ITRM20100063A1 - Uso di tossine che attivano le rho gtpasi per il trattamento e/o la prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di rett (rtt). - Google Patents
Uso di tossine che attivano le rho gtpasi per il trattamento e/o la prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di rett (rtt). Download PDFInfo
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Description
Uso di tossine che attivano le Rho GTPasi per il trattamento e/o la prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett (RTT)
La presente invenzione concerne l'uso di tossine che attivano le Rho GTPasi per il trattamento e/o la prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett (RTT). In particolare, l'invenzione concerne l'uso di una tossina scelta nel gruppo che consiste in Fattore Citotossico Necrotizzante di tipo 1 (CNF1) o di tipo 2 (CNF2) di Escherichia coli o DNT di Bordetella pertussis, loro varianti, frammenti attivi o loro miscele per la preparazione di un medicamento per il trattamento e/o la prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett (RTT). Dette tossine essendo altamente omologhe almeno nella porzione catalitica. Le varianti o i mutanti sono quelli in grado di attivare le Rho GTPasi e che agiscono tramite deamidazione o transglutaminazione del peptide .
La sindrome di Rett (RTT) à ̈ una patologia dello sviluppo del sistema nervoso che colpisce prevalentemente il genere femminile con una incidenza di 1/10.000 femmine nate vive. Mutazioni a carico del gene che codifica per la proteina MECP2 sono state osservate in più del 90% dei casi diagnosticati con una variante classica della sindrome (Amir et al., 1999, Chahrour and Zoghbi, 2007) . Sebbene questa proteina sembrerebbe possedere un ruolo multifunzionale, essa agisce preferenzialmente come repressore trascrizionale (Chahrour et al., 2008, Ogier and Katz, 2008) . La collocazione del gene MECP2 sul cromosoma X e la modalità dominante secondo cui esso viene ereditato, sono responsabili del fatto che ad essere colpito da questa patologia à ̈ prevalentemente il genere femminile. La probabilità di sopravvivenza dei maschi emizigoti, come anche delle femmine omozigoti, à ̈ infatti piuttosto bassa .
Facente parte, nel DSM-IV, dei Disturbi Pervasivi dello Sviluppo, la RTT presenta una sintomatologia estremamente complessa ed invalidante. Una sua caratteristica essenziale à ̈ uno sviluppo prenatale e perinatale apparentemente normale fino a circa 6-18 mesi di vita seguito da un periodo di regressione caratterizzato dalla progressiva perdita delle abilità sia comunicative che motorie e da un rallentamento nella crescita della circonferenza cranica che di solito conduce a microcefalia. Alla fine di questo periodo di regressione, che in alcuni casi dura diversi anni, lo sviluppo delle pazienti RTT raggiunge un plateau associato a una grande varietà di sintomi specifici. Questi comprendono movimenti stereotipati delle mani, irregolarità respiratorie, anomalie dell'ECG, disturbi del sonno, scoliosi, rigonfiamenti, difficoltà di alimentazione. In questa fase sono inoltre evidenti tratti autistici, assenza di coordinazione nei movimenti e un forte ritardo mentale. Con l'avanzare dell'età le pazienti vanno incontro a un notevole peggioramento delle capacità motorie. L'aspettativa di vita à ̈ estremamente variabile, con alcuni individui che raggiungono anche i 70 anni di età (Mount et al., 2001, Hagberg, 2002).
L'utilizzo di tecniche di ingegneria genetica ha permesso la creazione di diversi modelli murini transgenici per la RTT (Chen et al., 2001, Guy et al., 2001). La progressione dei sintomi in questi modelli segue un andamento simile a quello osservabile nelle pazienti RTT, in quanto la comparsa di sintomi evidenti avviene solo in seguito ad una fase apparentemente normale.
In uno dei modelli murini per la RTT, quello che possiede una forma tronca del gene Mecp2 (Mecp2-308) (Chen et al. 2001; Shahbazian et al. 2002), una mutazione associata ad un fenotipo meno grave e riscontrabile in circa il 10% dei pazienti RTT (Chahrour and Zoghbi, 2007), à ̈ stata effettuata una dettagliata caratterizzazione del fenotipo, che ha permesso di evidenziare nella fase chiaramente sintomatica (4-10 mesi di età ) la presenza di difficoltà nella coordinazione motoria, aumentati comportamenti riferibili a stati d'ansia e deficit cognitivi (Shahbazian et al-, 2002, Moretti et al., 2005, Moretti et al., 2006; De Filippis et al., 2009; McGill et al., 2006).
Fra i segni neuropatologici caratteristici della RTT vengono annoverati: una selettiva alterazione delle dimensioni dei dendriti e dei neuroni piramidali nelle regioni frontali, motorie e temporali; un decremento nelle spine dendritiche in alcune aree cerebrali,-alterazioni a livello sinaptico e degli interneuroni; alterazioni nella immunoreattività di MAP-2, un marcatore della dendritogenesi, in alcune popolazioni di neuroni (Armstrong, 2001). L'analisi post-mortem dei cervelli dei pazienti RTT ha inoltre permesso di evidenziare che, ad essere responsabili della presenza di un ridotto volume cerebrale, piuttosto che una riduzione nel numero di neuroni, siano una marcata diminuzione nelle dimensioni del soma neuronaie e nella estensione dei dendriti (Armstrong, 2005). Molte delle evidenze ottenute mediante studi post-mortem in pazienti RTT, ed in particolare la presenza di anomalie neuromorfologiche, sono state successivamente confermate anche nei modelli murini disponibili per la RTT (Fukuda et al., 2005; Belinchenko et al. 2009). Tutte insieme queste evidenze suggeriscono che la RTT non sia un disturbo neurodegerativo, che la formazione dei dendriti e degli assoni potrebbe essere preferenzialmente colpita in questa sindrome e che la disorganizzazione sinaptica e una ridotta plasticità potrebbero essere responsabili di almeno alcune delle anomalie comportamentali e motorie associate a questo disturbo.
In uno dei modelli murini disponibili, à ̈ stato recentemente osservato che la riaccensione del gene Mecp2 in una fase avanzata della patologia à ̈ in grado di revertire almeno alcuni (principalmente quelli motori) dei sintomi caratteristici della RTT (Giacometti et al., 2007, Guy et al., 2007). Sebbene l'approccio della terapia genica non rappresenti uno strumento oggi utilizzabile nella clinica, questi risultati dimostrano che il danno causato dall'assenza di Mecp2 durante le fasi precoci dello sviluppo non à ̈ irreversibile, suggerendo perciò che questa disabilitante sindrome possa essere trattata farmacologicamente con successo.
Alla luce di quanto sopra esposto risulta pertanto evidente l'esigenza di poter disporre di nuovi metodi per il trattamento della sintomatologia della sindrome di Rett che superino gli svantaggi dei metodi noti.
La tossina chiamata Fattore Citotossico Necrotizzante di tipo 1 (CNF1) é una proteina di 110 Kda codificata da un gene presente nel cromosoma di diversi ceppi di Escherichia coli, che selettivamente e permanentemente attiva le GTPasi della famiglia Rho ed à ̈ inoltre in grado di proteggere le cellule dai processi degenerativi (apoptosi). La proteina CNFl à ̈ capace di attraversare le membrane cellulari mediante endocitosi grazie al proprio dominio N-terminale (Lemichez et al., 1997, Contamin et al., 2000) ed attivare le Rho GTPasi (in particolare le tre sottofamiglie Rho, Rac e Cdc42) mediante deamidazione di alcune glutamine critiche attraverso il proprio dominio C-terminale (Flatau et al., 1997, Schmidt et al., 1997). L'attività catalitica à ̈ condivisa dal CNF2 di Escherichia coli e dalla DNT di Bordetella spp. che sono altamente omologhe al CNFl.
Le Rho GTPasi sono proteine espresse in modo ubiquitario nelle cellule eucariotiche ed agiscono da interruttori in diversi tipi di trasmissione del segnale. In particolare, le Rho GTPasi sono coinvolte nel rimodellamento della actina citoscheletrica (Fukazawa et al., 2003). In effetti, nei neuroni, la morfogenesi degli assoni, dei dendriti e delle spine à ̈ proprio sotto il controllo di proteine appartenenti alla famiglia delle Rho (Etienne-Manneville & Hall, 2002).
Gli autori della presente invenzione hanno ora somministrato, per via intracerebroventricolare, CNF1 in uno dei modelli murini disponibili per la RTT (topi Mecp2-308) in una fase pienamente sintomatica (10 mesi di età ) per testare la eventuale efficacia del CNF1 nel contrastare almeno alcuni dei sintomi caratteristici della RTT. In particolare, sono stati inclusi in questa valutazione l'analisi delle abilità motorie (manipolazione del materiale da nido e livelli di attività locomotoria mostrate nel corso delle 24 ore), i comportamenti riferibili a stati d'ansia (tempo speso nella parte centrale di una arena) e le abilità cognitive (novel object recognition test e fear conditioning) .
Gli Autori della presente invenzione hanno sorprendentemente trovato che il trattamento con CNF1 migliora significativamente la coordinazione motoria dei topi mutanti in quanto contrasta l'incapacità dei topi Mecp2-308 di manipolare il materiale da nido. Tale deficit era infatti già stato evidenziato in questo modello murino per la RTT ed à ̈ considerato come assimilabile alla aprassia delle mani spesso osservabile nelle pazienti RTT.
Anche le anomalie nei livelli di attività locomotoria mostrate nel corso delle 24 ore dai topi Mecp2-308, ed in particolare la ipoattività nella fase buia/attiva del ciclo, sono state efficacemente contrastate dal trattamento con CNF1. Oltre ad avere effetti benefici sulle capacità motorie, il CNF1 ha anche determinato un significativo miglioramento nella abilità cognitive dei topi Mecp2-308, misurate mediante il test di fear-conditioning. I risultati ottenuti in questo studio suggeriscono quindi che alcuni dei sintomi caratteristici di questa sindrome possano essere migliorati dalla manipolazione farmacologica della connettività neuronaie ed identificano il citoscheletro come potenziale target su cui intervenire per migliorare il fenotipo RTT.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione l'uso di una tossina scelta nel gruppo che consiste in Fattore Citotossico Necrotizzante di tipo 1 (CNF1) o di tipo 2 (CNF2) di Escherichia coli o DNT di Bordetella pertussis, loro varianti, frammenti attivi o loro miscele per la preparazione di un medicamento per il trattamento e/o la prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett (RTT), dette varianti essendo varianti in grado di attivare le Rho GTPasi, e detti frammenti attivi essendo la porzione catalitica C-terminale di CNF1 (CAA50007 genBank ), di CNF2 (AAA18229 genBank) o di DNT (AAA20995 genBank) che comprende o consiste nella sequenza peptidica dall'amminoacido 720 all'amminoacido 1014 di dette tossine, la cisteina 866 e l'istidina 881 essendo amminoacidi essenziali per l'attività . Dette tossine o loro varianti o frammenti possono essere fusi a piccoli peptidi, coniugati con nanoparticelle o veicolati da immunovettori. La dose di dette tossine, di loro varianti, frammenti o loro miscele può variare da 0.0001 fmol/kg a 1 Î1⁄4mol /kg, preferibilmente da 0.001 fmol/kg a 1 pmol/kg di peso corporeo del paziente.
Il medicamento può essere preparato in una forma adatta ad una somministrazione nel sistema nervoso centrale, ad esempio in forma di spray nasale o in forma iniettabile per via intracerebroventricolare, o per via periferica, ad esempio orale, sottocutanea, intramuscolare, endovenosa, sublinguale, oculare.
Secondo un particolare aspetto della presente invenzione dette tossine, loro varianti, frammenti attivi o loro miscele possono essere associati ad uno o più principi attivi per il trattamento sintomatico della sindrome di Rett quali, ad esempio anticonvulsivanti (ad esempio topiramato, un anticonvulsivante che attiva canali del cloro GABA dipendenti e al tempo stesso inibisce la neurotrasmissione eccitatoria, mediante un'azione diretta su recettori dell'acido cainico e GluR5), e antipsicotici atipici (ad esempio risperidone, antagonista dei recettori serotoninergici 5ht2a e 5ht2c e del recettore d2 della dopamina), inibitori del reuptake della serotonina.
La sintomatologia da trattare secondo la presente invenzione può essere quella di pazienti in tutti gli stadi della sindrome di Rett. Gli stadi della malattia infatti sono stati classificati come segue: 1° stadio: fase iniziale della sindrome (età da 6 mesi a 1 anno e mezzo); 2° stadio: fase distruttiva rapida o regressione (età da 1 a 4 anni); 3° stadio.· fase di stabilizzazione (dall'età prescolare all'età adulta);4° stadio: fase del tardo deterioramento motorio (età variabile). Inoltre si può ipotizzare l'utilizzo dell'invenzione anche durante la cosiddetta fase presintomatica che precede il primo stadio della sindrome.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una combinazione di una tossina scelta nel gruppo che consiste in Fattore Citotossico Necrotizzante di tipo 1 (CNF1) o di tipo 2 (CNF2) di Escherichia coli o DNT di Bordetella pertussis, loro varianti, frammenti attivi o loro miscele e di uno o più principi attivi per il trattamento sintomatico della sindrome di Rett per l'uso simultaneo, separato o sequenziale nel trattamento e/o nella prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett (RTT), dette varianti essendo varianti in grado di attivare le Rho GTPasi,
e detti frammenti attivi essendo la porzione catalitica C-terminale di CNF1 (CAA50007 genBank ), di CNF2 (AAA18229 genBank) o di DNT (AAA20995 genBank) che comprende o consiste nella sequenza peptidica dall'amminoacido 720 all'amminoacido 1014 di dette tossine, la cisteina 866 e l'istidina 881 essendo amminoacidi essenziali per l'attività . I principi attivi impiegati per il trattamento sintomatico della sindrome di Rett possono essere quelli riportati sopra.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui:
Figura 1 mostra l'attività locomotoria spontanea in topi lasciati indisturbati nelle loro gabbie ad un mese dall'icv. I dati sono espressi come media ± SEM. * p< .05, ** p< .01; N-6-8
Figura 2 mostra l'effetto del trattamento con CNF1 sulle abilità di costruzione del nido 20 giorni dopo la somministrazione mediante icv. I dati sono espressi come media ± SEM. * p< .05, ** p< .01; N=7-9.
Figura 3 mostra la modulazione della risposta comportamentale ad un test di contextual fear conditioning da parte del trattamento con CNF1, 12 giorni dopo la somministrazione mediante icv. I dati sono espressi come media SEM; * p< .05, ** p< .01; N=7-9.
Esempio 1: Studio dell'efficacia di CNF1 in topi Mecp2-308
MATERIALI E METODI
Preparazione di CNF1
Il CNF1 à ̈ stato ricavato dal ceppo 392 ISS (gentilmente fornito da V. Falbo, Roma, Italia) e purificato come precedentemente descritto in (Falzano et al., 1993). Come controllo à ̈ stata utilizzata la proteina ricombinante CNF1 C866S. In tale proteina infatti, l'attività enzimatica sulle Rho GTPasi viene eliminata mediante la sostituzione di una cisteina con una serina nella posizione 866 (Schmidt et al., 1998). Il plasmide codificante per CNF1 C866S à ̈ stato gentilmente fornito da E. Lemichez (U627 INSERM, Nice, France) e la proteina ricombinante à ̈ stata purificata come descritto in (Falzano et al., 1993).
Somministrazione intracerebroventricolare di CNF1 (icv)
In seguito ad anestesia totale (Equithesin, 3 ml/kg ip), i topi sono stati immobilizzati in un apparato stereotassico. Una soluzione di CNF1 (1 Î1⁄4Î ) o della proteina ricombinante CNF1 C886S (1 Î1⁄4Î ) Ã ̈ stata quindi intracerebroventricolarmente iniettata per circa un minuto alle seguenti coordinate stereotassiche AP=0.0; ML=+0.72 DV=-2.0 relativamente al bregma. In seguito all'operazione gli animali sono stati suturati con della colla apposita e lasciati indisturbati su di un tappetino riscaldato per permettergli di tornare ad una temperatura corporea adeguata.
Animali
Come soggetti sperimentali abbiamo utilizzato topi Mecp2-308 di circa 10 mesi di età e i loro fratelli wild-type, derivanti da un accoppiamento fra femmine eterozigote per la mutazione tronca di Mecp2 e maschi emizigoti, provenienti dai laboratori Jackson (USA) (B6.129S-Mecp2tmlHzo/J, stock number: 005439; incrociati con topi C57BL/6J per almeno 12 generazioni) .
Dopo essere stati sottoposti all'icv, i topi sono stati mantenuti isolati in gabbie trasparenti (33 x 13 x 14 cm) con segatura sul fondo. Acqua da bere e una dieta completa specifica per roditori (Rieper, BZ, Italy) sono stati forniti loro ad libitum. Nella stanza in cui gli animali erano stabulati il ciclo luce-buio seguiva il seguente regime: le luci venivano automaticamente spente alle 8 di mattina e riaccese alle 8 di sera. La temperatura della stanza era mantenuta costantemente intorno a 21 ± 1 C e l'umidità relativa intorno al 60 ± 10%. Tutte le procedure adottate sono in accordo con le Direttive Europee (86/609/EEC) ed approvate dal Consiglio dei Ministri italiano.
Attività locomotoria spontanea
Nei giorni immediatamente successivi all'icv ed a un mese di distanza dall'intervento, l'attività locomotoria spontanea all'interno delle gabbie dei mutanti e dei controlli à ̈ stata valutata mediante l'utilizzo di un software che monitorà il movimento degli animali utilizzando sensori infrarossi collocati in cima alla gabbia [ACTIVISCOPE System, NEWBEHAVIOR, CH; sito internet: www.newbehavior.com, vedi anche (Dell’Omo et al., 2002, Adriani et al., 2003). Il profilo di attività locomotoria nel corso delle 24 ore à ̈ stato quindi calcolato come la media su 7 giorni di misurazioni per ciascun animale.
Abilità di costruzione del nido
Cinque giorni dopo il test di Fear conditioning (vedi sotto), per valutare la coordinazione motoria degli arti anteriori, i mutanti ed i controlli sono stati sottoposti ad un test che sfrutta la naturale tendenza della specie topo ad utilizzare materiale cartaceo per la costruzione di nidi. A tutti gli animali à ̈ stato quindi fornito un pezzo di carta (10 x 12 cm) e a distanza di 1, 48 e 72 ore, la posizione e la qualità del nido sono stati valutati mediante una scala di valutazione che prevede l'assegnazione di un punteggio pari a zero nel caso la carta non sia stata toccata, e pari a 4 nel caso il nido sia stato ben collocato e ben fatto. Per l'applicazione di questo test vedi anche (Moretti et al., 2005).
Contextual and cued fear conditioning testa (test contestuale e di condizionamento alla paura indotta) Quattro giorni dopo il test di novel object recognition (vedi sotto), gli animali sono stati sottoposti ad un test di fear conditioning come descritto in (Moretti et al., 2005). Questo test consiste in 3 fasi. Durante la fase di addestramento, gli animali sono stati introdotti in una camera il cui pavimento à ̈ costituito di grata metallica e può rilasciare uno schock elettrico all'animale (Coulbourn Instruments, Allentown, USA). Dopo 3 minuti indisturbati in questa camera, gli animali sono stati esposti ad un suono per 30 secondi, associato ad uno schock negli ultimi 2 secondi (0.6 mA) (training). Dopo ulteriori 30 sec, gli animali sono stati riportati nelle loro gabbie. Nella fase successiva, 24 ore dopo, gli animali sono stati ricollocati all'interno della stessa gabbia in cui avevano ricevuto il giorno precedente lo schock ed il loro comportamento à ̈ stato osservato per un totale di 4 minuti (context test). La terza ed ultima fase à ̈ stata effettuata a distanza di almeno 1 ora dalla seconda. Durante questa fase, l'animale à ̈ stato introdotto in un nuovo contesto e dopo 3 minuti durante i quali ha potuto esplorare indisturbato il nuovo ambiente, l'animale à ̈ stato nuovamente esposto ad un tono uguale a quello da lui udito nel corso della fase di addestramento, ma della durata di 3 minuti e questa volta non associato allo schock (tone test). La durata e la frequenza dei seguenti comportamenti à ̈ quindi stata valutata in tutte le fasi del test: Crossing (numero di attraversamenti di due linee che suddividevano il pavimento in 3 parti uguali), Rearing (sollevamento della porzione anteriore del corpo e della testa), Wall rearing (sollevamento della porzione anteriore del corpo dal pavimento utilizzando come supporto le pareti della gabbia), Grooming (auto-pulizia del corpo), Inactivity (immobilità , ad eccezione di piccoli movimenti della testa).
Novel object recognition test (test di riconoscimento degli oggetti nuovi)
Ad una settimana di distanza dall'icv gli animali sono stati valutati nel test di riconoscimento di un oggetto nuovo come descritto in (Papaleo et al., 2008). All'inizio del test gli animali sono stati collocati in una arena vuota (40 x 40 cm) e lasciati lì per circa un'ora in modo che l'ambiente diventasse loro familiare (fase di abituazione).
Il giorno successivo i topi sono stati ricollocati nella stessa arena nella quale erano però presenti due oggetti identici. La durata di questa fase era di 10 minuti. A distanza di circa un'ora, gli animali sono stati ri-esposti per 5 minuti alla stessa arena nella quale uno dei due oggetti familiari era stato sostituito con un oggetto nuovo. Il tempo trascorso dagli animali nell'esplorare 1' oggetto familiare e quello nuovo durante la terza fase, fornisce un indice di riconoscimento da parte degli animali dell'oggetto nuovo rispetto a quello familiare.
Analisi dei dati
L'analisi della varianza (ANOVA) à ̈ stata condotta su tutti i dati. In particolare, il modello utilizzato prendeva in considerazione come fattore fra soggetti il genotipo e il trattamento (CNF1 o CNF C886S) ed uno o più fattori entro soggetti. I confronti posthoc sono stati effettuati mediante il test di Tukey, che può essere utilizzato in assenza di risultati significativi nell'ANOVA (Wilcox, 1987). Il test di Mann-Whitney à ̈ stato utilizzato per la valutazione delle latenze che non seguono una distribuzione normale.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Attività locomotoria spontanea
I risultati ottenuti hanno evidenziato un effetto significativo delle fasi di luce e di buio [F (1, 16) = 66.72; p < .001]. Come atteso, tutti gli animali indipendentemente dal genotipo si sono dimostrati più attivi durante la fase di buio piuttosto che durante quella di luce. In generale comunque, i topi mutanti si sono mostrati significativamente meno attivi dei topi di controllo [F (1, 16) = 8.93; p = .009]. Confronti posthoc effettuati sulla interazione genotipo per fase [F (1, 16) = 12.91; p = .024] hanno inoltre rivelato che la ipoattività dei mutanti era evidente solo durante la fase buia/attiva del ciclo (p < .01). Nella settimana successiva all'icv, il trattamento con CNFl non ha in alcun modo influenzato l'attività locomotoria spontanea.
Ad un mese di distanza dall'icv, in modo simile a quanto già osservato in precedenza, i topi mutanti hanno dimostrato di essere ipoattivi nella fase buia del ciclo in confronto ai controlli: un effetto delle fasi di luce e buio [F (1,24) = 62.41; p<.001] ed una interazione genotipo per fase [F (1,24) = 6.84; p = .015] sono stati nuovamente riscontrati (p<.05, after post hoc comparisons; vedere Fig. 1).
A differenza di quanto osservato in precedenza però, a distanza di un mese dall'icv, il trattamento con CNFl ha significativamente aumentato i livelli di attività locomoria durante la fase buia del ciclo (p < .01, after post hoc comparisons [F (1,24) = 4.63; p = .041]), riportando in questo modo i livelli di attività dei mutanti a livelli comparabili a quelli dei controlli (vedere Fig. 1).
Abilità di costruzione del nido
Come atteso tutti gli animali indipendentemente dal gruppo sperimentale hanno migliorato la qualità del nido con il passare del tempo [F(2,52) = 40.64, P < .001]. Tuttavia, i risultati ottenuti hanno permesso di evidenziare una interazione del genotipo e del tempo trascorso dall'introduzione della carta [F(2,52)
3.32, p = .044], In particolare, sebbene una tendenza simile fosse già evidente 42 ore dopo l'inizio del test, i topi mutanti hanno ottenuto punteggi significativamente peggiori nella valutazione del nido a 72 ore dall'introduzione della carta nella loro gabbia (p < .05, after posthoc comparison), (vedere Fig. 2).
Il trattamento con CNFl ha significativamente migliorato le abilità motorie dei mutanti aumentandone il punteggio nel test di valutazione del nido [p<.01, in seguito a confronti sull'interazione trattamento per tempo trascorso dall'introduzione della carta [F (2,52) = 3.67, p = .032)] (vedere Fig. 2).
Contextual and cued fear conditioning tests
In confronto ai valori di controllo, tutti i gruppi sperimentali hanno aumentato in modo significativo i livelli di inattività sia durante il context che il tone test, dimostrando quindi di ricordare sia il contesto che il suono a cui erano stati esposti il giorno precedente nella fase di training [Effetto della fase: Contextual: F{ 1, 26) = 54.57; p<.001; Cued: F (1, 26) = 47.57; p < .001]. Il trattamento con CNFl ha significativamente aumentato la risposta condizionata, ma solo durante il contextual fear conditioning [p<0.05 a seguito di confronti post hoc sull'interazione trattamento per fase F (1, 26) = 5.02, p = .034]. In effetti, confronti post hoc sull'interazione genotipo per trattamento per fase [p< .01, F (1,26) = 2.82; p = .10] hanno permesso di evidenziare che durante il contextual fear conditioning, il CNFl ha significativamente migliorato le prestazioni solo dei topi mutanti, senza influenzare il comportamento dei controlli (vedere Fig. 3).
Anche l'attività locomotoria, misurata come frequenza di Crossing, ha subito in tutti i gruppi un significativo decremento durante le fasi di test [Contextual: F( 1, 26) = 13.79/p = .001; Cued: F ( 1, 22) = 32.63; p < .001]. Nel corso del tone test à ̈ stato inoltre evidenziato un effetto del genotipo, in quanto durante questa fase i topi mutanti si sono dimostrati significativamente meno attivi dei controlli, avendo effettuato meno Crossings [F (1, 22) = 7.07, p<.014] (dati non mostrati). Non sono stati però riscontrati effetti del trattamento durante la fase del cued fear conditioning.
Novel object recognition test
Durante la fase di abituazione, non à ̈ stato possibile evidenziare effetti del genotipo sulla attività locomoria, sebbene siano state rilevate alcune anomalie nel profilo comportamentale dei mutanti che sono in effetti in linea con quanto già riportato in precedenza (De Filippis et al., 2009). In particolare, i mutanti hanno trascorso meno tempo nell'area centrale dell'arena [F (1,27) = 15.92, p < .001], confermando la presenza in questo modello murino di aumentati comportamenti riferibili a stati d'ansia (McGill et al., 2006, De Filippis et al., 2009). I mutanti hanno inoltre mostrato diminuiti livelli di Rearing e di Wall rearing [Effetto del genotipo: F (1,27) = 4.81, p = .037; F (1,27) = 3.35, p = .071, rispettivamente].
Non à ̈ stato possibile evidenziare nessun effetto del genotipo per quanto riguarda il tempo trascorso dagli animali nell'esplorare gli oggetti.
Nessun effetto del trattamento con CNF1 Ã ̈ stato evidenziato in questo test.
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Claims (4)
- RIVENDICAZIONI 1) Uso di una tossina attivante le Rho GTPasi, detta tossina essendo scelta nel gruppo che consiste in Fattore Citotossico Necrotizzante di tipo 1 (CNF1) o di tipo 2 (CNF2) di Escherichia coli o DNT di Bordetella pertussis, loro varianti, frammenti attivi o loro miscele per la preparazione di un medicamento per il trattamento e/o la prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett (RTT), dette varianti essendo varianti in grado di attivare le Rho GTPasi, e detti frammenti attivi essendo la porzione catalitica C-terminale di CNF1 (CAA50007 genBank ), di CNF2 (AAA18229 genBank) o di DNT (AAA20995 genBank) che comprende o consiste nella sequenza peptidica dall'amminoacido 720 all 'amminoacido 1014 di dette tossine, la cisteina 866 e l'istidina 881 essendo amminoacidi essenziali per l'attività .
- 2) Uso secondo la rivendicazione 1, in cui dette tossine o detti loro varianti o frammenti sono fusi a piccoli peptidi, coniugati con nanoparticelle o veicolati da immunovettori.
- 3) Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, in cui la dose di dette tossine, di detti loro varianti, frammenti o loro miscele varia da 0.0001 fmol/kg a 1 Î1⁄4ιηοΠ/kg, preferibilmente da 0.001 fmol/kg a 1 pmol/kg dipeso corporeo del paziente.
- 4) Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti in cui il medicamento à ̈ in una forma adatta ad una somministrazione nel sistema nervoso centrale o per via periferica . 5<)>Uso secondo la rivendicazione 4 in cui la via periferica à ̈ scelta tra la via orale, sottocutanea, intramuscolare, endovenosa, sublinguale, oculare. 6) Uso secondo la rivendicazione 4 in cui il medicamento à ̈ in forma di spray nasale o in forma iniettabile per via intracerebroventricolare. 7) Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti in cui dette tossine, detti loro varianti, frammenti attivi o loro miscele sono associati ad uno o più principi attivi per il trattamento sintomatico della sindrome di Rett. 8) Uso secondo la rivendicazione 7, in cui i principi attivi per il trattamento sintomatico della sindrome di Rett sono scelti nel gruppo che consiste in anticonvulsivanti, antipsicotici atipici, inibitori del re-uptake della serotonina. 9) Uso secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a 8, in cui la sintomatologia à ̈ quella di pazienti in tutti gli stadi della sindrome di Rett. 10) Combinazione di una tossina scelta nel gruppo che consiste in Fattore Citotossico Necrotizzante di tipo 1 (CNF1) o di tipo 2 (CNF2) di Escherichia coli o DNT di Bordetella pertussis, loro varianti, frammenti attivi o loro miscele e di uno o più principi attivi per il trattamento sintomatico della sindrome di Rett per l'uso simultaneo, separato o sequenziale nel trattamento e/o nella prevenzione della sintomatologia associata alla sindrome di Rett (RTT), dette varianti essendo varianti in grado di attivare le Rho GTPasi, e detti frammenti attivi essendo la porzione catalitica C-terminale di CNF1 (CAA50007 genBank ) , di CNF2 (AAA18229 genBank) o di DNT (AAA20995 genBank) che comprende o consiste nella sequenza peptidica dall' amminoacido 720 all' amminoacido 1014 di dette tossine, la cisteina 866 e l'istidina 881 essendo amminoacidi essenziali per l'attività . 11) Combinazione secondo la rivendicazione 10, in cui i principi attivi per il trattamento sintomatico della sindrome di Rett sono scelti nel gruppo che consiste in anticonvulsivanti, antipsicotici atipici, inibitori del re-uptake della serotonina.
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