ITRM20080545A1 - Produzione di plastica biodegradabile da olio di brassica carinata ad alto contenuto di acido erucico e da acidi grassi a catena molto lunga. - Google Patents

Description

PRODUZIONE DI PLASTICA BIODEGRADABILE DA OLIO DI BRAS-SICA CARINATA AD ALTO CONTENUTO DI ACIDO ERUCICO E DA

ACIDI GRASSI A CATENA MOLTO LUNGA

La presente invenzione riguarda la produzione di plastica biodegradabile da olio di brassica carinata ad alto contenuto di acido erucico e da acidi grassi a catena molto lunga, specificamente con un numero di atomi di carbonio superiore a venti. Più in particolare, l’invenzione concerne l’uso di acidi grassi a catena molto lunga (“very long chain fatty acids†, VLCFA, aventi catene alifatiche con un numero di atomi di carbonio maggiore di 20), sia come acidi grassi liberi che come trigliceridi (o triacilgliceroli, TAG) costituenti particolari oli vegetali, in particolare l’olio di Brassica carinata ad alto contenuto di acido erucico, per la produzione per via fermentativa di materiali plastici del tipo dei poliesteri batterici, caratterizzati da biodegradabilità e biocompatibilità e con una ampia possibilità di composizione comonomerica e conseguente modulabilità delle proprietà correlate.

Come à ̈ noto, l’agricoltura e le industrie collegate producono frequentemente eccedenze alimentari e sottoprodotti che possono essere usati come substrati a basso costo per processi fermentativi. Una delle possibili applicazioni pratiche di questo concetto sarebbe la produzione di poliesteri batterici per fermentazione da tali substrati, e specificamente la produzione dei polimeri biosintetici genericamente noti come poliidrossialcanoati o PHA.

I PHA sono una famiglia di poliesteri alifatici di 3-idrossiacidi generalmente prodotti in forma di granuli endocellulari, con funzioni di riserva di energia e di carbonio, da un’ampia varietà di batteri in presenza di limitazioni di nutriente e in presenza di fonti di carbonio in eccesso. Tali polimeri possono essere genericamente rappresentati dalla seguente formula generale:

in cui n rappresenta il numero di unità monomeriche e R à ̈ una catena laterale o gruppo pendente in posizione -3, che può essere –CH3o -C2H5nei PHA a catena corta (short chain length PHA o scl-PHA, rappresentati da poliidrossibutirrato – PHB o P3HB – e poliidrossivalerato – PHV o P3HV), o può variare da –C3H7a –C11H23nei medium chain length PHA (mcl-PHA).

In generale, i PHA a catena corta si comportano come polimeri termoplastici semicristallini, e sono comunemente prodotti da microrganismi delle specie Ralstonia eutropha e Alcaligenes latus, mentre i PHA a catena media, tipicamente prodotti da Pseudomonadi fluorescenti (come P. aeruginosa e P. oleovorans), sono più amorfi rispetto agli scl-PHA ed esibiscono proprietà elastomeriche dipendenti dalla composizione della catena laterale.

Come descritto, ad esempio, nella domanda di brevetto internazionale pubbl. No. WO 01/55436 (Procter & Gamble) la produzione di poliidrossialcanoati che includano una quota rilevante di monomeri 3-idrossiacilici a catena media (mcl-PHA) rappresenta un obiettivo tecnologicamente interessante, sia per il miglioramento di proprietà meccaniche come flessibilità e resistenza all’impatto che in termini di stampabilità del materiale, che viene ostacolata da temperature di fusione troppo elevate. Per tale motivo, il documento descritto propone per i PHA oggetto dello studio composizioni comonomeriche in cui i monomeri presenti in massima quota sono, oltre al 3-idrossibutirrato, il 3-idrossieptanoato e il 3-idrossiottanoato.

Mentre i substrati tradizionalmente e comunemente usati come fonti di carbonio per la produzione per via fermentativa dei PHA sono il glucosio e diversi carboidrati, gli acidi grassi ottenibili dai triacilgliceroli (TAG) han no anche attratto l’attenzione dei ricercatori perché sembrano essere un substrato fermentativo migliore da un punto di vista energetico rispetto ai carboidrati. Inoltre, à ̈ da tenere presente che i triacilgliceroli sono materiali rinnovabili. Per scopi fermentativi à ̈ auspicabile usare direttamente le materie prime in forma di trigliceridi come substrati piuttosto che gli acidi grassi corrispondenti, che debbono essere ottenuti preventivamente attraverso uno step addizionale di saponificazione.

Come notato, una economia nel processo fermentativo per la produzione di PHA potrebbe derivare dall’uso delle riserve alimentari ottenute a basso costo dall’agricoltura, tenendo conto del fatto che per la produzione mediante fermentazione di prodotti “bio-based†il costo del substrato contribuisce sul costo totale intorno al 28-50% (Lee, S. Y.; Choy J-I. Polym. Degrad. Stab. 1998, 59, 387-393; Braunegg, G.; Bona, R.; Koller, M.; Polimer-plastics Technol. Eng.2004, 43, 1779-1793). Conseguentemente, l’attenzione della ricerca à ̈ sempre di più concentrata su materie prime fermentabili poco costose da utilizzare come substrati per la produzione di PHA, come grassi, oli, melasse, siero.

Il primo report di produzione di poli(3-idrossibutirrato-co-3-idrossiesanoato) (P3HB-co-3HHx) da olio di oliva tal quale (costituito, come noto, principalmente da acido oleico, un acido grasso monoinsaturo con 18 atomi di carbonio, C18:1) per mezzo di Aeromonas caviae apparve nei primi anni 1990 (Shimamura, E.; Kasuya, K.; Kobayashi, G.; Shiotani, T.; Shima, Y.; Doi, Y. Macromlecules 1994, 27, 878-880). Successivamente Fukui e Doi dimostrarono l’uso dell’olio di oliva, dell’olio di granoturco (ricco principalmente in TAG dell’acido linoleico, un acido grasso diinsaturo: C18:2) e dell’olio di palma (ricco in TAG di acido palmitico, un acido grasso saturo: C12:0, oltre che di acido oleico) per produrre poliidrossibutirrato (P3HB) e P(3HB-co-3HHx) da Ralstonia eutropha (Fukui, T.; Doi, Y. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998, 49, 333-336).

Successivamente à ̈ comparso in letteratura l’utilizzo di olio di soia (ricco principalmente in trigliceridi degli acidi linoleico e oleico) con Aeromonas caviae (Kahar, P.; Tsuye, T.; Taguchi, K.; Doi, Y. Polym. Degrad. Stab. 2004, 83, 79-86), e poi Loo et al. hanno studiato la possibilità di ottenere scl-PHA da R. eutropha modificata utilizzando olio di palma grezzo e olio di palma acido (Loo, C-Y.; Lee, W-H.; Tsuye, T.; Doi, Y. ; Sudesh, K. Biotechnol. Lett.2005, 27, 1405-1410).

Cromwick et al. per primi dimostrarono, nel 1996, l’uso di un intatto TAG (tallow o sego, ovvero grasso animale) per la sintesi di mcl-PHA mediante Pseudomonas resinovorans (Cromwick, A-M.; Foglia, T.; Lenz, R. W. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996, 46, 464-469). Successivamente à ̈ stata anche riportata la sintesi di mcl-PHA mediante P. resinovorans con altri oli e grassi, e si à ̈ dimostrato che la composizione delle unità ripetitive del biopolimero riflette la composizione in acidi grassi dell’olio o del grasso utilizzato per la sintesi (Ashby, R. D.; Foglia, T. A. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996, 46, 464-469).

Nella letteratura del settore sono anche presenti studi sulla sintesi di mcl-PHA da glicerolo puro o dai residui di produzione di biodiesel ricco in glicerolo (Ashby, R. D.; Solaiman, D. K. Y.; Foglia, T. A. J. Polym. Environ., 2004, 12, 105-112).

Tenendo conto del fatto che l’uso di prodotti agricoli a basso costo e dei loro sottoprodotti come substrati fermentativi potrebbe migliorare l’economia di produzione dei PHA microbici e che si tratta comunque di risorse rinnovabili, che rendono il processo di produzione delle bioplastiche in questione accettabile da un punto di vista ecologico, i principali ostacoli sono le loro variabili quantità e la presenza di componenti non fermentabili. Questi fattori inevitabilmente influenzano la produttività della fermentazione e la linea di processo. Ad esempio, la fermentazione ad alta densità cellulare, determinante per alte rese di PHA, à ̈ difficile da ottenere con prodotti agricoli e sottoprodotti contenenti concentrazioni diluite di substrati come zuccheri e glicerolo.

In alcuni paesi europei della zona del Mediterraneo, ma anche in alcune regioni d’Italia, e in particolare in Sicilia, à ̈ in via di sperimentazione la produzione, raccolta e spremitura della Brassica carinata, che mira a creare una nuova filiera per la produzione di ecocarburanti (Cardone, M. ; Marroncini, M.; Menini, S.; Rocco, V.; Senatore, A.; Reggiani, M.; Vitolo, S. Biomass and Bioenergy, 2003, 623-636). Si tratta di una pianta della famiglia delle Brassicaceae, una famiglia che comprende piante erbacee a grandi foglie alcune delle quali di vitale importanza per l’economia e l’alimentazione umana, come le varie specie di cavolo (Brassica oleracea) e la colza (Brassica napus). La Brassica carinata o cavolo abissino à ̈ una pianta proveniente dall’altopiano dell’Etiopia che à ̈ stata recentemente introdotta in Sicilia per la produzione di olio per biodiesel a partire dai semi, il maggior componente di tale olio essendo il trigliceride dell’acido erucico, un acido grasso monoinsaturo con 22 atomi di carbonio (C22:1, un omologo superiore dell’acido oleico). La coltivazione di tale pianta, nella fase di sperimentazione, si à ̈ dimostrata una scelta molto valida perché à ̈ adatta ad entrare in rotazione con il grano contribuendo a migliorarne la qualità e il livello proteico, non ruba spazio alla coltivazione alimentare e protegge la fertilità del terreno.

La diffusa ed economica produzione di olio dalla Brassica carinata, destinato in origine alla produzione di biodiesel specialmente per uso agricolo, comporta di conseguenza un’ampia disponibilità di tale materia prima a costi ridotti anche in funzione di ulteriori usi, sia come alternativa che come mezzo di smaltimento delle eccedenze di produzione.

Alla luce di quanto sopra, la presente invenzione si propone lo scopo di fornire una nuova possibilità di utilizzazione produttiva per l’olio di Brassica carinata che, come per il caso del biodiesel, sia indirizzata alla tutela dell’ambiente, fornendo allo stesso tempo prodotti con ampie e molteplici possibilità di utilizzazione. A tale scopo, la presente invenzione propone di utilizzare l’olio di Brassica carinata, o materiali ad esso correlati, come gli acidi grassi liberi ottenibili da tale materia prima, come substrato nutritivo per processi biosintetici appositamente studiati, che diano come risultato la produzione di materiali polimerici biodegradabili e biocompatibili a base di poliidrossialcanoati.

Metodi di sintesi microbiologica di poliesteri del tipo dei PHA a partire da sorgenti di carbonio costituite, in tutto o in parte, da catene alifatiche lunghe, benché meno frequentemente, sono anche descritti nella letteratura brevettuale, ma in generale senza alcun riferimento all’olio di Brassica carinata o ad acidi grassi con un numero di atomi di C pari a 22 o superiori. In particolare, la domanda di brevetto europeo EP 0520405 A2 (Asahi Kasei) descrive un metodo per la produzione di poliesteri microbici che si avvale di microrganismi del genere Alcaligenes e usa come sorgente di carbonio acidi grassi a catena lunga o loro derivati. Analogamente, il brevetto US 5871980 (Naylor et al., cessionaria Monsanto) descrive un processo per la produzione di PHA ad opera di microrganismi del genere Alcaligenes, che utilizza come possibile sorgente di carbonio per la fase di fermentazione e accumulo del PHA un acido alifatico o un composto idrolizzabile a dare tale acido alifatico avente, nella forma più generale, un numero di atomi di C compreso tra 8 e 25, e preferibilmente tra 10 e 22.

Tuttavia, entrambi i documenti citati si riferiscono alla produzione di poliidrossialcanoati a catena corta (scl-PHA), in modo specifico al poli(3-idrossibutirrato) e/o a copolimeri con 3-idrossivalerato (P3HB-co-3HV).

Precedenti studi condotti dal gruppo di ricerca di cui fanno parte gli autori della presente invenzione (Ballistreri, A.; Giuffrida, M.; Guglielmino, S. P. P.; Carnazza, S.; Ferreri, A.; Impallomeni, G. Int. J. Biol. Macromol.

2001, 29, 107-114; Barbuzzi, T.; Giuffrida, M.; Impallomeni, G.; Carnazza, S.; Ferreri, A.; Guglielmino, S. P. P.; Ballistreri, A. Biomacromolecules, 2004, 5, 2469) hanno dimostrato che un microrganismo delle Pseudomonadacee, P. aeruginosa ATCC 27853, à ̈ in grado di utilizzare fonti di carbonio inusuali, quali acidi grassi a catena lunga, con numero di atomi di carbonio superiore a 18, ma hanno anche riportato che la produzione di PHA non si osserva quando la fonte di carbonio à ̈ un acido grasso saturo con un numero di atomi di C pari a 17 o superiore - nel caso di catene con un numero dispari di atomi di C - e pari a 22 o superiore - nel caso di catene con un numero pari di atomi di C. In modo specifico, i lavori citati hanno dimostrato che utilizzando come fonte di carbonio acidi grassi saturi con numero pari di atomi di carbonio, come l’acido ottanoico, decanoico, ecc., la produzione di PHA da parte del microrganismo cresce all’aumentare del numero di atomi di carbonio del substrato, fino all’acido eicosanoico (C20:0), ma con l’acido docosanoico (C22:0) non si ha alcuna produzione.

Nonostante tale precedente risultato à ̈ stato ora trovato, e costituisce pertanto oggetto della presente invenzione, che gli stessi ceppi batterici di Pseudomonas sopra citati sono in grado di crescere e sintetizzare mcl-PHA con buone rese da olio di Brassica carinata che, come à ̈ noto, ha come costituente principale l’acido erucico (C22:1), e sono anche in grado di metabolizzare l’acido erucico in forma di acido libero, con risultati anche migliori in termini di proprietà del polimero risultante. L’invenzione à ̈ anche estesa alla produzione di poliidrossialcanoati a catena media da acido nervonico, che rappresenta l’omologo superiore (C24:1) dell’acido erucico (C22:1), che recentemente à ̈ stato oggetto di numerosi studi perché adoperato con successo per il trattamento di diversi disturbi neurologici come demenza senile, malattia di Alzheimer e sclerosi multipla.

Con riferimento a quest’ultimo materiale di partenza, l’Institute of Plant Biotechnology del Consiglio Nazionale delle Ricerche del Canada ha di recente comunicato aver realizzato la trasformazione genetica della B. carinata per indurla a produrre acido nervonico fino al 40% del contenuto totale dell’olio. Tale innovazione à ̈ descritta anche nella domanda di brevetto internazionale pubbl. No. WO 2008/061334 (National Research Council of Canada). Lo sviluppo di questa tecnologia può costituire una sorgente economicamente efficiente per la produzione su scala commerciale di acido nervonico per applicazioni farmaceutiche o nutraceutiche, e secondo quanto proposto con la presente invenzione, una ulteriore applicazione dell’acido nervonico può consistere nella sua utilizzazione come substrato per produrre plastica biodegradabile e biocompatibile.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione l’uso di materie prime a base di acidi grassi a catena alifatica con più di venti atomi di carbonio, in forma di acidi liberi o dei relativi trigliceridi, come sorgente di carbonio per la produzione, per biosintesi da microrganismi del genere Pseudomonas, di poli(3-idrossialcanoati) a catena media (mcl-PHA).

Secondo alcune forme di realizzazione specifiche dell’’invenzione, dette materie prime a base di acidi grassi sono in forma di trigliceridi e sono costituiti da olio di Brassica carinata, preferibilmente olio di B. carinata ad alto contenuto di acido erucico.

In alternativa, sempre secondo l’invenzione, le citate materie prime a base di acidi grassi sono in forma di acidi liberi e sono costituite da acido erucico e/o da acido nervonico.

Come esposto in precedenza, il batterio denominato Pseudomonas aeruginosa à ̈ risultato in grado di produrre PHA quando à ̈ coltivato su olio di B. carinata, su acido erucico o su acido nervonico in mezzo di coltura privo di azoto. Più in generale, secondo l’invenzione, altre Pseudomonadacee potrebbero essere usate come fonti di carbonio per il procedimento fermentativo proposto secondo l’invenzione e tra queste, in particolare, oltre a P. aeruginosa, P. oleovorans , P. putida e P. corrugata. Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, tuttavia, detto microrganismo à ̈ P. aeruginosa ATTCC 27853.

Tra le varie materie prime sperimentate come fonti di carbonio per la produzione di mcl-PHA la migliore resa di PHA (81 mg/L, come mostrato nel rapporto sperimentale che segue) à ̈ stata ottenuta con acido erucico. Ciò à ̈ un risultato interessante perché, a conoscenza degli autori, la produzione di PHA ad opera di Pseudomonodacee utilizzando acidi grassi più lunghi di C20non era mai stata riportata prima.

Secondo alcune forme di realizzazione preferite della presente invenzione, i poli(3-idrossialcanoati) a catena media ottenuti sono copolimeri costituiti da unità monomeriche alifatiche sature e insature con numero di atomi di carbonio compreso tra 6 e 14.

Più in particolare, come sarà chiaro nella descrizione del lavoro sperimentale che segue, nel caso in cui la materia prima sia costituita dagli acidi liberi le diverse unità monomeriche identificabili nel mcl-PHA prodotto sono cinque: 3-idrossiesanoato, 3-idrossiottanoato, 3-idrossidecanoato, 3-idrossidodecanoato e 3-idrossitetradecenoato.

Nel caso in cui la materia prima sia invece l’olio vegetale ottenuto dai semi della Brassica carinata dette unità monomeriche comprendono, oltre a quote maggiori delle prime cinque unità monomeriche sopra menzionate, anche quote minori di 3-idrossiottenoato, 3-idrossidecenoato, 3-idrossidodecenoato, 3-idrossitetradecadienoato e 3-idrossitetradecatrienoato. Le strutture dei polimeri ottenuti nei due casi, con il dettaglio delle varie unità monomeriche presenti nel polimero, sono illustrate nelle Formule 1 e 2 presentate più avanti.

Secondo un suo ulteriore aspetto, forma un altro oggetto specifico della presente invenzione un processo per la produzione di poli(3-idrossialcanoati) microbici a catena media comprendente le seguenti fasi fondamentali:

a) coltura di un microrganismo del genere Pseudomonas capace di produrre per biosintesi poli(3-idrossialcanoati) a catena media in un terreno di coltura deprivato di azoto e contenente come sorgente di carbonio materie prime a base di acidi grassi a catena alifatica con più di 20 atomi di carbonio, in forma di acidi liberi o dei relativi trigliceridi, ad ottenere un brodo di coltura contenente detti poli(3-idrossialcanoati) a catena media;

b) separazione delle cellule di detto microrganismo contenenti poli(3-idrossialcanoati) a catena media da detto brodo di coltura e liofilizzazione delle stesse;

c) recupero di detti poli(3-idrossialcanoati) a catena media da dette cellule liofilizzate per estrazione con solvente.

Il procedimento descritto, a parte la scelta della sorgente di carbonio che à ̈ una caratteristica della presente invenzione, può essere eseguito secondo le modalità convenzionalmente adottate nei processi noti di produzione di poliidrossialcanoati per biosintesi da adatti ceppi batterici.

In base ad un suo ulteriore aspetto, l’invenzione ha per oggetto i materiali polimerici biodegradabili e biocompatibili che si ottengono applicando il metodo descritto e le materie prime dell’invenzione. Detti materiali sono costituiti da poli(3-idrossialcanoati) a catena media, ottenibili per biosintesi da microrganismi del genere Pseudomonas, posti in un terreno di coltura deprivato di azoto e contenente come sorgente di carbonio materie prime a base di acidi grassi a catena alifatica con più di 20 atomi di carbonio, in forma di acidi liberi o dei relativi trigliceridi.

Secondo una forma preferita dell’invenzione, le materie prime a base di acidi grassi da impiegare come sorgenti di carbonio sono in forma di trigliceridi, e sono costituite da olio di Brassica carinata.

Come risulta dalla sperimentazione sinteticamente riportata nel seguito, il PHA ottenuto per biosintesi da olio di B. carinata si presenta come un materiale trasparente con una temperatura di transizione vetrosa (Tg) di –47°C, totalmente amorfo, appiccicoso, facilmente reticolabile se lasciato all’aria, esposto alla luce e a temperatura ambiente. Tal quale può essere utilizzato in virtù della sua biodegradabilità come vernice ecologica, ma se derivatizzato con opportune reazioni sui doppi legami può dar luogo ad altri materiali potenzialmente utili nel campo dei biodegradabili.

I PHA prodotti utilizzando come sorgente di carbonio per la fermentazione acido erucico e acido nervonico si presentano anch’essi traspa renti, con una Tg di –46°C e -43°C rispettivamente, ma risultano parzialmente cristallini, mostrando una temperatura di fusione (Tm) di 50°C e quindi con caratteristiche gommose. Il loro impiego previsto à ̈ quello degli “scaffold†per l’ingegneria tissutale o nel campo dei “delivery system†farmaceutici.

La cristallinità di questi materiali polimerici appare sorprendente perché il PHA da acido oleico, che possiede le stesse unità ripetitive, à ̈ risultato totalmente amorfo e appiccicoso. Pur non intendendo rimanere vincolati da alcuna interpretazione teorica, tale risultato può essere spiegato con il fatto che, sebbene le unità monomeriche siano strutturalmente le stesse, i PHA dagli acidi erucico e nervonico inglobano una più alta percentuale di unità monomeriche più pesanti.

Su tali basi, risulta particolarmente interessante la prospettiva di poter produrre PHA a composizione monomerica innovativa, in maniera tale da poter estendere il range delle possibili applicazioni di interesse.

Le caratteristiche specifiche dell’invenzione, così come i vantaggi della stessa e le relative modalità operative, risulteranno più evidenti con riferimento alla descrizione dettagliata presentata a titolo meramente esemplificativo nel seguito, assieme ai risultati delle sperimentazioni effettuate su di essa e ai dati di confronto con la tecnica anteriore. Alcuni risultati sperimentali sono anche illustrati nei disegni allegati, in cui:

la Figura 1 mostra lo spettro<1>H-NMR a 500 MHz del poli(3-idrossilacanoato) ottenuto secondo l’invenzione da P. aeruginosa coltivata su acido erucico;

la Figura 2 mostra lo spettro<13>C-NMR a 125 MHz del poli(3-idrossilacanoato) ottenuto secondo l’invenzione da P. aeruginosa coltivata su acido erucico;

la Figura 3 mostra lo spettro<1>H- NMR a 500 MHz del poli(3-idrossilacanoato) ottenuto secondo l’invenzione da P. aeruginosa coltivata su olio di Brassica carinata;

la Figura 4 mostra mostra lo spettro<13>C- NMR a 125 MHz del poli(3-idrossilacanoato) ottenuto secondo l’invenzione da P. aeruginosa coltivata su olio di Brassica carinata; e

la Figura 5 mostra mostra un’espansione dello spettro<13>C- NMR della Figura 4 nella regione dei carboni olefinici.

Esempi di realizzazione e studio sperimentale

Nella sperimentazione condotta in relazione alla presente invenzione, i poliidrossialcanoati sono stati isolati da P. aeruginosa dopo crescita su olio di B. carinata, su acido oleico, acido erucico e acido nervonico. In accordo con l’invenzione, à ̈ stato utilizzato l’olio di B. carinata come nuova sorgente di carbonio a basso costo per la produzione di PHA, mentre come acidi grassi liberi compresi nell’ambito dell’invenzione sono stati utilizzati l’acido erucico libero, che costituisce il maggior componente dell’olio di B. carinata (35 -48 %), e l’acido nervonico, che à ̈ l’omologo superiore dell’acido erucico (C24:1vs C22:1), e non à ̈ un componente dell’olio di B. carinata. L’acido oleico à ̈ stato utilizzato come modello di confronto perché, come noto, oltre ad essere un componente minoritario dell’olio di B. carinata à ̈ un suo omologo inferiore ed à ̈ nota la struttura del PHA corrispondente (Ballistreri et al. 2001, già cit.; de Waard, P.; van der Wal, H.; Huijberts, G. N. M.; Eggink, G. J. Biol. Chem).

Terreni e condizioni di crescita

La biomassa di P. aeruginosa ATCC 27853 da utilizzare per la produzione di PHA Ã ̈ stata prodotta inoculando il batterio in 250 ml di Luria Bertani (LB) medium, incubando per 12-15 ore a 37°C in agitazione orbitale. Successivamente, le cellule sono state raccolte per centrifugazione a 8.250 x g e lavate mediante terreno E* medium (Volgen, H. J.; Bonner, D. M. J. Biol. Chem.1956, 218, 97-106) deprivato della fonte di azoto.

La biomassa così trattata à ̈ stata poi inoculata in 1 litro di terreno E* medium deprivato di azoto, fino ad una OD540finale pari a 0,8-1, fornendo come fonti di carbonio olio di Brassica carinata (contenuto di acido erucico 35 – 48 %) (gentilmente fornito dal Consorzio di Ricerca Gian Pietro Ballatore, zona industriale Dittaino, Assoro, Enna, Italia), acido oleico, acido erucico al 90% (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) e acido nervonico all’85% (Polichimica, Sondrio, Italia) a concentrazione 5 mM.

Per valutare la capacità di P. aeruginosa ATCC 27853 di usare i substrati di interesse come fonte di carbonio e di energia in condizioni di crescita ottimali, sono state allestite colture di controllo, inoculate in terreno E* medium completo.

Il terreno E* medium completo era così formulato: (NH4)2HPO4(1,1 g/l), K2HPO4(5,8 g/l), KH2PO4(3,7 g/l), MgSO47H2O 0,1 M (10 ml/l), soluzione MT (FeSO47H2O 10 mM, MnCl24H2O 10 mM, CoSO47H2O 10 mM, CaCl22H2O 10 mM, CuCl22H2O 10 mM, ZnSO47H2O 10 mM; 1 ml di soluzione MT per litro di terreno).

Nel terreno E* medium deprivato di azoto, (NH4)2HPO4à ̈ stato sostituito con Na2HPO4(1,2 g/l), per mantenere inalterata l’osmolarità del terreno e la medesima concentrazione dell’anione HPO4<-->.

Le fermentazioni sono state condotte a 37° C e protratte per un massimo di 78 ore, monitorate ad intervalli di tempo regolari, ogni 12 ore, per la produzione e l’accumulo di PHA, mediante colorazione fluorescente Nile Red.

Quest’ultima procedura à ̈ stata condotta come segue: 1 ml di campione à ̈ stato lavato con 1 ml di PBS sterile e il pellet risospeso in 1 ml di PBS; successivamente, il campione à ̈ stato miscelato con 20 µl di soluzione madre di Nile Red (10 mg/ml) e lasciato incubare a 37° C per 20 minuti al buio. Dopo l’incubazione, il campione à ̈ stato centrifugato, il surnatante scartato e il pellet risospeso in 100 µl di PBS sterile; 10 µl del campione colorato sono stati posti su un vetrino coprioggetti, per procedere poi ad osservazione con microscopio a fluorescenza con obiettivo 100x e un filtro FITC (Banda passante= 515-560 nm).

Nelle colture di controllo, à ̈ stata altresì misurata la torbidità mediante assorbanza spettrofotometrica (λ=540 nm), per verificare l’aumento di biomassa come conseguenza dell’avvenuta utilizzazione della fonte.

Dalle osservazioni mediante Nile Red si à ̈ monitorato il numero medio di cellule produttrici in base al tempo e la fermentazione à ̈ stata interrotta quando questo risultava massimale per ogni fonte utilizzata.

La brodocoltura à ̈ stata ripartita in 4 aliquote da 250 ml ciascuna, che sono state centrifugate a 8.500 x g per 10 minuti. I surnatanti sono stati scartati ed i pellet risospesi con 5-10 ml di PBS non sterile. Ogni pellet risospeso à ̈ stato trasferito in beuta da vuoto da 100 ml, surgelato a -80°C per almeno 12 ore e successivamente sottoposto a liofilizzazione. Metodica di estrazione dei PHA.

I PHA sono stati estratti dalle cellule liofilizzate in cloroformio mediante l’impiego di un estrattore di tipo Soxhlet. Dopo un periodo di 6 h di riflusso, la soluzione cloroformica à ̈ stata concentrata in evaporatore rotante. Il polimero grezzo così ottenuto à ̈ stato solublilizzato in cloroformio e subito precipitato in 10 volumi di etanolo.

Dopo un periodo di 30 min di continua agitazione, la soluzione à ̈ stata lasciata a decantare ed il precipitato separato per centrifugazione (Beckman J2-21; rotore JA-20; 20°C – 9000g), lavato due volte con etanolo e portato a secco sotto vuoto (1.00 mmHg).

Il prodotto à ̈ stato pesato e la precipitazione à ̈ stata ripetuta altre due volte.

Analisi dei prodotti

La sperimentazione ha confermato che l’olio di B. carinata e gli acidi oleico, erucico e nervonico possono supportare sia la crescita cellulare sia l’accumulo di PHA quando il terreno di crescita viene privato di azoto.

Le rese di biomassa e dei PHA accumulati sono riportate nella seguente Tabella.

TABELLA 1

Produzione di PHA da P. aeruginosa coltivata su olio di B. carinata, acido oleico, acido erucico e acido nervonico

Substrato Peso cellulare secco PHA contenuto (% Resa PHA (mg/L) peso cell.secco) (mg/L) Olio B. carinata 1000 4,8 50 Acido oleico 380 13,0 57 Acido erucico 866 8,5 81 Acido nervonico 416 9,2 42

La più alta resa di PHA (81 mg/L) à ̈ stata osservata per l’acido erucico, anche se per gli altri substrati la differenza non à ̈ stata alta.

I PHA prodotti sono stati caratterizzati mediante cromatografia a permeazione di gel (GPC, gel permeation chromatography) per la determinazione dei pesi molecolari, gas-cromatografia (GC) per la composizione comonomerica, spettroscopia NMR (<1>H e<13>C-NMR) per la caratterizzazione strutturale, calorimetria a scansione differenziale (DSC, differential scanning calorimetry) per la caratterizzazione termica.

La composizione dei poliesteri ottenuti à ̈ stata determinata attraverso gas-cromatografia (GC) dei 3-idrossialcanoati metil-esteri preparati per metanolisi totale.

Per la determinazione della composizione dei copolimeri, quantità di 2-5 mg di PHA sono state sottoposte a metanolisi mediante riscaldamento a 100°C per 140 min in una miscela composta da 1,00 ml CHCl3, 1,00 ml di CH3OH contenente il 15% di H2SO4(Gross et al.1989, già cit.).

La miscela di reazione à ̈ stata lavata con 1,00 ml di H2O e la frazione cloroformica analizzata mediante GC utilizzando un sistema cromatografico Perkin-Elmer 8420, equipaggiato con una colonna capillare AT-50 Alltech (30 m x 0.25 mm; carrier He 1 mL/min) e un detector a ionizzazione di fiamma (FID).

Il programma di temperatura era 80°C per 5 min, poi con un gradiente di 8°C/min la temperatura à ̈ stata portata a 280°C e mantenuta per 10 min. La quantità iniettata era di 0,2 µL con uno split 10:1. I metilesteri sono stati identificati paragonando i tempi di ritenzione con quelli dei metil-3-idrossialcanoati standard forniti dalla Sigma-Aldrich (U.S.A.) e da Larodan Fine Chemical (Svezia).

La composizione così determinata à ̈ riportata nella seguente Tabella 2.

TABELLA 2

Composizione comonomerica (mol %) dei PHA ottenuti da varie sorgenti di carbonio, determinata per GC<a>

Substrato C O O:1D D:1∆ ∆:1T:1T:2T:3

Olio B. carinata 3 34 3 32 3 10 1 9 2 3 Acido oleico 4 55 27 8 6

Acido erucico 3 43 36 10 8

Acido nervonico 4 28 43 14 11

a C = 3-idrossiesanoato; O = 3-idrossiottanoato; O:1= 3-idrossiottenoato;

D = 3-idrossidecanoato; D:1= 3-idrossidecenoato; ∆ = 3-idrossidodecanoato; ∆:1= 3-idrossidodecenoato; T:1= 3-idrossitetradecenoato;

T:2= 3-idrossitetradecadienoato; T:3= 3-idrossitetradecatrienoato.

Come si può rilevare dai dati riportati nella tabella, i PHA da acido oleico, erucico e nervonico sono costituiti da cinque monomeri, con 3-idrossiottanoato e 3-idrossidecanoato in maggiori quantità, mentre il PHA da olio di B. carinata ha cinque unità monomeriche in più: l’O:1, il D:1, il ∆:1, il T:2e il T:3, provenienti probabilmente da acido linoleico e acido linolenico contenuti come trigliceridi nell’olio. La struttura chimica di questi polimeri à ̈ proposta rispettivamente nelle Formule 1 e 2 che seguono.

c o D Δ

3 2 1 -CH2-CO- -o — CH-CH2-CO-O- -CH-CH2-CO-O — CH-CH2-CO-O m n

24CH24CH24CH2

2SCH2SCH2<5>†<H>2

36CH26CH26CH2

7CH27CH27CH2

8CH38CH28CH2

<9>CH2<g>CH2

10CH310CH2

11 CH2

12CH3

Formula 1

Struttura chimica del PHA ottenuto da acido erucico C5O5D5A O:1D;1 Δ:1T;1

3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 CH-CHrCO -o — CH-CH2-CO-O- -CH-CH2-C0-0- CH-CHrCO-O CH-CHrCO -o m n Jo L JpL

CK 4CH, 4CK 4CH24C<H>2

5CH 5CH25CH, 5CH

6CH<6>†<H>2 6CH 6CH

<7>CHg7CH 7CH<7>-Ί3 (CH2)

8CI-L 8CH<8>-<11>(†<h>2)414CK

9CH212CH3

10CH. 1

Formula 2

Struttura chimica del PHA ottenuto da olio di Brassica carinata Per quanto riguarda la caratterizzazione per spettroscopia NMR, gli spettri protonici sono stati registrati a 500 MHz con uno spettrometro Varian Unity Inova alla concentrazione di 15 mg/ml in CDCl3a 27 °C. La finestra spettrale era di 5000 Hz in 32K datapoints, l’impulso di eccitazione di 60°, il tempo di acquisizione di 3,3 s ed il numero di transienti accumulati di 128. Gli spettri sono stati calibrati internamente con tetrametilsilano. Per gli spettri di<13>C, à ̈ stato adoperato lo stesso strumento su campioni più concentrati (25 mg/ml) con finestra spettrale di 25000 Hz in 64K datapoints, impulso di eccitazione di 60°, tempo di acquisizione di 1,1 s ed numero di transienti accumulati di circa 30000. Gli spettri sono stati calibrati con il picco residuo del CHCl3a 77.0 ppm.

Nelle Figure 1 e 2 dei disegni allegati vengono riportati gli spettri<1>H e<13>C-NMR del PHA isolato da P. aeruginosa coltivata su acido erucico. Gli spettri del PHA da acido oleico e acido nervonico sono essenzialmente gli stessi, anche se le intensità di alcuni picchi sono diverse, e non vengono riportati per brevità. Le assegnazioni dei picchi<13>C-NMR sono stati eseguiti secondo Gross et al. (Gross, R.A.; De Mello, C.; Lenz, R.W.; Brandl, H.; Fuller, R.C. Macromolecules 1989, 22, 1106-1115), il lavoro precendente degli attuali autori (Ballistreri et al. 2001, già cit.), e i dati riportati per i PHA ottenuti da P. putida (de Waard, et al. già cit.; Casini E.; de Rijk T. C.; de Waard P.; Eggink G. J. Environ. Polym. Degr., 1997, 5, 153-158) e P. resinovorans (Ashby et al., 1996, già cit.) cresciute su acido oleico.

Nelle Figure 3 e 4 dei disegni allegati vengono riportati gli spettri<1>H e<13>C-NMR del PHA da P. aeruginosa coltivata su olio di B. carinata. Nello spettro<1>H-NMR di Fig. 3 oltre ai segnali presenti in Fig. 1 si notano i picchi aggiuntivi tra 5,2 e 5,5 ppm, da attribuire ai protoni olefinici della Formula 2, mentre il segnale a 2,7 ppm rappresenta i protoni dei gruppi metilenici in posizione diallilica. Il segnale a 0,96 ppm può essere assegnato ai protoni dei gruppi metilici in posizione β rispetto ai doppi legami.

Nello spettro<13>C-NMR di Fig.4, oltre ai segnali presenti in Fig.2 si notano nuovi segnali sia nella regione dei carboni saturi che nella regione degli insaturi. Nella regione dei carboni saturi, nuovi segnali si notano a circa 27 ppm, dovuti ai carboni 7 O:1, 9 D:1, 8 ∆:1, 7 T:1, 10 T:2, 13 T:3; a circa 25,5 ppm, dovuti ai carboni 7 T:2, 10 T:3; e a 14,3 ppm, dovuti ai carboni 8 O:1, 10 D:1, e 14 T:3(si veda la Formula.2).

La regione degli insaturi tra 120 e 140 ppm à ̈ stata espansa e riportata nella Figura 5 allegata. Si nota chiaramente la presenza di nuove strutture olefiniche sia con un solo doppio legame (5-6 O:1, 7-8 D:1, 6-7 ∆:1) che con due (5-6, 8-9 T:2) o tre (5-6, 8-9, 11-12 T:3). Le assegnazioni eseguite sono in accordo con i risultati presentati da de Waard et al. (de Waard et al., 1993, già cit.; Casini et al., 1997, già cit.) quando i PHA furono ottenuti da acido linoleico o da olio di lino idrolizzato.

La determinazione dei pesi molecolari medi dei composti ottenuti à ̈ stata effettuata mediante cromatografia a permeazione di gel (GPC), utilizzando una pompa Waters 515, un set di quattro colonne Styragel HR connesse in serie tra di loro (nell’ordine: HR4, HR3, HR2 ed HR1), e un detector Waters 401 ad indice di rifrazione. Come eluente à ̈ stato utilizzato cloroformio ad un flusso di 1,00 ml/min.

Per ciascun campione sono stati iniettati 100 µL di una soluzione di 5,00 mg/mL. La curva di calibrazione dei pesi molecolari à ̈ stata ottenuta utilizzando standard di polistirene a basso indice di polidispersione (Polymer Laboratories), utilizzando il software GPC Caliber per l’acquisizione e l’elaborazione dei dati (Polymer Laboratories).

L’analisi termica differenziale (DSC) à ̈ stata effettuata con un calorimetro Q100 della TA Instrument, con una velocità di riscaldamento di 20°C/min in un range da –80 a 100°C ed equipaggiato con un sistema di raffreddamento con un flusso di N2di 20 ml/min. La scala delle temperature era stata calibrata mediante l’utilizzo di standard ad elevato grado di purezza.

Campioni di 2-4 mg sono stati incapsulati in crogioli di alluminio e riscaldati da 0°C a 100°C con una velocità di 20°C/min (primo scan). Per misurare la temperatura di transizione vetrosa (Tg), i campioni sono stati mantenuti ad una temperatura di 100°C per 1 minuto e poi raffreddati rapidamente a –80°C. Successivamente i campioni sono stati nuovamente riscaldati da –80°C a 100°C con velocità di riscaldamento di 20°C al minuto (secondo scan). La temperatura di fusione (Tm) à ̈ stata registrata sul picco dell’endoterma di fusione, mentre la temperatura di transizione vetrosa (Tg) sul punto di flesso dovuto al cambio della capacità termica.

La seguente Tabella 3 mostra le caratteristiche fisiche dei PHA ottenuti da P. aeruginosa quando à ̈ coltivata su olio di B. carinata e sugli acidi oleico, erucico e nervonico in mezzo di coltura privo di azoto. I pesi molecolari medi ponderali determinati mediante GPC variano da circa 56000 per i PHA da olio di B. carinata e da acido oleico, a circa 120000 per i PHA da acido erucico e nervonico. Le Tg dei quattro campioni variano da -43°C a -52°C. Soltanto i PHA ottenuti dagli acidi erucico e nervonico mostrano anche una Tm, di 50°C, con un ∆Hm di circa 16 J/g.

TABELLA 3

Caratteristiche fisiche dei PHA isolati da P. aeruginosa coltivata su olio di B. carinata e sugli acidi oleico, erucico e nervonico.

Substrato Tg (<°>C) Tm (°C) ∆Hm (J/g) Mw 10<-3>Mn 10<-3>Mw/Mn Olio di B. carinata -47 56 31 1,8 Acido oleico -52 57 26 2,2 Acido erucico -46 50 16,1 122 63 1,9 Acido nervonico -43 50 15,5 114 56 2,0

Mentre i PHA da acido oleico e olio di B. carinata risultano totalmente amorfi, i PHA ottenuti per biosintesi ad opera di P. aeruginosa dagli acidi erucico e nervonico , mostrando una Tm di 50 °C e un ∆Hm di circa 16 J/g, risultano parzialmente cristallini con caratteristiche gommose.

In quest’ultimo caso si può quindi confermare che tali materiali polimerici cristallizzano con la partecipazione sia della catena principale che della catena laterale in un ordine a strati, similmente a quanto avviene con altre classi di polimeri che portano lunghe catene laterali (Gross et al.

1989, già cit.; Marchessault, R.H.; Monasterious, C. J.; Morin, F. G.; Sundarajan, P.R. Int. J. Biol. Macromol.1990, 12, 158-165).

La presente invenzione à ̈ stata descritta con riferimento ad alcune sue forme di realizzazione specifiche, ma à ̈ da intendersi che variazioni o modifiche potranno essere ad essa apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.

Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Uso di materie prime a base di acidi grassi a catena alifatica con più di 20 atomi di carbonio, in forma di acidi liberi o dei relativi trigliceridi, come sorgente di carbonio per la produzione, per biosintesi da microrganismi del genere Pseudomonas, di poli(3-idrossialcanoati) a catena media.
2. 2. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui dette materie prime a base di acidi grassi sono in forma di trigliceridi e sono costituite da olio di Brassica carinata.
3. 3. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui dette materie prime a base di acidi grassi sono in forma di acidi liberi e sono costituite da acido erucico e/o acido nervonico.
4. 4. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3, in cui detti microrganismi sono scelti tra P. aeruginosa, P. oleovorans , P. putida , P. corrugata.
5. 5. Uso secondo la rivendicazione 4, in cui detto microrganismo à ̈ P. aeruginosa ATTCC 27853.
6. 6. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-5, in cui detti poli(3-idrossialcanoati) a catena media ottenuti sono copolimeri costituiti da unità monomeriche alifatiche sature e insature con numero di atomi di carbonio compreso tra 6 e 14.
7. 7. Uso secondo la rivendicazione 6, in cui dette unità monomeriche sono costituite da 3-idrossiesanoato, 3-idrossiottanoato, 3-idrossidecanoato, 3-idrossidodecanoato e 3-idrossitetradecenoato.
8. 8. Uso secondo la rivendicazione 6, in cui dette unità monomeriche comprendono 3-idrossiesanoato, 3-idrossiottanoato, 3-idrossidecanoato, 3-idrossidodecanoato e 3-idrossitetradecenoato, e quote minori di 3-idrossiottenoato, 3-idrossidecenoato, 3-idrossidodecenoato, 3-idrossitetradecadienoato e 3-idrossitetradecatrienoato.
9. 9. Procedimento per la produzione di poli(3-idrossialcanoati) microbici a catena media comprendente le seguenti fasi fondamentali: a) coltura di un microrganismo del genere Pseudomonas capace di produrre per biosintesi poli(3-idrossialcanoati) a catena media in un terreno di coltura deprivato di azoto e contenente come sorgente di carbonio materie prime a base di acidi grassi a catena alifatica con più di 20 atomi di carbonio, in forma di acidi liberi o dei relativi trigliceridi, ad ottenere un brodo di coltura contenente detti poli(3-idrossialcanoati) a catena media; b) separazione delle cellule di detto microrganismo contenenti poli(3-idrossialcanoati) a catena media da detto brodo di coltura e liofilizzazione delle stesse; c) recupero di detti poli(3-idrossialcanoati) a catena media da dette cellule liofilizzate per estrazione con solvente.
10. 10. Materiali polimerici biodegradabili e biocompatibili costituiti da poli(3-idrossialcanoati) a catena media, ottenibili per biosintesi da microrganismi del genere Pseudomonas, posti in un terreno di coltura deprivato di azoto e contenente come sorgente di carbonio materie prime a base di acidi grassi a catena alifatica con più di 20 atomi di carbonio, in forma di acidi liberi o dei relativi trigliceridi.
11. 11. Materiali polimerici secondo la rivendicazione 10, in cui dette materie prime a base di acidi grassi sono in forma di trigliceridi e sono costituite da olio di Brassica carinata.