ITRM20080556A1 - Linee cellulari embrionali, metodo per la loro preparazione e loro uso. - Google Patents
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Description
“LINEE CELLULARI EMBRIONALI, METODO PER LA LORO PREPARAZIONE E LORO USO”
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda linee cellulari embrionali, nuovi metodi di preparazione, composizioni comprendenti dette linee cellulari e uso di dette linee cellulari e uso di dette composizioni.
STATO DELLA TECNICA
La ricerca e l'applicazione clinica per trapianti di cellule staminali sono tra gli argomenti medici di più moderno interesse, la scoperta biologica delle potenzialità di tali cellule ha indotto numerosi ricercatori a cercare metodi per l’isolamento, la coltura e l’uso di tali cellule, sia negli animali adulti che allo stadio di embrioni. L'uso di cellule staminali nella medicina rigenerativa è volto a creare "tessuti" umani o animali ex-vivo per trapiantarli in pazienti la cui malattia è causata da degenerazione o danno di cellule, tessuti e organi.
Attualmente i progressi più importanti nella ricerca sulle cellule staminali, sia embrionali che adulte, riguardano soprattutto la messa a punto di protocolli per isolarle e coltivarle, per evitarne la differenziazione durante la coltura e per indurre la loro differenziazione nei vari tipi cellulari desiderati quando tali cellule devono essere utilizzate, e per comprendere i meccanismi che conferiscono a queste cellule la loro caratteristica più importante, ossia la totipotenza e la pluripotenza o multipotenza.
Fino ad oggi, sono state sviluppate tecniche di coltura di cellule embrionali volte ad amplificare il numero di tali cellule impedendone la differenziazione, normalmente, un protocollo per la coltura di cellule embrionali derivanti da embrioni allo stadio di blastocisti (freschi o congelati), prevedono una messa in coltura per diversi giorni caratterizzato da numerosi passaggi (15-20) atti all’espansione di tali cellule in terreni comprendenti fattori di crescita e sostanze quali per esempio, nel caso delle cellule embrionali umane, la forculina, per evitare la differenziazione di tali cellule.
Sostanzialmente, gli sforzi maggiori, quando vengono sviluppate linee cellulari embrionali, sono volti ad impedire la differenziazione di tali cellule per non perdere la loro caratteristica di totipotenza (Mitalipova et al., 2000; Odorico et al., 2001).
Infatti, le cellule embrionali, eccezion fatta per l’uomo (Thomson et al., 1998; Reubinoff et al., 2000), il topo (Evans and Kaufman, 1981) e la scimmia (Thomson et al., 1996), hanno la tendenza a differenziare già dai primi giorni di coltura primaria o ai primi successivi passaggi anche quando coltivate su monostrato cellulare capace di fornire istochine come il LIF (Leukemia Inhibiting Factor), capace d’inibire teoricamente la differenziazione. Inoltre le suddette cellule mal tollerano il congelamento.
Quanto sopra indicato mette in luce due problematiche: quella di espandere in maniera potenzialmente illimitata le cellule di interesse ed i limiti della loro conservazione tramite congelamento.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
Nella presente invenzione è dimostrato che è possibile utilizzare con successo cellule embrionali (stem-like) provenienti da bottoni embrionali di blastocisti di 6-7 giorni prodotte in vitro, fresche o crioconservate come farmaci rigenerativi dopo una messa in coltura di soli 5-15 giorni dal prelievo.
Benché quanto sopra indicato sia applicabile all’uomo, essendo ancora aperto il dibattito etico sull’utilizzo di linee cellulari embrionali come sopra indicate, l’invenzione è limitata a mammiferi escluso l’uomo, è chiaro che se le decisioni etiche internazionali e nazionali dovessero permettere l’utilizzo di linee cellulari derivanti da embrioni umani prodotti in vitro, la presente invenzione riguarderebbe anche linee cellulari embrionali derivate da embrioni allo stadio di blastocisti prodotti in vitro di mammiferi incluso l’uomo.
La presente invenzione riguarda quindi una linea cellulare embrionale di mammifero, escluso l’uomo, derivata da cellule prelevate da embrioni allo stadio di blastocisti prodotti in vitro come farmaco veterinario per la rigenerazione dei tessuti, detta linea cellulare essendo coltivata per un periodo non superiore ai 15 giorni da detto prelievo, una composizione farmaceutica per il trattamento di lesioni articolari comprendente detta linea cellulare, ed, eventualmente, opportuni composti di sostegno quali, ad esempio, fibrinogeno e trombina ed altri composti noti al tecnico del settore, un metodo per la preparazione di detta linea cellulare, l’uso di detta linea cellulare per la preparazione di farmaci o di supporti per impianti ortopedici per la cura di lesioni o di patologie articolari, supporti per impianti ortopedici comprendenti detta linea cellulare.
Si sottolinea ancora che l’oggetto della descrizione sopra indicato, è limitato a mammiferi escluso l’uomo non per motivi tecnici, quanto descritto nella presente descrizione si applica anche all’uomo, ma per motivi etici essendo al momento in discussione delle direttive etiche riguardanti linee cellulari del tipo di quelle della presente invenzione. Gli inventori, limitano quindi l’oggetto dell’invenzione in attesa di decisioni che riguardino le cellule della descrizione quando di origine umana, gli inventori si riservano il diritto di estendere quanto rivendicato nella presente descrizione anche all’uomo qualora decisioni internazionali, regionali e/o nazionali permettessero il rilascio di domande di brevetto riguardanti linee cellulari embrionali mammifero incluso l’uomo derivate da cellule prelevate da embrioni allo stadio di blastocisti prodotti in vitro e mantenute in coltura non più di 5-15 giorni. Qualora questo tipo di cellule risultasse brevettabile, gli inventori si riservano il diritto di eliminare la limitazione, presente in tutte le rivendicazioni, ai mammiferi escluso l’uomo. Si ribadisce che tale limitazione è introdotta non per motivi tecnici, in quanto l’intera descrizione è applicabile all’uomo, ma per le attuali limitazioni (o assenze di chiare direttive) sul tipo di linee cellulari descritte nella presente descrizione, sui metodi per il loro prelievo, il loro utilizzo e la loro messa in coltura.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
Figura 1. La figura 1 è divisa in 12 pannelli in cui:
a, b, c, d (colonna a sinistra) mostrano il risultato di impianti in articolazioni di ginocchio di pecora in cui era stato indotto un danneggiamento della cartilagine, di linee cellulari embrionali secondo l’invenzione unitamente a trombina e fibrinogeno (ES-like), rispettivamente 1, 2, 6 e 12 mesi dopo l’impianto;
i pannelli e, f, g, h (colonna centrale) mostrano il risultato rilevato, rispettivamente 1, 2, 6 e 12 mesi dopo il danneggiamento della cartilagine su lesioni vuote (ED);
mentre i pannelli i, l, m ed n (colonna di destra) mostrano il risultato di impianti in articolazioni di ginocchio di pecora in cui era stato indotto un danneggiamento della cartilagine, con colla di fibrina (G).
Barra=5 mm.
Come si può vedere nella colonna di sinistra, la presenza delle cellule dell’invenzione risolve molto più rapidamente e in modo migliore la lesione.
La figura 2 riporta l’aspetto microscopico delle lesioni come per la figura 1 a 1 e 12 mesi dall’intervento sul ginocchio della pecora.
La colonna a sinistra, con i pannelli a, b, c, d, mostra l’aspetto delle lesioni cartilaginee a seguito degli impianti delle linee cellulari dell’invenzione (ES-like) rispettivamente, per ematossilina-eosina a 1 mese, collagene di tipo II a 1 mese, Azan-Mallory a 12 mesi, e collagene di tipo II a 12 mesi;
la colonna centrale, con i pannelli e, f, g, h, mostra l’aspetto delle lesioni (ED) senza alcun impianto rispettivamente, per ematossilina-eosina a 1 mese, collagene di tipo II a 1 mese, Azan-Mallory a 12 mesi, e collagene di tipo II a 12 mesi,
la colonna a destra, con i pannelli i, l, m, n, mostra l’aspetto delle lesioni cartilaginee a seguito degli impianti con colla di fibrina (G) rispettivamente, per ematossilina-eosina a 1 mese, collagene di tipo II a 1 mese, Azan-Mallory a 12 mesi, e collagene di tipo II a 12 mesi,
Ciascuna barra indica quanti µm rappresenta in ciascun pannello.
La figura 3, rappresenta un campione in cui è stato effettuato un impianto delle linee cellulari dell’invenzione sulla lesione cartilaginea, a 12 mesi da detto impianto. La figura mostra che a 12 mesi dall’impianto la cartilagine ialina è matura (A: ematossilinaeosina: barra 250 µm; B: collagene di tipo II; barra 500 µm).
.
. La figura 4 mostra i risultati di una ibridazione in situ per il rilevamento del marcatore delle linee cellulari embrionali secondo l’invenzione utilizzate nell’esperimento indicato In questo caso è stato selezionato un marcatore nucleotidico per una regione ripetuta del cromosoma Y di Ovis aries in modo da poter visualizzare il percorso delle cellule dell’invenzione e delle cellule da esse derivanti, essendo stato fatto l’impianto su individui di sesso femminile.
Nella colonna a sinistra della figura 4 vengono riportati gli impianti di ES-like cells a 2 mesi (fig.4 A), a 6 mesi (fig.4 B), a 12 mesi (fig.4 C) ed il controllo negativo (fig.4 D); mentre, nella colonna a destra della stessa figura, sono riportati gli ingrandimenti delle figure esposte a sinistra, con la relativa descrizione dei tipi cellulari riscontrati. Il pannello a. mostra i risultati su un impianto con le cellule dell’invenzione, il pannello b. è il controllo negativo dell’ibridazione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Le linee cellulari embrionali secondo la presente invenzione, non risultano dare origine a forme tumorali o di rigetto, in particolare, le linee cellulari secondo la presente invenzione, sono a differenza delle linee cellulari embrionali descritte in letteratura, coltivate per un periodo compreso tra 5 e 15 giorni prima del loro utilizzo e/o del loro congelamento per un utilizzo successivo.
Ove eticamente accettabile le linee cellulari dell’invenzione provengono da un mammifero incluso l’uomo, se eticamente non accettabile detto mammifero è limitato ad un mammifero escluso l’uomo, dove questo mammifero potrà essere un mammifero qualsiasi escluso l’uomo. In una forma di realizzazione tale mammifero potrà essere un animale da allevamento, da competizione (ad esempio) sportiva, estetica, di lavoro, un animale da compagnia, un animale a rischio di estinzione eccetera. Tra questi è possibile indicare animali (bovini, suini, ovini, caprini, equini, canidi, gatti, conigli eccetera) da competizione per conferire pregio all’allevamento (produzione, estetica ed altro), animali da competizione sportiva, in particolar modo cani cavalli e pony, animali da competizione da lavoro (ad esempio cani da lavoro, cani che effettuano prove di agility eccetera) animali da compagnia, ad esempio cani, gatti eccetera.
Nella presente invenzione è stato sorprendentemente scoperto che non è necessario prolungare il periodo di coltura perché le linee cellulari embrionali ottenute da bottoni embrionali di embrioni allo stadio di blastocisti possano essere utilizzate con successo come farmaco veterinario (ed umano se eticamente permesso) per la rigenerazione di tessuti anche solo dopo 5-15 giorni di coltura.
Secondo la presente invenzione gli embrioni vengono prodotti in vitro. In una forma di realizzazione, questi embrioni possono essere ottenuti da ovociti maturati in vitro e dalla loro successiva fertilizzazione con idoneo seme maschile. In una forma di realizzazione, gli ovociti, quando appartenenti a famiglie animali normalmente macellate per uso alimentare, quali, ad esempio, ovini, caprini, bovini, equini, suini eccetera, o quando appartenenti a famiglie animali comprendenti animali da compagnia quali piccoli felini, canidi eccetera, il cui cadavere deve o può essere consegnato alle autorità veterinarie, gli ovociti possono essere raccolti da animali regolarmente macellati o deceduti (quindi senza nemmeno sottoporre animali vivi a interventi) e coltivati in un idoneo terreno di maturazione. Esempi di terreni di maturazione idonei sono noti al tecnico del settore, è comunque qui indicato un possibile terreno utilizzabile per la coltivazione degli ovociti, senza che, ovviamente, l’invenzione sia limitata a quest’ultimo: terreno di maturazione composto da TCM199 comprendente circa 4 mg/ml di BSA, 100 mM di cisteamina e quantitativi idonei di estrogeni e gonadotropine, ad esempio 1 mg/ml di estradiolo-17b (estrogeno) e g 0.1 UI/ml r-FSH e 5 mg/ml LH (gonadotropine ipofisarie).
L’invenzione può essere realizzata anche su embrioni prodotti in vivo su animali escluso l’uomo, ad esempio mediante induzione di super ovulazione e prelievo di alcuni embrioni. Il titolare si riserva il diritto di rivendicare, ove consentito, tutte le forme di realizzazione dell’invenzione in cui l’embrione è prodotto in vivo.
Secondo l’invenzione, gli ovociti maturi possono essere fecondati con il seme idoneo (es. ovocita di giumenta con seme di cavallo, ovocita di pecora con seme di ariete, eccetera, quindi fecondazioni tra ovociti e spermatozoi della stessa specie) a formare potenziali zigoti che vengono messi in coltura in vitro in un terreno di coltura idoneo per un periodo compreso tra i 5 ed i 7 giorni, fino a formare blastocisti ad esempio, Sinthetycal Oviductal Fluid (SOF) (Fluido Oviduttale Sintetico) contenente l’1% (v/v) di amminoacidi non essenziali, l’1% (v/v) di amminoacidi essenziali, 1mM di glutamina ed 8 mg/ml di albumina sierica di bovino priva di acidi grassi, che verranno utilizzate per il prelievo delle cellule dal bottone embrionale per la realizzazione delle cellule secondo l’invenzione.
E’ stato dimostrato dagli inventori per la prima volta, che le blastocisti ottenute come sopra possono essere anche congelate per formare uno stock di materiale da cui recuperare, dopo scongelamento, le cellule dal bottone embrionale (cellule staminali) per la preparazione delle linee cellulari secondo l’invenzione. Le linee cellulari derivanti da embrioni congelati sono risultate essere efficaci nella rigenerazione di tessuti come descritto in seguito.
Il congelamento (vitrificazione) degli embrioni secondo l’invenzione può essere effettuato immergendo le blastocisti di interesse per circa 3-5 minuti in una prima soluzione di equilibrazione contenente glicole etilenico e DMSO al 10% e, di seguito, per meno di 45 sec in una seconda soluzione di vitrificazione contenente glicole etilenico e DMSO al 20% più saccarosio 0.5 M. Immediatamente dopo, le blastocisti vengono inserite in paillettes aperte (open pulled straws) ed immerse in azoto liquido fino al successivo scongelamento per la preparazione delle linee cellulari dell’invenzione.
Gli embrioni così congelati vengono scongelati al momento in cui si desidera procedere con la preparazione delle linee cellulari, ad esempio, si può allestire sul coperchio di una piastra di Petri, 2 gocce da ≈ 100 μl di soluzione di H-TCM 199 saccarosio 0.5 M ed una di medium di lavaggio (H-TCM 0.4% BSA). Prelevare la paillette da scongelare dall’azoto liquido, mantenerla a temperatura ambiente per 6’’ ed immergerla in una soluzione di H-TCM 199 0.4% BSA saccarosio 0.5 M posta in una provetta immersa in un bagnetto a 37°C, che salirà per capillarità all’interno della paillette stessa. Svuotare il contenuto della paillette nella soluzione di saccarosio 0.5 M allestita sul coperchio della Petri ed attendere 5’. Passare, quindi, le blastocisti nel medium di lavaggio, mantenendole per ≈ 30’’ e trasferirle in una piastra di Petri, poggiata su un piano riscaldato, contenente H-TCM 0.4% BSA. In tale medium gli embrioni verranno messi in incubazione a 39°C in atmosfera umidificata al 5% di CO2per 24 h. Solo le blastocisti che si riespanderanno saranno impiegate per la produzione delle linee cellulari embrionali.
Le cellule per la preparazione delle linee cellulari dell’invenzione, possono essere preparate mediante isolamento della massa cellulare interna (Inner Cell Mass, ICM) che viene disaggregata, ad esempio con un capillare di vetro in gruppi di poche cellule prima di essere messa in coltura, oppure, il prelievo di cellule per la preparazione delle linee dell’invenzione può essere effettuato senza distruggere l’embrione, prelevando mediante una microbiopsia un numero limitato di cellule, da circa 10 a circa 30 cellule, dalla ICM e lasciando così un embrione in grado di svilupparsi normalmente. Un embrione di 6-7 giorni è normalmente composto da: a) cellule del trofoblasto (circa 90-100) che danno origine alla placenta ; b) cellule dell'inner cell mass o bottone embrionale (circa 40-90) che daranno origine all'embrione vero e proprio. Il prelievo di un numero limitato di cellule del bottone embrionale come indicato nella presente descrizione, lascia un embrione vitale e in grado di svilupparsi normalmente.
Questa forma di realizzazione potrebbe essere la più idonea per la preparazione di cellule embrionali secondo la presente descrizione in cui il mammifero da cui vengono prelevati è, se verrà eticamente accettato, l’uomo. In questa forma di realizzazione, infatti, gli embrioni potrebbero essere gli embrioni che vengono preparati ma non utilizzati per le procedure di procreazione assistita e tali embrioni, inoltre, non verrebbero distrutti dalla procedura qui descritta. Un esempio di procedure non distruttive dell’embrione sono la preparazione di emiblastocisti ottenute mediante splitting in cui, da un embrione, si ottengono due embrioni che danno vita a individui sani. Evidentemente tale forma di realizzazione sarà rivendicata dagli inventori se le decisioni etiche in materia di cellule staminali embrionali permetteranno il rilascio di brevetti con tali rivendicazioni. Si rileva però che questa forma di realizzazione non danneggerebbe l’embrione.
In questo caso ovviamente l’uso delle cellule potrebbe essere, se eticamente accettato, medico non limitato alla medicina veterinaria.
Gli autori della presente invenzione hanno inoltre appurato che le cellule dell’invenzione, sono cellule in grado di rigenerare tessuti. Gli esperimenti volti a verificare le capacità rigenerative delle cellule dell’invenzione, sono stati effettuati su tessuti che notoriamente hanno bassissime, se non virtualmente inesistenti, capacità rigenerative. E’ infatti noto che lesioni o a carico dei tessuti articolari o patologie che creano tali lesioni non sono facilmente curabili mediante rigenerazione di tessuti. In particolar modo, è noto che il tessuto cartilagineo ha una capacità di rigenerazione e riparazione del tessuto molto limitata. Sono stati effettuati molti tentativi per riparare i difetti delle cartilagini articolari con scarso successo. Uno dei metodi prevede la coltura e l’impianto di tessuti cartilaginei autologhi, tale metodo però, ha lo svantaggio di richiedere l’ablazione di tessuto cartilagineo dal donatore/ricevente creando quindi lesioni, seppur piccole, in altri tessuti cartilaginei del paziente stesso. Nella presente descrizione, è dimostrato che le linee cellulari dell’invenzione possono essere utilizzate come medicamento per curare lesioni articolari, senza nemmeno la necessità di stimolare la differenziazione di tali cellule nei tessuti desiderati. La mera localizzazione delle cellule dell’invenzione nelle lesioni in cui il tessuto deve essere rigenerato, porta alla rigenerazione di detto tessuto. Le cellule dell’invenzione sono quindi idonee ad essere utilizzate, anche senza aggiunta di fattori di differenziazione, come farmaco ortopedico per la cura di lesioni cartilaginee e/o di patologie che causano lesioni cartilaginee o causate da lesioni cartilaginee. Nella forma di realizzazione dell’invenzione eticamente limitata come qui descritta il farmaco sarà un farmaco veterinario anche se in teoria si potrebbe realizzare partendo dalla presente invenzione, un farmaco ad uso umano per la cura di lesioni cartilaginee e/o di patologie che causano lesioni cartilaginee o causate da lesioni cartilaginee.
Un utilizzo veterinario del farmaco in questione è applicabile ad esempio agli animali da compagnia che hanno se non necessariamente un elevato valore economico, un elevato valore affettivo, o ad animali di elevatissimo valore economico in cui le articolazioni sono particolarmente importanti, quali, ad esempio, cavalli da corsa e da competizione (dressage, salto, completo, cross-country, polo).
Ovviamente il farmaco veterinario comprendente le cellule embrionali della presente descrizione può essere preparato per qualsiasi mammifero, tuttavia si pone semplicemente l’attenzione su quelle specie per le quali può esserci un maggiore interesse veterinario o economico.
In una forma di realizzazione, il farmaco, o composizione farmaceutica limitata alla ortopedia veterinaria per i motivi sopra descritti ma applicabilissima, salvo decisioni che ne permettano la brevettazione, anche all’ortopedia sull’uomo, comprenderà le cellule dell’invenzione come fin’ora descritte e come descritte nelle rivendicazioni, ed idonei eccipienti. Le cellule potranno essere sospese in veicoli farmaceuticamente accettabili (terreno di coltura sterile, soluzione fisiologica), potranno essere aggiunti idonei eccipienti rappresentati, ad esempio da uno o più dei seguenti composti: fibrinogeno, trombina o altri composti noti al tecnico del settore.
In una forma di realizzazione potranno essere utilizzati fibrinogeno e trombina (ovvero colla di fibrina) in parti uguali ed un numero di cellule di almeno 500.000 in circa 0,06 ml di volume finale.
La presente descrizione riguarda anche un metodo per la preparazione di linee cellulari embrionali in cui:
a. vengono prodotti zigoti in vitro;
b. detti zigoti vengono messi in coltura in un terreno idoneo per un periodo di 67 giorni fino ad ottenere delle blastocisti;
c. vengono prelevate cellule dal bottone embrionale di dette blastocisti e messe in coltura in terreno idoneo per un periodo di 5-15 giorni.
Come precedentemente indicato, la produzione degli zigoti al punto a. in vitro può essere effettuata facendo maturare ovociti prelevati da ovaie come sopra indicato o in qualsiasi modo noto al tecnico del settore e fecondandoli artificialmente con spermatozoi di individui della stessa specie seguendo le tecniche di fertilizzazione in vitro note al tecnico del settore. Ad esempio, dopo la rimozione delle cellule del cumulo ooforo gli ovociti “denudati” vengono lavati 3 volte in un medium di fertilizzazione e messi a contatto con spermatozoi (1x10<6>/ml) della stessa specie per un periodo di almeno 20-24 ore.
Gli zigoti così ottenuti vengono messi quindi in coltura fino allo stadio di blastocisti come sopra indicato in un terreno idoneo (ad esempio SOF complementato con amminoacidi essenziali e non,, BSA ed eventualmente idonei antibiotici) per un periodo di 6-7 giorni, fino allo stadio di blastocisti.
Dagli embrioni così ottenuti si isola il bottone embrionale attraverso tecniche d’immunochirurgia (previo trattamento con pronase 0.5% per 5 min a 37°C per le blastocisti con zona pellucida integra, esposizione ad anticorpo anti-sheep diluito 1:16 per 20 min a 38°C, seguita da esposizione a complemento diluito 1:5 per 15 min a 38°C; successivamente si aspira e si svuota ripetutamente l’embrione in goccia di PBS Ca<++>free BSA per liberare l’ICM e disgregarla ed i frammenti così ottenuti si seminano su feeder layer, mettendo in incubazione a 37°C 5% CO2per circa 7 gg) o semplicemente mediante tecniche di microchirurgia embrionale (splitting, microbiopsia: ciascun embrione viene posto individualmente in una goccia di PBS Ca<++>free senza BSA per evitare lo scivolamento durante la manipolazione, e viene tagliato con una microlama mediante un movimento verticale eseguito sotto un microscopio invertito [Labovert] usando un micromanipolatore [Leitz Labovert, Heidelberg]). Le cellule così ottenute vengono coltivate per 5-15 giorni su un monostrato cellulare e con un terreno specifico (vedi Dattena et al., 2005, pagina 2, paragrafo “Cell line isolation and culture”, seconda colonna: DMEM high glucose supplementato con 2 mM L-glutamina, 1 mM Na-Piruvato, 0.1 mM 2β-mercaptoetanolo, 0.1 mM di amminoacidi non essenziali, 10 ng/ml di LIF, 10<3>unità internazionali/ml di penicillina, 10 µg/ml di streptomicina). Tali cellule, prima di essere utilizzate, devono essere isolate dal monostrato cellulare nutriente nella seguente maniera: si contano le colonie presenti in ciascun pozzetto, si elimina il medium di coltura dal pozzetto, si lava la colonia desiderata con PBS Ca<++>free, si mettono 200 µl di tripsina/EDTA e si incuba a 37°C per 1-2 min; si isola la colonia col puntale e la si porta su goccia di PBS Ca<++>free siero; si spipetta per alcuni secondi (per ripulire la colonia dai fibroblasti) e si mette la colonia in una provetta da 1 ml con 500 µl di tripsina (0.25%); si incuba a 37°C per 2 min, si centrifuga a 27°C a 5500 g per 3 min, si elimina il surnatante e si risospende in 500 µl di DMEM. Infine si contano le cellule.
Come sopra indicato, nella realizzazione del metodo della presente invenzione, è possibile prelevare, dagli embrioni allo stadio di blastocisti che si ottengono alla fine del punto b., delle cellule dal bottone embrionale, se vengono prelevate la maggior parte delle cellule si ha un prelievo che porta alla distruzione dell’embrione. Volendo salvaguardare l’embrione, si possono prelevare comunque delle cellule di interesse (e cioè cellule staminali dal bottone embrionale), senza danneggiare l’embrione, effettuando una microbiopsia in cui vengono asportate tra le 5 e le 30 cellule circa tenendo presente che il bottone embrionale normalmente presenta tra le 40 e le 90 cellule, quindi potranno essere prelevate cellule in un numero compreso tra 5 e 30 (ciascun valore intero compreso nell’intervallo e ciascun valore che determina l’intervallo è da considerarsi come indicato puntualmente e come valore da cui è possibile determinare un qualsiasi intervallo es, 5, 6, 7, 8 eccetera fino a 30, che può indicare il numero di cellule che possono essere prelevate senza la distruzione dell’embrione così come rientra nella descrizione qualsiasi intervallo tra due numeri interi compresi tra 5 e 30).
Un esempio non limitativo di come possono essere prelevate le cellule con distruzione dell’embrione è il seguente: previa rimozione della zona pellucida mediante trattamento con pronase (3 mg/ml), gli embrioni, numericamente identificati, sono stati sottoposti ad immunosurgery, mediante lisi delle cellule trofoblastiche mediata da complemento, al fine di isolare la massa cellulare interna (Inner Cell Mass: ICM). Ciascuna ICM, identificata numericamente, è stata disaggregata con un capillare di vetro in gruppi di poche cellule prima di essere messa in coltura, in pozzi distinti e numerati, per 5-6 giorni secondo il metodo descritto da Dattena et al. (2005; Isolation, culture and characterization of embryonic cell lines from vitrified sheep blastocysts. Mol Reprod Dev 73 (suppl 1): 31-39. Pagina 2, paragrafo “Cell line isolation and culture”, seconda colonna, righe ~17-33).. Altro metodo per l’isolamento delle cellule senza distruggere l’embrione è quello dell’utilizzo di tecniche di microchirurgia embrionale (splitting, microbiopsia): ciascun embrione viene posto individualmente in una goccia di PBS Ca<++>free senza BSA per evitare lo scivolamento durante la manipolazione, e viene tagliato con una microlama mediante un movimento verticale eseguito sotto un microscopio invertito (Labovert) usando un micromanipolatore (Leitz Labovert, Heidelberg).
Le cellule ottenute secondo il metodo dell’invenzione, possono essere utilizzate come farmaco o per produrre un farmaco per la rigenerazione di tessuti con eventuale miscelazione con eccipienti idonei senza che sia necessaria l’aggiunta di sostanze che stimolino il differenziamento cellulare delle cellule dell’invenzione nelle cellule differenziate da rigenerare. Le cellule possono essere utilizzate fresche o dopo congelamento (Tripsinizzare le cellule formanti la colonia, centrifugare 200 g 5 min 20°C, risospendere il pellet in un volume di medium proporzionato alle dimensioni del pellet e fare la conta delle cells. Centrifugare nuovamente a 200 g 7-10 min RT, eliminare il surnatante, risospendere bene il pellet nel residuo di medium e poi aggiungere, goccia a goccia, il medium di congelamento (40% DMEM HG 50% FBS 10% DMSO) raggiungendo la concentrazione cellulare voluta. Mettere la sospensione cellulare in una criovial previamente messa in ghiaccio e stoccare o/n a -80°C. Il giorno dopo immergere in azoto liquido), il congelamento può anche essere effettuato sulla composizione farmaceutica finale da utilizzare. In accordo con quanto indicato sopra, si fa riferimento a composizioni per uso veterinario non per limiti tecnici di dette composizioni (che possono agire benissimo anche sull’uomo) ma per barriere etiche attualmente presenti. Inoltre, il metodo qui descritto può ulteriormente comprendere, dopo il punto b. un punto b’, in cui dette blastocisti vengono congelate e così conservate fino ad un successivo punto b’’, in cui dette blastocisti congelate vengono scongelate ed utilizzate come al punto c. sopra descritto.
Come precedentemente indicato, infatti, gli embrioni possono essere congelati e possono essere riutilizzati in seguito per il prelievo delle cellule per la realizzazione delle linee dell’invenzione.
Un esempio non limitativo di come possono essere congelati gli embrioni secondo il punto b’ del metodo qui descritto è indicato nel lavoro descritto da Dattena et al. del 2006 (Dattena et al., 2006 “Lambing rate of vitrified blastocysts is improved by embryo culture with BSA and Hyaluronan” Mol Reprod Dev 74, pagina 43, seconda colonna, paragrafo “vitrification and warming”). In sostanza, le blastocisti ottenute possono essere congelate mediante immersione per un periodo di circa 5 minuti in una prima soluzione di equilibrazione contenente glicole etilenico e DMSO al 10% e, di seguito, per meno di 45 sec in una seconda soluzione contenente glicole etilenico e DMSO al 20% più saccarosio 0.5 M. Immediatamente dopo, le blastocisti si inseriscono in paillettes aperte (open pulled straws) ed si immergono in azoto liquido.
Al punto b’’, l’embrione allo stadio di blastocisti congelato, può essere scongelato e messo in coltura per circa 24 ore, prima di procedere come al punto c. del metodo sopra indicato. Per lo scongelamento si può allestire sul coperchio di una piastra di Petri, 2 gocce da ≈ 100 μl di soluzione di H-TCM 199 saccarosio 0.5 M ed una di medium di lavaggio (H-TCM 0.4% BSA). Prelevare la paillette da scongelare dall’azoto liquido, mantenerla a temperatura ambiente per 6’’ ed immergerla in una soluzione di H-TCM 199 0.4% BSA saccarosio 0.5 M posta in una provetta immersa in un bagnetto a 37°C, che salirà per capillarità all’interno della paillette stessa. Svuotare il contenuto della paillette nella soluzione di saccarosio 0.5 M allestita sul coperchio della Petri ed attendere 5’. Passare, quindi, le blastocisti nel medium di lavaggio, mantenendole per ≈ 30’’ e trasferirle in una piastra di Petri, poggiata su un piano riscaldato, contenente H-TCM 0.4% BSA. In tale medium gli embrioni verranno messi in incubazione a 39°C in atmosfera umidificata al 5% di CO2per 24 h. Solo le blastocisti che si riespanderanno saranno impiegate per la produzione delle linee cellulari embrionali.
Le linee cellulari secondo la descrizione, quindi, sono utilizzabili per la preparazione di un farmaco veterinario per la cura ortopedica di lesioni e/o patologie articolari. Il farmaco veterinario potrà essere realizzato in forma collosa (in modo da riempire lesioni articolari come negli esempi) o anche essere realizzato in forma di supporto biocompatibile comprendente le linee cellulari dell’invenzione da applicare nel punto articolare leso per permettere la divisione e differenziazione delle linee cellulari dell’invenzione. Data la scarsa rigenerazione del tessuto cartilagineo, il farmaco o le cellule dell’invenzione potranno essere utilizzate in particolare per la cura di lesioni e/o patologie articolari a carico del tessuto cartilagineo.
Secondo una forma di realizzazione, detta cura ortopedica può essere effettuata impiantando nella lesione cartilaginea un quantitativo idoneo di una composizione comprendente le linee cellulari dell’invenzione fibrinogeno e trombina o altri composti idonei alla formazione di uno scheletro (scaffold) che mantenga le cellule dell’invenzione nella posizione desiderata in un paziente che lo necessiti.
Alternativamente, come già accennato, possono essere realizzati supporti biocompatibili per impianti ortopedici come già noti ed utilizzati nello stato della tecnica attuale (da cui l’esperto del settore potrà facilmente identificare quale supporto è il più idoneo) comprendenti le linee cellulari secondo l’invenzione e come definite in una qualsiasi delle rivendicazioni su dette linee cellulari. Come già anticipato l’uso delle linee cellulari dell’invenzione per la realizzazione di un supporto biocompatibile per impianto ortopedico può essere volto alla realizzazione di un supporto per la cura di lesioni e/o patologie articolari a carico del tessuto cartilagineo.
Il metodo terapeutico che utilizza le linee cellulari dell’invenzione, come definite dalle rivendicazioni, è anch’esso oggetto dell’invenzione e gli autori si riservano il diritto di rivendicarlo nei paesi che consentono la brevettazione di metodi terapeutici.
Secondo l’invenzione, il metodo terapeutico potrà essere effettuato su di un paziente che lo necessiti. Ove eticamente accettabile il paziente è un mammifero incluso l’uomo, altrimenti il paziente sarà ristretto ad un mammifero escluso l’uomo, se eticamente non accettabile detto mammifero è limitato ad un mammifero escluso l’uomo, dove questo mammifero potrà essere un mammifero qualsiasi escluso l’uomo. In una forma di realizzazione tale mammifero potrà essere un animale da allevamento, da competizione (ad esempio) sportiva, estetica, di lavoro, un animale da compagnia, un animale a rischio di estinzione eccetera. Tra questi è possibile indicare animali (bovini, suini, ovini, caprini, equini, canidi, gatti, conigli eccetera) da competizione per conferire pregio all’allevamento (produzione, estetica ed altro), animali da competizione sportiva, in particolar modo cani cavalli e poney, animali da competizione da lavoro (ad esempio cani da lavoro, cani che effettuano prove di agility eccetera) animali da compagnia, ad esempio cani, gatti eccetera.
Il metodo terapeutico secondo la presente invenzione prevede l’innesto di un numero adeguato di cellule appartenenti alle linee cellulari dell’invenzione nel sito in cui è necessaria la rigenerazione del tessuto. Ad esempio, le linee cellulari dell’invenzione possono essere utilizzate in un metodo terapeutico per la cura di lesioni articolari. Cellule appartenenti alle linee cellulari dell’invenzione potranno essere innestate, eventualmente mescolate con materiali collosi idonei che ne impediscano il libero movimento una volta innestate nel sito articolare desiderato, come ad esempio miscelate a colla di fibrina o a sostanze analoghe oppure ponendole su di un adeguato supporto ortopedico biocompatibile secondo gli insegnamenti noti nello stato della tecnica come descritto, ad esempio in Freed LE et Al. (J Cell Biochem. 1993 Mar;51(3):257-64) ed in molte altre pubblicazioni e brevetti noti al tecnico del settore.
ESEMPI
Esempio 1.
Produzione in vitro, congelamento e scongelamento di embrioni ovini.
Circa 100 embrioni allo stadio di blastocisti (6-7 giorni) sono stati prodotti mediante maturazione in vitro di ovociti e loro successiva fertilizzazione, coltura e congelamento come descritto da Dattena et al. (2006). In breve, gli ovociti, provenienti da ovaie di pecore regolarmente macellate, sono stati incubati in un medium di maturazione composto da TCM199 con 4 mg/ml di BSA, 100 mM di cisteamina ed 1 mg/ml di estradiolo-17b più 0.1 UI/ml r-FSH e 5 mg/ml LH (gonadotropine ipofisarie). Dopo fertilizzazione in vitro con seme fresco di ariete, i potenziali zigoti sono stati coltivati in vitro per 6-7 giorni. Le blastocisti così ottenute sono state vitrificate immergendole per 5 minuti in una prima soluzione di vitrificazione contenente glicole etilenico e DMSO al 10% e, di seguito, per meno di 45 sec in una seconda soluzione contenente glicole etilenico e DMSO al 20% più saccarosio 0.5 M. Immediatamente dopo, le blastocisti sono state inserite in paillettes aperte (open pulled straws) ed immerse in azoto liquido. Allo scongelamento, gli embrioni vengono posti in una piastra di Petri contenente H-TCM 0.4% BSA. In tale medium gli embrioni vengono messi in incubazione a 39°C in atmosfera umidificata al 5% di CO2per 24 h.
Per la produzione di linee cellulari embrionali (ES-like) sono stati selezionati solo gli embrioni riespansi. Essendo stata impiegata la sequenza del gene Y come marcatore per rilevare la presenza delle cellule di origine embrionale nel tessuto in via di riparazione, tra gli embrioni selezionati sono stati impiegati per l’impianto solo quelli maschi.
Esempio 2.
Isolamento di linee cellulari embrionali (ES-like), loro coltura, sessaggio e caratterizzazione.
Isolamento e coltura: previa rimozione della zona pellucida mediante trattamento con pronase (3 mg/ml), gli embrioni, numericamente identificati, sono stati sottoposti ad immunosurgery, mediante lisi delle cellule trofoblastiche mediata da complemento, al fine di isolare la massa cellulare interna (Inner Cell Mass: ICM). Ciascuna ICM, identificata numericamente, è stata disaggregata con un capillare di vetro in gruppi di poche cellule prima di essere messa in coltura, in pozzi distinti e numerati, per 5-6 giorni secondo il metodo descritto da Dattena et al. (2005).
Sessaggio degli embrioni : per evitare lo spreco di ICMs, il sessaggio è stato eseguito sulle cellule trofoblastiche scartate durante l’immunosurgery di ciascun embrione previamente identificato. La duplex PCR è stata eseguita secondo il protocollo di Mara et al. (2004). In breve, sono state usate 2 coppie di primers: la prima riconosce la sequenza di DNA Ovis aries Y chromosome repeat region OY 11.1 (SRY: sex determining region Y-linked gene sequence) e produce una banda di 301 paia di basi nei campioni di sesso maschile, mentre la seconda, usata come controllo positivo della reazione, riconosce la sequenza autosomica Sheep satellite 1114 DNA repeat unit e produce una banda di 216 paia di basi sia nei campioni di sesso maschile che femminile. La sequenza dei primers impiegati è riportata nella tabella 1 sotto riportata Tabella 1. Primers usati nella PCR per il test sul sessaggio
Caratterizzazione: le colonie di ES-like di sesso femminile sono state impiegate per la caratterizzazione mediante il rilevamento degli antigeni di superficie specifici dello stadio di staminalità, secondo il metodo di Dattena et al. (2005). In breve, le colonie di ES-like sono state lavate con PBS e fissate con metanolo glaciale per 5 minuti a – 20°C, sciacquate con PBS e lasciate per 1 h a temperatura ambiente in una soluzione di bloccaggio composta da PBS con il 2% di BSA. La presenza degli antigeni relativi allo stadio di staminalità SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4 (Stage Specific Embryonic Antigens-1, -3, -4) e di quelli relativi all’inizio della differenziazione verso il mesoderma precoce, la miosina embrionale e le cellule precursori del tessuto nervoso è stata investigata mediante l’impiego di anticorpi monoclonali forniti dalla Developmental Studies Hybridoma Bank, (University of Iowa, Iowa City, IA) alla diluizione di 1:100. Per rilevare i complessi antigene/anticorpo è stato utilizzato un anticorpo secondario biotinilato alla diluizione di 1:500 unitamente ad un complesso extra-avidinaperossidasi, secondo le procedure indicate dalla ditta produttrice. Gli antigeni ed i loro corrispondenti anticorpi sono elencati nella tabella 2.
Tabella 2. Caratterizzazione delle colonie ES-like mediante analisi immunocitochimica: antigeni e corrispondenti anticorpi impiegati e risultati ottenuti.
Come metodo di rivelazione sono state impiegate le soluzioni cromogene 3,3-diaminobenzidina (DAB/Metal; DAB-Pierce) e 3-amino-9-carbazolo etilenico (AEC; Lab Vision) secondo le istruzioni della ditta produttrice.
Esempio 3.
Preparazione dell’impianto
Per ciascun impianto 2-3 colonie di ES-like sono state isolate dal feeder layer e raggruppate insieme prima di essere sottoposte a disaggregazione mediante tripsina allo 0.05% EDTA allo 0.02% e spipettamento vigoroso. Dopo la risospensione in 500 µl di DMEM, le cellule così disaggregate sono state contate in una Camera di Thoma e centrifugate a 5500 g per 3 minuti a temperatura ambiente. Circa 500.000-750.000 cellule sono state incluse in 60 µl di una miscela composta da fibrinogeno e trombina in parti uguali (colla di fibrina) per essere impiantate nella lesione cartilaginea.
Esempio 4
Intervento chirurgico.
L’approvazione per la prova clinica è stata ottenuta dal Comitato per il Benessere Animale e tutte le procedure seguite erano conformi alle direttive dell’Istituto Nazionale della Salute per la protezione degli animali da laboratorio.
Quattordici pecore adulte sarde del peso di circa 45 kg sono state utilizzate per la sperimentazione. Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite sotto sedazione (diazepam: 0,4 mg/kg di peso vivo) ed anestesia epidurale (lidocaina al 2%: 1 ml/10 kg). Con l’animale in decubito dorsale, l’articolazione del ginocchio è stata preparata sterilmente prima di eseguire un’artrotomia mediante approccio antero-laterale. La patella è stata dislocata medialmente per esporre la troclea. Usando un perforatore dermico (punch) ed una fresa, è stato creata una lesione osteocondrale di 6 mm di diametro e 2 mm di profondità sul condilo mediale del ginocchio sinistro, nella quale è stato inserito l’impianto composto da miscela di fibrinogeno e trombina contenente circa 500.000-750.000 ES-like, che si è polimerizzato in situ attraverso l’attivazione della trombina mediata dal calcio, formando in tal modo un coagulo di fibrina avente una superficie liscia approssimativamente allo stesso livello della superficie della cartilagine adiacente. Come controlli sono state create 2 lesioni identiche alla precedente in entrambi i condili del ginocchio destro della stessa pecora: quella mediale è stata lasciata vuota (empty defect: ED) mentre la laterale è stata riempita con la miscela di fibrinogeno e trombina senza cellule (glue: G). Quindi la patella è stata ricollocata nella sua posizione originaria e l’articolazione è stata chiusa con filo Vicryl 0 usando una sutura semplice a punti staccati. Tutti gli animali hanno ricevuto un trattamento antibiotico (40 mg/kg/die di amoxicillina e 2 mg/kg/die di ketoprofene intramuscolo) nei 5 giorni successivi all’intervento e sono stati confinati in un’area ristretta per 10 giorni. Quindi sono stati immessi al pascolo libero fino all’eutanasia.
Esempio 5
Valutazione macroscopica e prelievo dei campioni di tessuto neoformato.
Le pecore sono state soppresse mediante eutanasia ad 1, 2, 6 e 12 mesi dall’intervento e le articolazioni femoro-tibio-rotulee di ogni animale sono state aperte e fotografate. Il tessuto di riparazione neoformato è stato esaminato da 2 osservatori mediante il metodo del doppio cieco, applicando un sistema di punteggio semiquantitativo (tabella 3) e facendo una media dei valori assegnati da ciascun osservatore.
Tabella 3. Punteggio semi-quantitativo per la valutazione macroscopica della riparazione delle lesioni cartilaginee a 1, 2, 6 e 12 mesi dopo l’intervento (9 = migliore; 0 = peggiore).
Successivamente sono stati effettuati i prelievi del tessuto neoformato, asportando dei blocchi, costituiti da cartilagine ed osso subcondrale, delle dimensioni di 17 mm di larghezza, 10-15 mm di profondità ed estendentisi 4-5 mm oltre i margini dell’impianto. I prelievi sono stati fissati in formalina al 10% per 2 giorni prima di essere sottoposti alle analisi istologiche, immunoistochimiche e di ibridazione in situ (ISH).
Esempio 6
Istologia ed immunoistochimica.
Dopo la fissazione, i campioni sono stati immersi in una soluzione decalcificante (acido citrico acido formico in rapporto di 1:1), disidratati in alcool, inclusi in paraffina e sezionati sagittalmente per ottenere delle fette di 5 µm di spessore. Per prevenire la fluttuazione dell’intensità della colorazione tra diversi esperimenti, tutti i vetrini oggetto della valutazione sono stati colorati lo stesso giorno in un’unica procedura. Le sezioni sono state colorate con ematossilina-eosina per valutare la morfologia generale del tessuto e con le colorazioni di Azan-Mallory e Safranina/O per rilevare, rispettivamente, la distribuzione del collagene e dei proteoglicani nella matrice cartilaginea. I vetrini sono stati esaminati da 2 osservatori mediante il metodo del doppio cieco ed applicando un sistema di punteggio graduale derivato da Caplan (Caplan et. al., 1997) (tabella 4).
Tabella 4 Sistema di punteggio per la valutazione microscopica della riparazione delle lesioni cartilaginee a 1, 2, 6 e 12 mesi dopo l’intervento (da Caplan, modificato).
Anche in questo caso è stata eseguita una media dei punteggi assegnati da ciascun osservatore per ottenere un punteggio finale relativo al grado di guarigione, in cui 56 indicava la completa restitutio ad integrum del tessuto. Inoltre, sono stati calcolati dei punteggi parziali relativi alle singole categorie istologiche considerate.
La colorazione immunoistochimica per il rilevamento del collagene di tipo II è stata eseguita, previa digestione con proteasi K per 60 minuti a 37°C, mediante trattamento con Endo/Blocker (Biomeda M69) per 5 minuti a temperatura ambiente, lavaggio con Automation Buffer 1X (Biomeda M30) ed incubazione per 5 minuti con Tissue Blocker (LAB/Probe Kit, Biomeda 10-102). L’anticorpo primario per il collagene di tipo II è stato diluito 1:20 col buffer di diluizione (Biomeda M35) e lasciato agire tutta la notte a 4°C, seguito dall’incubazione con l’anticorpo secondario biotinilato per 45 min. Dopo lavaggio con Automation Buffer1X ed incubazione per 15 minuti con 2 gocce di reagente 2- perossidasi (LAB/Probe Kit, Biomeda 10-102), la colorazione è stata ottenuta col reagente 3-cromogeno (LAB/Probe Kit, Biomeda 10-102) e, quando completata, è stata bloccata mediante lavaggio in acqua corrente. Le sezioni sono state contrastate con ematossilina ed esaminate al microscopio ottico per valutare la distribuzione del collagene di tipo II. I campioni di controllo derivavano dalla troclea di ginocchia di pecora, usando la porzione cartilaginea come controllo positivo e l’osso spugnoso come controllo negativo.
Esempio 7.
Rilevamento delle ES-like nel tessuto di riparazione mediante ibridazione in situ (ISH)
Per rilevare le ES-like nel tessuto di riparazione è stata usata la sequenza di DNA Ovis aries Y chromosome repeat region OY 11.1 come marcatore e la sua presenza è stata determinata mediante ISH. Per ciascun periodo considerato è stato analizzato un solo campione. I campioni sono stati processati secondo il metodo di Mara et..al. (2004) e Sanna et al. (2007): le sezioni di 7 μm montate su vetrini per capillarità sono state sparaffinate, reidratate, permeabilizzate con proteasi K, fissate in paraformaldeide al 4%, acetilate con trietanolamina 0.1 M ed anidride acetica allo 0.25% e sottoposte a pre-ibridazione mediante incubazione con il 50% di soluzione d’ibridazione 2X (SSPE 10X, DNA di sperma di salmone 200 µg/ml, 2X di soluzione di Denhardt's) ed il 49% di formamide per 2h a 38°C. L’ibridazione è stata eseguita usando le sonde SRY15’-DIG CTCAGCAAAGCACACCAGAC-3’ (seq id no. 1) 1 µM e SRY2 5’-DIG GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3’ (seq id no 2) 1 µM, costruite sui primers per la sequenza di DNA Ovis aries Y chromosome repeat region OY 11.1 (Mara et al., 2004), che sono state applicate sui vetrini per tutta la notte a 38°C. Dopo lavaggio e blocco delle fosfatasi endogene, la rivelazione è stata eseguita con il sistema immunoenzimatico digossigenina-NBT/BCIP, seguita dal montaggio dei vetrini in medium acquoso. Tutti i vetrini sono stati processati insieme e, come controllo negativo, è stata inserita la sezione di una troclea di un ginocchio normale di pecora.
Esempio 8.
Valutazione macroscopica
Per l’esperimento sono state impiegate quattordici pecore: 2 nel gruppo sacrificato ad 1 mese dall’intervento e 4 rispettivamente nei gruppi sacrificati a 2, 6 e 12 mesi dall’intervento. I dati raccolti dal gruppo di 1 mese sono stati esclusi dall’analisi statistica in quanto una pecora ha subito la dislocazione della patella che non è stato possibile risolvere. In una pecora del gruppo a 2 mesi gli impianti sono fuoriusciti dalla lesione, rendendo i campioni provenienti da questo animale non utilizzabili per il calcolo statistico. Nel gruppo a 6 mesi una pecora ha presentato un’artrite settica preesistente nel ginocchio destro e, per questa ragione, è stata esclusa dal calcolo statistico. In definitiva, l’analisi statistica è stata eseguita su 10 pecore, e precisamente: 3 campioni (ES-like, ED and G) da ciascuna delle 3 pecore dei gruppi a 2 ed a 6 mesi e 3 campioni da ciascuna delle 4 pecore del gruppo a 12 mesi.
Il punteggio graduale per la valutazione macroscopica di tutti i campioni (ES-like, ED and G) a 2, 6 e 12 mesi dall’intervento non ha mostrato differenze statisticamente significative, benché l’impianto con cellule embrionali (ES-like) abbia mostrato una riparazione migliore rispetto ai controlli a 6 e 12 mesi (tabella 5).
Tabella 5. Risultati del punteggio attribuito mediante la valutazione macroscopica dei trattamenti con linee cellulari embrionali (ES-like), lesione vuota (ED) e con solo colla di fibrina (G) a 2, 6 e 12 mesi dall’intervento (10 pecore). Il punteggio massimo equivale a 9; quello minimo equivale a 0. A 2 e 6 mesi sono stati analizzati 3 campioni per trattamento, a 12 mesi sono stati analizzati 4 campioni per trattamento.
Come presupposto, un graduale aumento nel processo di guarigione è stato osservato a partire dai 2 mesi fino ai 12 in tutti i campioni. Ad 1 mese le lesioni contenevano un tessuto rosso e morbido riferibile a tessuto di granulazione. La mancanza di continuità tra tessuto neoformato e tessuto ospite era ancora presente in tutti i campioni, sebbene quelli con le ES-like mostrassero una migliore organizzazione tessutale (fig.1 a, e, i). A 2 mesi il tessuto di riparazione appariva bianco, traslucido e liscio, simile a tessuto fibroso, con un parziale riempimento della cavità ed un’iniziale integrazione col tessuto ospite sia nell’impianto ES-like che nei controlli (fig.1 b, f, l). A 6 mesi il tessuto di riparazione mostrava un aspetto bianco-opaco e liscio, simile a cartilagine. Come presupposto, le cavità risultavano maggiormente riempite ed i margini erano meglio integrati col tessuto ospite. Tale tendenza era maggiormente evidente nell’impianto ES-like (fig. 1 c, g, m). A 12 mesi il tessuto di riparazione risultava molto simile alla cartilagine: la cavità era quasi completamente riempita e l’integrazione ospite-impianto era talvolta notevole (fig. 1 d, h, n). di nuovo, gli impianti ES-like hanno raggiunto il punteggio più elevato. Inoltre, un campione ES-like era quasi perfettamente guarito, mostrando un aspetto simile alla cartilagine ialina (fig. 1 d) e ricevendo il punteggio maggiore (9).
Esempio 9.
Valutazione istologica ed immunoistochimica
L’analisi statistica dei dati, utilizzante il modello dei minimi quadrati medi (least square means), applicata sia sul punteggio totale che su quello riferito alle singole categorie istologiche, non ha mostrato differenze statistiche significative tra i trattamenti nell’ambito di ciascun periodo, similmente ai risultati scaturiti dalla valutazione macroscopica. E’ stata osservata una graduale progressione del processo di guarigione dai 2 ai 12 mesi e gli impianti EC sono apparsi leggermente meglio riparati fin dal secondo mese rispetto ai controlli (tabella 6).
Tabella 6. Risultati del punteggio totale attribuito mediante la valutazione istologica ed immunoistologica dei trattamenti con linee cellulari embrionali (ES-like), lesione vuota (ED) e con colla di fibrina (G) a
2, 6 e 12 mesi dall’intervento (10 pecore). Il punteggio massimo equivale a 56, quello minimo equivale a 4. A 2 e 6 mesi sono stati analizzati 3 campioni per trattamento, a 12 mesi sono stati analizzati 4 campioni per trattamento.
Ad 1 mese le lesioni erano riempite con tessuto di granulazione in tutti i campioni (fig 2 a, e, i) e, come presupposto, non si rilevava alcuna positività con la colorazione per il collagene di tipo II (fig 2 b, f, l). Tuttavia, gli impianti EC apparivano riempire meglio la cavità ed avevano una superficie più regolare rispetto ai controlli. A 2 mesi tutte le
lesioni erano riempite con tessuto fibroso e fibrocartilagine in superficie mentre alla base era presente un processo di ossificazione endocondrale positivo per il collagene di tipo II. Gli impianti EC mostravano un processo di ossificazione più avanzato rispetto 5 ai controlli (tabella 7).
Tabella 7. Risultati del punteggio istologico e immunoistologico relativo ad alcune categorie istologiche ed immunoistologiche attribuito ai trattamenti con linee cellulari embrionali (ES-like), lesione vuota (ED) e con colla di fibrina (G) a 2, 6 e 12 mesi dall’intervento. I valori dei punteggi massimi e minimi attribuiti per le varie categorie sono i seguenti: Cartilagine: 12-1; Osso: 8-0; Margini: 140-0; Degenerazione: 12-3;caratteristiche colorimetriche della matrice cartilaginea: 10-0. A 2 e 6 mesi sono stati analizzati 3 campioni per trattamento, a 12 mesi sono stati analizzati 4 campioni per trattamento.
atric Tratt
ea
8 E
0,8
6,7
±
0,8
7,5 0,8
A 6 mesi nella zona superficiale era presente fibrocartilagine mentre alla base della 15 lesione si osservava la concomitanza del processo di ossificazione endocondrale unitamente ad osso immaturo. La positività per il collagene di tipo II era presente in tutto il tessuto neoformato. In questo gruppo sia gli impianti EC che i controlli ED hanno ottenuto un identico punteggio mentre i controlli G hanno raggiunto un punteggio inferiore. (tabella 6). Gli impianti EC hanno mostrato un punteggio più 20 elevato relativamente alla colorazione della matrice, oltrechè minore degenerazione e maggiore produzione di osso (tabella 7). A 12 mesi tutte le lesioni erano completamente riempite, la maggior parte di esse con cartilagine ialina immatura (distinguibile per le fibre collagene ancora visibili) nella porzione superficiale e con osso immaturo e maturo nella base (fig. 2 c, g, m). La cartilagine era positiva per il
25 collagene di tipo II in tutti i campioni (fig. 2 d, h, n). In generale, il punteggio istologico
totale e quello parziale riferito ad alcune categorie istologiche selezionate è risultato
più elevato negli impianti EC rispetto ai controlli (tabelle 6 e 7). Inoltre, in un impianto EC è stata riscontrata la presenza di cartilagine ialina matura (fig 3).
Esempio 10
Ibridazione in situ (ISH)
Tutti i campioni testati con l’ISH sono risultati postivi per il marker delle EC, dimostrando che il tessuto neoformato derivava dalle cellule embrionali impiantate (fig.
4 a, b, c). La troclea di un ginocchio di pecora, usata come controllo negativo, non ha mostrato alcun segnale (fig.4 d). Inoltre, l’ISH ha consentito di rilevare che le cellule della regione superficiale della lesione avevano assunto una morfologia similfibroblastica mentre nella porzione profonda assomigliavano a condroblasti (fig 4 a)
Claims (15)
- RIVENDICAZIONI 1. Linee cellulari embrionali di mammifero escluso l’uomo derivate da cellule prelevate da embrioni allo stadio di blastocisti prodotti in vitro freschi o crioconservati come farmaco veterinario per la rigenerazione dei tessuti, detta linea cellulare essendo coltivata per un periodo compreso tra 5 e 15 giorni da detto prelievo.
- 2. Linee cellulari secondo la rivendicazione 1 caratterizzate dal fatto di derivare da cellule prelevate dal bottone embrionale di un embrione allo stadio di blastocisti senza distruzione di detto embrione.
- 3. Linee cellulari secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 2 come farmaco ortopedico per la cura di lesioni e patologie articolari.
- 4. Linee cellulari embrionali secondo la rivendicazione 3 in cui dette lesioni articolari sono lesioni cartilaginee e dette patologie articolari sono patologie che causano lesioni cartilaginee o causate da lesioni cartilaginee.
- 5. Composizione farmaceutica per il trattamento di lesioni articolari comprendente linee cellulari secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, un veicolo farmaceuticamente accettabile e, opzionalmente fibrinogeno e trombina
- 6. Metodo per la preparazione di linee cellulari embrionali in cui: a. vengono prodotti zigoti in vitro; b. detti zigoti vengono messi in coltura in un terreno idoneo per un periodo di 5, 6 o 7 giorni fino ad ottenere delle blastocisti; c. vengono prelevate cellule dal bottone embrionale di dette blastocisti e messe in coltura in terreno idoneo per un periodo compreso tra 5 e 15 giorni.
- 7. Metodo per la preparazione di linee cellulari embrionali in cui: a. vengono prodotti zigoti in vitro; b. detti zigoti vengono messi in coltura in un terreno idoneo per un periodo di 5, 6 o 7 giorni fino ad ottenere delle blastocisti; b’. dette blastocisti vengono crioconservate; b”. dette blastocisti vengono scongelate c. vengono prelevate cellule dal bottone embrionale di dette blastocisti e messe in coltura in terreno idoneo per un periodo di compreso tra 5 e 15 giorni.
- 8. Metodo, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6 o 7, in cui le cellule al punto c. vengono prelevate in un numero compreso tra circa 10 e circa 30 mediante biopsia della massa interna di detta blastocisti senza distruzione dell’embrione.
- 9. Uso di linee cellulari secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 per la preparazione di un farmaco veterinario per la cura ortopedica di lesioni e/o patologie articolari.
- 10. Uso, secondo la rivendicazione 9, in cui dette lesioni e/o patologie articolari sono a carico del tessuto cartilagineo.
- 11. Uso, secondo la rivendicazione 10 in cui detta cura ortopedica viene effettuata impiantando nella lesione cartilaginea un quantitativo idoneo di una composizione comprendente una linea cellulare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, fibrinogeno e trombina in un paziente che lo necessiti.
- 12. Supporto biocompatibile per impianto ortopedico veterinario comprendente la linea cellulare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4.
- 13. Uso di linee cellulari secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 per la preparazione di un supporto biocompatibile per impianto ortopedico veterinario per la cura ortopedica di lesioni e/o patologie articolari.
- 14. Uso, secondo la rivendicazione 13, in cui dette lesioni e/o patologie articolari sono a carico del tessuto cartilagineo.
- 15. Uso, secondo la rivendicazione 14 in cui detta cura ortopedica viene effettuata impiantando nella lesione cartilaginea un supporto biocompatibile per impianto ortopedico comprendente una linea cellulare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in un paziente che lo necessiti.
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