ITRM20110149A1

ITRM20110149A1 - Biomarcatore per la rilevazione di cellule tumorali circolanti e relativi metodi e kit di rilevazione.

Info

Publication number: ITRM20110149A1
Application number: IT000149A
Authority: IT
Inventors: Massimo Zollo
Original assignee: Massimo Zollo
Priority date: 2011-03-25
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2012-09-26
Also published as: EP2503009A1

Description

Biomarcatore per la rilevazione di cellule tumorali circolanti e relativi metodi e ki di rilevazione

La presente invenzione concerne un biomarcatore per la rilevazione di cellule tumorali circolanti e relativi metodi e kit di rilevazione. In particolare, l'invenzione concerne un biomarcatore per la rilevazione di cellule tumorali circolanti ad esempio di tumore del colon, dell'esofago, tumore gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, mediante rilevazione del numero di copie del gene erbB2 o dell'espressione del gene erbB2 (dall'RNA eterogeno) nelle cellule tumorali circolanti del plasma/siero, sangue periferico intero, sangue midollare, liquido cefalorachidiano, liquido ascitico, succhi gastrici, feci, urine, liquido seminale, bile, saliva, liquido pleurico dei pazienti.

Il carcinoma esofageo (EC) è l'ottavo più comune cancro e la sesta causa primaria a livello mondiale della morte correlata al cancro. Nell'unione europea, nel 2006, sono stati contati 25.000 casi l'anno tra gli uomini e 8.300 tra le donne (1). In Italia, dati 2003 dai resoconti del registro dei tumori dell'associazione italiana (AIRTIUM), evidenzino 2.195 casi, con 40 nuovi casi l'anno a Napoli (AIRTUM 2000-2003; vedi: http://www.registri-tumori.it/cms/). La mortalità associata a EC è alta perchè i tumori sono raramente diagnosticati prima che la patologia sia arrivata ad uno stadio avanzato. Anche quando il tumore primario è asportabile, il tasso complessivo di sopravvivenza a cinque anni è al di sotto del 10% (2). Lo stadio in cui EC viene individuato è il fattore di maggiore importanza nel determinare la prognosi (classificazione in base al sistema T, N, M). Il tasso di metastasi linfonodale sia nel carcinoma a cellule squamose sia nell'adenocarcinoma, i due istotipi di EC, è correlato all'intensità dell'invasione (3-5). La maggior parte dei ECs che presentano sintomi hanno già invaso la muscularis propria (T3) e si sono già infiltrati a livello dei linfonodi locali (NI); questa è la spiegazione della cattiva prognosi.

I nuovi approcci per l'individuazione precoce e il monitoraggio del corso della terapia potrebbero essere di beneficio per la gestione clinica dei pazienti con EC. Diversi fattori prognostici sono correntemente accettati per l'uso clinico, come lo stato linfonodale e lo stadio del tumore; tuttavia, lo stato della malattia e le condizioni clinicopatologiche non permettono di identificare inequivocabilmente quali pazienti sono ad un alto e basso rischio riguardo la ricorrenza della malattia (2,6). Quindi, rimane la necessità di identificare marcatori prognostici migliori che possano essere dosati nei fluidi biologici (7,8).

L'oncogene erbB2, recettore umano per il fattore di crescita dell'epidermide codifica per un recettore transmembrana tirosin-chinasico che si è evoluto come uno dei maggiori classificatori di cancro alla mammella invasivo e come target terapeutico nella malattia (9). Tuttavia, il ruolo di erbB2 in EC è ancora controverso. Alcuni studi hanno rivelato che le differenze potrebbero dipendere dallo stadio del tumore o dall'istologia, o dall'interpretazione dei risultati dell 'immunoistochimica. Un altro studio sottolinea la mancanza di un impatto prognostico dell'amplificazione erbB2 nel carcinoma primario dell'esofago (10). Un ulteriore studio mostra l'amplificazione del gene erbB2 tramite PCR quantitativa gene-specifica in cellule tumorali da linfonodi e da midollo osseo di 98 pazienti con EC (11). Nel 50% degli aumenti di 17ql2.21, il gene erbB2 è stato ottenuto in cellule tumorali sia da linfonodi che da midollo osseo. Solo un aumento di erbB2, e non del 17ql2.21, era indicativo di scarsa sopravvivenza del paziente, suggerendo che l'incremento di erbB2 è critico per l'EC. Mentre un guadagno di erbB2 in una singola cellula cancerosa disseminata è stato mostrato essere un importante fattore di rischio in analisi multivariate, l'amplificazione di erbB2 nei tumori primari non è stata associata a scarsa sopravvivenza sia in un gruppo di paziente analizzati per cellule cancerose disseminate, sia in una coorte di un altro studio, entrambi comprendenti molti pazienti (11). Inoltre, l'amplificazione del gene erbB2 è stato dimostrata nell'istotipo di adenocarcinoma esoffageo, in 39 pazienti versus 39 campioni di controllo (12).

La formazione di nuovi vasi sanguigni (angiogenesi ) e di vasi linfatici (linfo-angiogenesi ) contribuisce significativamente alla crescita maligna e alle metastasi di tumori solidi (13-15) . Angiogenesi e linf oangiogenesi sono mediate da distinte citochine e dai loro recettori. Le citochine caratterizzate in modo migliore e più specifiche sono il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF-A, -B, -C, -D and -E) ed i loro recettori (VEGFR-1, -2 and -3) [16, 17]. Sono stati pubblicati studi clinico-patologici e sperimentali sull'espressione di VEGF-C/D in campioni di cellule esofagee squamose e in campioni di adenocarcinoma esafageo (18, 19).

Da studi su carcinoma squamoso esofageo è risultata una correlazione relativamente consistente tra l'espressione del fattore di crescita e progressione tumorale e invasione linfonodale. Uno studio recente ha riportato la presenza di aumento del VEGF-C sierico in carcinomi esafagei a cellule squamose, un risultato che uguaglia l'espressione di VEGF-C in campioni tissutali (20) . Lo studio ha correlato anche i livelli sierici di VEGF-C con la presenza di metastasi ai linfonodi, e ha concluso che l'aumento di VEGF-C non origina dalle piastrine o dai globuli bianchi .

Molti studi hanno indicato che il DNA solubile da tumori può essere misurato nel siero e nel plasma di pazienti con il cancro; alterazioni in microsatelliti ed amplificazione di oncogeni corrispondenti alle lesioni nei tumori sono state identificate in siero e plasma di pazienti con parecchi tumori (21-27). Tuttavia, una questione che rimane discutibile è se questo DNA è rilasciato da cellule tumorali primariamente dissociate o da cellule che invadono il sangue. E' stato mostrato come CTC (cellule tumorali circolanti) siano un legame critico tra i tumori primari e la malattia metastatica, che continua ad essere la principale causa di morte per molte malignità (28). Un sistema sensibile e specifico per la quantificazione delle CTCs e del loro DNA libero potrebbero quindi essere uno strumento utile per la diagnosi di EC, per monitorare la disseminazione delle cellule tumorali nel sangue periferico.

Gli autori della presente invenzione hanno ora trovato che cellule tumorali circolanti da EC sono caratterizzate da un numero di copie del gene erbB2 maggiore rispetto a quello di cellule sane. Lo studio ha rilevato le variazioni CN di erbB2 nel DNA libero da plasma di pazienti EC raccolto prima della resezione del tumore e della chemioterapia. In particolare, è stato isolato il DNA rilasciato nel plasma dalle cellule in pazienti con carcinoma esafageo, per analizzare le variazioni nel numero di copie di geni marcatori precoci della progressione tumorale.

Il plasma di 41 pazienti affetti da carcinoma esofageo è stato raccolto prima della resezione del tumore e della chemioterapia. Il set di dati a disposizione risultava eterogeneo per i dati clinici, coerentemente con le caratteristiche del tumore. E' stato estratto il DNA da plasma per analizzare le variazioni del numero di copie del gene erbB2 utilizzando la reai time PCR.

Gli esperimenti di reai time PCR per il gene erbB2 mostravano una variazione significativa (p=0.001) del numero di copie nel plasma di pazienti con carcinoma esofageo, in confronto ai controlli sani con un'alta sensibilità (80%) e specificità (95%). Queste variazioni in erbB2 erano correlate negativamente con la sopravvivenza dei pazienti (p=0.03), e rivelava un maggiore stratificazione delle categorie di rischio del pazienti con bassi livelli d'espressione di VEGF.

Pertanto, la variazione del numero di copie del gene erbB2 da plasma può essere utilizzata come marker prognostico per la rilevazione precoce di pazienti a rischio d'esito negativo nel cancro esofageo.

Nella pratica clinica, la diagnosi e la stadiazione del EC è prevalentemente basata sull'uso di verifiche cliniche morfologiche e funzionali. Ad oggi, marcatori siero specifici di EC non esistono, il che è in contrasto con la situazione di altri tumori del tratto gastrointestinale. Alcuni esempi al riguardo possono essere visti qui per il cancro gastrico, dove Ca.19.9 ha ruoli importanti nella diagnosi. Attualmente, possiamo concludere che singoli biomarcatori già identificati mostrano un'insufficiente sensibilità e specificità nel EC, e che è verosimile che multipli marcatori serviranno simultaneamente per indirizzare la diagnosi e la prognosi del EC [3].

La relazione tra l'incremento di espressione di erbB2 e le risposte ai trattamenti non è stata ancora stabilita per il EC. Sono emerse nuove prospettive, in primo luogo dal trial TOGA, che ha mostrato risultati efficienti da studi di fase III di tratuzumab (Herceptin®), un anticorpo monoclonale contro erbB2: quando somministrato con la chemioterapia, i benefici in quanto a sopravvivenza sono stati visti per pazienti con cancro gastrico precoce e metastatico con erbB2 positivo [9]. I dati nel trial TOGA hanno mostrato che trastuzumab con la chemioterapia è superiore alla sola chemioterapia, con una sopravvivenza media significativamente migliorata con trastuzumab comparata alla sola chemioterapia: 13.5 versus 11.1 mesi, rispettivamente. Trastuzumab è quindi un nuovo e ben tollerato trattamento per cancro gastrointestinale erbB2 positivo [46].

VEGF è un marcatore addizionale, che è aumentato dal 30% al 60% dei tumori esofagei. Alti livelli sierici di VEGF correlano con stadi avanzati e bassa sopravvivenza dei pazienti sottoposti a chirurgia curativa [38]. Numerosi studi hanno mostrato che l'aumento di VEGF-C correla con la gravità dell'invasione tumorale, dei linfonodi e con le metastasi linfonodali.

CTCs e DNA libero nel plasma sono stati analizzati da molti tumori, come del seno, del colonretto, polmone e del rene. E' stato mostrato come essi siano cruciali legami tra cancro primario e quelli che raggiungono uno stadio metastatico, che rappresenta la maggiore causa di morte per i maggiori tumori maligni [39-45]. Il nostro studio ha analizzato il modello in evoluzione per la misura del marcatore tumorale variazione del numero di copie (CN) nel DNA da plasma di pazienti EC. Sono state qui identificate variazioni del CN di erbB2 nel DNA libero da cellule di 41 pazienti con EC in confronto con 34 controlli sani. I nostri risultati sono in accordo con lo studio di Chiang PW. et al.,(1999) che ha mostrato che l'amplificazione di erbB2 in 39 campioni di plasma da pazienti con carcinoma esofageo con il solo istotipo adenocarcinoma. Il sistema di misurazione di erbB2 nel DNA da plasma tramite reai time PCR è innovativo e con validazione in una larga coorte di pazienti può essere usato per monitorare la stima dell'estensione del tumore ed il potenziale sviluppo di metastasi a distanza. Questo metodo si serve di un campione più semplicemente ottenibile e non invasivo, il sangue periferico, rispetto al saggio FISH (PathVysion FISH assay) eseguito su biopsie tumorali attualmente approvate dalla US Food and Drug Administrat ion (FDA) per determinare 1'eligibilità per il trattamento clinico con Herceptin nel carcinoma del seno con amplificazione di erbB2.

E' stato inoltre analizzato il CN di erbB2 da CTCs isolate da pazienti con EC ed è stato dimostrato che è simile a quello del DNA isolato da plasma degli stessi pazienti. Questi dati indicano che nei controlli sani, il DNA che noi abbiamo estratto derivava da cellule del sangue (principalmente linfociti e granulociti); invece, nei pazienti EC, il DNA libero nel plasma deriva maggiormente da CTCs (vedi tabella 4, per l'esame del contenuto di DNA nel plasma). A questo punto, una domanda rimane riguardo l'origine delle CTCs: queste cellule derivano dai tumori primari o da cellule che creeranno i foci metastatici? Attualmente non possiamo escludere che questo DNA derivasse dalle cellule del tumore primario a causa della nostra carenza di DNA dai tumori primari in questo studio. Tuttavia, i nostri dati relativi al CN di erbB2 mostrano che queste analisi sono in accordo con un altro studio che ha mostrato l'amplificazione di erbB2 in CTCs isolate da linfonodi e midollo osseo nel 50% dei pazienti EC [11]. Questo studio ha dimostrato che il tasso dell'amplificazione di erbB2 è più alto in CTCs che nei tumori primari, dove i livelli di amplificazione sono stati stimati essere circa del 10% [10, 46]. Questi dati sono in accordo con l'osservazione che le variazioni del CN di erbB2 sono un fenomeno tardivo in EC che è prevalentemente associato con le cellule tumorali circolanti. In più i dati dimostrano che le CTCs isolate da sangue periferico di questi pazienti EC hanno un simile tipo di amplificazione di erbB2 rispetto a quello visto da Stoecklein et al. (2008) nelle CTCs isolate da midollo osseo e linfonodi [11]. Il presente studio sottolinea che la misurazione del DNA piasmatico libero da cellule attraverso il prelievo di sangue in modo non invasivo può fornire informazioni rilevanti sullo stato della malattia di pazienti con EC. E' importante sottolineare che a dispetto del piccolo numero di pazienti EC (n.41) inclusi in questa coorte, l'incidenza di questo tumore è di 2195 casi per anno in Italia con 40 casi a Napoli e un livello grezzo (numero di casi in 100000 di abitanti per anno) di 2 nel sud Italia (dati dal registro dei tumori dell'associazione italiana AIRTUM 2000-2003; vedi: http://www.registritumori.it/cms/) . Inoltre, il nostro set di dati è eterogeneo per composizione e quindi comprende tutte le caratteristiche cliniche del carcinoma esofageo.

E' stata inoltre mostrata una correlazione tra il CN di erbB2 da plasma e la sopravvivenza libera da progressione in pazienti con EC con follow-up di 70 mesi (5, 8 anni). I pazienti EC sono stati divisi in due sottogruppi sulla base della media del CN (cutoff CN = 2), un'altra separazione in sottogruppi è stata fatta ma essi non hanno mostrato correlazione alla sopravvivenza libera da progressione a causa del piccolo numero di pazienti analizzati (vedi figura 5 C). I pazienti EC con erbB2 CN <2 mostravano una migliore sopravvivenza rispetto a quelli con CN >2. Questi dati dimostrano che la misurazione del CN di erbB2 nel plasma di pazienti EC può predire i tassi di sopravvivenza dei pazienti prima dell'uso delle strategie cliniche di resezione. Questi dati enfatizzano i risultati ottenuti da Mimura et al., (2005) che trovano un'associazione solo tra il rate di sopravvivenza e l'amplificazione del gene erbB2 (7 pazienti positivi versus 59 pazienti negativi) misurata con ibridazione in situ fluorescente (FISH) e non tra il tasso di sopravvivenza e la colorazione positiva o negativa di erbB2 tramite immunoisotchimica [46]. Inoltre, Kuwabara et al., (2009) hanno anche dimostrato la corrispondenza tra l'amplificazione del gene (analizzata tramite FISH) e l'espressione proteica (analizzata tramite immunoistochimica) di erbB2, sottolineando che l'amplificazione genica è un indicatore di cattiva prognosi nel carcinoma esofageo [35].

In particolare, è stato trovato che un erbB2 CN >2 era correlato ad una peggior tasso di sopravvivenza nell'istotipo adenocarcinoma . Da notare, è stato mostrato che 1'adenocarcinoma esofageo era in aumento nelle regioni dell'ovest del mondo nell'ultima metà dello scorso secolo, e specialmente negli uomini bianchi europei caucasici, sebbene il carcinoma esofageo a cellule squamose rimane il tipo di EC predominante sia nei paesi dell'ovest che dell'Asia [47-49]. Il rapido aumento di questo istotipo di adenocarcinoma è stato attribuito ad un aumento della prevalenza di reflusso esofageo ed obesità [47-49].

Inoltre, i dati confermano l'importanza della valutazione dello stato N attraverso l'analisi Kaplan-Meier. Quando i pazienti sono divisi in base allo stato N, un erbB2 CN >2 riduce il tasso di sopravvivenza dei pazienti con stato NI, confermando l'importanza dell'amplificazione del gene erbB2 nella predizione di un decorso clinico peggiore.

E' stato anche confermata l'importanza dell'espressione di VEGF nel set di dati, dimostrando che alti livelli di espressione di VEGF riducono il rate di sopravvivenza di questi pazienti EC.

Inoltre, è stata identificata una nuova categoria di rischio di EC: bassa espressione di VEGF e erbB2 CN >2. Questi dati sono importanti per le potenziali nuove terapie, anti erbB2, che potrebbero essere applicate a pazienti EC che non avranno benefici dal trattamento con anti VEGF.

L'uso dei metodi secondo la presente invenzione per misurare il DNA nel plasma di pazienti EC è in grado di aiutare la fase di rilevazione precoce, prima della resezione chirurgica del tumore e della chemioterapia, e indicare l'opportunità di variazioni nelle terapia per quei pazienti EC, VEGF positivi. La validazione della misurazione di erbB2 in una popolazione di larga scala rappresenta un nuovo marcatore prognostico da impiegare come un segno di EC precoce e pericoloso, e per la predizione di progressione della malattia. In questo modo, l'inibizione dell'attività di erbB2 potrebbe rappresentare una nuova possibilità per l'inibizione con successo della potenziale formazione di metastasi e rappresenta un nuovo target terapeutico per future terapie personalizzate contro il cancro. Questi dati indicano l'associazione tra la variazione del CN di erbB2 e la sopravvivenza libera da progressione in questi pazienti con EC.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione una sequenza nucleotidica intronica del gene erbB2 per l'uso come biomarcatore di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detta sequenza essendo consistente in:

CGCTGGGCAGGTATGCAgggctgacgtagtgcctttgtggcagcagTTTCGTG GCACACATTCTGC (SEQ ID No: 1)

(chrl7:37862429+37862494)

oppure

TATGCAGGGCTGACGTAGTGCctttgtggcAGCAGTTTCGTGGCACACATT (SEQ ID No: 2) (chrl7:37862440+37862490) contenuta in SEQ ID No:l; oppure la sequenza ribonucleotidica corrispondente alla SEQ ID NO:l in cui T è sostituita con U, ossia CGCUGGGCAGGUAUGCAGGGCUGACGUAGUGCCUUUGUGGCAGCAGUUUCGUGGC ACACAUUCUGC (SEQ ID NO: 13).

La presente invenzione concerne inoltre un metodo in vitro per la rilevazione di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto metodo essendo caratterizzato dalla rilevazione della variazione del numero di copie del gene erbb2 nelle cellule di un campione biologico rispetto al numero di copie di detto gene nelle cellule di un controllo sano mediante metodo TaqMan che impiega la seguente coppia di primer e una sonda per l'amplificazione di SEQ ID No: 1:

er-gen_for: CGCTGGGCAGGTATGCA (SEQ ID No: 3)

er-gen_rev : GCAGAATGTGTGCCACGAAA (SEQ ID No: 4) sonda erbB2: CTGACGTAGTGCCTTTGTGGCAGCA (SEQ ID No: 5) e una coppia di primer e una sonda per l'amplificazione di un gene normalizzatore scelto nel gruppo che consiste in gene beta-actina ID: 60, GAPDH Gene ID: 2597, UBB Gene ID: 7314, TUBA6 Gene ID: 84790, RPS13 Gene ID: 6207, NACA Gene ID: 4666, B2M Gene ID: 567, TBP Gene ID: 6908.

In particolare, la coppia di primer e la sonda per l'amplificazione di un gene normalizzatore può consistere nella seguente coppia di primer e sonda per l'amplificazione del gene beta-actina:

actb-gen _for : CCCAGCCACACCACAAAGTC (SEQ ID No: 6) actb-gen _rev : CCAGTTGAATAAAAGTGCACACCTT(SEQ ID No: 7)

sonda β-actin : CACTTGGCCTCATTTT (SEQ ID No: 8) Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un metodo in vitro per la rilevazione di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto metodo essendo caratterizzato dalla rilevazione della variazione del numero di copie del gene erbb2 nelle cellule di un campione biologico rispetto al numero di copie di detto gene nelle cellule di un controllo sano mediante metodo Syber che impiega la seguente coppia di primer per l'amplificazione di SEQ ID No: 2:

erbB2 S F: TATGCAGGGCTGACGTAGTGC (SEQ ID No: 9)

erbB2 S R: AATGTGTGCCACGAAACTGCT (SEQ ID No: 10) e una coppia di primer per l'amplificazione di un gene normalizzatore scelto nel gruppo che consiste in gene beta-actina ID: 60, GAPDH Gene ID: 2597, UBB Gene ID: 7314, TUBA6 Gene ID: 84790, RPS13 Gene ID: 6207, NACA Gene ID: 4666, B2M Gene ID: 567, TBP Gene ID: 6908.

In particolare, la coppia di primer per l'amplificazione di un gene normalizzatore può consistere nella seguente coppia di primer per l'amplificazione del gene beta-actina:

β-actin F: CCTCACCCTGAAGTACCCCA (SEQ ID No: 11) β-actin R: TCGTCCCAGTTGGTGACGAT (SEQ ID No: 12)

La presente invenzione concerne inoltre un metodo in vitro per la rilevazione di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto metodo essendo caratterizzato dalla rilevazione della diversa espressione di erbB2 nell'RNA eterogeneo delle cellule di un campione biologico rispetto all'espressione di erbB2 nell'RNA eterogeneo delle cellule di un controllo sano mediante metodo TaqMan che impiega la seguente coppia di primer e una sonda per l'amplificazione di SEQ ID No: 13:

erbB2 RNA_for: CGCUGGGCAGGUAUGCA (SEQ ID No: 14) erbB2 RNA rev : GCAGAAUGUGUGCCACGAAA (SEQ ID No:15) sonda erbB2 RNA: CUGACGUAGUGCCUUUGUGGCAGCA (SEQ ID No:16)

e una coppia di primer e una sonda per l'amplificazione di un gene normalizzatore scelto nel gruppo che consiste in gene beta-actina ID: 60, GAPDH Gene ID: 2597, UBB Gene ID: 7314, TUBA6 Gene ID: 84790, RPS13 Gene ID: 6207, NACA Gene ID: 4666, B2M Gene ID: 567, TBP Gene ID: 6908.

Il campione biologico può essere scelto tra siero/plasma, sangue periferico intero, sangue midollare, liquido cefalorachidiano, liquido ascitico, succhi gastrici, feci, urine, liquido seminale, bile, saliva, liquido pleurico dei pazienti.

I metodi della presente invenzione possono essere vantaggiosamente impiegati per la prognosi e la diagnosi della malattia tumorale.

La presente invenzione riguarda anche un kit per la rilevazione in vitro di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto kit comprendendo o essendo consistente nei seguenti primer e sonde per la rilevazione della variazione del numero di copie del gene erbb2 nelle cellule di un campione biologico rispetto al numero di copie di detto gene nelle cellule di un controllo sano mediante metodo TaqMan:

er-gen_for: CGCTGGGCAGGTATGCA (SEQ ID No: 3)

er-gen_rev : GCAGAATGTGTGCCACGAAA (SEQ ID No: 4) sonda erbB2: CTGACGTAGTGCCTTTGTGGCAGCA (SEQ ID No: 5) e una coppia di primer e sonda per l'amplificazione di un gene normalizzatore scelto nel gruppo che consiste in gene beta-actina ID: 60, GAPDH Gene ID: 2597, UBB Gene ID: 7314, TUBA6 Gene ID: 84790, RPS13 Gene ID: 6207, NACA Gene ID: 4666, B2M Gene ID: 567, TBP Gene ID: 6908. In particolare, la coppia di primer e la sonda per l'amplificazione di un gene normalizzatore può consistere nella seguente coppia di primer e sonda per l'amplificazione del gene betaactina:

sonda β-actin : CACTTGGCCTCATTTT (SEQ ID No: 8) Inoltre, costituisce oggetto della presente invenzione un kit per la rilevazione in vitro di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto kit comprendendo o essendo consistente nelle seguenti coppie di primer per la rilevazione della variazione del numero di copie del gene erbb2 nelle cellule di un campione biologico rispetto al numero di copie di detto gene nelle cellule di un controllo sano mediante metodo Syber:

erbB2 S F: TATGCAGGGCTGACGTAGTGC (SEQ ID No:9)

erbB2 S R: AATGTGTGCCACGAAACTGCT (SEQ ID No: 10) e una coppia di primer per l'amplificazione di un gene normalizzatore scelto nel gruppo che consiste in gene beta-actina ID: 60, GAPDH Gene ID: 2597, UBB Gene ID: 7314, TUBA6 Gene ID: 84790, RPS13 Gene ID: 6207, NACA Gene ID: 4666, B2M Gene ID: 567, TBP Gene ID: 6908. In particolare, la coppia di primer per l'amplificazione di un gene normalizzatore può consistere nella seguente coppia di primer per l'amplificazione del gene beta-actina:

La presente invenzione concerne inoltre un kit per la rilevazione in vitro di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto kit comprendendo o essendo consistente nelle seguenti coppia di primer e una sonda per la rilevazione della diversa espressione di erbB2 nell 'RNA eterogeneo delle cellule di un campione biologico rispetto all'espressione di erbB2 nell'RNA eterogeneo delle cellule di un controllo sano mediante metodo TaqMan:

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una sequenza nucleotidica intronica del gene erbb2 consistente in:

CGCTGGGCAGGTATGCAgggctgacgtagtgcctttgtggcagcagTTTCGTG GCACACATTCTGC (SEQ ID No: 1) oppure

TATGCAGGGCTGACGTAGTGCctttgtggcAGCAGTTTCGTGGCACAC ATT (SEQ ID No: 2) oppure la sequenza ribonucleotidica corrispondente alla SEQ ID NO:l in cui T è sostituita con U, ossia CGCUGGGCAGGUAUGCAGGGCUGACGUAGUGCCUUUGUGGCAGCAGUUUCGUG GCACACAUUCUGC (SEQ ID NO: 13).

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati in cui: Figura 1 mostra la variazione del numero di copie di ErbB2 nel DNA estratto dal plasma dei pazienti con carcinoma esofageo versus i controlli sani e relative curve ROC del saggio.(A) Box plot che mostra il range dei CN di erbB2 nel DNA da plasma dei pazienti EC (n.41) rispetto ai controlli sani (n.34). *P = 0.001. Le barre orizzontali nella box rappresentano la mediana dei CN che è uguale a 2 per i pazienti e 1 per i controlli. (B) Curve ROC (linea continua; AUC, 0.95) sono state effettuate per saggiare la sensibilità e la specificità dei CN di erbB2 (80% sensibilità e 95% specificità (linea tratteggiata; AUC, 0.5; P = 1.39 xlCT<11>). I dati sono rappresentativi di tre esperimenti.

Figure 2 mostra le curve di sopravvivenza Kaplan-Meier per le variazioni del numero di copie di ErbB2 nel plasma dei pazienti con carcinoma esofageo divisi in base alle caratteristiche cliniche. (A) Tutti i pazienti con EC; (B) pazienti EC con grading G2 del tumore; (C) pazienti EC con istologia adenocarcinoma; (D) pazienti EC con stadio Ni. I pazienti sono divisi per gruppi con erbB2 CN <2 (linea continua) ed erbB2 CN >2 (linea tratteggiata). I dati sono rappresentativi di tre esperimenti.

Figure 3 mostra la variazione del numero di copie di ErbB2 nel plasma dei pazienti con carcinoma esofageo divisi in base ai livelli plasmatici della proteina VEGF. (A) Istogramma che mostra la correlazione non significativa tra CN di erbB2 e livelli di VEGF nel plasma dei pazienti con EC (n.

41), come indicato. I numeri nelle barre mostrano il numero dei pazienti in ogni sotto gruppo (B, C).

Curve di sopravvivenza Kaplan-Meier per tutti i pazienti EC in base ai bassi o alti livelli di VEGF (B), e per i pazienti con EC e bassi livelli di VEGF divisi in base ad erbB2 CN <2 (linea blu) e erbB2 CN >2 (linea verde). I dati sono rappresentativi di tre esperimenti.

Figure 4 mostra la separazione ed isolamento delle cellule tumorali circolanti usando la tecnica "fluorescence-activated celi sorting" FACS.(A, B) Scatter plots per l'isolamento delle cellule positive a CK8, CK18, CK19 ed EpCAM nelle cellule MDA-231T, linea cellulare di carcinoma umano alla mammella (A; controllo positivo) e dal sangue di un paziente con EC. (C) Istogramma che mostra i CN di erbB2 dalle CTCs dei pazienti con EC in confronto con i CN ricavati dal DNA estratto dal plasma degli stessi pazienti. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti.

Figura 5 mostra la curva di calibrazione per i geni erbB2 e β—actin che mostrano i cicli soglia CT ed il numero di copie dei geni . (A) Per il gene erbB2. In alto a destra, equazione della curva e relativo coefficiente medio di correlazione (R2). (B) per il gene β-actin. In alto a destra, come per (A).

(C) Curva di sopravvivenza Kaplan-Meier per tutti i pazienti con EC divisi in base allo stato del gene erbb2 (perdita, normale o amplificazione).

Figura 6 mostra ErbB2 nei tessuti di carcinoma esofageo. (A) Colorazione di ErbB2 con un anticorpo policlonale nei tessuti dei pazienti con EC. 1, 2 and 3, mostrano il punteggio (score) di ++, + e , rispettivamente. (B) Colorazione di ErbB2 come in (A), nei tessuti di mucosa dell'esofago (CTR).

Figura 7 mostra la curva di calibrazione per i geni erbB2 e β-actin che mostrano i cicli soglia CT ed il numero di copie dei geni. In alto per il gene β-actin con l'equazione della curva e relativo coefficiente medio di correlazione (R2). In basso per il gene erbB2.

Figura 8 mostra la variazione del numero di copie di ErbB2 nel DNA estratto dal plasma dei pazienti con carcinoma gastrico versus i controlli sani. Box plot che mostra il range dei CN di erbB2 nel DNA da plasma dei pazienti EC (57) rispetto ai controlli sani (n.7234). P = 0.04. Le barre orizzontali nella box rappresentano la mediana dei CN.

Esempio 1: Studio sulla rilevazione del numero di copie del gene erbB2 nel plasma dei pazienti con carcinoma esofageo

Materiali e metodi

Prelievo dei campioni

Il presente studio ha incluso 41 pazienti (uomini e donne; età 52-74 anni) con EC (EC), diagnosticato dal Dipartimento Medico-Chirurgico di Internistica Clinica e Sperimentale "F. Magrassi e A. Lanzara" SUN, Università degli Studi, Napoli, Italia. La commissione etica della SUN ha approvato questo studio ed il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti prima dell'inclusione dello studio.

La tabella 1 mostra l'associazione della variazione del numero di copie di erbB2 con le caratteristiche clinico-patologiche dei pazienti con carcinoma esofageo (EC) .

N. di

Caratteristiche pazienti Numero di copie di erbB2

(%) <2 (3⁄4) >2 (3⁄4)

Età (anni)

>60 9 (22) 5 (20.8) 4 (23.5) 0.84

<60 32 (78) 19 (79.2) 13 (76.5)

Stadio T

TI 0 0

T2 8 20 4 (16.7) 4 (25) 0.81

T3 27 (67.5) 17 (70.8) 10 (62.5)

T4 5 (12.5) 3 (12.5) 2 (12.5)

Stadio N

NO 15 (39.5) 9 (39.1) 6 (40) 0.96

NI 23 (60.5) 14 (60.9) 9 (60)

N2 2 (3.4) ND ND

Grading tumorale

Gl 9 (24.3) 5 (22.7) 4 (11.1) 0.28

G2 20 (54.1) 14 (63.6) 6 (40)

G3 3 (13.6) 5 (33.3) 8 216

Localizzazione

tumorale

superiore 7 (17.1) 6 (25) 1 (5.9) 0.05 Centrale 20 (48.8) 8 (33.3) 12 (70.6) inferiore 14 (34.1) 10 (41.7) 4 (23.5) Istologia

squamoso 26 (63.4) 13 (54.2) 13 (76.5) 0.14 adenocarcinoma 15 (36.6) 11 (45.8) 4 (23.5)

Gli stadi T ed N sono stati valutati in accordo ai criteri UICC

Trentaquattro campioni di sangue periferico in EDTA da 34 volontari sani hanno costituito il gruppo di controllo negativo. Il sangue periferico di casi patologici e di controllo è stato centrifugato a 2850<χ>g per 10 min a 4°C, e il sopranatante (plasma) è stato conservato a -80°C fino al momento dell'analisi. Il lasso di tempo tra il prelievo di sangue e il processamento del plasma è stato di circa quattro ore sia per i pazienti EC che per i controlli sani.

Tutti i campioni di plasma da pazienti con EC inclusi nel presente studio sono stati prelevati prima della resezione chirurgica del tumore e prima del trattamento chemioterapico.

Preparazione del DNA da plasma

Un totale di 500 pL di plasma è stato trattato con 1 mg mLh<1>proteinasi K (GIBCO) e 10% SDS (Sigma Aldrich) per 1 h a 65°C. Questi campioni sono stati poi riscaldati a 95 °C per 10 min, per inattivare la proteinasi K. Il DNA nei campioni ha stato poi estratto con fenolo e precipitato con etanolo. Dopo la centrifugazione a 6000x g per 15 min a 4 °C, i pellet di DNA sono stati risospesi in 30 μΐ di acqua sterile.

Clonaggio dei prodotti di amplificazione di erbB2 e β-actina tramite reai time PCR per l'analisi del numero di copie

Dopo l'amplificazione tramite PCR, i prodotti della reai time PCR per erbB2 e β-actina sono stati clonati separatamente nel vettore per 2.1, usando il sistema originale di clonaggio TA (Invitrogen). Brevemente, i frammenti dei geni erbB2 e β-actina sono stati amplificati dal DNA genomico di sangue periferico del controllo saNo: I primers di PCR e le condizioni dei cicli erano le stesse usate per la reai time PCR del DNA da pazienti EC. Dopo il clonaggio nel vettore per 2.1, i plasmidi per erbB2 e β-actin sono stati preparati alla concentrazione di 100 ng/μΐ.

Determinazione delle variazioni del numero di copie di erbB2

Reai time PCR

La reai time PCR quantitativa (metodo Syber Green) è stata eseguita usando protocolli standard con un sistema Applied Biosystems ABI PRISM 7900HT Sequence Detection. Brevemente, 100 ng di DNA sono stati aggiunti a 12.5 μΐ di SYBR-green PCR master mix (Applied Biosystems), con 600 nM di ogni primer, e acqua per arrivare ad un volume finale di 25 μΐ. Le reazioni sono state amplificate con un singolo step di 2 min a 50 °C, uno di 5 min a 95°C, e poi per 40 cicli di 5 s a 95°C, e un ultimo step di 1 min a 60°C. Il protocollo di denaturazione termica è stato effettuato alla fine della PCR per determinare il numero di prodotti che erano presenti nelle reazioni. Tutte le reazioni sono state corse in triplicato e sono stati inclusi controlli non-templato per ogni gene. L'ammontare di ogni gene è stato normalizzato utilizzando la β-actina come gene di riferimento. I primers di reai time PCR per ogni gene sono stati disegnati utilizzando il software Primer Expression, versione 2.0 (Applied Biosystems), con una Tm di 60 °C ed una lunghezza dei primers tra 18 e 25 nt. Abbiamo usato un'analisi standard per calcolare l'amplificazione del gene erbB2 tramite il metodo 2<Λ>-DCt come descritto precedentemento (39). La reai time PCR è stata fatta due volte per ogni campione, e abbiamo usato il valore medio di questi due dati ottenuti indipendentemente per le successive analisi.

Curve di calibrazione

Per ogni esperimento, abbiamo preparato una curva di calibrazione di riferimento come descritto precedentemente (31), che contenesse una serie di diluizioni dei plasmidi esprimenti i geni erbB2 e βactina da 1.0 ng/μΐ a 1.0<χ>10<~8>ng/μΐ. Ogni curva di calibrazione è stato prodotta in triplicato. Abbiamo testato la riproducibilità delle curve di calibrazione per la determinazione dei geni erbB2 e β-actina in accordo alle pendenze e ai coefficienti di correlazione delle curve di calibrazione ottenute da ogni esperimento. Le pendenze medie delle curve di calibrazione per i due geni sono risultate simili: -3.285 per erbB2 e -3.036 per β-actina. I coefficienti medi di correlazione delle misure delle curve erano 0.989 e 0.994, rispettivamente. In questo lavoro abbiamo mostrato tre pendenze rappresentative per erbB2 e β-actina con gli errori standard; pendenze della β-actina: -3.122; -2.772; -3.215, deviazione standard 0.234 ed errore standard 0.135; pendenze di erbB2: -3,263; -3,232; -3,360, deviazione standard 0,066 ed errore standard 0.039. Una pendenza di -3.3 /- 10% riflette un'efficienza del 100% /- 10% della reazione di PCR (32). Per questa ragione, le pendenze dei due geni sono simili (p values= 0,150). Abbiamo calcolato i CN di questi geni dei pazienti usando valori di Ct del vettore e calcolando i CN del vettore in accordo alla formula (31, 33, 34):

Numero di copie = (quantità (ng) * 6.022<χ>ΐθ<23>) / (lunghezza (bp) * 1.0<χ>ΐθ<9>* 650).

Questa formula prende in considerazione 6.022x1023 (molecole/mole) che è il numero di Avogadro e 660 Da, che è il peso di una singola coppia di basi.

I risultati (non sono numeri interi) sono stati trattati sulle basi del cut-off CN>2 and CN <2 e sono stati arrotondati, in particolare, per difetto se il numero decimale era tra 0 e 4; mentre sono stati arrotondati per eccesso se il numero decimale era tra 5 e 9.

I primers per il gene erbB2 sono:

erbB2 F: TATGCAGGGCTGACGTAGTGC (SEQ ID No: 9)

erbB2 R: AATGTGTGCCACGAAACTGCT (SEQ ID NO: 10)

I primers per la β-actina sono:

Reai time PCR metodo TaqMan

La reai time TaqMan Singloplex e Multiplex PCR è stata effettuata con lo stesso sistema Applied Biosystems ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System, utilizzato per la reai time metodo Syber Green. Le reazioni sono state effettuate in un volume finale di 20 μΐ. 100 ng DNA sono stati aggiunti a 10 μΐ di master mix TaqMan Universal 2.0 (Applied Biosystems) per il metodo singolplex o a 10 μΐ di master mix TaqMan Environmental 2.0 (Applied Biosystems) per il metodo multiplex, con 0,3 μΜ di ogni primer e sonda ed acqua fino a 20 pL. La reazione è stata amplificata alle seguenti temperature: 2 min at 50 °C, e 5 min at 95 °C, poi per 40 cicli di 5s a 95 °C, e lmin a 60°C. La master mix TaqMan Universal contiene la DNA polimerasi AmpliTaq Gold, l'enzima AmpErase UNG, i dNTPs, il reference passivo 1 ed un buffer salino con magnesio cloruro. L'enzima DNA polimerasi AmpliTaq Gold, permette di ottenere alte prestazioni senza formazione di prodotti aspecifici, incluso i dimeri di primers perché l'enzima viene attivato soltanto quando viene raggiunta la temperatura di 95°C; il Reference passivo I, è usato come normalizzatore del segnale emesso dalle sonde, per minimizzare la variabilità dovuta a varie cause, come errori di peppattaggio ed evaporazione del campione; l'enzima AmpErase UNG protegge da conseguenti re-ampificazioni da prodotti di PCR contenenti dU derivanti da contaminanti come l'RNA. La master mix TaqMan Environmental 2.0 è specifica per reai time multiplex ed include l'enzima DNA polimerasi AmpliTaq Gold come la master mix ed il reference passivo. La stabilità è stata testata a 37°C per oltre 5 settimane.

Le coppie di primer e la sonda utilizzate per erbB2 sono :

er-gen_f or: CGCTGGGCAGGTATGCA (SEQ ID NO: 3)

er-gen_rev : GCAGAATGTGTGCCACGAAA (SEQ ID NO: 4) sonda erbB2 : CTGACGTAGTGCCTTTGTGGCAGCA (SEQ ID NO: 5) Le coppie di primer e la sonda utilizzate per le normalizzazioni sono:

actb-gen _for : CCCAGCCACACCACAAAGTC (SEQ ID NO: 6) actb-gen _rev : CCAGTTGAATAAAAGTGCACACCTT (SEQ ID NO: 7)

sonda β-actin : CACTTGGCCTCATTTT (SEQ ID NO: 8)

Separazione delle cellule tumorali circolanti tramite citometria a flusso

I campioni di sangue periferico intero da sei pazienti EC sono stati centrifugati a 2850x g per 10 min a 4°C, e il plasma è stato rimosso. Il pellet cellulare risultante è stato risospeso tramite diluizione in PBS e poi centrifugato a 1700x g per 30 min a 4 °C, per separare le cellule mononucleate . Poi, le cellule mononucleate sono state colorate a 4 °C evitando l'esposizione alla luce, con: citochine CK8-, CK18-, e CK19-FITC (anticorpo monoclonale A45-B/B3; Micromet, Munich, Germany) 1:30; CD326-APC (EpCAM, BECton Dickinson) 1:10; e CD45-PerCP (BECton Dickinson) 1:10. I campioni sono stati lavati con 2 mi di PBS con 2% di siero fetale bovino, e centrifugati a 800x g per 3 min a 4 °C. Il surnatante è stato rimosso e i pellet cellulari sono stati risospesi come prima (2 mi di PBS con 2% di siero fetale bovino), e filtrati con un filtro da 30 μπι (BECton Dickinson) prima dell'analisi tramite citometria a flusso. Le strategie di selezione g includevano: una prima selezione basata sui parametri fisici del forward scattering (FSC) versus il side scattering (SSC), per eliminare detriti cellulari e cellule morte. La popolazione leucocitaria è stato esclusa con un seconda selezione nel dot plot CD45 versus SSC. Le CTCs sono state selezionate tramite una selezione basata su cellule positive per le citocheratine CK8, CK18 e CK19 / CD326. Queste cellule sono state purificate tramite selezione con la strumentazione BD FACS Aria, e raccolte in un tubo da 2 mi.

Immunoistochimica

Uno o due pezzi di tumore rappresentativi per ogni paziente sono stati esaminati tramite immunoistochimica. Abbiamo analizzato erbB2 per 14 campioni di tessuto EC con un anticorpo anti erbB2 (1:500; DakoCytomation). Lo smascheramento è stato eseguito con buffer citrato 10 mM, pH 6, per 45 min a 97°C. Il blocking è stato eseguito con un diluente standard (DakoCytomation), per 30 min a temperatura ambiente. Il segnale è stato rilevato in accordo ai kit DAKO, per 15 min (ciascuno, per biotina e streptavidina), a temperatura ambiente. La DAB (substrato dell'enzima HRP) usata era della DakoCytomation, e le fette sono state montate ed esaminate sotto un microscopio Leica DC500 (Nussloch, Germania).

Alla colorazione per immunoistochimica di erbB2 nei campioni EC è stato dato un punteggio in accordo con il lavoro di Kuwabara et al., (2009) [35], che avevano adottato gli stessi criteri precedentemente validati per il cancro della mammella; vale a dire: colorazione assente o debole in meno del 10% delle cellule tumorali (-); colorazione debole in parte della membrana in più del 10% delle cellule tumorali (+); colorazione completa in parte della membrana con debole o moderata intensità in più del 10% delle cellule tumorali (++); colorazione marcata in più del 10% delle cellule tumorali, (+++).

Saggio ELISA per il VEGF

I livelli della proteina VEGF piasmatica, sono stati determinati negli stessi campioni di plasma (41 pazienti EC) usati per le amplificazioni di erbB2 usando un kit disponibile in commercio (sandwich enzyme immunoassay, Endogen VEGF ELISA kit, Cambridge, USA). Tutti i campioni sono stati testati in duplicato.

Analisi statistiche

Tutti i dati sono presentati come le mediane ± l'errore standard. La significatività statistica è stata calcolata usando il test di Mann-Whitney. I dati grezzi di reai time PCR per l'amplificazione di erbB2 nel plasma di controlli sani e pazienti con EC sono stati normalizzati usando i valori dell'amplificazione della β-actina. I valore CN di erbB2 sono stati divisi in due gruppi, "CN >2" e "CN <2". Le potenziali associazioni tra le variabili clinico-patologiche e il CN di erbB2 sono state analizzate tramite Pearson's Chi-Squared. Le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier sono state costruite per gruppi con alti e bassi livelli di erbB2 e VEGF, così come per le variabili clinico-patolgiche disponibili nel nostro set di dati. La sopravvivenza priva di progressione è stata misurata dalla data di registrazione dello studio fino alla data della progressione o dell'ultima visita di controllo. P <0.05 è stato considerato come statisticamente significativo .

Le curve delle caratteristiche del ricevitore operativo (ROC) e l'area sotto le curve ROC sono state generate per calcolare la specificità e la sensibilità della variazione di CN nei controlli sani e nei pazienti EC.

Risultati

Misura delle variazioni del numero di copie di erbB2 in DNA da plasma di pazienti con carcinoma esofageo

La reai time PCR per l'analisi CN è stata usata per l'analisi del DNA da plasma di 41 pazienti con EC, prima della resezione chirurgica e del trattamento chemioterapico. Abbiamo analizzato anche le variazioni di CN di erbB2 in 34 controlli sani. Come mostrato in figura Al, i CN di erbB2 erano significativamente più alti in campioni di plasma dai 41 pazienti EC, rispetto ai 34 soggetti sani di controllo (P=0.001). In particolare, 24 pazienti EC avevano CN <2 (58.5%), mentre 17 pazienti EC avevano CNs >2 (41.4%) con un CN medio di 2 e una deviazione standard di 5.02. I 34 soggetti sani di controllo mostravano una media di CN di erbB2 di 1, con una deviazione standard di 0.16. Le curve di calibrazione rappresentative per i geni erbB2 e beta-actina usati per l'analisi di variazione del CN sono mostrate nelle informazioni di supporto (Fig. 5).

Abbiamo anche valutato i dati dei CN di erbB2 tramite reai time PCR usando curve ROC, che permettono un'analisi della sensibilità e della specificità dell'esperimento. Le curve ROC sono state costruite per i CN di erbB2 nel plasma, esaminando 41 pazienti EC e 34 controlli sani. Come mostrato in figura 1B, in questo set di campioni, erbB2 aveva un'area sotto la curva (AUC) di 0.95, ed una significatività di P = 1.39 xlO<-11>. Per distinguere pazienti con EC dai controlli sani, erbB2 aveva una sensibilità dell'80% e una specificità del 95%.

L'associazione delle variazioni di CN di erbB2 con le caratteristiche clinico-patologiche dei pazienti EC è riassunta delle informazioni di supporto (tabella 1). L'associazione del CN di erbB2 e le caratteristiche cliniche del carcinoma esofageo sono state valutate anche tramite il test Chi-Squared. Non c'erano correlazioni dirette statisticamente significative tra il CN di erbB2 e queste caratteristiche cliniche, eccetto per la localizzazione del tumore quando associati a CN di erbB2 >2 (P = 0.05). Nonostante il basso numero di pazienti, il nostro set di dati comprende tutte le caratteristiche del tumore riguardo allo stadio T, stato N, grading tumorale, tumore locale ed istologia (tab. 1). Tutti i valori di CT del saggio reai time PCR per pazienti EC e controlli sani sono stati mostrati della tabella 2.

Tabella 2

Codice CT di Codice

dei CT di dei CT di CT di βpazienti erbB2 β~ controlli erbB2

actina actina EC sani

PI 21.94 20.46 elO 31.54 26.63 P2 25.97 26.01 el2 25.13 20.16 P3 31.77 26.45 el3 28.62 24.28 P4 23.54 22.50 el4 29.46 24.66 P5 28.54 27.04 e2 34.69 29.60 P6 26.84 27.55 e20 31.69 26.91 P7 26.80 25.02 e22 29.20 24.88 P8 23.70 22 .45 e23 27.59 22.78 P9 23.28 21.80 e3 28.53 23.72 PIO 28.98 27.29 e40 26.75 23.63 PII 21.79 20.40 e41 23.36 20.97 P12 29.51 27.62 e46 29.43 26.72 P13 26.50 25.38 e48 27.99 24.96 PI4 28.57 26.85 e49 28.58 23.38 P15 27.71 26.64 e5 31.21 25.92 P16 22.51 21.11 e51 29.03 23.99 PI7 26.57 25.02 e52 29.73 24.83 PI8 21.80 20.64 e53 27.69 22.62 PI9 27.50 26.48 e55 30.00 24.88 P20 26.43 25.27 e56 27.81 22.51 P22 37.16 26.94 e57 30.34 24.94 P24 22.98 21.16 e6 29.04 23.84 P25 24.21 21.98 e7 30.16 24.79 P26 24.28 22.87 e8 29.54 24.13 P27 24.73 22.87 f3 24.09 20.37 P28 30.16 27.35 f4 23.01 19.44 P29 27.63 25.78 f5 25.96 22.33 P30 23.69 21.59 f6 24.27 20.57 P31 23.45 20.87 el 28.55 24.01 P32 21.78 19.34 el5 31.79 27.47 P33 21.47 19.20 el8 29.67 25.63 P34 21 .76 20.40 el9 30 .80 26.29 P35 20.91 18.53 e21 27.92 23.20 P36 21.78 21.38 e24 32 .45 27.92 P37 25.14 25.61

P39 23 .25 20.52

P40 27.66 25.16

P41 21 .93 19.55

P42 28 .12 26.29

P43 31.68 26.43

P44 22.32 19.56

La tabella 3 mostra la variazione del numero d1 copie d i erbB2 nel DNA estratto dal plasma dei pazienti con EC in confronto al numero di copi e rilevato nelle CTCs degli stessi pazienti.

Tabella 3

Codice Numero Codice

del DNA di delle Numero

dei copie CTCs dei

pazienti di pazienti di copie

EC erbB2 EC

di erbB2

P2 15 CTCs 2 11

P5 3 CTCs 5 4

P15 5 CTCs 15 5

P19 5 CTCs 19 5

P22 10 CTCs 22 10

P24 11 CTCs 24 9

I dati di variazione del numero di copie di erbB2 sono stati misurati anche con la metodologia TaqMan (TaqMan Multiplex PCR, vedi materiali e metodi) per 39 DNA estratti da plasma di pazienti con carcinoma esofageo compresi tra quelli precedentemente analizzati. Le curve di calibrazione dei geni erbB2 e β-actina sono mostrate in figura 7. Nel plasma di questi pazienti in numero di copie del gene erbB2 è più di due copie nel 79.99% dei pazienti come mostrato in tabella 5.

Tabella 5

Numero di

copie ErbB2

<2 8 (20.51%)

>2 31 (79,49%)

Numero di

pazienti 39 (100%)

Inoltre, i dati di variazione di numero di copie di erbB2 sono stati misurati con la metodologia TaqMan anche nel cancro dello stomaco. La reai time PCR (TaqMan) per l'analisi CN è stata usata per l'analisi del DNA da plasma di 57 pazienti con carcinoma dello stomaco, prima della resezione chirurgica e del trattamento chemioterapico. Abbiamo analizzato anche le variazioni di CN di erbB2 in 72 controlli sani. Come mostrato in figura 8, i CN di erbB2 erano significativamente più alti in campioni di plasma dai pazienti con carcinoma dello stomaco, rispetto ai soggetti sani di controllo (P=0.04).

Variazioni del numero di copie di erbB2 predicono il tasso di sopravvivenza nei pazienti con carcinoma esofageo.

Abbiamo usato l'analisi Kaplan-Meier per vedere le correlazioni tra le variazioni di CN di erbB2 e la sopravvivenza senza progressioni del pazienti EC. Le curve di sopravvivenza dei pazienti EC sono state divise in accordo a erbB2 CN <2 e erbB2 CN >2, come mostrato in figura 2 sulla base della media di CN di pazienti EC. Abbiamo anche cercato di dividere i pazienti con erbB2 perso (CN<1), normale (2 > CN >1) e amplificato (CN > 2) rispettivamente di 6, 14 e 21 pazienti, e usando analisi Kaplan-Meier non siamo giunti ad una significatività statistica ma abbiamo visto la stessa tendenza (vedi fig. 2A) così come per le analisi di sopravvivenza con cut-off di 2 (Fig.5 C). Il numero di pazienti qui analizzati è troppo piccolo per essere diviso in tre gruppi, per questo motivo abbiamo analizzato tutti i dati con un valore di cut-off di 2. Il CN di erbB2 >2 era significativamente correlato negativamente ai tassi di sopravvivenza in questi pazienti EC (P = 0.03; Fig. 2A).

In analisi successive, in accordo al grading tumorale, i pazienti EC con un grado tumorale G2 possono essere successivamente stratificati in accordo al CN di erbB2 <2 e CN >2, che è stato nuovamente correlato negativamente in maniera significativa ai tassi di sopravvivenza dei pazienti EC (P = 0.03; Fig. 2B). Queste analisi per pazienti EC con grado tumorale Gl e G3 non mostravano nessun effetto statisticamente significativo sui loro tassi di sopravvivenza in rapporto al basso numero di pazienti in questi sottogruppi (dati non mostrati; vedi tabella 1).

Il nostro set di dati mostrava anche una composizione istologica eterogenea quando stratificati in accordo all'istotipo . Qui, le variazioni del CN di erbB2 erano significativamente correlate ai tassi di sopravvivenza dei casi di adenocarcinoma (P = 0.03; Fig. 2C). In maniera simile, abbiamo analizzato le correlazioni tra lo stato N e i tassi di sopravvivenza: erbB2 CN >2 nel sottogruppo Ni era significativamente correlato negativamente ai tassi di sopravvivenza di questi pazienti EC (P = 0.05, Fig. 2D). Di nuovo, queste analisi per pazienti EC con stato N di N2 e N3 non mostravano alcuna significatività statistica per i tassi di sopravvivenza in rapporto al basso numero di pazienti in questi sottogruppi (dati non mostrati; vedi tabella 1).

Correlazioni delle variazioni di numero di copie di erbB2 con i livelli di VEGF

Abbiamo poi testato il CN di erbB2 per una possibile associazione con I livelli della proteina VEGF nel plasma dagli stessi pazienti EC (fig.3). I dati dei livelli di VEGF erano disponibili nella nostra banca dati di tessuti e sieri, e sono stati precedentemente pubblicati [36]. Le variazioni del CN di erbB2 non mostravano nessuna diretta associazione significativa con i livelli plasmatici di VEGF (fig.

4A). Tuttavia, quando i pazienti EC sono stati stratificati in gruppi con bassi ed alti livelli di VEGF, come mostrato in figura 4B, i livelli alti di VEGF nel plasma di quei pazienti EC erano significativamente correlati negativamente ai loro tassi di sopravvivenza (P <0.00001). In successive analisi Kaplan-Meier, abbiamo anche osservato l'influenza delle variazioni di CN di erbB2 in questi pazienti EC con bassi ed alti livelli di VEGF; un erbB2 CN >2 era significativamente correlato negativamente al tasso di sopravvivenza di pazienti EC con bassa espressione di VEGF (P = 0.05; Fig. 3C). Inoltre, questi risultati mostrano che lo stato erbB2 CN >2 e livelli bassi di VEGF nel plasma di questi pazienti EC è utile per stratificare sottogruppi di pazienti con peggiore tasso di sopravvivenza.

Isolamento di cellule tumorali circolanti da sangue periferico di pazienti con carcinoma esofageo Per capire se questo DNA nel plasma di questi pazienti EC derivava da CTCs, abbiamo isolato queste cellule dai pazienti. Effettivamente, abbiamo misurato CTCs che erano disseminate in sangue periferico di sei di questi pazienti con EC. Le CTCs sono state isolate da sangue periferico di questi pazienti EC selezionando le cellule negative per CD45 (un antigene specifico per i linfociti) e tramite un intervallo basato su componenti del citoscheletro: le citocheratine CK8, CK18 e CK19, e c CD326 (EpCAM) (vedi materiali e metodi). Le citocheratine (CK8, CK18 and CK19) e 1'antigene EpCAM sono stati usati per identificare molecole di adesione cellulare, come precedentemente descritto nel lavoro di Stoecklein et al. (2008), in cui queste citocheratine venivano usati come marcatori per isolare CTCs dai linfonodi e dal midollo osseo di pazienti con EC [11]. Come precedentemente descritto, [37] abbiamo usato la linea cellulare MDA-231T come controllo positivo (Fig. 4A). Qui mostriamo che siamo riusciti ad isolare con successo solo cellule positive dai campioni di sangue dei pazienti EC (circa il 0.05%-0.1% delle 2.0 xlO<6>cellule analizzate; Fig. 4B), da cui abbiamo estratto il DNA genomico per la determinazione dei CN di erbB2. Queste analisi sono state eseguite in tutti gli altri cinque campioni analizzati, con risultati simili (dati non mostrati). Il sangue periferico dei controlli sani è stato analizzato nello stesso modo, ma non ha mostrato nessuna popolazione cellulare positiva per CK8, CK18 e CK19 ed EpCAM, e negativa per CD45 (dati non mostrati). Le analisi di questo DNA estratto da queste CTCs di pazienti EC mostravano che il CN di erbB2 era nello stesso intervallo (CN >2) del DNA isolato dal plasma degli stessi sei pazienti EC (fig.

4C). Lo stesso paragone dei valori di CN da plasma e da CTCs è mostrato nella tabella 2.

Espressione della proteina erbB2 nei tessuti tumorali di carcinoma esofageo

In più abbiamo eseguito analisi di immunoistochimica per la proteina erbB2 (in sezioni parallele) in 13 campioni di tessuto tumorale primario, di cui quattro erano inclusi nel set di dati di DNA da plasma precedentemente analizzati. Alcuni esempi di colorazione tissutale sono mostrati nelle informazioni di supporto, in figura 6. Una forte espressione di erbB2 è mostrata nel paziente con codice 1 (score ++), con espressione intermedia di erbB2 per il paziente con codice 2 (score +) e bassa espressione per il paziente con codice 3 (score ) (informazioni di supporto, fig. 6A). Esperimenti di controllo mostravano una colorazione debole di erbB2 in tessuti epiteliali proliferanti di mucosa di esofago sano (informazioni di supporto, fig. 6B).

La tabella 4 mostra la quantizzazione del DNA estratto dal plasma dei pazienti e dei controlli.

Tabella 4

Codice Concentrazione Codice Concentrazione dei del DNA dei del DNA pazienti estratto dal controlli estratto dal plasma (ng/pl) sani plasma (ng/pl)

PI 144 elO 40

P2 159 el2 34

P3 144 el3 27

P4 95 el4 14

P5 239 e2 7

P6 201 e20 78

P7 178 e22 64

P8 197 e23 8

P9 265 e3 33

PIO 155 e40 45 PII 137 e41 67 P12 298 e46 86 P13 301 e48 53 PI4 164 e49 37 P15 234 e5 10 P16 209 e5 1 24 PI7 309 e52 39 PI8 258 e53 28 PI9 123 e55 20 P20 143 e56 7 P22 276 e5 7 81 P24 302 e6 90 P25 175 e7 38 P26 274 e8 66 P27 128 f3 89 P28 132 f4 36 P29 298 f5 73 P30 304 f6 82 P31 309 el 94 P32 259 el5 13 P33 155 el8 56 P34 235 el9 58 P35 354 e2 1 83 P36 125 e2 4 27 P37 249

P39 187

P40 299

P41 310

P42 322

P43 182

P44 221

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Claims

RIVENDICAZIONI 1) Sequenza nucleotidica intronica del gene erbb2 per l'uso come biomarcatore di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detta sequenza essendo consistente in: CGCTGGGCAGGTATGCAgggctgacgtagtgcctttgtggcagcagTTTCGTG GCACACATTCTGC (SEQ ID No: 1) oppure TATGCAGGGCTGACGTAGTGCctttgtggcAGCAGTTTCGTGGCACACATT (SEQ ID No: 2) oppure CGCUGGGCAGGUAUGCAGGGCUGACGUAGUGCCUUUGUGGCAGCAGUUUCGUGGC ACACAUUCUGC (SEQ ID No: 13).
2) Metodo in vitro per la rilevazione di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto metodo essendo caratterizzato dalla rilevazione della variazione del numero di copie del gene erbb2 nelle cellule di un campione biologico rispetto al numero di copie di detto gene nelle cellule di un controllo sano mediante metodo TaqMan che impiega la seguente coppia di primer e una sonda per l'amplificazione di SEQ ID No: 1: er-gen_for: CGCTGGGCAGGTATGCA (SEQ ID No: 3) er-gen_rev : GCAGAATGTGTGCCACGAAA (SEQ ID No: 4) sonda erbB2: CTGACGTAGTGCCTTTGTGGCAGCA (SEQ ID No: 5) e una coppia di primer e una sonda per l'amplificazione di un gene normalizzatore scelto nel gruppo che consiste in gene beta-actina ID: 60, GAPDH Gene ID: 2597, UBB Gene ID: 7314, TUBA6 Gene ID: 84790, RPS13 Gene ID: 6207, NACA Gene ID: 4666, B2M Gene ID: 567, TBP Gene ID: 6908.
3) Metodo secondo la rivendicazione 2, in cui la coppia di primer e la sonda per l'amplificazione di un gene normalizzatore consiste nella seguente coppia di primer e sonda per l'amplificazione del gene betaactina: actb-gen _for : CCCAGCCACACCACAAAGTC (SEQ ID No: 6) actb-gen _rev : CCAGTTGAATAAAAGTGCACACCTT(SEQ ID No: 7) sonda β-actin : CACTTGGCCTCATTTT (SEQ ID No: 8) 4) Metodo in vitro per la rilevazione di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto metodo essendo caratterizzato dalla rilevazione della variazione del numero di copie del gene erbb2 nelle cellule di un campione biologico rispetto al numero di copie di detto gene nelle cellule di un controllo sano mediante metodo Syber che impiega la seguente coppia di primer per l'amplificazione di SEQ ID No: 2: erbB2 S F: TATGCAGGGCTGACGTAGTGC (SEQ ID No: 9) erbB2 S R: AATGTGTGCCACGAAACTGCT (SEQ ID No: 10) e una coppia di primer per l'amplificazione di un gene normalizzatore scelto nel gruppo che consiste in gene beta-actina ID: 60, GAPDH Gene ID: 2597, UBB Gene ID: 7314, TUBA6 Gene ID: 84790, RPS13 Gene ID: 6207, NACA Gene ID: 4666, B2M Gene ID: 567, TBP Gene ID: 6908. 5) Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui la coppia di primer per l'amplificazione di un gene normalizzatore consiste nella seguente coppia di primer per l'amplificazione del gene beta-actina: β-actin F: CCTCACCCTGAAGTACCCCA (SEQ ID No: 11) β-actin R: TCGTCCCAGTTGGTGACGAT (SEQ ID No: 12) 6) Metodo in vitro per la rilevazione di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto metodo essendo caratterizzato dalla rilevazione della diversa espressione di erbB2 nell'RNA eterogeneo delle cellule di un campione biologico rispetto all'espressione di erbB2 nell'RNA eterogeneo delle cellule di un controllo sano mediante metodo TaqMan che impiega la seguente coppia di primer e una sonda per l'amplificazione di SEQ ID No: 13: erbB2 RNA_for: CGCUGGGCAGGUAUGCA (SEQ ID No: 14) erbB2 RNA rev : GCAGAAUGUGUGCCACGAAA (SEQ ID No:15) sonda erbB2 RNA: CUGACGUAGUGCCUUUGUGGCAGCA (SEQ ID No :16) e una coppia di primer e una sonda per l'amplificazione di un gene normalizzatore scelto nel gruppo che consiste in gene beta-actina ID: 60, GAPDH Gene ID: 2597, UBB Gene ID: 7314, TUBA6 Gene ID: 84790, RPS13 Gene ID: 6207, NACA Gene ID: 4666, B2M Gene ID: 567, TBP Gene ID: 6908. 7) Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 2-6, in cui il campione biologico è scelto tra siero/plasma, sangue periferico intero, sangue midollare, liquido cefalorachidiano, liquido ascitico, succhi gastrici, feci, urine, liquido seminale, bile, saliva, liquido pleurico dei pazienti . 8) Kit per la rilevazione in vitro di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto kit comprendendo o essendo consistente nei seguenti primer e sonde per la rilevazione della variazione del numero di copie del gene erbb2 nelle cellule di un campione biologico rispetto al numero di copie di detto gene in un controllo sano mediante metodo TaqMan: er-gen_f or: CGCTGGGCAGGTATGCA (SEQ ID No: 3) er-gen_rev : GCAGAATGTGTGCCACGAAA (SEQ ID No: 4) sonda erbB2 : CTGACGTAGTGCCTTTGTGGCAGCA (SEQ ID No: 5) e una coppia di primer e sonda per l'amplificazione di un gene normalizzatore scelto nel gruppo che consiste in gene beta-actina ID: 60, GAPDH Gene ID: 2597, UBB Gene ID: 7314, TUBA6 Gene ID: 84790, RPS13 Gene ID: 6207, NACA Gene ID: 4666, B2M Gene ID: 567, TBP Gene ID: 6908. 9) Kit secondo la rivendicazione 8, in cui la coppia di primer e la sonda per l'amplificazione di un gene normalizzatore consiste nella seguente coppia di primer e sonda per l'amplificazione del gene betaactina: actb-gen _for : CCCAGCCACACCACAAAGTC (SEQ ID No: 6) actb-gen _rev : CCAGTTGAATAAAAGTGCACACCTT(SEQ ID No: 7) sonda β-actin : CACTTGGCCTCATTTT (SEQ ID No: 8) 10) Kit per la rilevazione in vitro di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto kit comprendendo o essendo consistente nelle seguenti coppie di primer per la rilevazione della variazione del numero di copie del gene erbb2 nelle cellule di un campione biologico rispetto al numero di copie di detto gene nelle cellule di un controllo sano mediante metodo Syber: erbB2 S F: TATGCAGGGCTGACGTAGTGC (SEQ ID No:9) erbB2 S R: AATGTGTGCCACGAAACTGCT (SEQ ID No: 10) e una coppia di primer per l'amplificazione di un gene normalizzatore scelto nel gruppo che consiste in gene beta-actina ID: 60, GAPDH Gene ID: 2597, UBB Gene ID: 7314, TUBA6 Gene ID: 84790, RPS13 Gene ID: 6207, NACA Gene ID: 4666, B2M Gene ID: 567, TBP Gene ID: 6908. 11) Kit secondo la rivendicazione 10, in cui la coppia di primer per l'amplificazione di un gene normalizzatore consiste nella seguente coppia di primer per l'amplificazione del gene beta-actina: β-actin F: CCTCACCCTGAAGTACCCCA (SEQ ID No: 11) β-actin R: TCGTCCCAGTTGGTGACGAT (SEQ ID No: 12) 12) Kit per la rilevazione in vitro di cellule tumorali circolanti di un tumore scelto nel gruppo che consiste in tumore del colon, dell'esofago, gastrico, della mammella, dei polmoni, medulloblastoma, della prostata, linfoma, melanoma, glioblastoma, carcinoma del pancreas, sarcoma, epatocarcinoma, detto kit comprendendo o essendo consistente nelle seguenti coppia di primer e una sonda per la rilevazione della diversa espressione di erbB2 nell'RNA eterogeneo delle cellule di un campione biologico rispetto all'espressione di erbB2 nell'RNA eterogeneo delle cellule di un controllo sano mediante metodo TaqMan: erbB2 RNA_for: CGCUGGGCAGGUAUGCA (SEQ ID No: 14) erbB2 RNA rev : GCAGAAUGUGUGCCACGAAA (SEQ ID No:15) sonda erbB2 RNA: CUGACGUAGUGCCUUUGUGGCAGCA (SEQ ID No:16) e una coppia di primer e una sonda per l'amplificazione di un gene normalizzatore scelto nel gruppo che consiste in gene beta-actina ID: 60, GAPDH Gene ID: 2597, UBB Gene ID: 7314, TUBA6 Gene ID: 84790, RPS13 Gene ID: 6207, NACA Gene ID: 4666, B2M Gene ID: 567, TBP Gene ID: 6908. 13) Sequenza nucleotidica intronica del gene erbb2 consistente in: CGCTGGGCAGGTATGCAgggctgacgtagtgcctttgtggcagcagTTTCGTG GCACACATTCTGC (SEQ ID No: 1) oppure TATGCAGGGCTGACGTAGTGCctttgtggcAGCAGTTTCGTGGCACACATT (SEQ ID No: 2) oppure CGCUGGGCAGGUAUGCAGGGCUGACGUAGUGCCUUUGUGGCAGCAGUUUCGUG GCACACAUUCUGC (SEQ ID No: 13).