O-CO-OR3HO OH

BiCl3 R3O-CO-O<O-CO-OR3>

HO OH OH O-CO-OR3

Schema 4. Modificazione superficiale delle particelle con il composto di formula III.

R3: di-tert-butil dicarbonato.

Un altro percorso di sintesi prevede la modificazione delle particelle creando solo gruppi esterei utilizzando un silano con un gruppo terminale idrossile con un composto di formula (IV) (R4O)3-Si-R5-OH dove R4à ̈ una catena alifatica da 1 a 2 gruppi CH2, e R5à ̈ una altra catena alifatica avente da 1 a 3 atomi di carbonio. Preferiti sono l’idrossimetiltrietossisilano e il 3-metossipropiltrimetossisilano. Lo spaziatore dispone altri gruppi ossidrili utili alla creazione di acidi carbossilici terminali (Schema 5) impiegando anidridi di un acido carbossilico (composto formula II) oppure un estere carbonato (composto formula III).

O-Si-R5-OH

OHOH(R4O)3-Si-R5-OH HO- R O-Si- R5-OH

HO

(composto formula IV)5-Si-O

HO- R5-Si-O O-Si- R5-OH

HO OH<HO- R>5<-Si-O>O-Si- R5-OH

HO OH OH O-Si- R5-OH

Anidride ac. Carbossilico

(composto formula II) /

R3O-CO-OR3

(composto formula III)

O-Si-R5-O-CO-R2/R3-COOH

HOOC-R3/<E>R<t>2<O>-C-O<CO>-O<-N>-R<H>5--S<S>O-Si-NH-CO-OEt

EtO-CO-NH-Sii<i>i-<-O - i-R>

-O5<-O-CO-R>2</R>3<-COOH>

O-Si-R5-O-CO-R2/R3-COOH

Schema 5. Percorso di modificazione delle particelle utilizzando solo gruppi esterei.

La formazione della prima porzione della catena spaziatrice, ossia la reazione tra la particella e i composti di formula I, II, III o IV, avviene in un alcol, quale etanolo.

La temperatura di reazione può essere compresa tra 20 e 30°C, preferita 25°C.

La reazione viene condotta per un tempo compreso tra 20 e 24 ore.

Se desiderato o necessario, il prodotto di reazione può essere isolato con tecniche convenzionali, ad esempio filtrazione o centrifugazione.

Sulla particella così funzionalizzata viene agganciato il glicosaminoglicano secondo la presente invenzione. Preferibilmente, i glicosaminoglicani (quali eparina o condroitina solfato A, acido ialuronico) hanno un peso molecolare compreso tra 2 e 5 kDa. I polisaccaridi menzionati possono essere modificati grazie alla creazione di un gruppo ammidico a partire dal loro gruppo carbossilico utilizzando opportuni metodi noti. Ad esempio si può utilizzare l’1-[3-(dimetilammino)propil]-1-etilcarboiimmide idrocloruro (EDCI) (agente condensante) e una diidrazide di formula (V) H2N-NH-CO-R6-CO-NH-NH2, dove R6à ̈ una catena alifatica avente da 1 a 6 gruppi –CH2- in soluzione acquosa a pH compreso tra 4,0 e 6,0, preferito pH=4,75. In questo modo, si aggiunge una seconda porzione della catena spaziatrice.

Per quanto noto ai presenti inventori, i processi proposti sono noti in Chimica Organica per modificare molecole ma in letteratura non sono citati, né suggeriti per modificare le superfici di particelle.

Nello Schema 6 Ã ̈ esemplificata una realizzazione della modifica del glicosaminoglicano.

H2NHN-CO-R6-CO-NHNH2

EDCI

n

Schema 6. Modificazione del glicosaminoglicano. R6:CH2CH2CH2CH2

Una modificazione alternativa del glicosaminoglicano prevede l’utilizzo di alcoli aminici, dove il gruppo aminico à ̈ protetto. In questo caso, il glicosaminoglicano può reagire con un composto di formula (VI) HO-R7-NHR8dove R7à ̈ una catena alifatica da 3 a 6 atomi di carbonio e R8à ̈ un gruppo protettore del tipo tert-butil carbamato (Boc), preferito à ̈ il 3-(Bocamino)-1-propanol. La reazione di esterificazione avviene in presenza di un agente condensante, ad esempio DBU, in alcool (etanolo). In seguito, si procede alla deprotezione del gruppo amino terminale in presenza di acido fosforico (H3PO4) oppure di acido trifluoro acetico (TFA), preferito à ̈ l’acido fosforico (composto formula VII) (Schema 7).

HO-R7-NHR8

(composto formula VI)

Glicosaminoglicano-COOH Glicosaminoglicano-CO-O-R7-NHR8

H3PO4

(composto formula VII)

Glicosaminoglicano-CO-O-R7-NH2

Schema 7. Modificazione chimica del glicosaminoglicano.

R7: CH2CH2CH2; R8:Boc

Infine, il percorso alternativo 7 prevede la creazione di un legame amidico tra la particella e il glicosaminoglicano. In dettaglio, i gruppi terminali carbossilici della particella inorganica, ottenuti dallo schema di sintesi 2 e 5, oppure i gruppi terminali Boc, ottenuti dagli schemi 3 o 4, reagiscono con i gruppi aminici del glicosaminoglicano, ottenuti dallo schema 6 o 7, in soluzione alcolica (etanolo).

Alternativamente alla eparina, esemplificata nello schema, si possono usare differenti molecole a base di condroitina solfato (per esempio condroitina C/D/E), l’acido ialuronico e i suoi derivati.

Il peso molecolare dei glicosaminoglicani modificati viene definito da un successivo processo di dialisi (taglio a 3500 Da).

L’aggancio dei glicosaminoglicani sulla superficie delle particelle avviene grazie all’azione dell’agente condensante, ad esempio EDCI, in presenza del bis-tris idrocloruro (tampone per ammine) oppure di tamponi capaci di lavorare in un intervallo di pH da 5,8 a 7,2.

La successiva ricopertura delle particelle ceramico-glicosaminoglicano si realizza con un film protettivo di polimero elettroconduttore.

Nel caso esemplificativo del polipirrolo (PPy), la ricopertura della particella legata covalentemente con il glicosaminoglicano à ̈ effettuata con un processo di polimerizzazione chimica o enzimatica del monomero (Py). In breve, la polimerizzazione avviene in una soluzione di sintesi contente il Py (20-200 mM), la particella legata al glicosaminoglicano (1-4 mg/ml), e un agente ossidante (2-20 mM). Il meccanismo di polimerizzazione si basa sull’ossidazione del monomero da parte dall’agente ossidante, successiva crescita degli intermedi e coniugazione fino ad arrivare al polimero (Schema 8).

Glucosio (glucosio ossidasi)

oppure H2O

SiO2

2

SiO2

Pirrolo (Py)

Schema 8. Processo di polimerizzazione del monomero di pirrolo in presenza di un agente ossidante e le particelle bioibride.

La polimerizzazione à ̈ condotta con metodi noti nell’arte (N.K. Guimard, N. Gómez, C.E. Schmidt. Progress in Polymer Science 32 (2007) 876-921). Come agente ossidante si possono citare in via esemplificativa: glucosio ossidasi (in presenza di glucosio o altri monosaccaridi), perossido di idrogeno (H2O2), ammonio persolfato ((NH4)2S2O8), sodio persolfato (Na2S2O8), tricloruro di ferro (FeCl3).

La purificazione delle particelle in tutte le successive fasi (dalla formazione fino alla ricopertura superficiale) avviene per lavaggio, centrifugazione e liofilizzazione.

Nella realizzazione dell’invenzione, l’elettropolimero, che ricopre la particella legata con il glicosaminoglicano, viene drogato con un altro glicosaminoglicano o un principio attivo di natura anionica che compensa la carica positiva del polimero. Esempi di farmaci utili in questa realizzazione dell’invenzione sono gli antiinfiammatori non steroidei caratterizzati da una funzione acida, il metotressato, i bifosfonati, gli alendronati.

In una forma particolarmente preferita di realizzazione, la biomolecola drogante à ̈ un secondo glicosaminoglicano, che può essere uguale, ma non esclusivamente, al primo glicosaminoglicano legato alla particella di ceramico.

È particolarmente preferita la realizzazione in cui detto primo e detto secondo glicosaminoglicano à ̈ a base di eparina. Questa realizzazione presenta il vantaggio di una cessione di eparina secondo una duplice cinetica: veloce per la eparina drogante (fisicamente adsorbito) e lenta per la prima eparina legata covalentemente.

La particella delle presente invenzione, in particolare nella sua forma di matrice, più in particolare nella sua forma di materiale elettroattivo, à ̈ utile come medicamento.

In special modo à ̈ utile come medicamento nel trattamento di patologie dell’osso e della articolazione. Preferibilmente, la patologia à ̈ osteoporosi, un processo infiammatorio o un trauma.

La particella, la matrice o il materiale elettroattivo sono somministrati a una soggetto che ne necessita sotto forma di composizioni farmaceutiche. Tali composizioni sono del tutto convenzionali e non necessitano di alcuna particolare descrizione. Si può far riferimento alle conoscenze generali del settore, ad esempio a “Remington’s Pharmaceutical Sciences†, ultima edizione.

Caratterizzazione dei composti

La dimensione delle particelle di stronzio-idrossiapatite à ̈ stata uniformata eseguendo una trattamento meccanico di macinazione usando un mulino a palle di agata (Fritsch).

Lo studio morfologico delle particelle di silice à ̈ stato eseguito con misure al microscopio a scansione elettronico (SEM, LEO 1450 VP).

La polidispersività delle soluzioni colloidali contenti le particelle à ̈ misurata con la tecnica di diffusione dinamica della luce (DLS). Lo strumento impiegato à ̈ stato un Malvern Nano ZS Zen 3500 equipaggiato con un laser He-Ne (λ=633 nm) ad un angolo operativo di 90° a temperatura ambiente (25°C). I campioni sono stati diluiti da 1:50 a 1:100 in acqua ultrapura MilliQ (pH=7,0) e soluzioni tamponate contenenti borax (sodio borato, Fluka, pH=9.47), e volumi di 2ml sono stati usati in cuvette di 10 mm. La carica superficiale delle sfere à ̈ stata studiata da analisi di Potenziale Zeta (ζ) con lo stesso strumento.

Le composizioni chimiche delle particelle di silice e stronzio-idrossiapatite native e modificate sono state studiate con l’analisi al plasma induttivamente accoppiata (ICP-OES, Varian Liberty 150).

La presenza e la natura di gruppi superficiali sulle particelle di silice e stronzio-idrossiapatite native e modificate sono state studiate con la spettroscopia IR (FTIR, Spectrometer 1760X Perkin Elmer).

La modificazione dei glicosaminoglicani à ̈ stata monitorata con misure di spettroscopia di emissione atomica al plasma induttivamente accoppiata (ICP-OES, Varian Liberty 150) e di<risonanza magnetica nucleare (H1>

La stabilità termica à ̈ stata studiata con misure di calorimetria differenziale a scansione (DSC, DSC 821 Mettler Toledo) e analisi termogravimetrica (TGA, TGS/STDA 851 Mettler Toledo).

Le polveri di silica e stronzio-idrossiapatite native e modificate sono state caratterizzate con diffrazione ai Raggi X (XRD, Rigaku Dmax) da 10 a 90 gradi, 0,05 gradi/min, 6 s per step.

L’area specifica superficiale delle particelle di Sr-HAP à ̈ stata studiata con il metodo Brunauer–Emmett–Teller (BET, Quantachrome Monosorb<®>); il campione à ̈ stato degassato per 24 ore a 100°C prima dell’analisi.

Risultati delle misure chimico-fisiche

La sintesi di Stöber opportunamente ottimizzata permette l’ottenimento di particelle di SiO2di dimensione sferica e diametro micrometrico, come confermato dalle misure al SEM. Le analisi eseguite allo spettrometro DLS mostrano una polidispersità effettiva ristretta con una dimensione media delle particelle di 255 nm (Figura 1). Le misure di ζ rilevano una carica superficiale negativa di -38±5 mV confermando la presenza di gruppi OH superficiali.

La sintesi di neutralizzazione ha permesso invece di ottenere il composto stronzioidrossiapatite come dimostrato dallo studio di diffrazione di Raggi X (Figura 2) e dai dati FTIR. Le particelle Sr-HAP hanno una area superficiale specifica di 105-118 m<2>/g. I rapporti tra gli atomi costitutivi dell’idrossiapatite sostituita sono Sr/Ca e Ca/P sono 0,13 e 1,6 rispettivamente, dati ottenuti dall’analisi ICP-OES.

La funzionalizzazione delle microsfere di silice con il glicosaminoglicano (sistema SiO2/GAG) richiede una iniziale modificazione tanto delle particelle ceramiche quanto del glicosaminoglicano così come descritto negli schemi 2 e 3. Le analisi spettroscopiche all’IR confermano la presenza di gruppi carbossilici sulla superficie della silice. Le micrografie al SEM mostrano particelle ibride aggregate di diametro maggiore. Le indagini DLS confermano un diametro medio di 300 nm con una inferiore polidispersità (Figura 3). La carica negativa sulla superficie à ̈ di -44±5 mV ottenuta da misure di ζ, valore che conferma la presenza di ulteriori cariche negative (COO-) sulle particelle.

Gli studi H<1>-NMR confermano l’avvenuta reazione e quindi, la presenza del legame ammidico nel glicosaminoglicano. Le analisi termiche DSC e TGA evidenziano come l’introduzione di catene laterali alifatiche riducono il grado di idratazione del glicosaminoglicano e la cinetica di decomposizione termica à ̈ diversa dal glicosaminoglicano non modificato.

La creazione del sistema ibrido SiO2/GAG à ̈ stata studiata dal punto di vista chimico, morfologico e chimico-fisico. La presenza del glicosaminoglicano sulla particella ceramica à ̈ stata confermata tramite la tecnica ICP-OES in grado di rilevare quantitativamente l’atomo di zolfo caratteristico dell’Hep e della CSA.

Lo studio spettroscopico DLS conferma che il diametro delle sfere ibride à ̈ di 284 nm (Figura 4). L’avvenuto aggancio del glicosaminoglicano à ̈ ulteriormente confermato dalle misure di ζ che mostrano un valore di -40±5 mV dovuto alle cariche superficiali introdotte dalla presenza del glicosaminoglicano (COO-; RSO3-; OH).

La successiva creazione di un film protettivo polimerico à ̈ raggiunta tramite polimerizzazione chimica o enzimatica da una soluzione contenente le particelle ibride in sospensione, il Py, il glicosaminoglicano (drogante) e l’agente ossidante. In funzione della natura di quest’ultimo si possono ottenere morfologie diverse di film protettivo. Ad esempio, film ottenuti da agenti ossidanti chimici mostrano morfologie molto porose, mentre agenti ossidanti enzimatici producono morfologie più lisce come osservato al microscopio SEM.

La porosità che viene controllata a seconda della polimerizzazione, permette di modulare la cinetica di rilascio dei glicosaminoglicani o profarmaci e l’accessibilità ai glicosaminoglicani interni.

La polimerizzazione, inoltre, consente al sistema ibrido di trattenere un secondo glicosaminoglicano, uguale o diverso al primo, garantendo al sistema possibili nuove attività biologiche.

Esempi di sistemi proposti sono a base di polipirrolo-eparina (PPy-Hep), polipirrolocondroitina solfato A (PPy-CSA) o polipirrolo-acido ialuronico (PPy-HA) da cui si ottengono,<ad esempio, i sistemi SiO>2/Hep/PPy-Hep, SiO2/Hep/PPy-CSA oppure SiO2/Hep/PPy-HA. La presenza del polimero PPy sulla particella ibrida si riflette nei valori di polidispersività ottenuti da misure DLS e dalle indagini al SEM. Le prime confermano la natura micrometrica del composito (diametro medio di 353 nm; campione SiO2/Hep/PPy-Hep) (Figura 5).

Dopo la ricopertura polimerica, ζ assume un valore negativo pari a -45±5 mV ad ulteriore conferma della presenza di PPy-Hep.

I risultati ottenuti dalle indagini realizzate al DLS hanno permesso di valutare il diametro medio delle particelle che può variare da decine di nanometri a centinaia di micrometri, ad esempio da 255 nm a 385 nm. La modificazione iniziale delle particelle di silice incrementa il loro diametro in un intervallo da 30 a 40 nm. La realizzazione del legame covalente tra particella di silice ed eparina aumenta il diametro della particella da 20 a 30 nm. Infine, la ricopertura finale con il polipirrolo-eparina ha uno spessore da 70 a 100 nm. Film di polipirrolo più spessi non sono porosi e rendono difficili il rilascio e/o accessibilità al glicosamminoglicano interno.

Esempio 1

Materiali utilizzati nelle fasi di sintesi e caratterizzazione

i) Sintesi delle particelle inorganiche

Preparazione di particelle di SiO2

Reagenti necessari:

Tetraetossisilano (TEOS, 98%, Aldrich<®>); etanolo (EtOH, 99.8% v/v, Fluka); ammoniaca (NH3, 30% v/v, Carlo Erba)

Preparazione di una soluzione A contenente 3 ml di TEOS (13 millimoli) in 90 ml di etanolo (1.5 moli). Agitare vigorosamente per 10 minuti. Aggiungere 3.9 ml di acqua MilliQ (0.2 moli) e lasciare in agitazione per 24 ore. Aggiungere goccia a goccia 6 ml di NH3(0.5 moli). Agitare vigorosamente per 10 minuti e successivamente moderatamente per 12 ore.

Rimozione dell’ammoniaca e del solvente etanolo con un serie di 5 centrifugazioni (1500 rpm, 10 minuti). Le particelle sono disperse in H2O MilliQ.

Preparazione delle particelle di stronzio-idrossiapatite Ca10-qSrq(PO4)6(OH)2

La sintesi del composto inorganico di stronzio-idrossiapatite à ̈ noto in letteratura (E. Landi, A. Tampieri, G. Celotti, S. Sprio, M. Sandri, G. Logroscino. Acta Biomaterialia 3 (2007) 961-969). A fine sintesi, le particelle di ceramico sono liofilizzate e, in seguito, sottosposte a un trattamento termico a 400°C (riscaldamento a 50°C/h sino a 400°C, 400°C per 6 ore, raffreddamento graduale).

Il ceramico ottenuto ha la composizione Ca8,8Sr1,2(PO4)6(OH)2.

ii) Modificazione superficiale delle particelle di SiO2

Reagenti necessari:

Etanolo (99.8% v/v, Fluka); 3-amminopropiltrietossisilano (APTS, >95%, Aldrich<®>); anidride succinica (≥99%, Aldrich<®>); 1-[3-(dimetilammino)propil]-1-etilcarboiimmide idrocloruro (EDCI, ≥99%, Aldrich<®>); diidrazide adipica (ADH, ≥99%, Aldrich<®>); bis-tris idrocloruro (≥99%, Aldrich<®>).

Preparazione di una soluzione E contenente 10 ml di particelle (20 % p/p) disperse in 70 ml di etanolo (1,2 moli) utilizzando un bagno a ultrasuoni (10 minuti a 40 kHz). Aggiungere lentamente 1 ml di APTS (4,4 millimoli). Lasciare in agitazione per 12 ore a 25°C. Rimozione dell’eccesso di APTS utilizzando etanolo eseguendo 3 cicli di centrifugazione (4000 rpm, 10 minuti).

Preparazione di una soluzione F contenente le particelle prima descritte in 100 ml di etanolo (1,7 moli). Aggiungere 0,1 g di anidride succinica (1 millimoli) e lasciare sotto agitazione moderata per 10 ore. Procedere alla rimozione dell’eccesso di anidride succinica con una serie di 5 cicli di centrifugazione (5000 rpm, 10 minuti).

iii) Modificazione dei glicosaminoglicani

Reagenti necessari:

I polisaccaridi impiegati sono eparina (Hep, 4-6 kDa, Aldrich<®>); l’agente condensante 1-[3-(dimetilammino)propil]-1-etilcarboiimmide idrocloruro (EDCI, ≥99%, Aldrich<®>); il tampone diidrazide adipica (ADH, ≥99%, Aldrich<®>); acido cloridrico (HCl, 37%, Aldrich<®>); idrossido di sodio (NaOH, 97%, Aldrich<®>).

Preparazione di una soluzione acquosa G 0,2 g di Hep (4mg/ml) in 50 ml di acqua MiliiQ. Aggiungere 3.5 g di ADH (20,5 millimoli) e 0,382 g di EDCI (2 millimoli). Il pH à ̈ mantenuto costante con addizioni di 0,1N di HCl (3,6 g HCl in 1000 ml). Soluzione sotto agitazione magnetica per 30 minuti a temperatura di 25°C. Finita la reazione, il pH à ̈ riportato a condizione neutra (pH=7) con l’addizione di piccoli volumi di NaOH 1N (40 g di NaOH in 1000 ml).

Successivamente si procede alla dialisi della soluzione G impiegando una membrana di dialisi di taglio a 3500Da. Lavaggi ogni 24 ore della soluzione utilizzando una soluzione di NaCl 100mM (11,74 g NaCl) per tre giorni.

Liofilizzazione della soluzione G dializzata.

iv) Creazione del legame covalente tra eparina modificata e particelle di SiO2Reagenti necessari:

Eparina modificata; silice modificata; EDCI (≥99%, Aldrich<®>); bis-tris idrocloruro (≥99%, Aldrich<®>).

Preparazione di una dispersione acquosa H contenente particelle di silice in 100 ml in acqua MilliQ sotto agitazione magnetica alla quale si aggiungono 24 mg di Hep modificata (1,2 mg/ml). Aggiungere 7,6 mg di EDCI (0,4 millimoli) e 0,5 g di bis-tris idrocloruro (2 millimoli). Mantenere in agitazione magnetica a 4°C per 24 ore.

Purificazione delle particelle finali combinando la centrifugazione (4000 rpm, 1 ora) alla ridispersione in acqua MilliQ in bagno a ultrasuoni (40 kHz, 30 minuti) per un totale di 4 cicli.

v) Ricopertura delle particelle bioibride con un ulteriore film polimerico

Reagenti necessari:

Pirrolo (Py, 98%, Aldrich<®>), eparina (17-19 kDa, Aldrich<®>), glucosio ossidasi (Sigma), glucosio (Aldrich<®>), perossido d’idrogeno (40% m/v, Carlo Erba); ammonio persolfato (98%, Sigma-Aldrich).

Preparazione di una soluzione acquosa di particelle bioibride (0,200 g) in 20 ml di acqua MilliQ sotto agitazione magnetica a 25°C. Addizione di 27,75 µl di Py (4 millimoli) e, in seguito, addizione dell’agente ossidante. I diversi agenti ossidanti sono impiegati nelle seguenti concentrazioni: 93,1 mg di ammonio persolfato (0,4 millimoli), oppure di 24 µl di perossido di idrogeno (0,8 millimoli), oppure 20 mg di glucosio ossidasi (1 mg/ml) in presenza di una soluzione tamponata di glucosio 72,1 mg (20 millimoli).

Per la realizzazione delle nanosfere composite tutti i reagenti sono stati usati senza previa purificazione.

Esempio 2

Caratterizzazione Biologica

Per la caratterizzazione biologica sono stati impiegati i seguenti materiali: Pre-osteoblasti di topo immortalizzati MC3T3-E1; cellule staminali mesenchimali (MSCs), ottenute da midollo osseo di topo; Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Sigma Aldrich Milano, Italia), paraformaldeide, anticorpo policlonale anti-FGF-2 ottenuto nel coniglio (Sigma-Aldrich S.r.l.), siero albumina bovina (BSA) (Sigma-Aldrich S.r.l.), anticorpo anti-IgG di coniglio coniugato con Alexa fluor 488 (Molecular Probes, Invitrogen), Falloidina coniugata con tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC) (Sigma-Aldrich S.r.l.).

Allo scopo di studiare la funzione biologica di particelle di SiO2rivestite da eparina, preosteoblasti di topo immortalizzati MC3T3-E1 costitutivamente incapaci di sopravvivere in sospensione o in mancanza di siero erano posti a crescere in bottiglie di vetro, sterilizzate tramite autoclave, in DMEM, senza aggiunta di siero, contenente una sospensione di particelle di SiO2rivestite da eparina alla concentrazione 0,3 mg di particelle/ml di mezzo di coltura. Tale sospensione osteoblasti-particelle di SiO2rivestite da eparina contenuta in bottiglie di vetro, era mantenuta in termostato incubatore su agitazione magnetica (40 giri/min per 6 ore ed a 80 giri/minuto per 48 ore). Parallelamente altri pre-osteoblasti erano posti a crescere nelle stesse condizioni in presenza di particelle di SiO2non rivestite.

Quindi cellule e particelle di SiO2rivestite e non rivestite da eparina venivano precipitati tramite centrifugazione (500 giri/minuto per 4 minuti) a temperatura di 25°C. Il supernatante era rimosso ed il precipitato era fissato con il 4% (v/v) di paraformaldeide diluita in tampone fosfato salino (PBS) per 30 minuti a temperatura di 25°C; i campioni erano depositati su vetrini portaoggetto per microscopia e lavati tre volte con PBS. Successivamente i campioni erano incubati sequenzialmente con un anticorpo anti-FGF-2 di coniglio diluito 1:70 in PBS -5% BSA per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo 3 lavaggi con PBS (10 minuti per ogni lavaggio) erano incubati con un anticorpo secondario anti-IgG di coniglio coniugato con Alexa fluor 488 diluito 1:100 in PBS -5% BSA per 1 ora a temperatura ambiente.

Dopo tre lavaggi con PBS, i vetrini portaoggetto erano montati con i coprioggetto per visualizzazione tramite microscopio a fluorescenza. Esperimenti di controllo erano svolti omettendo l’anticorpo primario.

I dati ottenuti dagli studi biologici indicano che l’eparina facilita il trattenimento dell’FGF-2, rilasciato dalle cellule nel mezzo di coltura, sulle particelle (Figura 6). L’eparina quindi, ottimizza il sistema in quanto permette di trattenere in situ proteine che possiedono domini di legame per tale molecola. Il legame dell’FGF-2, à ̈ di grande interesse in quanto svolge ruoli chiave nei processi di proliferazione e differenziamento degli osteoblasti; di conseguenza, se rilasciato e trattenuto localmente, può facilitare i processi di rimodellamento e riparazione del tessuto osseo in seguito a traumi, osteoporosi o in tutti gli altri processi in cui à ̈ necessaria nuova sintesi di matrice ossea (Montero A, Okada Y, Tomita M, Masato I, Tsurukami H, Nakamura T, Doetschman T, Coffin JD, Hurley MM.2000. Disruption of the fibroblast growth factor-2 results in decreased bone mass and bone formation. J Clin Invest 105:1085–1093; Hurley MM, Okada Y, Xiao L, Tanaka Y, Ito M, Okimoto N, Nakamura T, Rosen CJ, Doetschaman T, Coffin JD.2006. Impaired bone anabolic response to parathyroidhormone in Fgf2-/-and Fgf2+/+ mice. Biochem Biophys Res Commun 341:989–994; Naganawa T, Xiao L, Abogunde E, Sobue T, Kalajzic I, Sabbieti M, Agas D, Hurley MM. 2006. In vivo and in vitro comparison of the effects of FGF-2 null and haplo-insufficiency on bone formation in mice. Biochem Biophys Res Commun 339:490–498; Naganawa T, Xiao L, Coffin JD, Doetschman T, Sabbieti MG, Agas D, Hurley MM.2008. Reduced expression and function of bone morphogenetic protein-2 in bones of Fgf2 null mice. J Cell Biochem. 103:1975-88; Sabbieti MG, Agas D, Xiao L, Marchetti L, Coffin JD, Doetschman T, Hurley MM.2009. Endogenous FGF-2 is critically important in PTH anabolic effects on bone. J Cell Physiol.

219:143-51; Sabbieti MG, Agas D, Marchetti L, Santoni G, Amantini C, Xiao L, Menghi G, Hurley MM.2010. Signaling pathways implicated in PGF2alpha effects on Fgf2+/+ and Fgf2-/- osteoblasts.J Cell Physiol.224:465-74).

Ulteriormente, cellule staminali mesenchimali (MSCs), ottenute da midollo osseo di topo (Scutt A, Bertram P. Bone marrow cells are targets for the anabolic actions of prostaglandin E2 on bone: induction of a transition from nonadherent to adherent osteoblast precursors. J Bone Miner Res. 1995 Mar;10(3):474-87; Montero A, Okada Y, Tomita M, Ito M, Tsurukami H, Nakamura T, Doetschman T, Coffin JD, Hurley MM. 2000. Disruption of the fibroblast growth factor-2 gene results in decreased bone mass and bone formation. J Clin Invest.

105:1085-93), erano cresciute in sospensione in presenza di particelle di SiO2 rivestite daeparina ulteriormente rivestite da polipirrolo e eparina o condroitina solfato A. Tale sospensione era mantenuta in termostato incubatore sotto agitazione (40 giri/minuti per 6 ore e 80 giri/minuto per 72 ore) in bottiglie di vetro precedentemente sterilizzate. Quindi cellule e particelle erano precipitati tramite centrifugazione (500 giri/minuto per 4 minuti) a temperatura di 25°C. Il supernatante era rimosso ed il precipitato era fissato con il 4% (v/v) di paraformaldeide diluita in PBS per 30 minuti a temperatura di 25°C; quindi i precipitati, così fissati, erano depositati su vetrini portaoggetto per microscopia.

I campioni erano lavati tre volte con PBS, permeabilizzati con Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 30 minuti ed incubati con BSA allo 0,5% sciolta in PBS a temperatura di 25°C per 20 minuti. Quindi i campioni erano incubati con 4x10<-6>mol/L di falloidina coniugata con tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC) per 20 minuti a temperatura di 25°C.

Dopo tre lavaggi in PBS i vetrini portaoggetto erano montati con i coprioggetto per la successiva analisi tramite microscopia a fluorescenza.

Gli studi sulla funzionalità biologica di particelle di SiO2rivestite da eparina e ulteriormente ricoperte da polipirrolo e eparina o condroitina solfato A dimostrano che tali matrici bio-ibride si organizzano in aggregati, costituendo in tal modo un efficace supporto per la crescita delle cellule. La crescita delle cellule su particelle di SiO2rivestite da eparina ulteriormente rivestite da polipirrolo e eparina o condroitin solfato A viene confermata dalla marcatura dei filamenti di F-actina, dimostrando quindi biocompatibilità dei substrati proposti.

Claims (20)

1. RIVENDICAZIONI 1. Particella comprendente un nucleo di materiale ceramico osteointegrabile funzionalizzata con un primo glicosaminoglicano, caratterizzata dal fatto che detta particella comprende ulteriormente un film superficiale di un polimero elettroconduttore farmaceuticamente accettabile.
2. 2. Particella secondo la rivendicazione 1, di formula C-L-G dove C Ã ̈ detto ceramico, L Ã ̈ una catena distanziatrice, G Ã ̈ detto glicosaminoglicano.
3. 3. Particella secondo la rivendicazione 2, di formula C-Q-L-Q’-G dove C, L e G sono come definiti sopra e Q e Q’, uguali o diversi fra loro, sono dei gruppi chimici idrolizzabili.
4. 4. Particella secondo una delle rivendicazioni 1-3, in cui detto materiale ceramico à ̈ scelto nel gruppo che consiste di SiO2, TiO2, un’apatite, una idrossiapatite, i loro sostituiti, in particolare stronzio-idrossiapatite; un vetro ad elevata biocompatibilità.
5. 5. Particella secondo una delle rivendicazioni 1-4, in cui detto primo glicosaminoglicano à ̈ scelto nel gruppo che consiste di eparina, condroitina solfato A, condroitina solfato B, condroitina solfato C, condroitina solfato D, condroitina solfato E, chitina, chitosano e suoi derivati, e acido ialuronico e suoi derivati.
6. 6. Particella secondo una delle rivendicazioni 1-5, in cui detto polimero elettroconduttore à ̈ polipirrolo oppure poli(3,4-etilenediossitiofene).
7. 7. Procedimento per la preparazione della particella di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, comprendente: a. fornire un nucleo di materiale ceramico osteointegrabile ; b. funzionalizzare detto nucleo con un primo glicosaminoglicano a dare una particella ceramico/glicosaminoglicano; c. ricopertura di detta particella ceramico/glicosaminoglicano con un film di un polimero elettroconduttore.
8. 8. Particella secondo una delle rivendicazioni 1-6, comprendente un profarmaco immobilizzato su detto film superficiale.
9. 9. Particella secondo la rivendicazione 8, in cui detto profarmaco à ̈ scelto nel gruppo che consiste di farmaci antiinfiammatori, osteoinducenti e antitumorali.
10. 10. Particella secondo la rivendicazione 9, in cui detto profarmaco antiinfiammatorio à ̈ un secondo glicosaminoglicano.
11. 11. Particella secondo la rivendicazione 10, in cui detto secondo glicosaminoglicano à ̈ uguale a detto primo glicosaminoglicano.
12. 12. Particella secondo la rivendicazione 11, in cui detto primo e detto secondo glicosaminoglicano à ̈ eparina.
13. 13. Procedimento per la preparazione della particella della rivendicazione 8, comprendente il procedimento della rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che lo stadio c) Ã ̈ condotto alla presenza di detto profarmaco
14. 14. Matrice composita comprendente una pluralità di microparticelle di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6 e/o 8-12.
15. 15. Materiale elettroattivo comprendente la matrice della rivendicazione 14.
16. 16. Materiale elettroattivo della rivendicazione 15 come medicamento in una patologia dell’osso o delle articolazioni.
17. 17. Materiale elettroattivo secondo la rivendicazione 16, in cui detta patologia à ̈ scelta nel gruppo che consiste di osteoporosi, un processo infiammatorio e un trauma.
18. 18. Composizione farmaceutica comprendente il materiale elettroattivo di una delle rivendicazioni 15-17.
19. 19. Composizione secondo la rivendicazione 18 adatta alla somministrazione iniettabile.
20. 20. Uso della particella di una delle rivendicazioni 1-6 o 8-12 o la matrice della rivendicazione 14 come supporto in un metodo per la crescita e il differenziamento di osteoblasti.