ITRM20090595A1 - METHOD FOR EXTENDING AND IMPROVING THE FUNCTIONALITY OF VITRO SPERM - Google Patents
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Description
"METODO PER PROLUNGARE E MIGLIORARE LA FUNZIONALITA’ DI "METHOD TO EXTEND AND IMPROVE THE FUNCTIONALITY OF
SPERMATOZOI IN VITRO" SPERMATOZOA IN VITRO "
DESCRIZIONE DESCRIPTION
La presente invenzione si riferisce a un nuovo metodo per prolungare la vitalità e/o migliorare la funzionalità di spermatozoi in vitro comprendente la preparazione di co-colture di spermatozoi e di cellule del Sertoli e a colture cellulari ottenute secondo il metodo dell’invenzione. The present invention relates to a new method for prolonging the viability and / or improving the functionality of spermatozoa in vitro comprising the preparation of co-cultures of spermatozoa and Sertoli cells and cell cultures obtained according to the method of the invention.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE STATE OF THE PRIOR ART
L’infertilità à ̈ un problema che coinvolge un alto numero di coppie, solo negli Stati Uniti stimato oltre i 6 milioni. I problemi d’infertilità per oltre il 30% delle coppie à ̈ causato esclusivamente dall’infertilità maschile dovuta ad una funzionalità ridotta degli spermatozoi come ad esempio una riduzione dei parametri di motilità spermatica (astenozoospermia) o un basso numero di spermatozoi nell’eiaculato (oligozoospermia). Per poter risolvere i problemi d’infertilità sono state sviluppate diverse tecniche di procreazione medicalmente assistita quali ad esempio l’inseminazione intrauterina, la fertilizzazione in vitro, la fecondazione assistita e l’iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo. Tutte queste tecniche prevedono l’uso di spermatozoi in vitro. Infertility is a problem that affects a large number of couples, estimated at over 6 million in the United States alone. Infertility problems for more than 30% of couples is caused exclusively by male infertility due to a reduced sperm function such as a reduction in sperm motility parameters (asthenozoospermia) or a low number of spermatozoa in the ™ ejaculate (oligozoospermia). In order to solve infertility problems, various medically assisted procreation techniques have been developed such as intrauterine insemination, in vitro fertilization, assisted fertilization and intracytoplasmic sperm injection. All these techniques involve the use of spermatozoa in vitro.
È noto che gli spermatozoi appena eiaculati e posti in coltura, seppur incubati in terreni specifici (come ad esempio il terreno BWW), perdono rapidamente e progressivamente le loro caratteristiche funzionali in termini di motilità , vitalità e funzione mitocondriale (Calamela et al., Andrologia 33, 79-86, 2001). Calamera et al. (Andrologia 33, 79-86, 2001), dimostrano, in maniera molto netta, che le colture di spermatozoi umani, come quelle allestite per le metodiche di procreazione medicalmente assistita, oltre le 47 ore subiscono una netta perdita di tutti i parametri funzionali quali motilità , vitalità , frammentazione del DNA e capacità di attuare la reazione acrosomiale influenzando negativamente l’esito della fecondazione dell’ovocita. Gli autori mostrano anche che tale perdita di vitalità e funzionalità non può essere in alcun modo rallentata tramite l’aggiunta in coltura di sistemi di “scavenger†dei radicali liberi d’ossigeno, come la catalasi. Successivamente Chi et al. (Human reproduction 23(5),1023-1028, 2008) sono riusciti a migliorare la “performance†funzionale di spermatozoi umani, tramite l’aggiunta al sistema, oltre alla catalasi, anche dell’EDTA, soltanto però non oltre 24 ore dall’eiaculazione. Allo stato delle attuali conoscenze scientifiche, non esiste alcuna possibilità di prolungare la vitalità di colture di spermatozoi oltre le 48 ore mantenendone inalterate le caratteristiche funzionali. La rapida e progressiva perdita delle caratteristiche di vitalità ed efficienza degli spermatozoi in vitro influenza negativamente l’esito delle tecniche di procreazione medicalmente assistita non consentendo un’accurata selezione degli spermatozoi più vitali o un eventuale pre-trattamento degli spermatozoi con sostanze che ne migliorino i parametri funzionali come la motilità . Era pertanto molto sentito nello stato della tecnica il bisogno di proporre nuovi metodi per prolungare e/o migliorare la vitalità e funzionalità di spermatozoi in vitro. It is known that freshly ejaculated and cultured spermatozoa, even if incubated in specific media (such as BWW medium), rapidly and progressively lose their functional characteristics in terms of motility, vitality and mitochondrial function (Calamela et al., Andrologia 33, 79-86, 2001). Calamera et al. (Andrologia 33, 79-86, 2001), show, very clearly, that human spermatozoa cultures, such as those set up for medically assisted procreation methods, over 47 hours suffer a net loss of all functional parameters such as motility, vitality, DNA fragmentation and the ability to carry out the acrosomal reaction negatively influencing the outcome of egg fertilization. The authors also show that this loss of vitality and functionality cannot be slowed down in any way by adding oxygen free radical scavenger systems, such as catalase, to the culture. Subsequently Chi et al. (Human reproduction 23 (5), 1023-1028, 2008) managed to improve the functional â € œperformanceâ € of human spermatozoa, through the addition of EDTA to the system, in addition to catalase, only but not beyond 24 hours from ejaculation. In the current state of scientific knowledge, there is no possibility of prolonging the viability of spermatozoa cultures beyond 48 hours while maintaining their functional characteristics unaltered. The rapid and progressive loss of the characteristics of vitality and efficiency of the spermatozoa in vitro negatively influences the outcome of medically assisted procreation techniques, not allowing an accurate selection of the most vital spermatozoa or a possible pre-treatment of the spermatozoa with substances that improve functional parameters such as motility. The need to propose new methods to prolong and / or improve the vitality and functionality of spermatozoa in vitro was therefore strongly felt in the state of the art.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE SUMMARY OF THE INVENTION
Forma pertanto oggetto della presente invenzione un nuovo metodo in vitro per prolungare la vitalità e/o migliorare la funzionalità di spermatozoi comprendente i seguenti passaggi: Therefore, the subject of the present invention is a new in vitro method for prolonging the viability and / or improving the functionality of spermatozoa comprising the following steps:
a. incubare in coltura per un tempo compreso tra 72 e 144 ore cellule del Sertoli isolate con un grado di purezza superiore al 90%; to. incubate in culture for between 72 and 144 hours isolated Sertoli cells with a degree of purity higher than 90%;
b. aggiungere spermatozoi a detta coltura di cellule del Sertoli; b. adding spermatozoa to said Sertoli cell culture;
c. mantenere detta coltura ottenuta allo stadio b) in un rapporto numero di cellule del Sertoli/numero di spermatozoi sostanzialmente compreso tra 1:5 e 1:20 per un tempo compreso tra 1 e 7 giorni. c. maintain said culture obtained in step b) in a ratio of Sertoli cells / number of spermatozoa substantially comprised between 1: 5 and 1:20 for a time comprised between 1 and 7 days.
Gli inventori hanno evidenziato mediante la misura di parametri quali la motilità , vitalità , funzionalità mitocondriale e capacità di penetrazione degli ovociti che spermatozoi posti in co-coltura con le cellule del Sertoli secondo il metodo dell’invenzione hanno valori superiori nel tempo rispetto a spermatozoi posti in coltura secondo i metodi della tecnica nota. The inventors have shown by measuring parameters such as motility, viability, mitochondrial functionality and penetration capacity of the oocytes that spermatozoa placed in co-culture with the Sertoli cells according to the method of the invention have higher values over time than spermatozoa. cultured according to the methods of the known art.
L’invenzione presenta quindi i seguenti vantaggi rispetto alla tecnica nota: The invention therefore has the following advantages with respect to the known technique:
- il prolungamento dei tempi di vitalità degli spermatozoi in vitro permette di selezionare in modo più accurato quelli più funzionali da utilizzare subito o previo pre-trattamento con sostanze che ne migliorino la funzionalità in tecniche di procreazione medicalmente assistita. - the prolongation of the vitality times of the spermatozoa in vitro allows to select more accurately the most functional ones to be used immediately or after pre-treatment with substances that improve their functionality in medically assisted procreation techniques.
- gli spermatozoi coltivati in vitro secondo il metodo dell’invenzione oltre a rimanere vitali, mobili e funzionali per oltre 7 giorni, non vanno incontro a capacitazione né a reazione acrosomiale prematura. Questi due processi possono essere attivati a piacimento, in vitro, quando si deciderà di utilizzare gli spermatozoi per penetrare l’ovocita mediante ad esempio una delle tecniche di procreazione medicalmente assistita nota. - the spermatozoa cultured in vitro according to the method of the invention, besides remaining viable, mobile and functional for more than 7 days, do not undergo either a capacitation or a premature acrosome reaction. These two processes can be activated at will, in vitro, when it is decided to use the spermatozoa to penetrate the oocyte using, for example, one of the known medically assisted procreation techniques.
- spermatozoi che presentano una fertilità ridotta a causa di una riduzione dei parametri di motilità possono essere coltivati in vitro secondo il metodo dell’invenzione determinando un miglioramento dei parametri di motilità . Gli spermatozoi così ottenuti potranno essere usati con maggiore probabilità di successo per la fecondazione degli ovociti. - spermatozoa that have a reduced fertility due to a reduction in the motility parameters can be cultured in vitro according to the method of the invention, resulting in an improvement of the motility parameters. The spermatozoa thus obtained can be used with greater probability of success for the fertilization of oocytes.
La presente invenzione si riferisce inoltre alle Colture cellulari comprendenti cellule del Sertoli e spermatozoi, ottenibili con questo metodo, e ai loro usi. The present invention also relates to cell cultures comprising Sertoli cells and spermatozoa, obtainable with this method, and to their uses.
I vantaggi, caratteristiche e le modalità di impiego della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di alcune forme di realizzazione, presentate a scopo esemplificativo e non limitativo. The advantages, characteristics and methods of use of the present invention will become evident from the following detailed description of some embodiments, presented by way of non-limiting example.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE DETAILED DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIGURA 1. La figura 1 mostra microfotografie di cellule del Sertoli suine. La figura 1A Immunocitochimica, ottenuta incubando il preparato con anticorpi anti-mullerian inhibiting factor (MIS). B: Immunocitochimica, ottenuta incubando il preparato con anticorpi anti-vimentina. C-D: Per dimostrare la scarsa presenza di cellule di Leydig e cellule peritubulari, il preparato é stato sottoposto a tecniche istochimiche per valutare la presenza di fosfatasi alcalina, colorazione con Fast- Red (C), e di attività 3-β-idrossisteroidodeidrogenasica, colorazione con Nitro-blu tetrazolium (D). FIGURE 1. Figure 1 shows micrographs of porcine Sertoli cells. Figure 1A Immunocytochemistry, obtained by incubating the preparation with anti-mullerian inhibiting factor (MIS) antibodies. B: Immunocytochemistry, obtained by incubating the preparation with anti-vimentin antibodies. C-D: To demonstrate the scarce presence of Leydig cells and peritubular cells, the preparation was subjected to histochemical techniques to evaluate the presence of alkaline phosphatase, Fast-Red (C) staining, and 3-β-hydroxysteroidodehydrogenase activity, staining with Nitro-blue tetrazolium (D).
FIGURA 2. A: co-coltura di spermatozoi umani su monostrato di cellule del Sertoli. B: spermatozoi umani in terreno di controllo. Gli spermatozoi, chiaramente distinguibili dal sottostante monostrato di cellule del Sertoli, rimangono vitali ed in movimento durante tutta la durata del periodo di osservazione. FIGURE 2. A: co-culture of human spermatozoa on monolayer of Sertoli cells. B: human spermatozoa in control medium. The spermatozoa, clearly distinguishable from the underlying monolayer of Sertoli cells, remain viable and in motion throughout the duration of the observation period.
FIGURA 3. Risultati dei test funzionali (motilità , vitalità e funzione mitocondriale) eseguiti sugli spermatozoi in co-coltura con le SC. A-B: la motilità degli spermatozoi durante la co-coltura si mantiene costante attestandosi a circa 45 % (motilità A+B+C) (Pannello A) e 25 % (A+B) (Pannello B) dopo 7 giorni di co-coltura. C: La vitalità degli spermatozoi si mantiene costante fino al 4°-5° giorno, decrescendo poi al settimo. D: La funzionalità mitocondriale, indice dello status energetico dello spermatozoo, si mantiene costante durante tutto il periodo di osservazione. Tutti gli esperimenti sono risultati significativi (valore p) quando comparati ai controlli (terreno di coltura delle Sertoli e terreno di coltura standard per gli spermatozoi, BWW). FIGURE 3. Results of functional tests (motility, viability and mitochondrial function) performed on spermatozoa in co-culture with SCs. A-B: the motility of spermatozoa during co-culture remains constant, settling at approximately 45% (motility A + B + C) (Panel A) and 25% (A + B) (Panel B) after 7 days of co-culture . C: The vitality of the spermatozoa remains constant until the 4th-5th day, then decreasing on the seventh. D: Mitochondrial functionality, index of the energetic status of the spermatozoon, remains constant throughout the observation period. All experiments were significant (p-value) when compared to controls (Sertoli culture medium and standard sperm culture medium, BWW).
FIGURA 4. Risultati dei test di valutazione del movimento di calcio intracellulare (capacitazione) (Pannello A) e di reazione acrosomiale (Pannello B) eseguiti sugli spermatozoi in co-coltura con le SC. Dai risultati si deduce che gli spermatozoi dopo 7 giorni di co-coltura con cellule del Sertoli non vanno incontro né a capacitazione né a reazione acrosomiale, mantenendo così intatto il loro potere fecondante. FIGURE 4. Results of intracellular calcium movement (capacitation) (Panel A) and acrosome reaction (Panel B) tests performed on spermatozoa in co-culture with SCs. From the results it can be deduced that the spermatozoa after 7 days of co-culture with Sertoli cells do not undergo neither capacitation nor acrosome reaction, thus keeping their fertilizing power intact.
FIGURA 5. Risultati dei test di induzione della reazione acrosomiale con progesterone (Pannello A) e del test di penetrazione degli ovociti di hamster, HEPT (Pannello B). Ad ulteriore conferma della buona qualità degli spermatozoi a 7 giorni di co-coltura e della loro capacità fecondante, quando sottoposti a induzione della reazione acrosomiale reagiscono come gli spermatozoi a fresco. Inoltre, sottoposti all’HEPT, mantengono la loro capacità di penetrare l’ovocita. FIGURE 5. Results of the induction tests of the acrosome reaction with progesterone (Panel A) and of the hamster oocyte penetration test, HEPT (Panel B). As a further confirmation of the good quality of the spermatozoa at 7 days of co-culture and of their fertilizing capacity, when subjected to induction of the acrosome reaction they react like fresh spermatozoa. Furthermore, subjected to HEPT, they maintain their ability to penetrate the oocyte.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Glossario Glossary
Nell’ambito della presente invenzione saranno utilizzate le seguenti definizioni con i seguenti significati: In the context of the present invention the following definitions will be used with the following meanings:
cellule del Sertoli o SC: cellule ubicate nella parete dei tubuli seminiferi con ruolo trofico ed immuno-modulatorio sulle cellule germinali in via di maturazione; spermatozoo: la cellula germinale o gamete maschile che ha il ruolo di raggiungere il gamete femminile, l’uovo, per fecondarlo durante la riproduzione sessuale; astenozoospermia: una riduzione dei parametri di motilità spermatica < 50% di nemaspermi con motilità progressiva; Sertoli cells or SC: cells located in the wall of the seminiferous tubules with a trophic and immuno-modulatory role on the maturing germ cells; spermatozoon: the germ cell or male gamete which has the role of reaching the female gamete, the egg, to fertilize it during sexual reproduction; asthenozoospermia: a reduction in sperm motility parameters <50% of sperm with progressive motility;
oligozoospermia: riduzione del numero di spermatozoi nell’eiaculato < 20 milioni/ml); teratozoospermia: una presenza nell’eiaculato di spermatozoi con morfologia normale < 30%; oligozoospermia: reduction in the number of spermatozoa in the ejaculate <20 million / ml); teratozoospermia: a presence in the ejaculate of spermatozoa with normal morphology <30%;
procreazione medicalmente assistita: l’insieme delle tecniche mediche e biologiche che permettano la riproduzione al di fuori dei processi naturali. medically assisted procreation: the set of medical and biological techniques that allow reproduction outside natural processes.
processo di capacitazione: processo che consiste nella rimozione dalla membrana più esterna dello spermatozoo di una glicoproteina detta acrosome-stabilizing factor. La capacitazione dà l’avvio ai processi di attivazione dello spermatozoo che permettono l’incontro ed il contatto con l’ovocita. capacitation process: process which consists in the removal from the outermost membrane of the spermatozoon of a glycoprotein called acrosome-stabilizing factor. The capacitation initiates the sperm activation processes that allow the meeting and contact with the oocyte.
reazione acrosomiale: durante la fecondazione, l'unione dello spermatozoo con l' ovocita secondario, innesca la liberazione degli enzimi idrolitici responsabili della digestione della membrana extracellulare dell'oocita, facilitando cosi l'accesso dello spermatozoo alla membrana plasmatica dell'oocita stesso. Questo processo prende il nome di " reazione acrosomiale". acrosome reaction: during fertilization, the union of the spermatozoon with the secondary oocyte triggers the release of the hydrolytic enzymes responsible for digestion of the extracellular membrane of the oocyte, thus facilitating the access of the spermatozoon to the plasma membrane of the oocyte itself. This process is called the "acrosome reaction".
Il metodo oggetto dell’invenzione comprende caratteristiche essenziali che saranno qui di seguito descritte con maggior dettaglio per le possibili forme di realizzazione per ciascuna di loro. The method object of the invention comprises essential characteristics which will be described in greater detail below for the possible embodiments for each of them.
Il primo passaggio prevede l’incubazione di cellule del Sertoli isolate con un grado di purezza superiore a circa il 90% per un periodo di almeno 72 ore. The first step involves the incubation of isolated Sertoli cells with a degree of purity higher than about 90% for a period of at least 72 hours.
Cellule del Sertoli isolate possono essere ottenute mediante diverse tecniche note nell’arte anteriore. Le cellule del Sertoli possono essere isolate da varie fonti animali quali ad esempio maiale, ratto, topo, cane, gatto o uomo, preferibilmente da individui prepuberi. Gli animali morti o dopo anestesia sono sottoposti ad orchiectomia bilaterale. I testicoli, dopo la rimozione dell’epididimo, sono sottoposti a digestione multienzimatica. Dopo il completamento della digestione, il tessuto tubulare à ̈ sottoposto a filtrazione ed i tubuli cosi ottenuti sono posti in coltura. Sono noti nell’arte anteriore diversi terreni di coltura che possono essere usati sia nei passaggi d’isolamento delle cellule del Sertoli sia per il loro mantenimento in coltura come ad esempio il terreno DMEM (o HAM-F12). Isolated Sertoli cells can be obtained by various techniques known in the prior art. Sertoli cells can be isolated from various animal sources such as for example pig, rat, mouse, dog, cat or man, preferably from prepubertal individuals. Dead animals or animals after anesthesia undergo bilateral orchiectomy. The testicles, after removal of the epididymis, are subjected to multi-enzymatic digestion. After the completion of digestion, the tubular tissue is subjected to filtration and the tubules thus obtained are placed in culture. Various culture media are known in the prior art which can be used both in the isolation steps of the Sertoli cells and for their maintenance in culture such as DMEM medium (or HAM-F12).
Nella presente invenzione sono usate cellule del Sertoli isolate con una purezza superiore a circa il 90%. Il grado di purezza delle cellule del Sertoli isolate e trasferite in coltura dipenderà principalmente dalla presenza di altri tipi cellulari, quali cellule del Leydig o peritubulari, copurificate durante il procedimento d’isolamento. La purezza delle cellule del Sertoli isolate e trasferite in coltura può essere valutata con diverse metodiche note nell’arte anteriore. Ad esempio mediante tecniche di immunocitochimica, in cui il preparato à ̈ incubato con anticorpi anti-mullerian inhibiting factor (MIS), ed anti-vimentina fluoresceinati che marcano rispettivamente le molecole MIS e vimentina entrambe unicamente espresse dalle cellule del Sertoli e tecniche istochimiche per valutare la presenza sia di fosfatasi alcalina (colorazione con Fast-Red), tipica delle cellule peritubulari, che l’attività dell’enzima 3-β-idrossisteroidodeidrogenasi (colorazione con Nitro-blu tetrazolium) che à ̈ invece tipico delle cellule del Leydig. Isolated Sertoli cells with a purity greater than about 90% are used in the present invention. The degree of purity of Sertoli cells isolated and transferred to culture will depend mainly on the presence of other cell types, such as Leydig or peritubular cells, copurified during the isolation procedure. The purity of Sertoli cells isolated and transferred to culture can be evaluated with various methods known in the prior art. For example, by means of immunocytochemistry techniques, in which the preparation is incubated with anti-mullerian inhibiting factor (MIS) antibodies, and anti-vimentin fluoresceinates which respectively label the MIS and vimentin molecules, both only expressed by Sertoli cells and histochemical techniques to evaluate the presence of both alkaline phosphatase (Fast-Red staining), typical of peritubular cells, and the activity of the 3-β-hydroxysteroid dehydrogenase enzyme (staining with Nitro-blue tetrazolium) which is instead typical of Leydig cells .
Gli autori dell’invenzione hanno evidenziato che le cellule del Sertoli con questo grado di purezza e con un’eventuale presenza di cellule di Leydig in proporzioni non superiori al 5-8% rispetto al numero di cellule totali conferiscono una migliore funzionalità rispetto a cellule con un minore grado di purezza o con un’assenza di cellule di Leydig. L’incubazione delle cellule del Sertoli in coltura potrà essere eseguita ad una temperatura compresa tra 32 e 37° C, preferibilmente 37°C, ad un’atmosfera con circa il 5% di CO2in incubatori standard noti al tecnico del settore. La concentrazione cellulare cui incubare le cellule potrà essere sostanzialmente compresa in valori standard quali ad esempio 200x10<3>e 270 x 10<3>cellule/cm<2>. Dopo un certo tempo d’incubazione le cellule del Sertoli iniziano a aderire alle piastre di coltura formando un monostrato cellulare cui sono aggiunti spermatozoi come descritto in dettaglio di seguito. Il tempo d’incubazione prima dell’aggiunta di spermatozoi à ̈ di almeno 72 ore e preferibilmente di 96 ore e comunque non superiore a 144 ore. The authors of the invention have shown that the Sertoli cells with this degree of purity and with a possible presence of Leydig cells in proportions not exceeding 5-8% with respect to the total number of cells confer a better functionality than cells with a lower degree of purity or with an absence of Leydig cells. The incubation of Sertoli cells in culture can be performed at a temperature between 32 and 37 ° C, preferably 37 ° C, in an atmosphere with about 5% CO2 in standard incubators known to the skilled in the art. The cell concentration to which the cells are to be incubated can be substantially comprised in standard values such as for example 200x10 <3> and 270 x 10 <3> cells / cm <2>. After a certain time of incubation, the Sertoli cells begin to adhere to the culture plates forming a cell monolayer to which spermatozoa are added as described in detail below. The incubation time before the addition of spermatozoa is at least 72 hours and preferably 96 hours and in any case not more than 144 hours.
Nel secondo passaggio del metodo sono aggiunti spermatozoi alla coltura di cellule del Sertoli ottenuta al primo passaggio. In the second step of the method, spermatozoa are added to the Sertoli cell culture obtained in the first step.
Gli spermatozoi potranno essere aggiunti direttamente dopo eiaculazione a detta coltura cellulare o a seguito di un pretrattamento volto ad ottenere spermatozoi con un maggiore grado di purezza. Il tecnico del settore utilizzando le conoscenze note nello stato dell’arte sarà in grado di scegliere senza attività inventiva il pretrattamento più idoneo. Ad esempio in campioni appena eiaculati, utilizzando come pretrattamento il metodo di selezione per gradiente di Ficoll, come descritto negli esempi, gli spermatozoi potranno essere blandamente selezionati per rimuovere la componente cellulare non gametica. The spermatozoa can be added directly after ejaculation to said cell culture or following a pretreatment aimed at obtaining spermatozoa with a higher degree of purity. The technician of the sector, using the knowledge known in the state of the art, will be able to choose the most suitable pre-treatment without inventive activity. For example, in freshly ejaculated samples, using the Ficoll gradient selection method as pretreatment, as described in the examples, the spermatozoa can be lightly selected to remove the non-gametic cellular component.
In una forma vantaggiosa di realizzazione dell’invenzione gli spermatozoi sono aggiunti alla coltura di cellule del Sertoli in modo da ottenere un rapporto finale cellule del Sertoli /spermatozoi compreso tra circa 1:5 e circa 1:20. In an advantageous embodiment of the invention the spermatozoa are added to the Sertoli cell culture so as to obtain a final Sertoli cell / sperm ratio between about 1: 5 and about 1:20.
Un esempio di concentrazione delle cellule del Sertoli cui aggiungere gli spermatozoi à ̈ circa 10 milioni/ml, il tecnico del settore sulla base della presente descrizione e gli insegnamenti della tecnica nota sarà in grado di definire una concentrazione idonea. In una forma vantaggiosa di realizzazione dell’invenzione prima di aggiungere gli spermatozoi le cellule del Sertoli ottenute al passaggio precedente sono trattare con un tampone di lisi come ad esempio un tampone tris che permette di eliminare, attraverso lisi osmotica, le cellule germinali residue. An example of concentration of the Sertoli cells to which the spermatozoa must be added is about 10 million / ml, the person skilled in the art on the basis of the present description and the teachings of the prior art will be able to define a suitable concentration. In an advantageous embodiment of the invention, before adding the spermatozoa, the Sertoli cells obtained in the previous step are treated with a lysis buffer such as for example a tris buffer which allows the residual germ cells to be eliminated through osmotic lysis.
Nel terzo passaggio del metodo la coltura cellulare comprendente spermatozoi e cellule del Sertoli ottenuta al secondo passaggio à ̈ incubata mantenendo un rapporto numero di cellule del Sertoli/numero spermatozoi sostanzialmente compreso tra 1:5 e 1:20 per un tempo compreso tra 1 e 7 giorni. In the third step of the method, the cell culture comprising spermatozoa and Sertoli cells obtained in the second step is incubated maintaining a ratio of Sertoli cells / spermatozoa number substantially between 1: 5 and 1:20 for a time between 1 and 7 days.
La coltura cellulare comprendente cellule del Sertoli e spermatozoi potrà essere incubata ad una temperatura compresa tra 35-38°C preferibilmente 37°C, ad un’atmosfera con circa il 5% di CO2in incubatori standard per un tempo compreso tra 1 e 7 giorni. Per assicurare che la vitalità degli spermatozoi rimanga elevata anche ad una settimana di distanza dal momento in cui gli spermatozoi sono aggiunti in coltura, il rapporto numero di cellule del Sertoli/numero spermatozoi dovrà essere compreso tra 1:5 e 1:20, preferibilmente 1:10. Cell culture including Sertoli cells and spermatozoa can be incubated at a temperature between 35-38 ° C, preferably 37 ° C, in an atmosphere with about 5% CO2 in standard incubators for a time between 1 and 7 days. . To ensure that the viability of the spermatozoa remains high even one week after the spermatozoa are added to the culture, the ratio of Sertoli cell / sperm count should be between 1: 5 and 1:20, preferably 1 : 10.
Potranno essere aggiunte alle colture cellulari, ottenute nei vari passaggi del metodo oggetto dell’invenzione, sostanze idonee all’ottimizzazione di colture cellulari quali ad esempio terreni per coltura arricchiti, amminoacidi non essenziali, relaxina, carnitina, vitamina D, antiossidanti; il tecnico del settore sulla base della tecnica nota sarà in grado di selezionare quali composti e in che quantità aggiungerli. Substances suitable for the optimization of cell cultures such as enriched culture media, non-essential amino acids, relaxin, carnitine, vitamin D, antioxidants can be added to cell cultures, obtained in the various steps of the method object of the invention; the person skilled in the art on the basis of the known art will be able to select which compounds and in what quantities to add them.
Come dimostrato e descritto in dettaglio negli esempi mediante test funzionali gli spermatozoi isolati dalla co-coltura ottenuta secondo il metodo dell’invenzione mantengono valori di vitalità e funzionalità elevate dopo più di una settimana dalla loro aggiunta in coltura con cellule del Sertoli. As demonstrated and described in detail in the examples by functional tests, the spermatozoa isolated from the co-culture obtained according to the method of the invention maintain high vitality and functionality values after more than a week from their addition in culture with Sertoli cells.
Le colture cellulari dell’invenzione potranno quindi essere utilizzate per selezionare gli spermatozoi con parametri di vitalità e funzionalità migliori che avranno quindi maggiori probabilità di fecondare l’ovocita quando usati in tecniche di procreazione medicalmente assistita. The cell cultures of the invention can therefore be used to select spermatozoa with better vitality and functionality parameters which will therefore have a greater chance of fertilizing the oocyte when used in medically assisted procreation techniques.
In una forma di realizzazione il metodo dell’invenzione potrà quindi comprendere un quarto passaggio in cui sono isolati uno o più spermatozoi dalla co-coltura ottenuta al terzo passaggio del metodo della presente descrizione. La selezione degli spermatozoi dalle colture cellulari oggetto dell’invenzione potrà avvenire mediante procedure note al tecnico del settore. In one embodiment, the method of the invention may therefore comprise a fourth step in which one or more spermatozoa are isolated from the co-culture obtained in the third step of the method of the present description. The selection of the spermatozoa from the cell cultures object of the invention can take place by means of procedures known to the person skilled in the art.
L’invenzione della presente descrizione si riferisce anche alle colture cellulari comprendenti spermatozoi e cellule del Sertoli ottenibili secondo i metodi qui descritti e agli spermatozoi isolati da dette colture. The invention of the present description also refers to cell cultures comprising spermatozoa and Sertoli cells obtainable according to the methods described herein and to spermatozoa isolated from said cultures.
Sono oggetto della presente invenzione anche composizioni per prolungare la vitalità e/o migliorare la funzionalità di spermatozoi in vitro comprendenti cellule del Sertoli con un grado di purezza superiore al 90% e terreni per coltura cellulare. Also object of the present invention are compositions for prolonging the viability and / or improving the functionality of spermatozoa in vitro comprising Sertoli cells with a degree of purity higher than 90% and media for cell culture.
ESEMPI EXAMPLES
Esempio 1: Isolamento delle SC da suino neonato pre-pubere e preparazione della coltura. Example 1: Isolation of SC from pre-pubescent newborn pig and preparation of the culture.
Le SC vengono separate da testicoli di suini neonati (7-15 giorni di vita) “Large-White†. I suini, dopo anestesia tramite somministrazione i.m. di 0,1 mg/kg di azaperon (Stresnil® 40 mg/ml, Janssen, Beerse, Belgio) e 15 mg/kg di chetamina (Imalgene® 100 mg/ml, Gellini Farmaceutici), sono sottoposti ad orchiectomia bilaterale. I testicoli, dopo la rimozione dell’epididimo, vengono decorticati dall’albuginea, finemente tagliuzzati in piccoli frammenti tissutali (1-3 mm<3>) e immediatamente sottoposti ad una prima digestione enzimatica a base di collagenasi P (Roche Diagnostics, S.p.A., Monza, Italy) (2 mg/ml) in HBSS (Sigma Chemical Co, St.Louis, USA). La digestione à ̈ quindi proseguita fino alla separazione dei tubuli seminiferi. I tubuli raccolti sono quindi lavati in HBSS e centrifugati a 500 r.p.m. Dopo il lavaggio i tubuli vengono incubati con una soluzione di HBSS contenente tripsina (2 mg/ml) e DNAse I (Sigma). Dopo il completamento della seconda digestione, la soluzione di tripsina à ̈ diluita 1:1 con Hank’s 20% FBS per arrestarne l’attività enzimatica. I tubuli dopo ulteriori lavaggi con HBSS vengono separati dalle cellule peritubulari tramite blanda centrifugazione a 300 rpm. Il “pellet†contenente il tessuto tubulare viene adeguatamente filtrato con un filtro in acciaio inox con apertura di maglia di 500 µm. Infine, per rimuovere le eventuali cellule peritubulari e di Leydig contaminanti il preparato, la sospensione contenente i tubuli viene ulteriormente centrifugata a 800 rpm per 5 min e il pellet risultante viene trattato per 7 min con una soluzione di glicina 1 M ed EDTA 2 mM in HBSS a pH 7.2. I tubuli cosi ottenuti vengono posti in coltura in HAM F12 (Euroclone) supplementato con acido retinoico 0,166 nM (Sigma) e con 5 ml/500 ml di insulin-transferrin-selenium (ITS) (Becton Dickinson#354352), a 37°C in atmosfera al 5% di CO2. Dopo 48 ore di coltura, le SC iniziano a aderire alle piastre di coltura formando un monostrato cellulare. Al fine di rimuovere le cellule germinali residue, il monostrato di SC viene trattato con un tampone, tris-(idrossimetil)-amminometano idrocloruro (TRIS) (Sigma) che permette di eliminare, attraverso lisi osmotica, le cellule germinali residue. Infine le SC vengono coltivate nelle condizioni sopra riportate in fiasche di polistirene. Le SC ottenute sono state analizzate in termini di purezza, vitalità e funzionalità . The SCs are separated from the testes of newborn pigs (7-15 days old) â € œLarge-Whiteâ €. Pigs, after anesthesia by i.m. of 0.1 mg / kg of azaperon (Stresnil® 40 mg / ml, Janssen, Beerse, Belgium) and 15 mg / kg of ketamine (Imalgene® 100 mg / ml, Gellini Farmaceutici), undergo bilateral orchiectomy. The testicles, after removal of the epididymis, are decorticated from the albuginea, finely shredded into small tissue fragments (1-3 mm <3>) and immediately subjected to a first enzymatic digestion based on collagenase P (Roche Diagnostics, S.p.A., Monza, Italy) (2 mg / ml) in HBSS (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA). Digestion then continued until the separation of the seminiferous tubules. The collected tubules are then washed in HBSS and centrifuged at 500 r.p.m. After washing the tubules are incubated with a solution of HBSS containing trypsin (2 mg / ml) and DNAse I (Sigma). After the completion of the second digestion, the trypsin solution is diluted 1: 1 with Hank's 20% FBS to stop its enzymatic activity. After further washing with HBSS, the tubules are separated from the peritubular cells by gentle centrifugation at 300 rpm. The â € œpelletâ € containing the tubular fabric is adequately filtered with a stainless steel filter with a mesh opening of 500 µm. Finally, to remove any peritubular and Leydig cells contaminating the preparation, the suspension containing the tubules is further centrifuged at 800 rpm for 5 min and the resulting pellet is treated for 7 min with a 1 M glycine and 2 mM EDTA solution in HBSS at pH 7.2. The tubules thus obtained are cultured in HAM F12 (Euroclone) supplemented with retinoic acid 0.166 nM (Sigma) and with 5 ml / 500 ml of insulin-transferrin-selenium (ITS) (Becton Dickinson # 354352), at 37 ° C in the atmosphere at 5% CO2. After 48 hours of culture, the SCs begin to adhere to the culture plates forming a cell monolayer. In order to remove residual germ cells, the SC monolayer is treated with a buffer, tris- (hydroxymethyl) -aminomethane hydrochloride (TRIS) (Sigma) which allows to eliminate, through osmotic lysis, the residual germ cells. Finally, the SCs are grown under the above conditions in polystyrene flasks. The SCs obtained were analyzed in terms of purity, vitality and functionality.
La purezza delle SC, risultata superiore al 90%, à ̈ stata valutata con tecniche di immunocitochimica, incubando il preparato con anticorpi anti-mullerian inhibiting factor (MIS), ed anti-vimentina fluoresceinati, che marcano rispettivamente le molecole MIS e vimentina entrambe unicamente espresse dalle SC (Fig.1 A,B). Per dimostrare la ridotta presenza di cellule di Leydig e peritubulari come possibili contaminanti, i preparati di SC sono stati sottoposti a valutazioni istochimiche. Questi test permettono di valutare sia la presenza di fosfatasi alcalina (colorazione con Fast-Red), tipica delle cellule peritubulari, che l’attività dell’enzima 3-β-idrossi-steroidodeidrogenasi (colorazione con Nitro-blu tetrazolium) che e’ invece tipico delle cellule del Leydig (Fig.1 C,D). I risultati ottenuti con queste indagini istochimiche hanno permesso di evidenziare la presenza del 5-8% di cellule peritubulari e di Leydig; queste popolazioni cellulari risultano peraltro utili (quando presenti in queste proporzioni) a garantire un “cross-talk†molecolare favorevole alle corretta funzionalità di queste popolazioni di cellule testicolari. The purity of the SC, which was higher than 90%, was evaluated with immunocytochemical techniques, incubating the preparation with anti-mullerian inhibiting factor (MIS) and anti-vimentin fluoresceinated antibodies, which respectively label the MIS molecules and vimentin both only expressed by the SC (Fig. 1 A, B). To demonstrate the reduced presence of Leydig and peritubular cells as possible contaminants, SC preparations were subjected to histochemical evaluations. These tests allow to evaluate both the presence of alkaline phosphatase (Fast-Red staining), typical of peritubular cells, and the activity of the 3-β-hydroxy-steroid dehydrogenase enzyme (staining with Nitro-blue tetrazolium) which is Instead, typical of Leydig cells (Fig.1 C, D). The results obtained with these histochemical investigations allowed to highlight the presence of 5-8% of peritubular and Leydig cells; these cell populations are also useful (when present in these proportions) to guarantee a molecular â € œcross-talkâ € favorable to the correct functionality of these testicular cell populations.
La vitalità delle SC à ̈ stata determinata mediante trattamento con bromuro di etidio (EB) e fluoresceina-diacetato (FDA) (Sigma). Le cellule, osservate con microscopio a fluorescenza mostravano, in tutte le condizioni, una vitalità superiore al 95%. The viability of SC was determined by treatment with ethidium bromide (EB) and fluorescein-diacetate (FDA) (Sigma). The cells, observed with a fluorescence microscope showed, under all conditions, a viability greater than 95%.
Il test di vitalità cellulare à ̈ routinariamente condotto immediatamente dopo l’isolamento e al secondo giorno di coltura. The cell viability test is routinely conducted immediately after isolation and on the second day of culture.
Esempio 2 Co-coltura di spermatozoi umani e SC suine. Example 2 Co-culture of human spermatozoa and porcine SC.
Gli spermatozoi eiaculati vengono ottenuti dal paziente dopo 3 giorni di astinenza sessuale. Dopo aver atteso la liquefazione del campione, gli spermatozoi vengono blandamente selezionati per rimuovere la componente cellulare non gametica tramite metodo a gradiente (Ficoll-Paque Plus [GE Healthcare] al 50%-75%-90%, centrifugati a 800 g per 20 minuti a temperatura ambiente). Successivamente, il pellet di spermatozoi viene lavato con sperm washing medium [Irvine Scientific] e posto in cocultura su piastre contenenti il monostrato di SC suine alla concentrazione di 10 milioni/ml e supplementate con terreno di coltura specifico per SC sopra descritto (punto A). Le piastre così ottenute vengono incubate a 37°C in atmosfera arricchita del 5% di CO2(Figura 2). The ejaculated spermatozoa are obtained from the patient after 3 days of sexual abstinence. After waiting for the sample to liquefy, the spermatozoa are gently selected to remove the non-gametic cellular component by means of a gradient method (Ficoll-Paque Plus [GE Healthcare] at 50% -75% -90%, centrifuged at 800 g for 20 minutes at room temperature). Subsequently, the sperm pellet is washed with sperm washing medium [Irvine Scientific] and placed in coculture on plates containing the pig SC monolayer at a concentration of 10 million / ml and supplemented with culture medium specific for SC described above (point A) . The plates thus obtained are incubated at 37 ° C in an atmosphere enriched with 5% CO2 (Figure 2).
Esempio 3 Valutazione della vitalità e funzionalità degli spermatozoi in co-coltura con le cellule del Sertoli. Example 3 Evaluation of the viability and functionality of spermatozoa in co-culture with Sertoli cells.
Ogni 2 giorni (fino ad un massimo di 7 giorni) sono stati eseguiti test funzionali sugli spermatozoi posti in co-coltura con le cellule del Sertoli. I test comprendono valutazione della motilità nemaspermica (scanner automatico), della vitalità (eosina test), della funzionalità mitocondriale (JC-1), della frammentazione del DNA (Tunel test), del calcio intracellulare (calcium orange), della reazione acrosomiale (CD-46), della capacità di penetrazione (Hamster egg penetration test). Tali test hanno evidenziato che, in confronto agli spermatozoi posti in solo terreno di coltura senza SC, dopo 7 giorni: Every 2 days (up to a maximum of 7 days) functional tests were performed on the spermatozoa placed in co-culture with the Sertoli cells. The tests include evaluation of nemaspermic motility (automatic scanner), vitality (eosin test), mitochondrial function (JC-1), DNA fragmentation (Tunel test), intracellular calcium (calcium orange), acrosome reaction (CD -46), of the penetration capacity (Hamster egg penetration test). These tests showed that, compared to spermatozoa placed in culture medium alone without SC, after 7 days:
- Tutti i parametri funzionali valutati sono significativamente più conservati rispetto al controllo (figura 3); - All the functional parameters evaluated are significantly more conserved than the control (figure 3);
- Gli spermatozoi non vanno incontro a capacitazione né a reazione acrosomiale prematura, come messo in evidenza dai test di valutazione del calcio intracellulare e di esposizione di CD-46 (Figura 4); - The spermatozoa do not undergo either capacitation or premature acrosomal reaction, as evidenced by the tests for the evaluation of intracellular calcium and exposure of CD-46 (Figure 4);
- Gli spermatozoi mantengono la capacità di penetrare l’ovocita (Figura 5). - The spermatozoa retain the ability to penetrate the oocyte (Figure 5).
Di seguito sono riportati nel dettaglio le procedure utilizzate per eseguire i test funzionali: The procedures used to perform functional tests are detailed below:
Esempio 4 Test per la valutazione dell’esposizione della Fosfatidil-serina mediante l†̃Annexin V-FITC, Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) Example 4 Test for the assessment of phosphatidyl-serine exposure using the Annexin V-FITC, Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences)
Test per la valutazione dell’esposizione della Fosfatidil-serina, ligando specifico dell’Annessina V, all’esterno della membrana cellulare quale fenomeno caratteristico dell’apoptosi nelle sue fasi precoci. Viene ulizzata l’Annessina V, coniugata al FITC (fluorocromo che ha la proprietà di emettere a fluorescenza nel verde), con un indicatore di vitalità cellulare quale lo ioduro di propidio (fluorocromo che a fluorescenza emette nel rosso), intercalante del DNA. In breve, in una eppendorf (1,5 ml) si pone il liquido seminale (almeno 2 milioni spermatozoi) e si lava con PBS 1 X a 2500rpm per 10minuti. Successivamente si risospendono le cellule con 100ul di Binding Buffer 1X ad una concentrazione di 1-2 milioni di cellule/ml e si aggiunge 10 ul di Annexin V-FITC (mantenuta in frigorifero a 4°C) e si lasciare incubare al buio per 15 minuti. In seguito si Risospende con 500ul di Binding Buffer e si aggiungono 4 ul di PI (Concentrazione finale 25ug/ml). Il campione à ̈ così pronto per essere analizzato al citofluorimetro. Test for the evaluation of the exposure of Phosphatidyl-serine, a specific ligand of Annexin V, outside the cell membrane as a characteristic phenomenon of apoptosis in its early stages. Annexin V is used, conjugated to FITC (fluorochrome which fluoresces in green), with an indicator of cell viability such as propidium iodide (fluorochrome which fluoresces in red), intercalating DNA. Briefly, seminal fluid (at least 2 million spermatozoa) is placed in an eppendorf (1.5 ml) and washed with 1 X PBS at 2500rpm for 10 minutes. Subsequently, the cells are resuspended with 100ul of Binding Buffer 1X at a concentration of 1-2 million cells / ml and 10 ul of Annexin V-FITC (kept in the refrigerator at 4 ° C) is added and allowed to incubate in the dark for 15 minutes. Then it is resuspended with 500ul of Binding Buffer and 4 ul of PI are added (Final concentration 25ug / ml). The sample is now ready to be analyzed on the flow cytometer.
Esempio 5 Test per la valutazone energetica degli spermatozoi mediante il Mitoprobe JC-1 Assay Kit (Apoptosi Mitocondri) INVITROGEN Example 5 Test for the energetic evaluation of spermatozoa using the Mitoprobe JC-1 Assay Kit (Mitochondria Apoptosis) INVITROGEN
Valuta lo stato energetico degli spermatozoi, determinato in base al potenziale di membrana mitocondriale.Viene utilizzato il catione lipofilico 5, 5’, 6, 6’ tetcloro-1, 1’, 3, 3’ tetraetil-benzimidazolcarbocianide iodato (JC-1). Il JC-1 si trova in forma monomerica quando il Î ̈m mitocondriale à ̈ depolarizzato e se viene eccitato a 488nm emette nel verde; al contrario forma aggregazioni multimeriche quando Î ̈m mitocondriale à ̈ polarizzato e se viene eccitato emette nel rosso (590 nm). Gli spermatozoi vengono aliquotati all’interno di un’Eppendorf (da 1.5 ml) con una concentrazione di circa 2 x 10<6>e si aggiunge 1ml di PBS e 10ul di sonda. Si avvolge l’eppendorf sia con parafilm che con carta stagnola e si incubare per 30 minuti al buio a 37° C. Successivamente si centrifuga a 2500 rpm 10 minuti al cui termine il pellet viene lavato con 1 ml di PBS 1X e centrifugato a 2500rpm per 5 minuti. Infine si Risospende il pellet con 500 µl di PBS1X e si esaminano le cellule attraverso citofluorimetria. Evaluates the energetic state of spermatozoa, determined on the basis of the mitochondrial membrane potential. The lipophilic cation 5, 5â € ™, 6, 6â € ™ tetchlor-1, 1â € ™, 3, 3â € ™ tetraethyl-benzimidazole iodized carbocyanide is used ( JC-1). The JC-1 is found in monomeric form when the mitochondrial Î ̈m is depolarized and if it is excited at 488nm it emits in the green; on the contrary, it forms multimeric aggregations when mitochondrial Î ̈m is polarized and if excited it emits in red (590 nm). The spermatozoa are aliquoted inside an Eppendorf (1.5 ml) with a concentration of about 2 x 10 <6> and 1ml of PBS and 10ul of probe are added. The eppendorf is wrapped with both parafilm and aluminum foil and incubated for 30 minutes in the dark at 37 ° C. Subsequently it is centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes at the end of which the pellet is washed with 1 ml of 1X PBS and centrifuged at 2500rpm for 5 minutes. Finally, the pellet is resuspended with 500 µl of PBS1X and the cells are examined by flow cytometry.
Esempio 6 Valutazione del grado di frammentazione del DNA - DEATH DETECTION KIT, FLUORESCEIN (TUNEL) Example 6 Evaluation of the degree of DNA fragmentation - DEATH DETECTION KIT, FLUORESCEIN (TUNEL)
Valuta il grado di frammentazione del DNA, presente ancora nel nucleo, nella popolazione spermatica (fenomeno tardivo del’apoptosi) mediante marcatura fluorescente delle estremità 3’-OH libere con FITC (fluoresceina) Viene utilizzata una colorazione di contrasto con DAPI (blu) che ci permette di evidenziare lo stato vitale positivo di una cellula. Portare a temperatura ambiente Paraformaldeide 4% in PBS (conservata a 4°C). Dopo aver lavato il liquido seminale con PBS 1X in volume 1:2 lo stesso viene centrifugato per 10 minuti a 2000 rpm, si elimina il surnatante e si aggiungono 3 ml di PBS 1X e si ripete la centrifugazione dopo aver rotto molto bene il pellet con una pipetta. A questo punto si eliminare il surnatante e si aggiungono 50-100µl di PBS 1X. A questo punto si striscia il pellet su un vetrino. Dopo averlo lasciato asciugare si fissa il preparato per 60 minuti a temperatura ambiente in camera oscura con Paraformaldeide. A conclusione si lava per 2 minuti con PBS 1X. Successivamente si pongono 100 microlitri di soluzione di permeabilizzazione sui vetrini (Triton, sigma) e si incuba 2 minuti in frigorifero ponendo i vetrini distesi all’interno di una scatola. Si lava 2 volte con PBS 1X contenuto in due giare diverse in modo da eliminare tutta la soluzione di permeabilizzazione. A questo punto ai campioni vengono aggiunti 50 µl di sonda a 37 °C in atmosfera umidificata per 60 minuti e successivamente si lava 2 volte con PBS 1X per 2 minuti ogni lavaggio e con 40 ml di PBS 1X 3 ul DAPI per 40 secondi. Aggiungere infine 10 ul di Antifade a vetrino umido e coprire con un vetrino copri-oggetto 24x40 e osservare al microscopio a fluorescenza a 100X in immersione. Evaluates the degree of DNA fragmentation, still present in the nucleus, in the sperm population (late apoptosis phenomenon) by fluorescent labeling of the free 3â € ™ -OH extremities with FITC (fluorescein) A counterstain with DAPI (blue) is used ) which allows us to highlight the positive vital state of a cell. Bring 4% Paraformaldehyde in PBS (stored at 4 ° C) to room temperature. After washing the seminal fluid with 1X PBS in volume 1: 2 it is centrifuged for 10 minutes at 2000 rpm, the supernatant is removed and 3 ml of 1X PBS are added and centrifugation is repeated after having broken the pellet very well with a pipette. At this point the supernatant is removed and 50-100µl of 1X PBS are added. At this point the pellet is swiped on a slide. After allowing it to dry, the preparation is fixed for 60 minutes at room temperature in a dark room with Paraformaldehyde. At the end it is washed for 2 minutes with 1X PBS. Then 100 microliters of permeabilization solution are placed on the slides (Triton, sigma) and incubated for 2 minutes in the refrigerator by placing the slides lying flat inside a box. It is washed twice with 1X PBS contained in two different jars in order to eliminate all the permeabilization solution. At this point 50 µl of probe at 37 ° C in a humidified atmosphere are added to the samples for 60 minutes and then washed twice with 1X PBS for 2 minutes each wash and with 40 ml of 1X PBS 3 ul DAPI for 40 seconds. Finally, add 10 ul of Antifade to a wet slide and cover with a cover slide 24x40 and observe under a fluorescence microscope at 100X in immersion.
Esempio 7 valutazione del grado di capacitazione dello spermatozoo mediante REAZIONE ACROSOMIALE Example 7 evaluation of the degree of capacitation of the spermatozoon by ACROSOMIAL REACTION
Valuta la presenza di cd46 esternalizzato come indice di avvenuta reazione acrosomiale dello spermatozoo. Evaluate the presence of externalized cd46 as an index of the acrosomal reaction of the spermatozoon.
Il liquido seminale viene lavato con terreno di coltura e si centrifuga a 2000 rpm per 10 minuti. Il pellet viene risospeso in 100 ul di anti-mouse IgG (vector 4°C) e si lascia incubare per 30 minuti al buio. Successivamente si eseguono due lavaggi e al pellet risospeso si aggiungono 10 ul di CD46-FITC (BD Pharmingen a+4°C). Si lascia incubare 30 minuti al buio. Si eseguono nuovamente dei lavaggi e dopo risospensione in 0,5 ml di PBS si aggiungono 4 ul di PI (25ug/ml) e si esegue la lettura del campione al citofluorimetro. The seminal fluid is washed with culture medium and centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes. The pellet is resuspended in 100 ul of anti-mouse IgG (vector 4 ° C) and allowed to incubate for 30 minutes in the dark. Subsequently, two washes are carried out and 10 ul of CD46-FITC (BD Pharmingen at + 4 ° C) are added to the resuspended pellet. It is left to incubate for 30 minutes in the dark. Washes are carried out again and after resuspension in 0.5 ml of PBS, 4 ul of PI (25ug / ml) are added and the sample is read on the flow cytometer.
Esempio 8 valutazione della presenza di calcio nello spermatozoo- CALCIUM ORANGE Example 8 evaluation of the presence of calcium in the spermatozoon - CALCIUM ORANGE
Valuta la presenza di calcio nello spermatozoo come indice di status di capacitazione dello stesso.Il liquido seminale viene lavato con PBS (3 ml) e successivamente centrifugato a 2500 rpm per 10 minuti. Il pellet viene risospeso in 0,5 ml di PBS e si aggiungono 5 ul di Cacium Orange (10uM, Invitrogen Molecular Probes 4°C) e il tutto viene lasciato per 30’ al buio a temperatura ambiente. A questo punto si aggiungono 3ml di PBS e si centrifugare a 2500 rpm per 10 minuti. Infine il pellet viene risospeso in 100 ul di PBS e viene allestito un vetrino per la lettura al microscopio a fluorescenza nel filtro della Rodamina. Evaluate the presence of calcium in the spermatozoon as an index of its capacitance status. The seminal fluid is washed with PBS (3 ml) and then centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes. The pellet is resuspended in 0.5 ml of PBS and 5 ul of Cacium Orange (10uM, Invitrogen Molecular Probes 4 ° C) are added and the whole is left for 30â € ™ in the dark at room temperature. At this point 3ml of PBS are added and centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes. Finally, the pellet is resuspended in 100 ul of PBS and a slide is prepared for reading under the fluorescence microscope in the Rhodamine filter.
Esempio 9 Pretrattamento di spermatozoi con il metodo di selezione per gradiente di Ficoll. Example 9 Pretreatment of spermatozoa with the Ficoll gradient selection method.
Il Ficoll à ̈ una sostanza a base di silicio colloidale che consente di separare le cellule secondo il loro gradiente di densità . In pratica in una provetta si stratificano le soluzioni di Percoll a concentrazioni crescenti, si depone il liquido seminale in cima alla provetta e si centrifuga per circa 30 minuti. In questo modo si otterrà una separazione degli elementi presenti nel liquido seminale in rapporto alla loro densità . In fondo alla provetta troveremo gli spermatozoi più mobili mentre la componente non gametica si troverà nella porzioni superiori. Il sedimento così ottenuto viene quindi diluito e lavato prima di essere utilizzato per la co-coltura. Ficoll is a colloidal silicon-based substance that allows cells to be separated according to their density gradient. In practice, the Percoll solutions are stratified in a test tube at increasing concentrations, the seminal liquid is deposited on top of the test tube and centrifuged for about 30 minutes. In this way, a separation of the elements present in the seminal fluid in relation to their density will be obtained. At the bottom of the test tube we will find the most mobile spermatozoa while the non-gametic component will be found in the upper portions. The sediment thus obtained is then diluted and washed before being used for co-culture.
BIBLIOGRAFIA BIBLIOGRAPHY
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