ITRM20090195A1 - Complessi fra fosfolipidi e la proteina vimentina e metodo in vitro per la rilevazione di anticorpi contro detti complessi - Google Patents
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Description
Descrizione dell'Invenzione Industriale avente per titolo:
"Complessi fra fosfolipidi e la proteina vimentina e metodo in vitro per la rilevazione di anticorpi contro detti complessi"
Campo dell’invenzione
La presente invenzione riguarda il complesso che nasce dall’interazione di tipo elettrostatico fra fosfolipidi, in particolare la cardiolipina, e la proteina vimentina e un metodo analitico in vitro per la rilevazione nel siero o in altri campioni biologici di anticorpi contro tale complesso.
Arte nota
La sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi (Antiphospholipid Sindrome, APS), anche nota come sindrome di Hughes, Ã ̈ un disordine su base autoimmune caratterizzato da trombosi arteriose e venose e aborti ricorrenti (Bertolaccini M.L. et al., Nature Clin Practice (2005) 1:40-46; Atanassova P.A., Yonsei Med. J. (2007) 48: 901-926).
L'interpretazione delle manifestazioni cliniche e delle analisi di laboratorio su cui si basa la diagnosi di questa sindrome à ̈ resa complicata in primo luogo dalla loro sovrapposizione a quelle di altre malattie autoimmuni, in particolare il lupus eritematoso sistemico (Systemic Lupus Erithematosus, SLE).
L'attuale consenso richiede che almeno uno dei criteri clinici e uno dei criteri di laboratorio illustrati in Tabella 1, siano soddisfatti perché si possa formulare una diagnosi certa di APS.
Tabella 1: Criteri consenso per la diagnosi dell'APS (da Miyakis S. et al., J. Tromb. Haemost. (2006) 4:295-306).
Criteri clinici
Trombosi vascolare
1 eventi di trombosi venosa o in piccole arterie in qualsiasi tessuto o organo, confermato tramite analisi strumentale o istopatologica in assenza di prove significative di infiammazione della parete vascolare
Gravidanza
1 morti inspiegate di feti morfologicamente sani a partire dalla 10° settimana di gravidanza in poi
1 nascite premature di un neonato morfologicamente normale a partire dalla 34° settimana di gestazione, a causa di una grave pre-eclampsia, eclampsia o insufficienza placentale
3 aborti spontanei consecutivi inspiegati prima della 10° settimana di gestazione (escluse anormalità anatomiche o ormonali materne e cause di tipo genetico)
Criteri di laboratorio
1. Anticoagulante del lupus presente nel plasma in due o più occasioni distanti fra loro almeno 12 settimane, analizzato secondo le linee guida della International Society on Thrombosis and Heaemostasis; oppure
2. Anticorpi anticardiolipina, isotipo IgG o IgM, presenti in titolo medio o alto nel siero o plasma (vale a dire, > 40 GPL o MPL o superiori al 99° percentile) in due o più occasioni separate distanti almeno 12 settimane misurati tramite un saggio ELISA standardizzato; oppure
3. Anticorpi contro la b2 glicoproteina nel siero o plasma (titolo superiore al 99° percentile) determinati in due o più occasioni separate distanti almeno 12 settimane, misurati tramite un saggio ELISA standardizzato, secondo le procedure raccomandate. Titoli medi o alti di anticorpi anticardiolipina (aCL) di tipo IgG e/o IgM presenza del cofattore b2 glicoproteina I misurati tramite un saggio standardizzato di immunoassorbimento legato ad enzimi (ELISA) o un saggio positivo dell'anticoagulante del lupus (Lupus Anticoagulant, LA) in due o più occasioni che siano separate fra loro da almeno 6 settimane, saggiati secondo le linee guida della International Society on Thrombosis and Haemostasis.
I criteri di base illustrati in Tabella 1 includono le conoscenze derivanti dalle osservazioni che si sono accumulate negli ultimi anni (Miyakis S. et al., J. Thromb. Haemost. (2006) 4:295-306). In particolare, per quanto riguarda i criteri di laboratorio, per la diagnosi di APS Ã ̈ necessario:
- avere positività di almeno un test LA (anticoagulante del lupus; Lupus Anticoagulant, LA) in due o più occasioni che siano distanti fra di loro almeno 12 settimane, oppure
- presentare titoli medi o alti degli anticorpi aCL in presenza del cofattore b2 glicoproteina I (>40 GPL o MPL, o superiori al 99° percentile) IgG o IgM nel siero o plasma in due o più occasioni distanziate fra loro da almeno 12 settimane, misurati attraverso un metodo ELISA standardizzato, oppure
- presentare titoli di anticorpi anti-b2 glicoproteina I > al 99° percentile, in due o più occasioni distanziate da almeno 12 settimane, misurati secondo le procedure raccomandate tramite un metodo ELISA standardizzato.
Le unità MPL e GPL sono unità internazionali utilizzate per quantificare la positività agli anticorpi aCL di classe IgM e IgG. In particolare un'unità MPL o GPL equivale rispettivamente ad 1mg/ml di IgM o IgG nel campione in esame.
Il saggio del LA consiste in una combinazione di saggi di coagulazione, nel corso dei quali l'eventuale ritardo della coagulazione mostrato da un campione può venire corretto dall'aggiunta di reagenti contenenti una alta concentrazione di fosfolipidi ma non di plasma normale. I saggi più utilizzati dagli esperti nel ramo sono il tempo parziale di tromboplastina attivata (APTT), il saggio del tempo di veleno di vipera di Russell diluito (dRVVT) e il tempo di coagulazione al caolino (KCT).
Nonostante questo adeguamento dei criteri alle evidenze più recenti, la diagnosi della presenza di APS in un paziente rimane piuttosto complessa. Questa complessità non à ̈ solo dovuta alla similitudine clinica e diagnostica fra APS e altre malattie autoimmuni, ma à ̈ anche legata al carattere stesso della malattia.
Gli anticorpi anti-fosfolipidi presenti nelle pazienti con APS costituiscono una famiglia che comprende non solo anticorpi specifici per la cardiolipina, ma anche anticorpi che riconoscono altri fosfolipidi anionici e i loro complessi con proteine plasmatiche, quali la protrombina, la b2 glicoproteina I, la proteina S e la proteina C, e gli anticorpi che vanno sotto il nome di lupus anticoagulant, influenzando in vario modo la cascata della coagulazione in corso di APS (Oosting J.D. et al., Blood (1993) 81:2618-2625; Matsuura E. et al., J. Exp. Med. (1994) 179:457-462; Galli M. et al., Blood (1995) 86:617-623; Nojima et al., Clin. Chem. (2005) 51:545-552).
I criteri di laboratorio su cui si basa attualmente la diagnosi di APS sono: a) la presenza di livelli medi o alti di anticorpi contro la cardiolipina complessata al cofattore b2 glicoproteina I o b) la presenza di anticorpi contro la sola b2 glicoproteina I; o c) la positività per il fattore anticoagulante del lupus (LA). In realtà , però, non à ̈ ancora chiaro quale sia il peso relativo, anche in campo diagnostico, degli altri anticorpi che molto probabilmente partecipano alle manifestazioni cliniche della malattia (Balasch J.
et al., Hum. Reprod. (1999) 14:1956-1959; Bertolaccini M.L. et al., Br. J. Rheumatol. (1998) 37:1229-1232).
Inoltre esistono casi in cui i pazienti vengono definiti come falsi negativi o "sieronegativi" in quanto presentano sintomi clinici secondari della APS (cioà ̈ emicrania, spiccata livedo reticularis, trombocitopenia, ripetuti aborti e problemi valvolari cardiaci) e risultano consistentemente negativi per la presenza di anticorpi contro la cardiolipina complessata alla b2 glicoproteina I e per i saggi di coagulazione LA. Pertanto, in tali pazienti non può essere posta la diagnosi di APS, secondo i criteri consenso sopra illustrati (Hughes G.R.V. e Khamashta M.A., Ann. Rheum. Dis. (2003) 62:1127; McCarty G.A., APS Foundation of America Newsletter, Vol. 2, Summer 2006; Lockshin M.D. et al., Arthritis Rheum. (2000) 43:440-443). Per questi pazienti la diagnosi rimane quindi sospesa ed esiste un serio pericolo di subire dei fenomeni trombotici anche gravi in assenza di un trattamento anticoagulante preventivo.
A questi pazienti vanno anche aggiunti tutti quei casi in cui i livelli di anticorpi aCL sono bassi e quindi non rientrano nei criteri consenso per la diagnosi di APS. A questo proposito à ̈ opportuno evidenziare il fatto che non à ̈ stata ancora raggiunta una vera standardizzazione dei risultati che si ottengono utilizzando kit diagnostici per la rilevazione degli anticorpi contro la cardiolipina complessata al cofattore b2 glicoproteina I di produttori diversi (Audrain M.A.P. et al., Rheumatology (2004) 43:181-185). Di conseguenza, la rilevazione della presenza o meno di bassi livelli di anticorpi aCL può divenire dipendente dal produttore del kit, o addirittura dal lotto di produzione (Audrain M.A.P. et al., supra) per uno stesso produttore.
Una problematica, quindi, per quanto concerne la diagnosi di APS consiste nel miglioramento delle performance dei kit utilizzati per il riconoscimento degli anticorpi contro la cardiolipina e la b2 glicoproteina I. E’ stata ora identificata la presenza nel siero di anticorpi rivolti verso un nuovo complesso fra la cardiolipina e una proteina (diversa dalla b2 glicoproteina I), che possono contribuire alla diagnosi nei pazienti “sieronegativi†, non identificabili con gli attuali strumenti diagnostici e, per i quali oggi non esiste una chiara indicazione ad effettuare una terapia anticoagulante preventiva.
La vimentina à ̈ una proteina il cui peso molecolare à ̈ 56 kDa ed à ̈ un membro della famiglia delle proteine dei filamenti intermedi che sono tipici delle cellule eucariotiche e contribuiscono alla formazione del citoscheletro insieme ai microtubuli e ai microfilamenti di actina. La vimentina si presenta come un monomero, come altre proteine dei filamenti intermedi del citoscheletro, ha un dominio alfa elica centrale, una testa aminoterminale ed una coda carbossi-terminale con struttura non ad alfa elica (Fuchs E. and Weber K., Annu. Rev Biochem (1994) 63: 345– 82.)
Due monomeri possono avvolgersi tra di loro per formare un dimero “coiled-coil†come conseguenza delle interazioni idrofobiche tra le alfa eliche.
I filamenti di vimentina interagiscono con elementi del nucleo, del reticolo endoplasmatico e dei mitocondri, svolgendo un ruolo molto importante nei processi di sostegno e di ancoraggio di vari organelli nel citoplasma. In generale, la vimentina à ̈ considerata come un componente del citoscheletro responsabile del mantenimento dell'integrità cellulare (Katsumoto T., Mitsushima A., Kurimura T., Biol Cell (1990) 68:139–46; Goldman R. D., Khuon S., Chou Y., Opal P., Steinert P. J Cell Biol (1996) 134:971– 83).
La presenza di anticorpi contro la vimentina in pazienti affetti da SLE à ̈ stata verificata da alcuni ricercatori (Alcover A. et al., Arthritis Rheum. (1984) 27:922-928; Alcover A. et al., Clin. Exp. Immunol. (1985) 61:24-30; Sanchez A. et al., J. Rheumatol. (1990) 17:205-209). Tuttavia, nell'ambito della complessa diagnosi di questa malattia, l'importanza della presenza di questi anticorpi non à ̈ mai stata confermata e tutt'ora non rientra nei criteri consenso per la diagnosi di questa malattia (Bertsias G. et al., Ann. Rheum. Dis. (2008) 67:195-205).
Blaschek et al. (Ann. Rheum. Dis. (1988) 47:708-716) hanno studiato la presenza di anticorpi contro la vimentina in pazienti affetti da SLE e il rapporto fra il loro livello e quello degli anticorpi contro la cardiolipina e l'ssDNA, formulando l'ipotesi che esista una reattività crociata fra epitopi presenti sulle molecole di questi antigeni nei malati di SLE.
È stato ora trovato che nel sangue di pazienti che si presentano con una probabile diagnosi di APS "sieronegativa" à ̈ presente un complesso fra fosfolipidi carichi negativamente e la proteina vimentina.
Sommario dell’invenzione Costituiscono pertanto oggetto della presente invenzione il complesso fra fosfolipidi, in particolare la cardiolipina, e la proteina vimentina e il saggio analitico per la rilevazione nel siero o in altri campioni biologici di anticorpi contro tale complesso.
È altresì oggetto dell'invenzione un metodo analitico che permette di rilevare la presenza di anticorpi contro il complesso fra un fosfolipide carico negativamente, in particolare il fosfolipide cardiolipina e la proteina vimentina in una porzione più ampia di pazienti rispetto ai correnti saggi che rilevano la presenza di anticorpi verso il complesso cardiolipina/b2 glicoproteina I.
La struttura tridimensionale della vimentina à ̈ caratterizzata dalla presenza di interazioni ioniche tra cariche positive e negative degli aminoacidi con conseguente formazione di ponti intercatena e intracatena. (Fuchs E. and Weber K., Annu. Rev Biochem (1994) 63: pp. 345–82.) Si pensa che la formazione del complesso cardiolipina-vimentina possa essere attribuita alle interazioni elettrostatiche tra aminoacidi carichi positivamente della vimentina e le cariche negative del fosfolipide anionico cardiolipina.
È ancora oggetto dell'invenzione un kit per la rilevazione degli anticorpi contro un fosfolipide carico negativamente, in particolare la cardiolipina, complessato alla proteina vimentina come cofattore nei pazienti che presentano patologie della coagulazione. Il kit dell'invenzione trova particolare utilità nel quadro della diagnosi nei pazienti che presentano i sintomi clinici dell'APS ma non presentano positività per l'anticoagulante del lupus e per gli anticorpi contro la cardiolipina e la b2 glicoproteina I.
È oggetto della presente invenzione anche l'uso del complesso fra un fosfolipide carico negativamente, in particolare cardiolipina, e la proteina vimentina per la produzione di composizioni in campo farmaceutico, in particolare ad uso diagnostico.
Altri oggetti risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata e dalle rivendicazioni allegate.
Breve descrizione delle figure
Figura 1: Identificazione della vimentina come cofattore proteico endoteliale in pazienti falsi negativi ("sieronegativi") per l'APS. (A) un estratto di proteine di membrana di cellule endoteliali della linea cellulare endoteliale immortalizzata EAhy926 (Edgell CJS et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA. 80: 3734-3737) fu separato per elettroforesi bidimensionale su gel e trasferito su una membrana di nitrocellulosa. Il filtro fu incubato con i sieri di 2 pazienti "sieronegativi" rivelando due "spot" di peso molecolare di circa 54 e 57 kDa. L'analisi MALDI-TOF MS dei due "spot" ha fornito degli spettri corrispondenti a due isoforme della vimentina (B) e (C) (SEQ ID NO 1).
Figura 2: Curva di legame dose-dipendente della vimentina alla cardiolipina. Dosi scalari, da 10 mg/ml a 1,25 mg/ml, di vimentina (R&D Systems) in soluzione salina tamponata (PBS) a pH 7.4 sono state incubate con cardiolipina, alla concentrazione di 50 mg/ml in metanolo, (Sigma Chem. Co.) per tutta la notte a 4°C in piastre di polistirene. Dopo 3 lavaggi con PBS, contenente 0.1% Tween 20, i pozzetti sono stati bloccati per 2 ore a temperatura ambiente con 100 ml/pozzetto di tampone bloccante,PBS contenente 3% di albumina sierica bovina (Sigma Chem. Co.). Dopo 3 lavaggi con PBS contenente 0.1% Tween 20 (PBS/Tween), i pozzetti sono stati incubati con anticorpi policlonali di capra contro la vimentina umana (R&D Systems), diluiti 1:200 nel tampone bloccante. Dopo 3 ulteriori lavaggi con PBS/Tween, le piastre sono state incubate per un’ora a temperatura ambiente con anticorpi secondari IgG coniugati all’enzima perossidasi diluiti 1:1000 nel tampone bloccante (Sigma Chem. Co.). Le piastre sono state lavate per 3 volte come sopra. Il legame della perossidasi à ̈ stato rivelato con l’aggiunta di 100 ml/pozzetto di una soluzione di cloruro di O-fenilendiammina incubando per 10 minuti a temperatura ambiente. La reazione à ̈ stata bloccata con H2SO41N, 50 ml/pozzetto per 5 minuti. L'assorbanza à ̈ stata letta a 492 nm in un lettore per piastre ELISA (BioRad).
Figura 3: Rilevazione mediante ELISA degli anticorpi verso il complesso cardiolipina/vimentina secondo il metodo dell'invenzione. Gli anticorpi, sia di classe IgG (Fig. 3A) sia IgM (Fig. 3B), erano presenti nei pazienti affetti da APS, da APS “sieronegativa†e da SLE con una frequenza significativamente superiore rispetto ai soggetti sani di controllo (p<0.0001). In particolare, la frequenza degli anticorpi di classe IgG nei pazienti con APS era significativamente più elevata rispetto ai pazienti con SLE e a quelli con artrite reumatoide (p<0.0001).
Figura 4: Effetto sulle cellule endoteliali degli anticorpi contro il complesso cardiolipina/vimentina.
La linea cellulare endoteliale immortalizzata EAhy926 à ̈ stata incubata con frazioni di IgG purificate da sieri di pazienti "sieronegativi", al fine di verificare l’effetto funzionale degli anticorpi. In (A) si osserva la fosforilazione della proteina cellulare IRAK-1 (Interleukin-1 Receptor-associated Kinase 1); in (B) si osserva la fosforilazione e la traslocazione al nucleo del fattore di trascrizione NF-kB; in (C) à ̈ mostrata l'espressione di VCAM sulla membrana cellulare; in (D) un aumentato rilascio del fattore procoagulante denominato Tissue Factor (TF).
Figura 5: Curva standard di legame degli anticorpi al complesso cardiolipina/vimentina eseguita secondo il metodo dell'invenzione.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
La presente invenzione à ̈ basata sulla scoperta che la proteina vimentina si può complessare con un fosfolipide carico negativamente e in tal modo può fungere da cofattore per il suo legame agli anticorpi eventualmente presenti in campioni biologici, tipicamente derivati del sangue, quali plasma e siero.
L'identificazione della vimentina come costituente di complessi con un fosfolipide carico negativamente, in particolare la cardiolipina, e come cofattore nella determinazione della presenza di anticorpi contro detto fosfolipide à ̈ stata effettuata come descritto più avanti nell'Esempio 1. Fosfolipidi preferiti sono fra gli altri la cardiolipina, la fosfatidilserina, il fosfatidilinositolo e l'acido fosfatidico. Particolarmente preferita à ̈ la cardiolipina.
Nell'ambito della presente invenzione con il termine "complesso/i" si intende l’associazione fra due macromolecole, conseguente, nel caso specifico ad una interazione di tipo elettrostatico fra un fosfolipide carico negativamente e una proteina che nella sua sequenza primaria presenta aminoacidi con una carica positiva
Con il termine “fosfolipide carico negativamente†si intende un fosfolipide anionico che presenta una carica elettrica negativa. In particolare, la cardiolipina à ̈ un difosfatidil-glicerolo che presenta nella sua formula di struttura due gruppi fosfatidici con una conseguente doppia carica negativa.
Sempre nell'ambito della presente invenzione, con il termine "cofattore" si intende una molecola (nel caso specifico di natura proteica), che, legata a un fosfolipide (nel caso specifico la cardiolipina), ne aumenta la antigenicità , cioà ̈ la capacità di essere riconosciuta dalle cellule del sistema immunitario.
Nell'Esempio 6 e in Figura 4 sono illustrati alcuni degli effetti esercitati in vitro sulle cellule endoteliali dagli anticorpi che riconoscono il complesso cardiolipina/vimentina .
È stato anche scoperto dagli inventori che il complesso cardiolipina/ vimentina viene riconosciuto da anticorpi presenti nel siero di pazienti affetti da APS in una popolazione più ampia rispetto a quanto permettano i correnti saggi per la determinazione di anticorpi che riconoscono il complesso cardiolipina/b2 glicoproteina I. In questo modo à ̈ possibile contribuire alla diagnosi di APS anche in una porzione sostanziale di pazienti che risultano "sieronegativi" per gli anticorpi contro i fosfolipidi e contro la b2 glicoproteina I.
Come precedentemente già osservato da altri nel caso del complesso fra b2 glicoproteina I e cardiolipina, anche nel presente caso solo il 26% dei pazienti APS aveva nel siero IgG specifiche per la vimentina non complessata al fosfolipide, mentre il 23% aveva IgM specifiche, con valori di assorbanza ottica significativamente più bassi rispetto a quelli rilevati con il complesso cardiolipina/vimentina (p<0,001). Ciò indica una stretta correlazione fra la formazione del complesso fosfolipide/vimentina e il riconoscimento anticorpale in vitro.
Il metodo dell'invenzione si riferisce al dosaggio degli anticorpi contro il complesso fosfolipide/vimentina tramite uno dei metodi comunemente in uso, quali per esempio metodi immunoenzimatici (per esempio, la tecnica ELISA), metodi radioimmunologici (RIA), metodi di immunofluorescenza, come anche metodiche che sfruttano substrati chemiluminescenti (Rosner M.H. et al. Environ Health Perspect, 1991, 94:131-134) In particolare, il metodo dell'invenzione permette di determinare la presenza e il titolo degli anticorpi contro il complesso cardiolipina/vimentina.
Più in particolare, il metodo dell'invenzione permette di supportare la diagnosi di APS in pazienti che presentano le manifestazioni cliniche della malattia, ma che risultano negativi ai test di laboratorio necessari per la conferma della diagnosi, (pazienti "sieronegativi"), come precedentemente discusso.
Il metodo fornito dalla presente invenzione comprende i seguenti stadi:
a) preparazione del complesso fosfolipide/vimentina;
b) incubazione dei campioni biologici con detto complesso; c) determinazione del titolo degli anticorpi eventualmente presenti nel campione e che si sono legati al complesso fosfolipide/vimentina. Preferibilmente il campione viene saggiato in triplicato.
Il complesso dello stadio a) viene preparato su un substrato solido (preferibilmente una piastra da ELISA a 96 pozzetti) incubando 50-150 ml di una soluzione contenente 40-60 mg/ml di fosfolipide in solvente organico, preferibilmente metanolo, con 50-150 ml di una soluzione 3-6 mg/ml di vimentina in PBS, per 8-12 ore a una temperatura compresa fra 3°C e 8°C. Preferibilmente, per l'esecuzione dello stadio a) vengono utilizzati 100 ml di una soluzione di fosfolipide (tipicamente cardiolipina) 50 mg/ml in metanolo a cui vengono aggiunti 100 ml di una soluzione di 5 mg/ml di vimentina in PBS, per 12 ore a 4°C.
L'incubazione dello stadio b) viene eseguita con 50-150 ml di campione a temperatura ambiente per 60-120 minuti. Tipicamente, 100 ml di campione (siero o plasma) diluiti 1:100 vengono incubati a temperatura ambiente per 1 ora.
La determinazione del titolo degli anticorpi presenti nel campione saggiato viene eseguita incubando nei pozzetti 50-150 ml di anticorpi policlonali secondari contro gli anticorpi umani di classe IgG o IgM per 60-120 minuti a temperatura ambiente. Gli anticorpi secondari possono essere coniugati con una sostanza radioattiva o con un enzima, al fine di potere essere rivelati e permettere una lettura del risultato finale. La determinazione della quantità di anticorpi presente nei campioni saggiati avviene con l'ausilio di una curva standard costruita con quantità scalari di complesso fosfolipide/vimentina (Figura 5).
Il campione derivato dal sangue può consistere in siero o plasma indifferentemente. Possono anche essere analizzati altri liquidi biologici (urine, liquido sinoviale, liquor e saliva).
Qualsiasi fosfolipide carico negativamente può essere utilizzato nel metodo dell'invenzione (per esempio, cardiolipina, fosfatidilserina, fosfatidilinositolo o acido fosfatidico fra gli altri). In particolare, i risultati ottenuti hanno evidenziato una reattività dei sieri di pazienti con APS anche nei confronti del complesso fosfatidilserina/vimentina (Esempio 5).
In particolare, il metodo permette la determinazione di anticorpi contro il complesso del fosfolipide cardiolipina legato alla vimentina come cofattore.
Tipicamente, nel metodo dell'invenzione il complesso fosfolipide/vimentina o gli anticorpi contro detto complesso sono immobilizzati su un supporto solido adeguato, quale una colonna per cromatografia o una superficie di plastica, quale quella di una piastra da saggio o uno stick ad immersione, o altri supporti solidi, quale la nitrocellulosa, secondo i metodi noti agli esperti nel ramo (Rosner M.H. et al. Environ Health Perspect, 1991, 94:131-134) Il materiale per la colonna cromatografica può consistere fra gli altri, per esempio, in una matrice di granuli di agarosio, poliacrilammide, o destrano.
Fra i materiali plastici che possono essere utilizzati nell'ambito del metodo dell'invenzione ricordiamo fra gli altri il polimetacrilato di metile, il polistirene, il polietilene, il polietilentereftalato e il polipropilene. Tipicamente, Ã ̈ possibile utilizzare una qualsiasi piastra da saggio.
La superficie solida può anche essere costituita da una matrice o gel (esempio gel di silice) in cui il fosfolipide e/o il cofattore, il complesso o l'anticorpo possono essere incorporati.
La vimentina utilizzata nel metodo della presente invenzione può essere di origine umana o eventualmente murina data l’elevata omologia di sequenza tra le sequenze amminoacidiche della vimentina tra le due specie (92%). Preferibilmente à ̈ in forma pura. Più preferibilmente la vimentina utilizzata nel metodo dell'invenzione à ̈ di origine ricombinante.
Tipicamente si può utilizzare una tecnica ELISA standard in cui l'antigene o l'anticorpo sono marcati. La marcatura può avvenire per esempio con un enzima o un radioisotopo. In genere il marcatore à ̈ un enzima.
Un’ulteriore forma preferita della presente invenzione riguarda un kit per il saggio della presenza di anticorpi contro il complesso fosfolipide/vimentina nell'ambito della diagnosi di malattie autoimmuni, comprendente:
a) la proteina vimentina;
b) un fosfolipide carico negativamente, scelto preferibilmente fra cardiolipina, fosfatidilserina, fosfatidilinositolo o acido fosfatidico fra gli altri. Particolarmente preferita à ̈ la cardiolipina.
In una forma particolarmente preferita dell'invenzione il kit per il saggio della presenza di anticorpi contro la cardiolipina nell'ambito della diagnosi di malattie autoimmuni, comprende il complesso fosfolipide/vimentina immobilizzato su un supporto solido per ottenere un kit di rapido e facile utilizzo ("rapid kit).
I kit secondo l'invenzione sono tipicamente confezionati in modo da contenere anche eventuali componenti aggiuntivi che permettono la realizzazione dell'analisi, quali, per esempio, tamponi, reagenti di cattura, reagenti di sviluppo, marcatori, superfici di reazione, campioni di controllo e istruzioni per l'uso.
Nei kit dell'invenzione, il legame degli anticorpi contro i complessi fra fosfolipide (tipicamente cardiolipina) e vimentina può essere determinato utilizzando uno qualsiasi dei mezzi a disposizione nel ramo (e fornito insieme ai kit), quale, per esempio, un anticorpo secondario contro immunoglobuline umane nel caso che l'analisi venga eseguita su campioni umani. Il marcatore può essere uno qualsiasi fra quelli utilizzati nel ramo, per esempio un enzima o un radioisotopo. Tipicamente, il marcatore à ̈ un enzima.
Il metodo dell'invenzione permette di diagnosticare, con un unico saggio, pratico e di facile esecuzione, la presenza di APS in una fascia più ampia di pazienti rispetto ai metodi diagnostici attualmente in uso. Infatti, il responso proveniente da detto metodo, in unione ai dati clinici, non solo à ̈ utile per il riconoscimento dei pazienti che risulterebbero positivi per la diagnosi di APS anche se sottoposti ai tradizionali saggi per la determinazione della presenza di tale malattia autoimmune (in particolare i saggi per la presenza di anticorpi contro la cardiolipina complessata alla b2 glicoproteina I e anche contro la b2 glicoproteina I da sola), ma fornisce anche un utile dato di laboratorio, in una sostanziale percentuale di pazienti che, pur presentandone i sintomi clinici, non possono ricevere la diagnosi di APS a causa della negatività dei propri test di laboratorio secondo il corrente consenso clinico.
Gli esempi seguenti sono illustrativi della portata dell'invenzione e non sono limitativi della medesima.
Esempi
Esempio 1
Identificazione della vimentina come cofattore proteico endoteliale in pazienti falsi negativi ("sieronegativi") per l'APS.
Le proteine della membrana plasmatica delle cellule endoteliali EAHY926, una linea cellulare immortalizzata (Edgell C.J.S et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA. 80: 3734-3737) sono state purificate utilizzando il kit commerciale “Pierce Cell Surface Protein Isolation Kit†(Pierce, Rockford, IL). Successivamente sono state separate mediante elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilammide e poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa (Schleicher & Schuell). La membrana à ̈ stata poi analizzata in presenza di sieri provenienti da pazienti "sieronegativi" per l'APS diluiti 1:100 in PBS. Per la rivelazione sono stati utilizzati anticorpi secondari di capra contro le IgG umane (BioRad), coniugati con perossidasi diluiti 1:1000 in PBS e la colorazione à ̈ stata sviluppata con il substrato 3'-3' diamminobenzidina (Sigma Chem. Co.) rivelando la presenza di due "spot" positivi (Figura 1A).
Il gel colorato con Coomassie blue corrispondente agli spot à ̈ stato escisso, decolorato con 50% acetonitrile e digerito con tripsina. L’analisi di spettrometria di massa à ̈ stata eseguita mediante MALDI micro MX (Micromass, Manchester, UK). I picchi ottenuti dallo spettro (Figura 1B e 1C) corrispondenti ai peptidi digeriti sono stati analizzati in Mascot usando il database Swiss-Prot. L'analisi dei due "spot" ha fornito degli spettri corrispondenti a due isoforme della vimentina (B) e (C) (SEQ ID NO 1).
Esempio 2
Legame dose-dipendente della vimentina alla cardiolipina.
Dosi scalari, da 10 mg/ml a 1,25 mg/ml, di vimentina in soluzione salina tamponata (PBS) a pH 7.4 sono state incubate con cardiolipina (Sigma Chem. Co.) 50 mg/ml in metanolo per tutta la notte a 4°C in piastre di polistirene da 96 pozzetti. Dopo 3 lavaggi con PBS, contenente 0.1% Tween 20 (PBS/Tween), i pozzetti sono stati bloccati per 2 ore a temperatura ambiente con 100 ml/pozzetto di tampone bloccante (PBS contenente 3% di albumina sierica bovina, Sigma Chem. Co.). Dopo 3 lavaggi con PBS/Tween, i pozzetti sono stati incubati con anticorpi policlonali di capra contro la vimentina (R&D Systems). Dopo 3 ulteriori lavaggi con PBS/Tween, le piastre sono state incubate per un'ora a temperatura ambiente con anticorpi policlonali secondari IgG (Sigma Chem. Co) coniugati all’enzima perossidasi (1:1000 nel tampone bloccante). Le piastre sono state lavate per 3 volte con PBS/Tween, come sopra. Il legame della perossidasi à ̈ stato rivelato con l’aggiunta di 100 ml/pozzetto di una soluzione di cloruro di O-fenilendiammina incubando per 10 minuti a temperatura ambiente. La reazione à ̈ stata bloccata con 50 ml/ pozzetto di H2SO41N, per 5 minuti. L'assorbanza à ̈ stata letta a 492 nm in un lettore per piastre ELISA (BioRad).
Il risultato (illustrato in Figura 2) ha dimostrato un legame dose-dipendente fra cardiolipina e vimentina.
Esempio 3
Determinazione tramite tecnica ELISA della presenza di anticorpi contro il complesso cardiolipina/vimentina.
Piastre in polistirene da 96 pozzetti sono state incubate per una notte a 4°C con 100 ml/pozzetto di cardiolipina 50 mg/ml (Sigma Chem. Co.) in metanolo e quindi con 100 ml/pozzetto di vimentina umana ricombinante (R&D Systems: 5 mg/ml) in PBS. La vimentina à ̈ stata lasciata aderire alla piastra per tutta la notte a 4°C.
Dopo tre lavaggi con PBS contenente 0.1% Tween 20 (PBS/Tween), i pozzetti sono stati bloccati per 2 ore a temperatura ambiente con 100 ml/pozzetto di PBS contenente 3% di albumina sierica bovina ((Sigma Chem. Co.; tampone bloccante).
Dopo 3 lavaggi con PBS/Tween i pozzetti sono stati incubati con 100 ml/pozzetto di campione di siero dei pazienti diluito 1:100 in tampone bloccante per 1 h a temperatura ambiente. I campioni sono stati saggiati in triplicato. Un anticorpo di capra contro la vimentina (R&D Systems) diluito 1:200 in tampone bloccante à ̈ stato utilizzato come controllo positivo.
Dopo altri 3 lavaggi in PBS/Tween, le piastre sono state incubate per 1 h a temperatura ambiente con anticorpi policlonali secondari di capra contro IgG o IgM umane (Sigma Chem Co.) coniugati con perossidasi di rafano diluiti 1:1000 in PBS 1% BSA.
Le piastre sono state di nuovo lavate 3 volte con PBS/Tween e la reazione della perossidasi à ̈ stata sviluppata con 100 ml/pozzetto di una soluzione di cloruro di O-fenilendiammina per 10 minuti a temperatura ambiente. La reazione à ̈ stata fermata con 50 ml/pozzetto di H2SO41N per 5 minuti. L'assorbanza à ̈ stata letta a 492 nm in un lettore per piastre BioRad.
L'assorbanza dei pozzetti di controllo negativo (legame non specifico) à ̈ stata sottratta da ciascuna lettura dei campioni e il valore di soglia per la positività dei campioni à ̈ stato stabilito come la media 3 volte la deviazione standard (SD) dei valori ottenuti nei campioni da pazienti sani.
La curva standard à ̈ stata ricavata utilizzando a diluizioni scalari il siero di riferimento utilizzato come controllo positivo. Essa à ̈ standardizzata in unità arbitrarie: in ascisse sono riportate le diluizioni scalari utilizzate (vedi Figura 5).
Esempio 4
Dosaggio degli anticorpi contro il complesso cardiolipina/vimentina in pazienti con APS
In Tabella 2 sono riportati i dati ottenuti in un campione di pazienti composto come segue:
- 29 sieri da pazienti con le manifestazioni cliniche della APS (trombosi arteriose e venose e/o aborti ricorrenti) ma negativi a tutti i classici saggi per la determinazioni degli autoanticorpi ("sieronegativi");
- 40 sieri da pazienti con APS, (di cui 30 da pazienti con APS primaria e 10 con APS secondaria. I pazienti erano positivi ad Tabella 2
anticorpi aCL con saggio ELISA ed, eventualmente, ad anticorpi anti-b2 glicoproteina I e/o al saggio del LA. Inoltre, presentavano una sintomatologia clinica stabilita secondo i criteri di Sapporo (Wilson W.A. et al., Arthritis Rheum. (1999) 42: 1309-1311). La patologia si può manifestare come disturbo isolato (APS primaria) o in corso di una malattia autoimmunitaria sistemica, come il Lupus eritematoso sistemico (APS secondaria);
- 30 sieri da pazienti con lupus eritematoso sistemico ;
- 30 sieri da pazienti con artrite reumatoide;
- 32 sieri da soggetti sani.
Il valore di soglia per la positività à ̈ stato calcolato sulla base della media dei risultati ottenuti sui sieri dei pazienti sani 3 volte la deviazione standard (SD) dei valori ottenuti.
I dati della Tabella 2 mostrano che i sieri dei pazienti classificati come "sieronegativi" per gli anticorpi contro i fosfolipidi (cioà ̈ negativi per gli anticorpi contro il complesso cardiolipina/b2 glicoproteina I e per il Lupus Anticoagulant ma che presentano un quadro clinico di APS), analizzati con il metodo dell'invenzione, Anticorpi contro il Pazienti Pazienti con
complesso “sieronegativi†per APS Soggetti sani vimentina/cardiolipina l'APS
IgG 16/29 55.2% 37/40 92.4% 0/32 0%
IgM 11/29 37.9% 32/40 80.0% 0/32 0%
presentavano una percentuale pari a circa il 50% di positività per gli anticorpi contro il complesso cardiolipina/vimentina. Inoltre, sempre come mostrato in Tabella 2 la quasi totalità dei campioni provenienti dai pazienti affetti da APS presentava anche anticorpi delle classi IgG e IgM contro il complesso fra cardiolipina e vimentina.
I sieri sono stati analizzati anche per la loro reattività con la vimentina in assenza di fosfolipide. La positività per la vimentina in assenza di fosfolipide si presentava per l’isotipo IgG nel 26 % dei pazienti APS e per l’isotipo IgM nel 23% dei pazienti APS. Non sono stati saggiati tipi di vimentina diversi da quella umana ricombinante.
I risultati ottenuti e illustrati in Figura 3a e 3b mostrano che gli anticorpi sono diretti preferenzialmente contro il complesso fosfolipide-proteina. Gli anticorpi, sia di classe IgG sia IgM, erano presenti nei pazienti con APS e con APS “sieronegativa†con una frequenza significativamente superiore rispetto ai soggetti sani di controllo (p<0,0001).
L’analisi dei dati ottenuti mediante il test non parametrico di Mann-Whitney ha evidenziato i seguenti risultati:
- IgG: ciascun gruppo di pazienti vs controlli sani p<0,0001
- IgM: ciascun gruppo di pazienti vs controlli sani p<0,0001.
Esempio 5
Determinazione tramite tecnica ELISA della presenza di anticorpi contro il complesso fosfatidilserina /vimentina
Con metodica analoga, à ̈ stato verificato che altri fosfolipidi a carica negativa possono essere complessati con la vimentina. In particolare, i risultati ottenuti hanno evidenziato una reattività dei sieri di pazienti con APS verso il complesso fosfatidilserina/vimentina, dimostrando che anche tale complesso può rappresentare un bersaglio degli anticorpi in corso di APS Piastre in polistirene da 96 pozzetti furono incubate per una notte a 4°C con 100 ml/pozzetto di fosfatidilserina 50 mg/ml (Sigma Chem. Co.) in metanolo e quindi con 100 ml/pozzetto di vimentina umana ricombinante (5 mg/ml) (R&D Systems) in PBS. Dopo tre lavaggi con PBS contenente 0.1% Tween 20 (PBS/Tween), i pozzetti sono stati bloccati per 2 ore a temperatura ambiente con 100 ml/pozzetto di PBS contenente 3% di albumina sierica bovina (Sigma Chem. Co.; tampone bloccante).
Dopo 3 lavaggi con PBS/Tween i pozzetti sono stati incubati con 100 ml/pozzetto di campione di siero dei pazienti diluito 1:100 in tampone bloccante per 1 h a temperatura ambiente. I campioni sono stati saggiati in triplicato. Un anticorpo di capra contro la vimentina (R&D Systems) Ã ̈ stato utilizzato come controllo positivo diluito 1:200 in tampone bloccante. Dopo altri 3 lavaggi in PBS/Tween, le piastre sono state incubate per 1 h a temperatura ambiente con anticorpi policlonali secondari di capra contro IgG o IgM umane (Sigma Chem. Co) coniugati con perossidasi di rafano diluiti 1:1000 in PBS 1% BSA.
Le piastre sono state di nuovo lavate 3 volte con PBS/Tween e la reazione della perossidasi à ̈ stata sviluppata con 100 ml/pozzetto di una soluzione di cloruro di O-fenilendiammina per 10 minuti a temperatura ambiente. La reazione à ̈ stata fermata con 50 ml/pozzetto di H2SO41N per 5 minuti. L'assorbanza à ̈ stata letta a 492 nm in un lettore per piastre BioRad.
L'assorbanza dei pozzetti di controllo negativo (legame non specifico) à ̈ stata sottratta da ciascuna lettura dei campioni e il valore di soglia per la positività dei campioni à ̈ stato stabilito come la media 3 volte la deviazione standard (SD) dei valori ottenuti.
Esempio 6
Stimolazione esercitata sulle cellule endoteliali da parte delle IgG purificate dai sieri di pazienti "sieronegativi"
Le cellule endoteliali Eahy926, una linea cellulare immortalizzata che cresce in aderenza, furono stimolate con frazioni IgG purificate dai sieri di pazienti “sieronegativi†(200 mg/ml in PBS), che erano state preventivamente incubate con micelle di cardiolipina (1 mg/ml), e vimentina (200 mg/ml) in PBS. Il controllo positivo consisteva nelle stesse cellule stimolate con LPS (100 ng/ml in PBS) o TNF-a (20 ng/ml in PBS) (Sigma Chem. Co.). Il controllo negativo consisteva in cellule Eahy926 incubate con frazioni IgG purificate da donatori sani.
Il trattamento delle cellule fu effettuato ad una temperatura di 37°C in atmosfera umidificata al 5% di CO2. I tempi di incubazione erano diversi nei vari esperimenti, come indicato successivamente.
Esempio 6A: Fosforilazione della proteina cellulare IRAK-1 (Interleukin-1 Receptor-associated Kinase 1).
Per verificare la fosforilazione di IRAK-1, le cellule Eahy926 furono stimolate come descritto sopra per 45 minuti. Dopo il trattamento, le cellule furono lavate due volte con PBS e furono staccate dalla fiasca con tripsina, secondo la pratica nota agli esperti del ramo. Le cellule così staccate, furono poi lavate sospendendole prima in terreno di coltura D-MEM (Sigma Chem. Co.) e successivamente in PBS, centrifugando a 300 x g per 6 minuti a 4°C dopo ogni lavaggio. Il pellet finale fu sospeso per 30 minuti a 4°C, in una soluzione lisante costituita da Nonidet P-40 1%, Tris-HCl (100 mM pH 7.5), NaCl (150 mM), EDTA (5mM), PMSF (1 mM), leupeptina (10 mg/ml), Na3VO4(1mM) e aprotinina (75 U) (Sigma Chem. Co.). Il lisato cellulare così ottenuto fu poi centrifugato a 15000 x g per 30 minuti a 4°C, per eliminare i nuclei e i detriti cellulari. Il contenuto proteico del sovranatante recuperato fu determinato utilizzando il metodo di Bradford (Bio-Rad). In seguito, i campioni furono eventualmente diluiti in modo da contenere tutti la stessa concentrazione di proteine prima di essere sottoposti a corsa elettroforetica seguita da Western Blot. La separazione elettroforetica à ̈ stata eseguita su gel di poliacrilammide al 7,5 % utilizzando un apparato mini Protean II Dual Slab Cell (BioRad). La determinazione dei pesi molecolari à ̈ stata fatta sulla base della mobilità elettoforetica di protene standard incluse nel gel (Bio-Rad). Dopo trasferimento delle proteine su nitrocellulosa, il filtro à ̈ stato incubato per un’ora a temperatura ambiente in un tampone di saturazione TBS-Tween (Tris–HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 150 mM, 0,05 % di Tween 20) con albumina al 3 %, allo scopo di bloccare i siti di legame aspecifici della nitrocellulosa. Dopo questa fase, il filtro à ̈ stato incubato, per 12 ore a 4°C, con 2 Î1⁄4g/ml di anticorpo policlonale di coniglio contro la fosfo-IRAK1 (Cell Signalling Technology), in TBS-Tween. Dopo 3 lavaggi in TBS-Tween, il filtro di nitrocellulosa à ̈ stato incubato, per un’ora a temperatura ambiente, con anticorpi secondari policlonali di capra coniugati alla perossidasi (Sigma Chem. Co.), diluiti 1:5000 in TBS-Tween. Dopo tre ulteriori lavaggi, eseguiti come descritto sopra, la reattività degli anticorpi fu rivelata mediante reazione di chemiluminescenza, utilizzando un sistema ECL per Western Blot (Amersham). Il controllo del contenuto proteico dei campioni fu eseguito successivamente incubando il filtro con anticorpi monoclonali anti-actina (Sigma Chem. Co.), 1µg/ml in TBS-Tween. Questa reazione fu sviluppata come sopra descritto.
Esempio 6 B: Fosforilazione e traslocazione al nucleo del fattore di trascrizione NF-kB.
Per analizzare l’attivazione del fattore di trascrizione nucleare NF-kB, furono valutate la fosforilazione e la traslocazione nel nucleo della subunità p65.
Le cellule Eahy926 furono stimolate come sopra descritto. Dopo il trattamento, le cellule furono lavate due volte con PBS, staccate dalla fiasca con tripsina e successivamente lavate con terreno di coltura e con PBS e centrifugate come sopra descritto Per la preparazione degli estratti nucleari i pellets cellulari ottenuti dopo detti lavaggi furono prima risospesi in un tampone A costituito da: HEPES (20 mM pH 7.9), KCl (20 mM), MgCl2(3.0 mM), Na3VO4(1mM), leupeptina (10 mg/ml), PMSF (1 mM), E64 (10 Î1⁄4M), pepstatina (0.5 Î1⁄4g/ml), DTT (5 mM), Nonidet P-40 1%, (Sigma Chem. Co), agitati al vortex e lasciati riposare in ghiaccio per 30 minuti. Successivamente, gli estratti così ottenuti furono centrifugati per 30 minuti a 10.000 x g a 4°C. I pellets (che corripondono ai nuclei) furono risospesi in un tampone B costituito da: HEPES (40 mM pH 7.9), NaCl (0.84 M), EDTA (0.4 mM), glicerolo al 50%, Na3VO4(1mM), leupeptina (10 mg/ml), PMSF (1 mM), E64 (10 Î1⁄4M), pepstatina (0.5 Î1⁄4g/ml), DTT (5 mM), Nonidet P-40 1%, (Sigma Chem. Co.) agitati al vortex e lasciati riposare in ghiaccio per un’ora. Gli estratti nucleari così ottenuti sono stati quindi centrifugati a 10.000 x g per un'ora a 4°C. Sui sovranatanti fu quindi eseguita una determinazione proteica utilizzando il metodo di Bradford (Bio-Rad). In seguito, i campioni furono eventualmente diluiti in modo da contenere tutti la stessa concentrazione di proteine prima di essere sottoposti a corsa elettroforetica seguita da Western Blot, come precedentemente descritto per la fosforilazione di IRAK1. Il filtro di nitrocellulosa fu incubato con anticorpi policlonali di coniglio contro la p65 fosforilata (2 Î1⁄4g/ml in TBS-Tween: Cell Signalling Technology). Dopo 3 lavaggi in TBS-Tween, lo stesso filtro fu incubato con anticorpi secondari di capra coniugati alla perossidasi (Sigma Chem. Co.) diluiti 1:5.000 in TBS-Tween. La reazione fu sviluppata come già descritto sopra. Il controllo della purezza degli estratti nucleari fu eseguito incubando lo stesso filtro di nitrocellulosa con anticorpi monoclonali anti-Istone 1 (Upstate Biotecnnology) diluiti a 1µg/ml in TBS-Tween. La reazione fu poi sviluppata come già descritto sopra.
Esempio 6 C: Espressione di VCAM sulla membrana cellulare delle cellule EAhy926.
Fu usata la tecnica della'immunofluorescenza indiretta per analizzare l’espressione della proteina VCAM sulla membrana delle cellule endoteliali EAhy926.
In breve, per ogni campione le cellule furono stimolate per 20 ore come precedentemente descritto. Dopo il trattamento furono lavate due volte con PBS e staccate dalla fiasca con tripsina secondo il metodo noto agli esperti del ramo, lavate e centrifugate come già descritto sopra. I pellets cellulari ottenuti furono fissati per 20 minuti a 4°C con formaldeide al 4% in PBS. Dopo questo passaggio le cellule furono lavate e centrifugate per tre volte in PBS, come già descritto sopra, e poi incubate per un'ora a 4°C con un anticorpo monoclonale anti-VCAM (GeneTex, Inc) diluito a 1Î1⁄4g/ml in PBS. Dopo l’incubazione furono eseguiti altri tre lavaggi in PBS seguiti da centrifugazuione come sopra descritto, e le cellule furono incubate per 30 minuti a 4°C con anticorpi secondari di capra coniugati all’isotiocianato di fluoresceina (FITC, un fluorocromo che emette nel verde; Sigma Chem. Co) diluiti 1:50 in PBS. Dopo questa fase di incubazione le cellule furono nuovamente lavate con PBS come sopra e risospese in PBS. L’intensità della fluorescenza fu analizzata con un citofluorimetro Becton Dickinson.
Esempio 6 D: Rilascio del fattore procoagulante denominato Tissue Factor (TF) dalle cellule EAhy926.
Per valutare l'aumento del rilascio del fattore procoagulante denominato Tissue Factor (TF) dalle cellule EAhy926, le cellule furono prima stimolate per 4 ore come precedentemente descritto. Dopo il trattamento le cellule furono lavate due volte con PBS, staccate dalla fiasca con tripsina, lavate e centrifugate come già descritto sopra. Dopo i lavaggi i sovranatanti furono recuperati e saggiati per la presenza di TF utilizzando un kit ELISA commerciale (American Diagnostica) secondo le istruzioni del fabbricante.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Complesso fra un fosfolipide e la proteina vimentina, detta vimentina essendo scelta in una sua isoforma pura o miscela di isoforme.
- 2. Complesso secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il fosfolipide à ̈ un fosfolipide carico negativamente.
- 3. Complesso secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il fosfolipide carico negativamente à ̈ scelto fra cardiolipina, fosfatidilserina, fosfatidilinositolo e acido fosfatidico.
- 4. Complesso secondo le rivendicazioni 1-3, per l'impiego in campo medico, in particolare per la determinazione di pazienti affetti da sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi (APS).
- 5. Composizioni farmaceutiche comprendenti il complesso secondo le rivendicazioni 1-4, comprendenti adiuvanti e/o agenti veicolanti farmacologicamente accettabili.
- 6. Metodo analitico per la determinazione della presenza di anticorpi contro il complesso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 in fluidi biologici, comprendente i seguenti stadi: a) preparazione del complesso fosfolipide/vimentina; b) incubazione dei campioni biologici con detto complesso; c) determinazione del titolo degli anticorpi eventualmente presenti nel campione e che si sono legati al complesso fosfolipide/vimentina.
- 7. Metodo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che la proteina vimentina utilizzata nello stadio a) à ̈ in una sua isoforma pura o miscela di isoforme, preferibilmente di origine umana o murina, più preferibilmente à ̈ ricombinante.
- 8 Metodo secondo le rivendicazioni 6-7 caratterizzato dal fatto che il fosfolipide utilizzato nello stadio a) Ã ̈ un fosfolipide carico negativamente scelto fra cardiolipina, fosfatidilserina, fosfatidilinositolo e acido fosfatidico.
- 9. Kit per l'esecuzione del metodo secondo le rivendicazioni 6-8, comprendente: a) la proteina vimentina in una sua isoforma pura o miscela di isoforme; b) almeno un fosfolipide carico negativamente; e, opzionalmente; c) superfici di reazione e supporti solidi, tamponi, reagenti di cattura, reagenti di sviluppo, marcatori, campioni di controllo e istruzioni per l'uso.
- 10. Uso del complesso secondo le rivendicazioni 1-3 per la produzione di composizioni in campo farmaceutico, in particolare a scopo diagnostico, più in particolare per l'identificazione di pazienti affetti da sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi (APS).
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Families Citing this family (5)
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|---|---|---|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002066990A2 (en) * | 2001-02-20 | 2002-08-29 | The Babraham Institute | Immobilised cardiolipin probes |
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-
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-
2010
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002066990A2 (en) * | 2001-02-20 | 2002-08-29 | The Babraham Institute | Immobilised cardiolipin probes |
| WO2008078193A2 (en) * | 2006-08-29 | 2008-07-03 | Glycominds Ltd | Method of diagnosing and stratifying anti-phospholipid syndrome |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| AUDRAIN MARIE A P ET AL: "Comparison of different kits in the detection of autoantibodies to cardiolipin and beta2glycoprotein 1.", RHEUMATOLOGY (OXFORD, ENGLAND) FEB 2004, vol. 43, no. 2, February 2004 (2004-02-01), pages 181 - 185, XP002557959, ISSN: 1462-0324 * |
| BLASCHEK M A ET AL: "Relation of antivimentin antibodies to anticardiolipin antibodies in systemic lupus erythematosus.", ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES SEP 1988, vol. 47, no. 9, September 1988 (1988-09-01), pages 708 - 716, XP002557957, ISSN: 0003-4967 * |
| HORKOVICS-KOVATS S ET AL: "Specific interaction of the intermediate filament protein vimentin and its isolated N-terminus with negatively charged phospholipids as determined by vesicle aggregation, fusion, and leakage measurements.", BIOCHEMISTRY 18 SEP 1990, vol. 29, no. 37, 18 September 1990 (1990-09-18), pages 8652 - 8657, XP002557956, ISSN: 0006-2960 * |
| KARIN MALICKOVA ET AL: "Relationship of Anti-vimentin antibodies to anti-endothelial antibodies", CENTRAL EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINE, CENTRAL EUROPEAN SCIENCE JOURNALS, WA, vol. 1, no. 3, 1 September 2006 (2006-09-01), pages 228 - 236, XP019415714, ISSN: 1644-3640 * |
| LIN L ET AL: "Monoclonal IgM antiphosphatidylserine antibody reacts against cytoskeleton-like structures in cultured human umbilical cord endothelial cells", AMERICAN JOURNAL OF REPRODUCTIVE IMMUNOLOGY AND MICROBIOLOGY, ALAN R. LISS, NEW YORK, NY, US, vol. 33, no. 1, 1 January 1995 (1995-01-01), pages 97 - 107, XP008114807, ISSN: 8755-8920 * |
| PERIDES G ET AL: "Electrostatic and hydrophobic interactions of the intermediate filament protein vimentin and its amino terminus with lipid bilayers.", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 5 OCT 1987, vol. 262, no. 28, 5 October 1987 (1987-10-05), pages 13742 - 13749, XP002557955, ISSN: 0021-9258 * |
| PERIDES G ET AL: "Influence of phospholipids on the formation and stability of vimentin-type intermediate filaments", EUROPEAN JOURNAL OF CELL BIOLOGY, WISSENSCHAFLICHE VERLAGSGESELLSCHAFT, STUTTGART, DE, vol. 42, no. 2, 1 December 1986 (1986-12-01), pages 268 - 280, XP008114745, ISSN: 0171-9335 * |
| PISKO E J ET AL: "Human rheumatoid factor producing cell induction by 2-mercaptoethanol: Immunomodulation by a simple thiol compound", INTERNATIONAL JOURNAL OF IMMUNOPHARMACOLOGY, ELMSFORD,NY, US, vol. 5, no. 2, 1 January 1983 (1983-01-01), pages 163 - 171, XP023811143, ISSN: 0192-0561, [retrieved on 19830101] * |
| THEBAULT SANDRINE ET AL: "Orderly pattern of development of the autoantibody response in (New Zealand WhiteXBXSB)F1 lupus mice: Characterization of target antigens and antigen spreading by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 169, no. 7, 1 October 2002 (2002-10-01), pages 4046 - 4053, XP002557958, ISSN: 0022-1767 * |
| TRAUB P ET AL: "INTERACTION IN-VITRO OF NONEPITHELIAL INTERMEDIATE FILAMENT PROTEINS WITH TOTAL CELLULAR LIPIDS INDIVIDUAL PHOSPHOLIPIDS AND A PHOSPHOLIPID MIXTURE", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 261, no. 23, 1986, pages 10558 - 10568, XP002557954, ISSN: 0021-9258 * |
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