ITRM20090235A1 - Modello murino ottenuto mediante inattivazione del gene glucocorticoid-induced leucine zipper, metodo per la sua preparazione e relativi usi. - Google Patents

Description

Modello murino ottenuto mediante inattivazione del gene Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper, metodo per la sua preparazione e relativi usi.

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La presente invenzione si riferisce ad un modello murino ottenuto mediante inattivazione del gene Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper (GILZ) (gene a cerniera di leucina indotto dai glucocorticoidi), metodo per la sua preparazione e relativi usi. In particolare, la presente invenzione concerne un topo da impiegare come modello animale per lo studio dell’infertilità maschile generato mediante una modificazione genetica che comporta la soppressione dell’espressione del gene GILZ.

Circa il 15% della popolazione mondiale ha problemi di infertilità (De Kretser and Baker 1999), tuttavia, ad oggi, la diagnosi e il trattamento dell’infertilità sono piuttosto problematiche e ancora non efficaci. Il potenziale di fertilità di una coppia dipende da molti fattori coordinati e combinati che riguardano l’apparato riproduttore maschile e femminile. Si stima che circa il 13% delle coppie nei paesi occidentali evidenzia problemi di fertilità e il 40% di questi dipendono dai maschi (Van Assche et al.

1996). Le cause più significative dell’infertilità riguardano difetti anatomici, disfunzioni nella gametogenesi, patologie a carico del sistema endocrino, problemi di natura immunologici, difetti nell’eiaculazione ed esposizione a fattori ambientali (Matzuk and Lamb 2008). Anche se nell’uomo alcuni difetti genetici sono stati associati all’infertilità (come ad esempio la sindrome di Turner (Zinn and Ross 2001), i progressi fatti nella conoscenza e nelle tecnologie utilizzate per la comprensione delle cause dell’infertilità sono ancora insufficienti per poter predire e/o curare questo tipo di disfunzione e soprattutto non sono stati individuati i geni responsabili dell’infertilità.

Nel corso degli ultimi anni, diversi modelli animali, modificati geneticamente, hanno contribuito in maniera significativa all’individuazione dei difetti genetici e dei meccanismi molecolari responsabili della sterilità maschile (Escalier 2001; Matzuk and Lamb 2008). I geni che sono coinvolti nella regolazione della fertilità maschile svolgono diverse funzioni in un organismo; essi, per esempio, prendono parte ai processi che guidano la determinazione del sesso o la formazione delle gonadi, oppure possono essere coinvolti nei meccanismi che controllano la spermatogenesi. La complessità del sistema riproduttivo e delle sue funzioni, tuttavia, non consente ancora di definire in modo chiaro e completo quelli che sono i meccanismi responsabili dello sviluppo, della funzione e della regolazione dell’apparato riproduttivo maschile ed infatti molti difetti di infertilità maschile sono spesso diagnosticati come infertilità idiopatica o varicocele senza precisare le cause del difetto stesso (Kojima et al. 2008).

Lo sviluppo dell’apparato riproduttivo à ̈ un processo, che dura settimane (nei roditori) o anni (nell’uomo) e che porta alla maturazione delle cellule germinali e alla formazione delle future gonadi. In particolare lo sviluppo e il differenziamento della linea germinale maschile rappresenta un processo dinamico che prevede la migrazione delle cellule germinali primordiali (PGC) nel testicolo in sviluppo dove si generano le PGC che entrano in arresto mitotico per tutta la durata dello sviluppo fetale. Dopo la nascita queste cellule riprendono l’attività mitotica per formare gli spermatogoni.

Il processo differenziamento degli spermatozoi si distingue in tre fasi: 1) la spermatogenesi che rappresenta la fase proliferativa e maturativa, 2) la spermiogenesi cioà ̈ la fase in cui avviene il differenziamento dello spermatozoo, 3) la spermiazione che rappresenta la fase di rilascio dal testicolo (Wong et al. 2005).

La spermatogenesi à ̈ un processo complesso e coordinato che porta quotidianamente alla maturazione di milioni di spermatozoi nei testicoli. La morfogenesi dei testicoli dei mammiferi inizia a livello embrionale e continua anche dopo la nascita fino alla pubertà quando le cellule germinative risultano completamente mature (spermatozoi). La generazione e il mantenimento di questo ciclo produttivo di cellule germinali mature avviene all’interno dei tubuli seminiferi del testicolo dove risiedono le cellule del Sertoli che formano la nicchia di maturazione di precursori immaturi. Le cellule del Sertoli sono in grado di rilasciare segnali che coordinano i processi di proliferazione, differenziamento e sopravvivenza di cellule germinali ed inoltre, secernono diversi fattori, come il GDNF (Glial cell line-Derived Neutrophic Factor, (Meng et al. 2000), coinvolti nella regolazione della produzione degli spermatozoi. Negli spazi compresi fra i tubuli seminiferi risiedono le cellule del Leydig che secernono principalmente il testosterone. I cicli di maturazione delle cellule germinali sono regolati anche dall’espressione di specifici geni che partecipano, insieme agli stimoli estrinseci, alla normale spermatogenesi.

Gli spermatogoni rappresentano i precursori immaturi dai quali si generano gli spermatozoi. Gli spermatogoni sono le cellule staminali adulte della linea germinale e sono responsabili del mantenimento della spermatogenesi, infatti, da una parte il pool di spermatogoni viene conservato mediante un processo di auto rinnovamento, dall’altra, mediante un processo di differenziamento, vengono generati gli spermatozoi maturi. L’equilibrio tra la fase proliferativa ed il differenziamento degli spermatogoni, à ̈ fondamentale allo scopo di assicurare la fertilità maschile.

La biologia delle staminali spermatogoniali à ̈ stata solo in parte identificata, in particolare sono stati chiariti alcuni aspetti molecolari regolati dai fattori GDNF, oct4, mvh, plzf, gpr15 e taf4b tuttavia, la reale rilevanza di questi fattori nella differenziazione spermatogenetica resta oscura (Wong et al. 2005). Tali difficoltà sono soprattutto legate alla mancanza di un marcatore in grado di identificare e seguire questa specifica sottopopolazione cellulare. La comprensione dei meccanismi molecolari alla base della spermatogenesi à ̈ complicata dal fatto che la maturazione e il funzionamento delle gonadi maschili non dipendono solo dalle cellule germinali, ma anche da cellule di supporto, quali quelle del Sertoli e da cellule con una funzione endocrina, quali le cellule di Leydig. Una cellula staminale, normalmente, risiede in un ambiente definito nicchia e la loro sopravvivenza e/o differenziamento dipende dalle interazioni cellulacellula e da segnali extracellulari, per esempio quelli endocrini. Il ruolo funzionale delle cellule di supporto e delle cellule endocrine che abitano la nicchia delle cellule staminali ed interagiscono con esse non à ̈ tuttavia chiaro(Li and Xie 2005).

Come descritto sopra, le interazioni cellulari tra le cellule germinali e quelle somatiche, entrambe componenti del testicolo, sono cruciali per la normale spermatogenesi e contribuiscono ai complessi meccanismi del loro mantenimento e sviluppo. Difetti che riguardano un solo tipo cellulare possono determinare l’involuzione del testicolo. Per esempio, la sindrome “Sertoli cell-only†può risultare da un difetto nello sviluppo delle cellule germinali, da un difetto della funzione delle cellule del Sertoli, con conseguente perdita di cellule germinali, o da un difetto nel sistema endocrino, anch’esso protagonista nel controllo di un normale processo di spermatogenesi (Bettocchi et al. 1998).

Data questa complessità di interazioni cellulari coinvolte nella spermatogenesi, il sistema nella sua interezza non può essere riprodotto in vitro, e i modelli di topi geneticamente modificati forniscono una alternativa attraente. Usando questo approccio, possiamo studiare i difetti che la mancanza di un determinato gene può portare e scoprire nuovi geni candidati responsabili di un fenotipo aberrante come l’infertilità. Il difetto può diventare evidente in diverse fasi dello sviluppo delle gonadi maschili, a partire dallo sviluppo fetale, come nel caso del topo KO per il fattore trascrizionale steroidogenic factor 1 (SF-1) che non riesce a sviluppare un testicolo normale (Luo et al. 1994). Sono stati descritti diversi topi KO con un difetto post-natale di maturazione delle cellule germinali. Per esempio, topi con una delezione nel locus jsd (juvenile spermatogonial depletion) nel cromosoma 1 nascono con cellule germinali primordiali indifferenziate normali, ma che poi non sono in grado di differenziare a spermatogoni di tipo A (Boettger-Tong et al. 2001). I testicoli di questi topi mancano completamente di cellule della linea germinativa e riproducono la sindrome diagnosticata nell’uomo come “Sertoli cell-only†. Un altro gene con un difetto di maturazione degli spermatogoni, sempre studiato su un modello KO, à ̈ DAZL (Schrans-Stassen et al. 2001), che codifica per una proteina che lega l’RNA ed à ̈ coinvolto nella differenziazione della linea germinale.

Un passo in avanti à ̈ stato fatto utilizzando modelli animali per il trapianto di cellule staminali germinali (Brinster 2007). In questi modelli, le cellule germinali sono iniettate su testicoli recipienti. Queste cellule successivamente dovrebbero essere in grado di colonizzare i tubuli seminiferi dei riceventi che dovrebbero ricostituire una normale produzione di spermatozoi. Per esempio, il trapianto di cellule staminali spermatogoniali (SSC) ha permesso l’identificazione di difetti cellulo-specifici in molti topi mutanti che non erano fertili, come per esempio quelli mancanti per c-Kit e il suo recettore (Ohta et al. 2000).

Comunque, malgrado gli studi fin qui condotti non à ̈ ancora chiaro quanti e quali geni sono coinvolti nel controllo nella generazione della linea germinativa (De Kretser and Baker 1999; Matzuk and Lamb 2008). Infatti, anche se un certo numero di geni candidati al controllo dei complicati meccanismi che regolano la fertilità sono stati identificati grazie all’analisi di modelli animali, la complessità del sistema riproduttivo in generale non ha ancora permesso di identificare quel gene essenziale per la regolazione della spermatogenesi.

Alla luce di quanto esposto sopra risulta pertanto evidente l’esigenza di poter disporre di nuovi strumenti per lo studio delle cause e delle possibili cure della infertilità che superino gli svantaggi della tecnica nota.

Il gene GILZ à ̈ stato originariamente clonato nel 1997 durante uno studio sistematico riguardante l’apoptosi indotta dai glucocorticoidi (GC) e dai geni indotti dai GC (D'Adamio et al. 1997). In seguito, à ̈ stato dimostrato che GILZ può mediare numerose funzioni dei GC, come la modulazione dell’attivazione dei linfociti T, della produzione dell’interleuchina-2 (IL-2), della proliferazione e della morte cellulare (Ayroldi et al. 2001; Delfino et al. 2004; Ayroldi et al. 2007). Più recentemente, sono state definite nuove funzioni di GILZ, incluse quelle riguardanti la regolazione del differenziamento di cellule T helper, la funzione delle cellule dendritiche (Cohen et al.

2006; Hamdi et al. 2007), l’aumento del trasporto di ioni Na+ nel rene (Muller et al. 2003; Soundararajan et al. 2005) e il controllo della trasformazione neoplastica attraverso l’inibizione dell’attività dell’oncogene Ras (Ayroldi et al. 2007).

GILZ à ̈ espresso a diversi livelli in molti tessuti e interagisce con diverse proteine, in particolare gli studi effettuati fino ad oggi hanno dimostrato la sua capacità di interazione con molecole e fattori trascrizionali coinvolti nel controllo del processo infiammatorio, nel ciclo cellulare e nella morte cellulare programmata. Infatti, l’alterazione della normale espressione e/o funzione di GILZ sembrerebbe essere associata all’alterazione dei meccanismi molecolari responsabili della risposta infiammatoria, nonché dell’omeostasi tissutale mediante il controllo del ciclo cellulare e dell’apoptosi.

Come menzionato sopra, GILZ Ã ̈ espresso o indotto in risposta ai GC in molti tipi cellulari che mediano le risposte immunosoppressorie e anti-infiammatorie (D'Adamio et al. 1997; Ayroldi et al. 2001; Berrebi et al. 2003; Cannarile et al. 2006; Cannarile et al.

2009). Tuttavia, anche se l’espressione di GILZ à ̈ di solito indotta dai GC, alcuni studi hanno messo in evidenza come l’induzione di GILZ à ̈ possibile anche in altri modelli sperimentali senza necessariamente la presenza dei GC. Ad esempio, la rimozione di IL-2 porta all’espressione di GILZ in cellule T (Asselin-Labat et al. 2004). La vasopressina e l’aldosterone stimolano la sua espressione in cellule epiteliali renali (Soundararajan et al. 2005), l’IL-10 nei macrofagi di topo (Berrebi et al. 2003) e in cellule endoteliali (Gleissner et al. 2007). GILZ à ̈ anche espresso nella decidua di topo alla fine della gravidanza (Zhao et al.

2006). Inoltre, GILZ à ̈ represso nei linfociti T dopo attivazione da anti-CD3 (Ayroldi et al. 2001), nei linfociti B dall’attivazione del recettore delle cellule B (Glynne et al. 2000), nelle cellule derivate da tumore della mammella MCF-7 dagli estrogeni (Tynan et al. 2004), nelle cellule epiteliali bronchiali umane dalle citochine pro-infiammatorie IL-1, TNF-α, IFN-γ (Eddleston et al. 2007).

GILZ possiede un motivo leucine zipper e pertanto inizialmente era stato considerato un fattore trascrizionale. Il dominio di legame al DNA di GILZ, tuttavia, non à ̈ canonico ed à ̈ necessario per omo- od etero-dimerizzare con altri membri della sua famiglia (D'Adamio et al. 1997) o interagire in vitro con un’altra proteina leucine zipper, c-Fos (Mittelstadt and Ashwell 2001); inoltre, GILZ à ̈ in grado di interagire anche con il fattore trascrizionale NF-κB che à ̈ una proteina “non-leucin zipper†. Il primo studio riguardante l’interazione tra GILZ e le subunità di NF-κB descrive l’inibizione della traslocazione nucleare, il legame al DNA e la transattivazione di NF-kB (Ayroldi et al. 2001). Successivamente à ̈ stato dimostrato che l’interazione GILZ/NF-κB dipende da un dominio di 29 aminoacidi (posizione 98-127) della regione PER che si trova in posizione C-terminale accanto alla Leucine Zipper, e che questo dominio à ̈ necessario per il legame e la repressione trascrizionale di NF-kB (Di Marco et al. 2007).

GILZ attraverso il suo dominio di legame a Ras (RBD) (Ayroldi et al. 2002) interagisce anche con la proteina Raf-1 mediando la via di trasduzione MEK-ERK a cui si à ̈ più recentemente aggiunta quella con Ras (Ayroldi et al. 2007). In particolare, GILZ interagisce principalmente con Ras, anche se, insieme a Raf, possono formare un complesso ternario la cui formazione dipende dallo stato di attivazione di Ras. Inoltre, studi di legame al DNA mediante ChIP (chromatin immunoprecipitation) hanno dimostrato come GILZ funziona come repressore trascrizionale per il gene di peroxisome-proliferator-activated receptor- 2 (PPAR- 2) (Shi et al. 2003). Lo stesso studio ha dimostrato, in un modello sperimentale in vitro, l’interazione di GILZ con histone deacetylase 1 (HDAC1) (Shi et al. 2003).

Gli autori della presente invenzione hanno ora trovato che i topi GILZ Knock Out (KO) maschi risultano essere sterili, in particolare la più importante differenza tra i topi normali (wild-type, WT) e GILZ KO à ̈ stata trovata nei testicoli, dove si à ̈ osservata una notevole riduzione delle dimensioni accompagnata ad un completo svuotamento nei tubuli seminiferi delle cellule germinali. Le differenze tra topi normali e GILZ KO sono evidenti, dal punto di vista sia morfologico sia funzionale, durante la fase di maturazione post-natale delle cellule germinali. Le differenze riscontrate tra i topi che esprimono le isoforme di GILZ e quelli che non le esprimono sono correlate ad un aumento dell’apoptosi delle cellule in maturazione all’interno dei tubuli seminiferi.

Sulla base di quanto sopra riportato gli autori della presente invenzione hanno generato una linea di cellule staminali manipolate geneticamente per creare topi knock-out con espressione condizionata, al fine di valutare il ruolo fisiologico e/o patologico della proteina GILZ in diversi tessuti. L’analisi bioinformatica e genetica del locus genico di GILZ ha permesso di caratterizzare la natura del gene e ha evidenziato come almeno tre isoforme diverse possano essere prodotte dal suddetto gene. Tra queste long-GILZ (L-GILZ), che à ̈ stato clonato e caratterizzato recentemente nel nostro laboratorio (GenBank n. EU81878), come viene in seguito descritto. La manipolazione genetica di questo locus su cellule embrionali staminali di topo ha permesso la generazione di topi knock out (KO) per GILZ (GILZ KO), dove nessuna delle isoforme di GILZ può essere prodotta.

Il modello animale secondo la presente invenzione, pertanto, può contribuire in maniera determinante a chiarire quali sono i meccanismi che regolano la spermatogenesi. Inoltre, l’identificazione del ruolo delle isoforme di GILZ, come proteine essenziali per una corretta maturazione delle cellule germinali maschili, apre nuovi approcci terapeutici sia in termini di terapia genica sia di screening di molecole in grado di modificare le funzioni di GILZ, come ad esempio agonisti, antagonisti, inibitori, etc…, per il trattamento della sterilità maschile.

Pertanto, gli studi qui descritti dimostrano che GILZ à ̈ un gene importante codificante per proteine (GILZ e soprattutto L-GILZ) essenziali per la spermatogenesi. Di particolare interesse à ̈ il fatto che il difetto spermatogenetico del topo GILZ KO bene mima la patologia umana della Sindrome “Sertoli cell only†, causa di sterilità maschile.

Inoltre, il topo GILZ KO rappresenta un modello importante, quale recipiente, per esperimenti di trapianto di cellule germinale onde verificarne la capacità rigenerativa (terapia cellulare) anche nel caso in cui siano state sottoposte a manipolazione genica pre-trapianto. Tale approccio assume importanza anche al fine di verificare il possibile effetto tossico (lesivo) di farmaci e sostanze sui precursori spermatogenetici. Infine, se la mutazione di un gene nel topo o nell’uomo determina l’infertilità, la proteina prodotta da quel gene può essere un futuro bersaglio sia per la generazione di nuovi sistemi contraccettivi, atti ad ottenere una infertilità temporanea o permanente (tramite modulazione dell’espressione genica o l’uso di molecole antagoniste etc…), sia per la stimolazione della spermatogenesi atta ad antagonizzare la sterilità maschile. In questo quadro come sopra descritto il topo GILZ KO può rappresentare un modello di malattia ed un modello atto ad esperimenti di trapianto rigenerativo e/o curativo, della linea germinativa.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un animale transgenico murino, preferibilmente topo, ottenuto mediante delezione condizionale tessuto-specifico mediante ricombinasi CRE del gene GILZ. In particolare, l’animale transgenico murino secondo l’invenzione può essere ottenuto per delezione dell’esone 6 del gene GILZ.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione l’uso dell’animale transgenico murino secondo l’invenzione come modello sperimentale per lo studio e per la ricerca di cure della infertilità maschile.

La presente invenzione concerne inoltre un metodo di preparazione di un animale transgenico murino come definito sopra comprendente o consistente nelle seguenti fasi: a) isolamento da BAC della sequenza nucleotidica del gene GILZ codificante per le proteine aventi numero di accesso in GenBank AAD01789.1, ACJ09091, AAG41220.1; b) preparazione di un vettore targeting mediante clonazione della sequenza nucleotidica della fase a) in un vettore contenente siti LoxP ai lati dell’esone 6 di GILZ, al fine di eliminare la sequenza contenuta dai siti LoxP una volta che sia presente nella stessa cellula la ricombinasi CRE; c) introduzione del vettore targeting e conseguente manipolazione genetica del locus genico di GILZ in cellule staminali embrionali murine Bruce4 ceppo C57BL/6 mediante ricombinazione omologa con il vettore targeting finale; d) iniezione dei cloni in cui à ̈ avvenuta la modifica del locus genico di GILZ in blastocisti di origine C57BL/6 impiantate nell’utero di topi recipienti pseudo-gravide; e) generazione di chimere e screening di animali che consentono la trasmissione genetica del locus di GILZ modificato per ottenere l’animale trasgenico; e f) incrocio di chimere maschi ottenuti nella fase e) con topi femmina CMV-CRE in modo da ottenere topi Knockout per GILZ per tutti gli organi e tessuti. In particolare, l’isolamento della sequenza nucleotidica del gene GILZ della fase a) può essere condotto mediante l’impiego dei seguenti primer: 5'-CACTCCCCTTCTCACTCTGC-3' (senso) (SEQ ID NO: 1) e 5'- GAACTTTATAAGCAGTCATCCC -3' (antisenso) (SEQ ID NO:2).

Costituiscono ulteriore oggetto dell’invenzione cellule staminali embrionali murine Bruce4 ceppo C57BL/6 ottenibili mediante le fasi da a) a c) del metodo definito sopra.

Infine, l’invenzione concerne un animale transgenico ottenibile mediante il metodo definito sopra.

Il modello murino secondo la presente invenzione può essere vantaggiosamente impiegato per lo studio e per la ricerca di cure della infertilità maschile. In particolare, il modello può essere impiegato come modello di malattia tipo Sertoli cell-only syndrome o altri difetti X-linked, per lo studio dei meccanismi che regolano la spermatogenesi nei mammiferi, della possibilità di associare difetti genetici riguardanti il gene GILZ e difetti nella spermatogenesi e nella sterilità. Inoltre, il gene GILZ può essere impiegato come target nella contraccezione, o nella diagnosi mediante sequenziamento di DNA genomico per presenza di polimorfismi o mediante analisi tramite biopsia e rilevamento della proteina GILZ.

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure nei disegni allegati.

Figura 1: A. Schema del locus genico di GILZ murino. Modificato dal Genome Browser on Mouse july 2007 assembly di UCSC (University of California Santa Cruz). Rappresentazione del cromosoma X di topo nella regione qF1, strand -, posizione chrX:137074068-137135061. B. Open Reading Frame (ORF) delle isoforme di GILZ. I numeri sotto le barre rappresentano gli esoni come nominati nello schema A. Sopra le barre sono indicate le ORF delle isoforme con la relativa lunghezza espressa come numero di aminoacidi (aa).

C. L-GILZ ha un inizio di trascrizione contenente un codone CUG non canonico.

D. Comparazione tra le isoforme GILZ e L-GILZ. I numeri rappresentano la posizione degli aminoacidi. TSC: TGF-b stimulated clone-box; LZ: dominio leucine zipper; PER: regione ricca (R) in proline (P) e acido glutammico (E).

Figura 2: GILZ locus nel cromosoma X (modificato dal database CloneFinder NCBI). Gli esoni di GILZ sono rappresentati da box neri con sotto i rispettivi numeri. X: sito di riconoscimento per l’enzima di restrizione XbaI, utile per il subclonaggio del frammento del gene GILZ nel vettore targeting. A, B: siti di inserzione delle sequenze LoxP.

In basso, schema del targeting vector pBSX9.3GILZ dove sono evidenziate tutte le sue caratteristiche piu’ importanti, come descritto nella sezione Materiali e Metodi.

Figura 3: Modificazione genetica del locus del gene GILZ. A. Rappresentazione schematica del locus genico di GILZ e della strategia di modificazione mediante ricombinazione omologa al fine di inattivare il gene GILZ. B. Verifica, mediante tecnica di southern blot, dell’avvenuta modificazione del locus genico di GILZ.

Figura 4: GILZ e la sua isoforma L-GILZ non sono espresse nei testicoli di topi GILZ KO. A. Controllo dell’espressione di mRNA di GILZ ed L-GILZ in topi GILZ WT o KO come indicato in figura mediante RT-PCR. L’espressione del messaggio del gene housekeeping HPRT à ̈ stata utilizzata come controllo. B. Controllo dell’espressione della proteina di GILZ ed L-GILZ in topi GILZ WT o KO come indicato in figura mediante analisi Western blot.1: controllo positivo; 2: milza WT; 3: milza KO; 4: testicoli WT; 5: testicoli KO. L’espressione della proteina ß-actina à ̈ stata utilizzata come controllo.

Figura 5: Espressione di GILZ (A) e L-GILZ (B) in diversi tessuti di topi C57BL/6 valutata mediante Real Time PCR. Fold induction: rapporto di espressione relativo tra il gene housekeeping HPRT e il gene in analisi. Le colonne rappresentano la media di cinque diversi esperimenti deviazione standard. L’espressione di GILZ à ̈ stata arbitrariamente considerata come l’unità.

Figura 6: Atrofia dei testicoli in topi GILZ KO. A. Immagini di testicoli prelevati da topi di 12 settimane WT (wild-type, riga in alto) o KO (knock-out, riga in basso). B. Media ponderale (N=5) del peso corporeo di topi GILZ WT (colonna nera) o KO (colonna bianca); C. Media ponderale (N=5) del peso di testicoli di topi GILZ WT (colonna nera) o KO (colonna bianca); Media ponderale (N=5) della Conta cellulare di topi GILZ WT (colonna nera) o KO (colonna bianca). * < p<0,05.

Figura 7: Analisi del peso di topi normali e GILZ KO a diverse età come indicato nella figura. I valori in figura rappresentano la media ponderale deviazione standard del peso di 10 topi per gruppo.

Figura 8: Arresto della spermatogenesi in topi GILZ KO adulti. A. Colorazione Ematossilina-Eosina di sezioni di testicoli espiantati da topi GILZ WT (A) o KO (B). Ingrandimento 20x. Le frecce indicano le cellule del Sertoli. La lettera L indica le cellule di Leydig all’esterno dei tubuli seminiferi. C. I tubuli seminiferi dei topi GILZ KO adulti contengono solamente cellule del Sertoli. Ingrandimento 63x.

Figura 9: Analisi dell’espressione di mRNA di marker specifici di diverse popolazioni cellulari presenti nei testicoli murini mediante RT-PCR in 3 differenti topi GILZ WT o KO come indicato in figura. L’espressione del messaggio del gene housekeeping HPRT à ̈ stata utilizzata come controllo.

Figura 10: Assenza di cellule aploidi e tetraploidi in topi GILZ KO adulti valutato mediante analisi ciofluorimetrica di cellule di testicolo colorate con Propidio Ioduro. Il grafico rappresenta la media ponderale (N=5) deviazione standard di cellule colorate di GILZ WT (colonna nera) o KO (colonna bianca).

Figura 11: L’espressione di geni essenziali per il mantenimento e il differenziamento delle cellule PGC (primordial germ cells) à ̈ fortemente alterata in testicoli di topi GILZ KO. Analisi di RT-PCR condotta su testicoli di topi adulti WT e GILZ KO di marker espressi da cellule del Sertoli (A) o da cellule germinali (B). L’espressione del messaggio del gene housekeeping HPRT à ̈ stata utilizzata come controllo.

Figura 12: Espressione di GILZ ed L-GILZ durante la maturazione delle cellule germinali. Analisi dei livelli di mRNA di GILZ ed L-GILZ nei testicoli di topi C57BL/6 WT a diversi giorni dopo la nascita come indicato in figura. (dpp: day post partum, giorni dopo la nascita). Fold induction: rapporto di espressione relativo tra il gene housekeeping HPRT e il gene in analisi.

Figura 13: Arresto della spermatogenesi in topi GILZ KO in età prepuberale e adulta. Colorazione Ematossilina-Eosina di sezioni di testicoli espiantati da topi GILZ WT (immagine a sinistra) o KO (destra) a diverse età come indicato in figura (dpp: day post partum, giorni dopo la nascita).

Figura 14: Analisi di geni marker specifici di diverse fasi della spermatogenesi. Espressione del RNA messaggero di OCT4, CycA1, CycA2 e Bmp8a in testicoli di topi WT e GILZ KO a diverse età come indicato in figura. (dpp: day post partum, giorni dopo la nascita). Questo à ̈ un esprerimento di RT-PCR rappresentativo di tre differenti esprerimenti. L’espressione del gene housekeeping HPRT à ̈ stata utilizzata come controllo.

Figura 15: Alterazione dell’apoptosi in topi GILZ KO a differenti età neonatali. Saggio TUNEL di sezioni di testicoli espiantati da topi GILZ WT (immagine a sinistra) o KO (destra) a diverse età come indicato in figura (dpp: day post partum, giorni dopo la nascita).

Figura 16: L’espressione di geni essenziali per il normale controllo dei processi apoptotici non varia in testicoli di topi WT eGILZ KO. Analisi di RT-PCR condotta su testicoli di topi neonatali WT e GILZ KO a diverse età come indicato in figura (dpp: day post partum). L’espressione del messaggio del gene housekeeping beta-Actina, b-Act, à ̈ stata utilizzata come controllo.

Figura 17: Le cellule rimanenti all’interno di tubuli seminiferi di topi GILZ KO adulti sono cellule del Sertoli. Immunofluorescenza per GATA-1 in topi WT e GILZ KO adulti. Ingrandimento 20x.

Figura 18: A. Espressione di recettori ormonali in testicoli di topi WT o GILZ KO adulti mediante RT-PCR. L’espressione del messaggio di HPRT à ̈ stata utilizzata come controllo. B. Livelli di testosterone WT o GILZ KO adulti valutato mediante saggio RIA. C. Espressione di FSH ed LH valutata mediante RT-PCR su ipofisi di topi WT o GILZ KO adulti. L’espressione del messaggio di HPRT à ̈ stata utilizzata come controllo.

Esempio 1: Preparazione e studio di topi GILZ KO secondo l’invenzione

MATERIALI E METODI

Clonaggio di L-GILZ.

Da un’analisi computazionale sul database della University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser, (http://genome.ucsc.edu/), si puo’ evidenziare come il gene gilz (o TSC22d3) mappa sul filamento negativo del braccio lungo del cromosoma X in posizione 137074068-137135061. È formato complessivamente da una sequenza genomica di 39007 bp in cui si trovano 6 esoni e 5 introni (Fig. 1). GILZ, à ̈ già stato clonato precedentemente nel nostro laboratorio (D'Adamio et al.

1997). L’RNA messaggero di GILZ ha una lunghezza di 1963 bp, di cui 414 bp costituiscono “l’open reading frame†codificante per una proteina di 137 residui amminoacidici, mentre le restanti fanno parte della regione trascritta e non tradotta al 5’ e al 3’. L’analisi di sequenze EST (Expressed Sequence Tags) e la previsione basata sui dati di RefSeq, Genbank, and UniProt, mostra come siano possibili almeno altri 2 trascritti alternativi generati dallo stesso locus aventi in comune il secondo e terzo esone di GILZ (Fig. 1B).

Partendo da questi dati, abbiamo disegnato dei primers basandoci sulla sequenza denominata nel suddetto database uc009ulb.1 (SEQ ID NO: 60 rappresentata nella Tabella I).

Tabella I

>uc009ulb.1 length=2149 tcactccccttctcactctgcgtgcgtgcgggctgctgggcaagtctctcgaggg gtcgacggagccggtttacctgaagtggcagcttgtttttccgggcaccctggag tcccaaaaggctagctccgcaggtgcgcacctgccggccgcccccgacctccctg agcaggccgccgccgccgctgcctccaagccggagaagatggcccagcccaagac cgagtgccgctcacctgttggcctcgactgctgcaactgctgcctcgacctggcc aaccgctgcgagctccagaaggagaagagcggggagagcccgggcagccccttcg tgagcaactttcggcagctgcaggagaagctcgtcttcgagaacctcaacactga caagctgaacaacataatgcgccaggattccatggagcccgtggtgcgcgacccc tgctacctgatcaatgagggcatctgcaaccgcaacatagaccagaccatgctct ccattctacttttcttccacagtgcctccggagccagtgtggtggccctagacaa caagattgagcaggccatggacctcgtgaagaaccacctgatgtacgctgtgaga gaggaggtggaggtcctaaaggagcagattcgtgagctgcttgagaagaactccc agctggagcgcgagaacaccctcctgaagacgctggcaagccccgagcaactgga aaagttccagtcccggctgagccctgaagagccagcacctgaagccccagaaacc ccggaaaccccggaagcccctggtggttctgcggtgtaagtggctctgtccttag ggtgggcagagccacatcttgttctacctagttctttccagtttgtttttggctc cccaagcgtcatctcatgtggagaactttacacctaacatagctggtgccaagag atgtcccaaggacatgcccatctgggtccactccagtgacagacccctgacaaag agcaggtctctggagactaagttgcatggggcctagtaacaccaagccagtgagc ctgtcgtgtcaccgggccctgggggctcccagggcctgggcaacttagttacagc tgaccaaggagaaagtagttttgagatgtgatgccagtgtgctccagaaagtgta aggggtctgtttttcatttccatggacatcttccacagcttcacctgacaatgac tgttcctatgaagaagccacttgtgttctaagcagaagcaacctctctcttcttc tctgtcttttccaggcaggggcagagatgggagagattgagccaaatgagccttc tgttggttaatactgtataatgcatggctttgtgcacagcccagtgtggggttac agctttgggatgactgcttataaagttctgtttggttagtattggcatcgttttt ctatatagccataatgcgtatatatacccatagggctagatctatatcttagggt agtgatgtatacatatacacatacacctacatgttgaagggcctaaccagctttg ggagtactgactggtctcttatctcttaaagctaagtttttgactgtgctaattt accaaattgatccagtttgtcctttagattaaataagactcgatatgagggaggg aggggagaccagcctcacaatgcggccacagatgccttgctgctgcagtcctccc tgatctgtccactgaagacatgaagtcctcttttgaatgccaaacccaccattca ttggtgctgactacatagaatggggttgagagaagatcagtttggacttcacatt tttgttttaagttttaggttgtttttttttggttttgtttgtttgtttgtttgtt tgtttttgttttttgtttttcttttttttaagttcttgtgggaaactttggggtt aatcaaaggatgtagtcctgtggtagaccagaggagtaactagttttgatccctt tggggtgtggaaaatgtacccaggaagcttgtgtaaggaggttctgtgacagtga acactttccactttctgacacctcatcctgctgtacgactccaggatttggattt ggatttttcaaatgtagcttgaaatttcaataaactttgctcctttttctaaaaa taaa

Questa sequenza rappresenta il trascritto più lungo che il gene GILZ può generare. Questa isoforma à ̈ prodotta dallo splicing dell’ esone 1 e 2 che vanno sull’esone 5 e 6, come descritto in Fig. 1. Abbiamo ottenuto il cDNA da cellule murine, prima mediante estrazione di RNA totale con il reagente Trizol Reagent (Invitrogen) e successivamente con la retro-trascrizione a cDNA con il kit SuperScript III (Invitrogen). I primers utilizzati per appaiarsi alle regioni 5’- e 3’-non traslate del trascritto che volevamo clonare sono stati: 5'-CACTCCCCTTCTCACTCTGC-3' (senso) (SEQ ID NO: 1) e 5'- GAACTTTATAAGCAGTCATCCC -3' (antisenso) (SEQ ID NO:2). Il prodotto generato dalla reazione di PCR à ̈ stato clonato nel vettore pcDNA3.1-Topo vector (Invitrogen). La sequenza che à ̈ stata così clonata ha una lunghezza di 1402 paia di basi e abbiamo chiamato questa sequenza L-GILZ (GenBank Accession number EU818782; protein ID ACJ09091).

Costruzione del vettore targeting pBSX9.3GILZ.

La prima fase di generazione di un topo modificato geneticamente e’ localizzare la regione del locus genico che si vuole modificare o eliminare. Per fare questo e’ necessario preparare un vettore detto “targeting†con regioni di omologia fiancheggianti la regione da modificare.

Il frammento genomico contenente il locus genico di GILZ e’ stato ottenuto mediante digestione del BAC (#RP23-384P21, posizione 136928703-137123544, cromosoma X banda XqF1) acquistato presso BACPAC Resources Center (BPRC), Children's Hospital and Research Center at Oakland (CHRCO), Oakland, CA, USA. La digestione del BAC e’ avvenuta con diversi emzimi di restrizione. I frammenti utili alla preparazione del vettore per il targeting del gene GILZ sono stati isolati mediante purificazione da gel di agarosio, purificati e subclonati con l’enzima di restrizione XbaI nel vettore pBlueScript. Successivamente sono state individuate due sequenze, una a monte ed una a valle dell’esone 6, chiamate A e B (rispettivamente posizione 137076141-137076272 e 137073825-137074044), adatte all’inserimento dei siti LoxP di 34 paia di basi (Fig. 2). Queste sequenze sono state inserite mediante la tecnica di ET recombination (Zhang et al. 1998) in modo da ottenere il vettore targeting finale pBSX9.3GILZ (Fig. 2). Da notare, indicate nella figura, le seguenti parti inserite nel vettore pBSX9.3GILZ: una cassetta contenente il gene batterico della fosfotransferasi neomicina sotto il controllo del promotore della timidina chinasi, per conferire la resistenza alla sostanza G418 (NEO); cassetta contenente la resistenza all’antibiotico Ampicillina (AmpR); sito unico di riconiscimento per l’enzima di restrizione NotI, necessario per la linearizzazione del vettore targeting prima dell’elettroporazione nelle cellule staminali embrionali (Fig. 2).

Il vettore targeting finale pBSX9.3GILZ e’ stato controllato mediante mappa di restrizione con diversi enzimi e sequenziato nei punti di giunzione. Dopo che queste analisi si sono confermate corrette, una preparazione “maxi†del plasmide pBSX9.3GILZ e’ stata fatta utilizzando il maxi-kit per l’estrazione plasmidica “endotoxin-free†(Qiagen), per avere una quantita’ sufficiente di plasmide necessaria per l’elettroporazione nelle cellule ES.

Generazione di cellule embrionali staminali di topo ricombinanti e produzione di chimere.

La fase successiva per la preparazione del topo KO Ã ̈ il targeting del locus genico nelle cellule ES utilizzando il vettore targeting pBSX9.3GILZ.

30 µg del vettore targeting pBSX9.3GILZ sono stati elettroporati in 1x10<6>di cellule staminali embrionali murine Bruce4 (C57BL/6 strain) con un singolo impulso di 240 Volts, 500 µF. Dopo 24 ore dall’elettroporazione, à ̈ stato aggiunto al terreno di coltura il G418 per la selezione. Dopo 7 giorni i cloni resistenti al terreno selettivo sono stati prelevati dalla piastra di coltura ed espansi singolarmente su piastre a 96 pozzetti per due settimane in triplicato (una copia à ̈ stata congelata e due sono state utilizzate per l’estrazione del DNA genomico). Il DNA genomico estratto da queste cellule à ̈ stato utilizzato per valutare il genotipo dei cloni e individuare quelli dove era avvenuta la modificazione del locus genico di GILZ mediante ricombinazione omologa. Questi eventi di ricombinazione sono stati verificati mediante Southern blot come descritto in Fig. 3. Tre cloni positivi sono stati espansi ulteriormente in vitro su piastra e successivamente iniettati su blastocisti di origine C57BL/6. Le chimere generate sono state genotipizzate mediante Southern blot, con la stessa strategia utilizzata per lo screening delle cellule staminali embrionali e che ha previsto due probe (probe 5’ e 3’) come indicato in fig. 3A. L’incrocio di chimere maschi positive con topi femmina CMV-CRE (Su et al. 2002) ha permesso la formazione di topi con l’allele modificato con la rimozione dell’esone 6. In questa maniera tutti i topi contenenti questa modifica nel cromosoma X hanno il gene GILZ inattivato. Tutte le analisi sono state condotte con topi con un ceppo puro C57BL/6.

Purificazione dell’RNA e analisi RT-PCR.

L’RNA totale à ̈ stato isolato da testicoli di topi WT o KO della stessa età e della stessa cucciolata utilizzando il reagente Trizol (Invitrogen) seguendo le istruzione della casa produttrice. La retrotrascrizione à ̈ stata fatta con il kit della Qiagen QuantiTect Reverse Transcription. I primers utilizzati nelle RT-PCR sui diversi tessuti analizzati per l’amplificazione del cDNA sono elencati nella Tabella II.

Tabella II

AR for AAGACCTGCCTGATCTGTGG (SEQ ID NO 3)

AR rev TCGTTTCTGCTGGCACATAG (SEQ ID NO 4)

Bax for GCGAATTGGAGATGAACTGGAC (SEQ ID NO 5)

Bax rev AGCAAAGTAGAAGAGGGCAACC (SEQ ID NO 6)

BAZF for GCAGCAGTGAAGAAGGAACC (SEQ ID NO 7)

BAZF rev AGCCACAGCCTCACAGTTCT (SEQ ID NO 8)

BCL2 for AGTACCTGAACCGGCATCTG (SEQ ID NO 9)

BCL2 rev GGTATGCACCCAGAGTGATG (SEQ ID NO 10)

Bcl-XL for GAATGACCACCTAGAGCCTTG (SEQ ID NO 11)

Bcl-XL rev GAACCACACCAGCCACAG (SEQ ID NO 12)

Beta_Actin for CCAACCGTGAAAAGATGACC (SEQ ID NO 13) Beta_Actin rev CGTGAGGGAGAGCATAGCC (SEQ ID NO 14) Bmp-8b for ATTACTGTGCTGGGGAGTGC (SEQ ID NO 15) Bmp-8b rev TGGGGATGATATCTGGCTTC (SEQ ID NO 16) CyclinA1 for CAGAGCTCCAAGAGTGGAG (SEQ ID NO 17) CyclinA1 rev AGTGGAGATCTGACTTGAGC (SEQ ID NO 18) CyclinA2 for CACCTCGAGGCATTCGGG (SEQ ID NO 19) CyclinA2 rev CGGGTAAAGAGACAGCTGC (SEQ ID NO 20) ER_alpha for GATGGGCTTATTGACCAACC (SEQ ID NO 21) ER_alpha rev CCAGGCACACTCCAGAAGG (SEQ ID NO 22) ERM for CCGAGTTGTCGTCCTGTAG (SEQ ID NO 23) ERM rev ACTGGCTTTCAGGCATCATC (SEQ ID NO 24) FasL for ACCCCAGTACACCCTCTGAA (SEQ ID NO 25) FasL rev GATCACAAGGCCACCTTTCT (SEQ ID NO 26) FSH_beta for TCAGCTTTCCCCAGAAGAGA (SEQ ID NO 27) FSH_beta rev CCGAGCTGGGTCCTTATACA (SEQ ID NO 28) FSHR for CCAAGCTTCGAGTCATTCCA (SEQ ID NO 29) FSHR rev ATGCAAGTTGGGTAGGTTGG (SEQ ID NO 30) GDNF for CGGACGGGACTCTAAGATGA (SEQ ID NO 31) GDNF rev CGTCATCAAACTGGTCAGGA (SEQ ID NO 32) GFRA1 for CCATGTTCCTAGCCACTCTG (SEQ ID NO 33) GFRA1 rev CACTGGCTTTCACACAGTCC (SEQ ID NO 34) GILZ rev TCTTGTTGTCTAGGGCCACC (SEQ ID NO 35) GILZ for AGGGGATGTGGTTTCCGTTA (SEQ ID NO 36) GR for AACTGGAATAGGTGCCAAGG (SEQ ID NO 37)

GR rev GAGCACACCAGGCAGAGTTT (SEQ ID NO 38)

HPRT for CGTCGTGATTAGCGATGATG (SEQ ID NO 39)

HPRT rev ACAGAGGGCCACAATGTGAT (SEQ ID NO 40)

HSP 70-2 for CGCCTCACCCAACTAGATATCA (SEQ ID NO 41)

HSP 70-2 rev GCTTCATATCGGACTGCACTGT (SEQ ID NO 42)

LGILZ for ACCGCAACATAGACCAGACC (SEQ ID NO 43)

LGILZ rev TCTTGTTGTCTAGGGCCACC (SEQ ID NO 44)

LH-beta for AGTTCTGCCCAGTCTGCATC (SEQ ID NO 45)

LH-beta rev TGAGGGCTACAGGAAAGGAG (SEQ ID NO 46)

LHCGR for TCACAAGCTTTCAGGGGACT (SEQ ID NO 47)

LHCGR rev GCAGGTTTTTGGTGTTCTGG (SEQ ID NO 48)

NGN3 for GCTATCCACTGCTGCTTGA (SEQ ID NO 49)

NGN3 rev CCGGGAAAAGGTTGTTGTGT (SEQ ID NO 50)

OCT4 for GAGCACGAGTGGAAAGCAAC (SEQ ID NO 51)

OCT4 rev TTCTGCAGGGCTTTCATGTC (SEQ ID NO 52)

p53 for TTCAGTTCATTGGGACCATC (SEQ ID NO 53)

p53 rev ATATCCGACTGTGACTCCTC (SEQ ID NO 54)

SOX9 for AGTACCCGCATCTGCACAAC (SEQ ID NO 55)

SOX9 rev AATCGGGGTGGTCTTTCTTG (SEQ ID NO 56)

Le condizioni della reazione PCR sono state le seguenti: denaturazione 95°C 5 minuti seguita da 30 cicli composti da: denaturazione 95°C 20 secondi: appaiamento 60°C 20 secondi; allungamento 72°C 20 secondi.

Analisi Real-Time PCR.

Per la Real-Time PCR quantitativa sono stati utilizzati I seguenti primers: GILZ senso 5'-GGTGGCCCTAGACAACAAGA-3' (SEQ ID NO: 57), antisenso 5'-TCTTCTCAAGCAGCTCACGA-3' (SEQ ID NO: 58). L-GILZ, senso 5'-ACCGCAACATAGACCAGACC-3' (SEQ ID NO: 43), antisenso 5'-TCTTCTCAAGCAGCTCACGA-3' (SEQ ID NO:59). HPRT, senso 5'-CGTCGTGATTAGCGATGATG-3' (SEQ ID NO:39), antisenso 5'-ACAGAGGGCCACAATGTGAT-3' (SEQ ID NO:40). La reazione di polimerizzazione à ̈ avvenuta utilizzando il termociclatore CHROMO 4 (MJ Research Bio Rad, Milan, Italy) usando il kit DyNAmo HS SYBR GREEN qPCR (Finnzymes; Celbio). Le condizioni per i cicli della reazione sono stati I seguenti: denaturazione (95°C for 15 min), amplificazione e programma di quantizzazione, ripetuto 40 volte, 95°C per 20 sec, 58°C per 20 sec, 72°C per 20 sec, curva di denaturazione 70-95°C con una velocità di riscaldamento di 0.5 °C per sec).

Pee calcolare le quantità relative di GILZ, L-GILZ and HPRT mRNA, à ̈ stato utilizzato il metodo della comparazione della ∆∆C(t). Il valore C(t) à ̈ stato determinato utilizzando il software Opticon Monitor 2 (MJ Research Bio Rad).

Analisi istologica di testicoli di topi neonati e adulti e reazione TUNEL.

I testicoli sono stati espiantati da topi WT e KO di differente età e fissati in soluzione di Bouin (Sigma) per 24 ore a 4C, progressivamente disidratati in una serie graduata di etanolo ed inclusi in paraffina (Paraplast, SIGMA). Successivamente sono state montate su vetrino sezioni di tessuti in paraffina di 5 micrometri. Queste sezioni sono state utilizzate per gli esperimenti di immunoistochimica, di immunofluorescenza, per la reazione TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end-labeling) e per la colorazione con ematossilinaeosina.

Per la TUNEL sono state seguite le istruzioni del kit commerciale ApopTAg Red in situ (Chemicon International). Brevemente, le sezioni sono state pretrattate con proteinasi K (20 µg/ml) per 15 min. a temp. amb. Dopo 2 lavaggi con PBS 1x, i campioni sono stati incubati con il tampone di reazione contenente TdT per 1 ora a 37C. Dopo lavaggio con PBS 1x, i campioni sono stati incubati per 30 min. a temp. amb. Con il tampone contenente l’anticorpo anti-digoxigenina coniugato con rodamina. Prima del montaggio i vetrini sono stati colorati anche con 15 µl di DAPI (1 µg/ml) per cinque minuti. I campioni sono stati conservati al buio a -20C fino al momento dell’analisi al microscopio a fluorescenza.

Per le analisi di immunofluorescenza, le sezioni sono state incubate, dopo la procedura di smascheramento dell’antigene (bollitura 1 ora in tampone Sodio citrato 10 mM pH 6), le cellule sono state lavate tre volte con PBS 1x e successivamente incubate con anticorpo primario (GATA-1, Santa Cruz, diluizione 1:100) per 1 ora a temperatura ambiente in PBS 3% BSA 0.1% Triton X-100. Stessi tempi e tampone di incubazione per l’anticorpo secondario (anti-ratto coniugato con AlexaFluor, Molecular Probes). La colorazione con DAPI (Sigma) à ̈ stata fatta subito prima di montare il vetrino per cinque minuti a temperatura ambiente. L’acquisizione delle immagini à ̈ stata fatta con un miscoscopio Leica equipaggiato con una telecamera Diagnostic Instruments.

Analisi Western blot.

Una quantità uguale di proteine (30 µg) di diversi tessuti di ogni genotipo, sono state separate mediante SDS-PAGE e successivamente analizzate con tecnica immunoblotting come precedentemente descritto (Bruscoli et al. 2006). SOno stati utilizzati i seguenti anticorpi: anticorpo policlonale di coniglio anti-GILZ (Santa Cruz, FL-134); anticorpo monoclonale di topo anti--actina (Sigma). Tutti gli anticorpi primari sono stati incubati per tutta la notte a 4°C. Gli anticorpi secondari anti-coniglio e anti-topo coniugati con la perossidasi (HRP, Thermo Scientific) sono stati incubati a temp. amb. Per 1 ora. La membrana per il trasferimento delle proteine à ̈ la PVDF (Hybond plus) dell’Amersham. Per la reazione di chemioluminescenza sono state utilizzate le soluzioni SuperSignal (Pierce).

Saggio RIA.

I livelli di Testosterone sono stati valutati con un kit commerciale RIA (Radioimmuno assay) (ICN Pharmaceuticals Ltd., Basingstoke, UK) come precedentemente descritto (Ã’Shaughnessy and Sheffield 1990). Il siero prelevato da cinque animali di topi adulti normali o GILZ KO, sono stati messi insieme per formare il gruppo WT o GILZ KO da testare nel saggio.

Analisi statistiche.

Tutti gli esperimenti, anche dove non esplicitamente espresso, sono stati condotti almeno in triplicato. Per l’analisi dei dati, il test t di Student à ̈ stato applicato con il programma compurerizzato STATPAC ed una P<0.05 à ̈ stata considerata significativa.

RISULTATI

Analisi del locus genico di GILZ

L’analisi bioinformatica del locus genico di GILZ murino à ̈ stata condotta utilizzando il database della UCSC (University of California Santa Cruz). Il gene di GILZ si trova sul cromosoma X in posizione 137,074,068-137,135,061. GILZ à ̈ stato clonato nel nostro laboratorio nel 1997, come precedentemente descritto (D’adamio, Immunity, 1997). Recentemente abbiamo clonato e sottomesso una nuova sequenza amminoacidica per una nuova isoforma prodotta dal gene GILZ, che abbiamo chiamato L-GILZ. Questa nuova variante ha una ORF (open reading frame) di 705 paia di basi (bp) e codifica per una proteina di 234 amminoacidi, con un peso molecolare previsto di 26 KDa e differisce dall’isoforma GILZ solo nella porzione N-terminale (Fig 1B). Una caratteristica particolare di questo trascritto alternativo à ̈ quello di avere un sito di origine di trascrizione non canonico non-AUG; infatti, il trascritto inizia con un CTG dove c’à ̈ un’alta omologia con la sequenza consenso di Kozak, sequenza caratteristica dei siti di origine di trascrizione (Fig. 1C). Almeno tre isoforme vengono generate dal gene GILZ e tutte e tre vengono generate da un diverso esone 1 alternativi tra loro che poi convergono negli esoni 5 e 6, che sono le parti in comune a tutti le isoforme come si vede nello schema della figura 1A. Queste isoforme condividono una porzione comune importante della sequenza amminoacidica. Gli esoni condivisi codificano per una parte importante dell’ORF della proteina e comprende i domini leucine zipper (LZ), Tsc-box, e PER (Fig. 1D), importanti per la funzione della proteina GILZ, come già precedentemente dimostrato (Ayroldi et al. 2002; Ayroldi et al. 2007; Di Marco et al. 2007).

Generazione del topo GILZ KO

Nel disegnare la strategia di delezione della funzione di GILZ l’eventuale presenza di trascritti alternativi va tenuta in considerazione poiché la delezione di una sola isoforma potrebbe portare ad un effetto di compensazione provocato da un’altra isoforma. Quindi nella messa a punto della strategia di targeting si à ̈ deciso di modificare il locus determinando una delezione dell’esone 6 dato che e’ condiviso da tutti i trascritti del gene e contiene una porzione importante della proteina GILZ. Infatti, l’esone 6 codifica per la maggior parte della proteina GILZ (circa il 65%); codifica per i domini funzionali fino ad oggi conosciuti responsabili della dimerizzazione e dell’interazione diretta con altre proteine quali NF-kB; l’eliminazione dell’esone 6 assicura anche che le altre 2 possibili proteine generate dai trascritti alternativi siano prive dei domini funzionali sopra citati.

Il topo GILZ KO à ̈ stato generato partendo da cellule embrionali staminali (ES) in cui il gene GILZ à ̈ stato modificato geneticamente mediante ricombinazione omologa con il vettore pBSX9.3 GILZ (targeting vector), contenente l’allele modificato con i siti LoxP ai lati dell’esone 6 di GILZ (Fig. 2A). La iniezione di ES così modificate in blastocisti di topi C57BL/6 ha dato origine a 4 chimere contenenti il locus di GILZ modificato come nel targeting vector. Due di queste chimere sono state incrociate con topi transgenici CMV-CRE, contenenti la ricombinasi CRE, che riconosce i siti LoxP ed elimina in maniera specifica la porzione di DNA che à ̈ compresa tra questi siti. Questo incrocio ha portato all’immediata rimozione della cassetta all’interno dei siti LoxP, generando un allele modificato come in figura 3A. Tutti i trascritti prodotti dal gene GILZ nel cromosoma modificato dovrebbero essere in questo modo inattivati e nessun trascritto funzionale di GILZ dovrebbe essere prodotto in seguito alla rimozione dell’esone 6 di GILZ. I nuovi nati sono stati controllati mediante Southern blot e PCR per individuare l’avvenuta trasmissione genetica della modifica (Fig 3B). Questi animali sono diventati i capistipiti di una nuova linea di topi manipolati geneticamente, dove, su un puro background C57BL/6, il gene GILZ à ̈ stato inattivato. Questi topi saranno chiamati da qui in poi topi GILZ KO.

Analisi fenotipica del topo GILZ KO

I topi GILZ KO nascono vitali e il numero dei cuccioli per parto, la frequenza dei parti e il rapporto tra nati maschi e femmina à ̈ normale. Alla nascita i cuccioli non presentano segni evidenti di malattie o di difetti morfologici, anatomici o di comportamento.

In prima analisi abbiamo verificato che, all’avvenuta inattivazione del gene GILZ, corrispondesse l’assenza del RNA messaggero e della proteina delle isoforme prodotte dal gene GILZ. In Fig. 4A si vede come il mRNA di GILZ e di L-GILZ à ̈ rilevabile nei testicoli di topi WT, mentre à ̈ completamente assente in topi GILZ KO. Stesso risultato per quanto riguarda l’espressione della proteina (Fig. 4B, linea 4 contro linea 5). È interessante notare come, per quanto riguarda i testicoli, l’isoforma principalmente espressa sia L-GILZ (Fig. 4B, linea 4), mentre nella milza à ̈ prevalentemente espressa l’isoforma GILZ (Fig 4B, linea 2).

Studi sull’espressione delle varie isoforme di GILZ nei diversi tessuti, effettuati mediante RealTime PCR, mostrano come i diversi trascritti di GILZ siano differentemente espressi in diversi tessuti (Fig. 5). Come dimostrato in precedenza (D'Adamio et al. 1997; Cannarile et al. 2001), GILZ à ̈ espresso nei tessuti linfoidi, ma anche in altri tessuti come muscolo scheletrico e polmone (Fig 5A). L-GILZ, invece, sembra essere principalmente espresso nei testicoli, in rapporto ad altri tessuti, come quelli linfoidi (Fig.

5B).

L’autopsia di giovani topi maschi in età adulta (10-12 settimane) non ha mostrato sostanziali differenze apprezzabili a carico dei seguenti organi: Timo, polmoni, cuore, fegato, reni, intestino, stomaco, milza, pancreas, vescica.

L’unico organo dove sono evidenti delle differenze tra topi normali e GILZ KO à ̈ il testicolo. Come si vede dalla Fig. 6A, i testicoli dei topi GILZ KO hanno una dimensione ridotta del 70-80% rispetto ai topi WT della stessa età. Inoltre, mentre il peso di topi WT e KO sono comparabili (Fig. 6B, a sinistra), il peso e la conta cellulare dei testicoli à ̈ significativamente diverso tra topi WT e GILZ KO (Fig. 6B, al centro e a destra).

Tre topi GILZ KO sono stati accoppiati ciascuno con una coppia di topi C57BL/6 femmina per un periodo di 6 mesi, e nessuna delle femmine in accoppiamento à ̈ rimasta incinta.

Durante i primi 9 mesi di vita dei topi non ci sono apprezzabili differenze di peso tra topi WT e GILZ KO (Fig. 7)

Da questa prima analisi fenotipica si può pertanto concludere che il topo maschio GILZ KO à ̈ vitale, raggiunge l’età adulta ed à ̈ sterile.

GILZ à ̈ essenziale per la normale spermatogenesi Sulla base dell’infertilità e dell’atrofia osservata nei testicoli dei topi GILZ KO, siamo andati a studiare la spermatogenesi nei testicoli di topi GILZ KO.

L’analisi istologica condotta su sezioni di testicoli adulti da topi WT e GILZ KO rivela che nel testicoli di topi GILZ KO sono più piccoli, circa un quinto dei normali, e presentano una completa deplezione delle cellule della linea geminativi all’interno dei tubuli seminiferi (Fig 8B, C confrontata con 8A).

L’assenza di cellule germinali in topi adulti GILZ KO à ̈ confermata da analisi di RT-PCR. Infatti, mentre l’espressione dell’mRNA di SOX-9 e del recettore dell’ormone luteinizzante (LHGCR), rispettivamente marker specifici delle cellule del Sertoli e delle cellule di Leydig, à ̈ simile in topi WT e GILZ KO, l’espressione di Oct-4, marker di cellule germinali, à ̈ completamente assente nei topi GILZ KO (Fig. 9).

Questo dato à ̈ confermato dalla analisi citofluorimetrica che determina il contenuto di DNA per cellula, mediante colorazione con Propidio ioduro (PI). Nelle cellule dei testicoli di GILZ KO sono assenti la popolazione tetraploide e apolide, che caratterizzano le fasi più mature delle cellule germinali, a partire dagli spermatociti in fase meiotica fino agli spermatozoi (Fig. 10).

Alterazione dell’espressione di markers molecolari essenziali per il mantenimento e il differenziamento di precursori immaturi di cellule germinali (PGC) in topi GILZ KO.

Il mantenimento di una normale fertilità nei mammiferi dipende in primo luogo dai meccanismi che regolano il rinnovo di un pool di cellule indifferenziate e il differenziamento di PGC (Wong et al. 2005).

Queste cellule interagiscono fisicamente con le cellule del Sertoli, cellule somatiche presenti nei tubuli seminiferi, che fungono da supporto per il rinnovo e il differenziamento di PGC. È noto, ad esempio, che le cellule del Sertoli producono GDNF che controlla il mantenimento delle PGC in maniera dose-dipendente (Meng et al. 2000; Wong et al. 2005). In topi adulti GILZ KO, la produzione di GDNF sembra essere normale, comparabile ai livelli di topi WT (Fig. 11A). Anche l’espressione di ERM, una molecola presente solo su cellule del Sertoli importante per il rinnovo di PGC (Chen et al. 2005), à ̈ simile in topi adulti WT e GILZ KO (Fig. 11A).

Il GDNF si lega ad un recettore, presente sulle PGC, composto da due differenti molecole, Ret e GRF-α1 (Meng et al. 2000; Wong et al. 2005). Nei topi adulti GILZ KO, uno di questi trascritti, il GRF-α1, à ̈ pressochà ̈ non rilevabili mediante RT-PCR (Fig. 11B). Inoltre, abbiamo valutato fattori intrinseci, che sono prevalentemente espressi su PGC, come ngn3 e BAZF, importanti per il mantenimento di cellule PGC indifferenziate (Oatley et al. 2006; Yoshida et al.

2006), Hsp70-2, la cui mancanza determina un difetto durante la fase meiotica (Dix et al. 1996).

Questi trascritti scompaiono tutti in topi adulti GILZ KO (Fig. 11B) in confronto alla normale espressione su testicoli di topi WT.

Questi dati supportano l’ipotesi che il difetto nei testicoli di topi GILZ KO riguarda direttamente le cellule germinali e non riguarda la presenza e la funzione di supporto di cellule del Sertoli all’interno dei tubuli seminiferi.

Il difetto di spermatogenesi in topi GILZ KO si determina durante le prime fasi della maturazione di cellule della linea germinativa.

Si à ̈ andato poi ad analizzare le sezioni di testicoli di topi GILZ KO appena nati e nei primi giorni di vita, quando si susseguono le diverse fasi della maturazione delle cellule germinali, fino a 28 giorni, quando la maturazione à ̈ completa ed iniziano ad apparire all’interno dei tubuli seminiferi gli spermatozoi.

Prima di tutto à ̈ stata analizzata l’espressione di GILZ ed L-GILZ su testicoli di topi appena nati, e a diverse età durante le diverse fasi della spermatogenesi murina, evidenziano come la quantità del trascritto di L-GILZ aumenti progressivamente con il passare dei giorni, fino ad arrivare al massimo di livelli di espressione durante l’età adulta, mentre i livelli dell’isoforma GILZ rimangono sempre bassi (Fig 12).

Giunte nelle gonadi le cellule PGC si dividono per formare spermatogoni di tipo A1. Sono cellule staminali che dopo un aserie di divisioni si dividano generando un altro spermatogonio di tipo A1 ed uno spermatogonio di tipo A2, gli spermatogoni di tipo A2 a loro volta si dividono generando spermatogoni di tipo A3 e successivamente spermatogoni di tipo A4. Gli spermatogoni sono cellule staminali che ad un certo punto della maturazione sessuale, circa intorno al 10 giorni nei topi, possono avere diversi destini: 1) autorinnovarsi dando origine ad altri spermatogoni , 2) possono andare incontro a morte cellulare (apoptosi) o 3) possono dare origine agli spermatogoni di tipo B, precursori degli spermatociti primari (de Rooij 2001; Oatley and Brinster 2008).

La prima fase della spermatogenesi, nei topi durante i primi 10 giorni di vita, prevede che alla nascita all’interno dei tubuli seminiferi sono presenti solamente gli spermatogoni, precursori indifferenziati delle cellule della linea germinativa, e cellule del Sertoli.

L’esame delle sezioni di topi WT e KO GILZ a 7 giorni di vita mostrano come in entrambi i gruppi il numero e la morfologia delle cellule del Sertoli e degli spermatogoni siamo normali (Fig. 13, 7gg.). In contrasto, già a 14 giorni si osservano delle differenze, non tanto nel numero, quando nel tipo di cellule presenti nel tubuli di topi GILZ KO. (Fig. 13, 14 gg.). Infatti, nei GILZ KO si osservano cellule del Sertoli e spermatogoni, ma non sembrano essere presenti spermatociti a varie fasi di sviluppo che si osservano nei tubuli di topi WT (Fig 13, 14 gg.). Queste differenze diventano molto più evidenti a 21 giorni, dove alla normale progressione della spematogenesi che si osserva in topi WT, si contrappone lo svuotamento della maggior parte delle cellule della linea germinativa nei tubuli di GILZ KO (Fig. 13, 21 gg.). Questo fenotipo progredisce fino ad arrivare ad una completa assenza di cellule germinali in topi GILZ KO di cinque mesi (Fig. 12, adulto).

Queste analisi morfologiche delle sezioni colorate con ematossilina-eosina mostrano come nel topo GILZ KO ci sia una progressiva degenerazione delle cellule germinali e come non compaiano mai le fasi della spermatogenesi successive agli spermatociti, che poi nei topi normali entrano nella fase meiotica che porta nei giorni successivi alla formazione di gameti maschili aploidi (spermatidi e spermatozoi).

Pertanto, i dati fin qui analizzati suggeriscono che la maturazione delle cellule germinali à ̈ arrestata nei testicoli di topi GILZ KO in una fase precoce durante l’età neonatale.

Analisi di marker della spermatogenesi a differenti fasi della maturazione.

Al fine di caratterizzare ed individuare la fase in cui la spermatogenesi dei topi GILZ KO à ̈ bloccata, siamo andati ad analizzare l’espressione di geni espressi nei testicoli a diversi stadi della spermatogenesi. Come si vede in Fig. 14, l’analisi di RT-PCR condotta per il gene BMP-8, un gene espresso nella fase iniziale della spermatogenesi (Zhao e Hogan, Mech Dev 1996), non ci sono differenze di espressione evidenti tra i genotipi fino a 21 giorni. Invece, per quanto riguarda l’espressione di geni come Ciclina A1, che appare in spermatociti in fase pachitene (Sweeny, Dev 1996), si vede come in topi GILZ KO à ̈ sempre assente, anche in topi di 21 giorni, quando invece inizia a comparire nei topi WT, indicando che nei topi GILZ KO non sono presenti spermatociti in fase pachitene (Fig 14). Come controllo, si vede come negli stessi campioni l’espressione di Ciclina A2, che invece à ̈ espressa in maniera costitutiva in tutte le fasi di maturazione dello sviluppo delle cellule germinali (Sweeney et al. 1996), à ̈ espressa in uguale misura, sia in topi WT che GILZ KO (Fig 14).

Analogamente, anche l’espressione di Oct4, marker di cellule della linea germinativa, à ̈ presente in tutte le fasi della spermatogenesi di topi WT, mentre a partire da 21 giorni à ̈ completamente assente in topi GILZ KO. Questi risultati suggeriscono che le cellule germinali di topi GILZ KO terminano il loro programma di processo differenziativo sicuramente prima che arrivano alla fase di spermatociti durante il pachitene della meiosi.

Aumento dell’apoptosi all’interno dei tubuli seminiferi nei testicoli di topi GILZ KO.

Successivamente, abbiamo condotto esperimenti di TUNEL per valutare i livelli di cellule morte per apoptosi, al fine di capire se la continua degenerazione di cellule germinali nella fase precoce dello sviluppo potesse dipendere da un alterato controllo sui processi che regolano la morte cellulare. Come mostra la figura 15, in topi appena nati, il numero di cellule colorate con la metodica TUNEL, quindi in apoptosi, à ̈ molto limitato, sia su sezioni di testicoli di topi WT che GILZ KO di 7 giorni, anche se gli eventi apoptotici all’interno dei tubuli di topi GILZ KO sembrano essere più frequenti.

Queste differenze diventano molto più evidenti a 14 giorni, dove si osserva una massiva apoptosi in alcuni tubuli di topi GILZ KO. In seguito, a 21 giorni, in topi WT si osservano una normale frequenza di cellule in apoptosi, dovuto ad un normale turn-over di cellule che maturano e si differenziano, mentre i tubuli di topi GILZ KO, come già evidenziato con colorazione ematossilina-eosina, sono già quasi vuoti e quindi non si osservano più eventi apoptotici (Fig. 15).

Questi risultati indicano che le cellule germinali di topi GILZ KO vanno in apoptosi durante una fase precoce di sviluppo, intorno all’inizio della prima fase di divisione meiotica e che questo aumento di morte cellulare porta ad una progressiva eliminazione di cellule della linea germinativa all’interno dei tubuli seminiferi.

La velocità di proliferazione delle cellule della linea germinativa, tra le più alte nell’organismo, à ̈ molto ben regolata; per questo non à ̈ affatto sorprendente che geni coinvolti nella crescita (come Kit, Cfs e Bmp8a) e nell’apoptosi (come Apaf-1, Bax, BclX), sono coinvolti per un normale mantenimento e sviluppo dei spermatogoni. Durante il processo di maturazione di queste cellule, circa il 75% muore prima di diventare spermatozoi maturi. Un bilanciamento tra i livelli di espressione di geni anti-apoptotici come Bcl-2, Bcl-6, BclX, e di geni pro-apoptotici come la proteina Bax, sono di estrema importanza per regolare la sopravvivenza delle cellule germinali (de Rooij 2001; Sofikitis et al. 2008). È possibile che difetti che riguardano questo delicato bilancio tra proliferazione e morte contribuisca alla formazione di infertilità maschile. Nel topo, per esempio, l’assenza di BclX risulta in una completa perdita di cellule germinali prima della nascita (Kasai et al. 2003).

Abbiamo valutato alcuni dei più importanti fattori che riguardano il controllo dell’apoptosi in topi WT e GILZ KO durante i primi sette giorni di vita. Come si osserva dall’analisi di RT-PCR in Fig. 16, i livelli dei trascritti di Bcl2, Bax, BclXL, p53, sono comparabili tra topi normali e GILZ KO, suggerendo che questi geni non sono coinvolti nell’aumento dell’apoptosi che si verifica nei topi GILZ KO come precedentemente illustrato.

I tubuli seminiferi dei testicoli di topi GILZ KO contengono solamente cellule del Sertoli

I risultati fin qui analizzati mostrano chiaramente come ci sia una progressiva deplezione di cellule germinali all’interno dei tubuli in testicoli GILZ KO. Vari lavori indicano che GATA-1 può essere considerato un buon marker che definisce le cellule del Sertoli all’interno del tubulo seminifero (Meng et al.

2000; Chen et al. 2005). Abbiamo sfruttato questa peculiarità per stabilire se nei tubuli seminiferi dei testicoli atrofici dei topi GILZ KO adulti rimangono effettivamente solo cellule del Sertoli. Per fare questa valutazione abbiamo condotto esperimenti di immunofluorescenza su sezioni di testicoli WT e GILZ KO di topi adulti di 5 mesi. I risultati in Fig. 17 indicano che alla base di tubuli seminiferi svuotati di topi GILZ KO adulti rimangono solamente cellule del Sertoli, come evidenziato dalla colorazione per GATA-1 che colora tutte le cellule che rimangono all’interno del tubulo. Al contrario, nei tubuli di topi WT sono un 10-15% di cellule sono positive per GATA-1, come atteso per una distribuzione di cellule all’interno del tubulo (Fig 17).

Questa analisi conferma che le cellule che rimangono vitali all’interno dei tubuli seminiferi di testicoli GILZ KO, sono cellule del Sertoli.

I livelli ormonali di recettori di ormoni coinvolti nel mantenimento e nella funzione dei testicoli non variano tra topi WT e GILZ KO.

Le normali funzioni dei testicoli sono influenzati sia da fattori del sistema endocrino (extratesticolare) che paracrino (intra-testicolare). Le gonadotropine LH ed FSH, che sono i principali ormoni endocrini coinvolti, sono secreti a livello dell’ipofisi. Questi regolano funzioni di cellule specifiche all’interno del testicolo attraverso recettori specifici (recettore dell’ormone luteinizzante LHGCR e recettore dell’ormone follicolostimolante FSHR), che sono espressi rispettivamente dalle cellule Leydig e del Sertoli. La regolazione paracrina della spermatogenesi dipende dalla produzione di ormoni steroidei, come il testosterone e l’estradiolo, che sono sintetizzati dalle cellule Leydig nell’interstizio tubulare dei testicoli (Sharpe et al. 2003; Sofikitis et al. 2008). Il topo KO per il recettore degli androgeni (AR) non riescono a maturare normali gonadi maschili (Yeh et al. 2002). Inoltre sembra che anche il recettore per i glucocoticoidi (GR) sia importante per la normale funzione delle cellule di supporto alla maturazione delle cellule germinali (Weber et al. 2000).

L’analisi condotta mediante reazione di RT-PCR mostra che i livelli del messaggio del recettore degli estrogeni (ERα), AR, FSHR, LHGCR, GR, sono comparabili tra topi WT e GILZ KO (Fig. 18A).

Anche i livelli ormonali di Testosterone (Fig. 18B), FSH e LH (Fig. 18C) sono simili in topi WT e GILZ KO. Nel loro insieme questi risultati suggeriscono che le funzioni endrochine del topo GILZ KO non sembrano perturbate dall’assenza del gene GILZ e che quindi il difetto nella maturazione di cellule della linea germinativa non dipendono da alterazione dei segnali che vengono dall’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi che sembrano nel loro insieme normali.

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Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1) Animale transgenico murino ottenuto mediante delezione condizionale tessuto-specifico mediante ricombinasi CRE del gene GILZ .
2. 2) Animale transgenico murino secondo la rivendicazione 1 ottenuto per delezione dell’esone 6 del gene GILZ.
3. 3) Animale transgenico secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, in cui detto animale à ̈ un topo.
4. 4) Uso dell’animale transgenico murino secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3 come modello sperimentale per lo studio e per la ricerca di cure della infertilità maschile.
5. 5) Metodo di preparazione di un animale transgenico murino come definito in ognuna delle rivendicazioni 1-3 comprendente o consistente nelle seguenti fasi: a) isolamento da BAC della sequenza nucleotidica del gene GILZ codificante per le proteine aventi numero di accesso in GenBank AAD01789.1, ACJ09091, AAG41220.1; b) preparazione di un vettore targeting mediante clonazione della sequenza nucleotidica della fase a) in un vettore contenente siti LoxP ai lati dell’esone 6 di GILZ; c) introduzione del vettore targeting e conseguente manipolazione genetica del locus genico di GILZ in cellule staminali embrionali murine Bruce4 ceppo C57BL/6 mediante ricombinazione omologa con il vettore targeting finale; d) iniezione dei cloni in cui à ̈ avvenuta la modifica del locus genico di GILZ in blastocisti di origine C57BL/6 impiantate nell’utero di topi recipienti pseudo-gravide; e) generazione di chimere e screening di animali che consentono la trasmissione genetica del locus di GILZ modificato per ottenere l’animale trasgenico; e f) incrocio di chimere maschi ottenuti nella fase e) con topi femmina CMV-CRE in modo da ottenere topi Knockout per GILZ per tutti gli organi e tessuti.
6. 6) Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui l’isolamento della sequenza nucleotidica del gene GILZ della fase a) à ̈ condotto mediante l’impiego dei seguenti primer: 5'-CACTCCCCTTCTCACTCTGC-3' (senso) (SEQ ID NO: 1) e 5'- GAACTTTATAAGCAGTCATCCC -3' (antisenso) (SEQ ID NO:2).
7. 7) Cellule staminali embrionali murine Bruce4 ceppo C57BL/6 ottenibili mediante le fasi da a) a c) del metodo definito in ognuna delle rivendicazioni 5-6.
8. 8) Animale transgenico ottenibile mediante il metodo definito in ognuna delle rivendicazioni 5-6.