ITRM20070574A1 - Ciclatore termico miniaturizzato per amplificazione ed analisi di molecole biologiche biochip operante attraverso elettrosmosi ac - Google Patents

Description

Tìtolo dell’invenzione

Ciclatore termico miniaturizzato per amplificazione ed analisi di DNA e molecole biologiche su biochip operante attraverso elettroosmosi AC

Riassunto dell’invenzione

La presente invenzione consiste in un metodo innovativo per realizzare l amplificazione chimica di DNA e molecole biologiche su un dispositivo integrato. Tale metodo trova la sua attuazione in una camera di reazione miniaturizzala (dell’ordine di grandezza dei millimetri) nella quale l’accurato controllo dei cicli termici necessari all’operazione è garantito attraverso la creazione di vortici, generati per elettroosmosi AC, controllati in tensione e frequenza. L’utilizzo di tensioni alternale che alimentano gli elettrodi posti sulla base della camera di reazione proposta consente di controllare il “movimento” del fluido, in cui sono immerse le molecole da amplificare, attraverso accensione e spegnimento degli stessi, garantendo così un tempo di permanenza alle temperature richieste sufficiente a permettere gli stadi di amplificazione.

L’innovazione rispetto alle tecniche tradizionali consiste nel realizzare amplificazione chimica in una microcamera operante tra due sole sorgenti di temperatura, rispetto alle tre normalmente utilizzate (in realtà la temperatura intermedia viene comunque raggiunta) e sfruttando il fenomeno della convezione forzata per generare il movimento del fluido. L’applicazione dei principi della convezione forzata, che sono alla base del funzionamento di tale cella, garantisce un’efficiente amplificazione chimica senza dover trasferire piccoli volumi di liquido o regolare e variare continuamente la temperatura del vaso di reazione. Regolando opportunamente i parametri di flusso è possibile produrre un singolo vortice convettivo che trasporta il DNA tra le due pareli, producendo un percorso controllato in temperatura analogo a quello realizzato nei convenzionali termociclatori.

Descrizione

La presente invenzione si colloca nei campi della diagnostica clinica e della biologia molecolare e cellulare. In -tali ambiti l’osservazione di cambiamenti biochimici individuabili già nel sangue del paziente (soprattutto in nucleotidi e peptidi poiché una mutazione o sostituzione di essi può servire come primo indicatore dello stato di malattia [l]-[4]), può segnalare il danneggiamento (o almeno un principio di esso) di organi o disfunzioni prima che siano osservabili malfunzionamenti cellulari a livelli microscopici o altri sintomi. Si rivela pertanto necessario incrementare la capacità delle analisi convenzionali, lente e costose, attraverso la miniaturizzazione dei sistemi di esame, con il vantaggio di utilizzare piccole quantità di fluido e volume di reagente, ottenendo rapidi tempi di analisi, basso spreco di fluido, elevata accuratezza, semplicità di utilizzo ed eventuale possibilità di realizzare dispositivi usa e getta. Da questo nasce la richiesta di sviluppo di biochips dì diagnostica clinica fàcili da utilizzare e poco costosi che, servendosi di chips microfluidici completamente integrati, siano in grado di effettuare rapide ed attendibili misure di parametri metabolici del corpo umano e con la minima invasività. I sistemi microfluidici appena introdotti presentano come principale innovazione l utilizzo di microvolumi di templato. L’analisi richiesta, tuttavia, è possibile solo se è presente un preciso quantitativo di materiale biologico da analizzare attraverso una serie di stadi successivi. Essendo minimo il volume di templato introdotto, il primo di questi passi consiste nell’amplificazione chimica dello stesso, in modo tale da avere quantità di analita sufficienti per svolgere le analisi richieste. I primo stadio di questi chip di analisi è la PCR (tecnica che realizza l amplificazione chimica) e la presente invenzione consiste in un metodo innovativo per realizzarla su un dispositivo integrato. Lo scopo principale di tale metodo è quello di garantire un accurato controllo dei cicli termici necessari all’operazione, attraverso la creazione di vortici, generati per elettroosmosi AC, controllati in tensione e frequenza. L’utilizzo di tensioni alternate che alimentano gli elettrodi posti sulla base della camera di reazione proposta consente di controllare il “movimento” del fluido, in cui sono immerse le molecole da amplificare, attraverso accensione e spegnimento degli stessi, garantendo cosi un tempo di permanenza alle temperature richieste sufficiente a permettere gli stadi di amplificazione. L’innovazione rispetto alle tecniche tradizionali consiste nel realizzare amplificazione chimica in una microcamera operante tra due sole sorgenti di temperatura, rispetto alle tre normalmente utilizzate (in realtà la temperatura intermedia viene comunque raggiunta) e sfruttando il fenomeno della convezione forzata per generare il movimento del fluido. L’applicazione dei principi della convezione forzata che si instaura quando viene superato il valore critico del Numero di Rayleigh, che sono alla base del funzionamento di tale cella, garantisce un’efficiente amplificazione chimica senza dover trasferire piccoli volumi di liquido o regolare e variare continuamente la temperatura del vaso di reazione. Regolando opportunamente i parametri di flusso è possibile produrre un singolo vortice convettivo che trasporta il DNA tra le due pareti, producendo un percorso controllato in temperatura analogo a quello realizzato nei convenzionali tennociclatori (si veda la Figurai).

Descrizione delinvenzione

L’amplificazione biochimica è una tecnica che amplifica chimicamente una piccola parte di un lungo filamento di DNA esponenzialmente senza la produzione simultanea di altro materiale genetico presente in uguale o più grande quantità nella soluzione. La tecnica appena citata utilizza generalmente processi naturali biochimici che accadono regolarmente all’interno delle cellule per la replicazione e la ricostruzione del DNA. La PCR avviene attraverso cicli di replicazione consistenti in :

1. da uno ad alcuni minuti a temperature superiori a novanta gradi centigradi durante i quali il DNA è denaturato in singoli strands (fase di melting) ;

2. da uno ad alcuni minuti tra cinquanta e sessantacinque gradi centigradi durante i quali avviene da parte dei primers (“iniziatori” della nuova sequenza) l’ibridizzazione (o annealing) attraverso ponti ad idrogeno delle loro sequenze complementari su un’altra sede della sequenza target;

3. da uno ad alcuni minuti tra settanta e settantasette gradi centigradi durante i quali l’enziina di polimerasi lega ed estende uno strand di DNA complementare tra ciascun primer (fase di extension). Man manti che l’amplificazione procede, la sequenza di DNA tra i primers raddoppia alla fine di ogni ciclo.

Dato che alcune amplificazioni sono imponenti, l’importante concetto da ricordare è che essa è selettiva: vengono amplificate esponenzialmente solo le sequenze di DNA collocate tra i primers. Il resto del DNA nel genoma non è amplificato.

La selettività appena citata aiuta a comprendere meglio il motivo per cui la PCR è una tecnica molto utilizzata nella diagnostica clinica: essa aiuta infatti a:

■ scoprire varie tipologie di mutazioni associate a malattie genetiche quali inserimento, mancanza e mutazioni puntuali di basi azotate;

• rilevare la presenza di materiale genetico non richiesto, ad esempio batteri o infezioni virali; offrendo una rapida e semplice alternativa ai test convenzionali.

Le tecniche di realizzazione della PCR sono normalmente implementate su macchinari di grandi dimensioni, Il tentativo di miniaturizzare tali dispositivi è abbastanza recente e fino ad ora la letteratura ha fornito solo l’esempio di chip dedicati che eseguono l’amplificazione avvalendosi generalmente di microstrutture, tipicamente capillari, che, permettendo lo scorrimento del templato introdotto attraverso tre zone a diversa temperatura, definiscono il processo di ciclaggio termico con il vantaggio di lavorare con microvolumi di templato [5]. Una tecnica alternativa, implementata su una cella operante tra due sole temperature [6], utilizza una cella di convezione di Rayleigh-Bénard, in cui il campione di DNA scorre all’interno di una cavità cilindrica sottoposta ad un gradiente di temperatura creato tra due superimi a temperature diverse. L’applicazione dei principi della convezione di Rayleigh-Bénard, che sono alla base del funzionamento di tale cella, garantisce un’efficiente amplificazione chimica senza dover trasferire piccoli volumi di liquido o regolare e variare continuamente la temperatura del vaso di reazione. In tale cella la differenza di temperatura tra le due pareti dà origine all’instabilità di Rayleigh-Bénard (processo di convezione naturale), che si manifesta con la formazione di celle, o vortici [7]. Regolando opportunamente i parametri di flusso è possibile produrre un singolo vortice convettivo che trasporta il DNA tra le due pareti, producendo un percorso controllato in temperatura analogo a quello realizzato nei convenzionali termociclatori. Questo dimostra che, una volta noti i campi di velocità e di temperatura del templato, è possibile realizzare la PCR in maniera innovativa [8]-[9]. In realtà l’instabilità di Rayleigh-Bénard si instaura all’interno di camere dell’ordine di grandezza del centimetro cubo di volume; l’innovazione apportata dalla seguente invenzione consiste nella realizzazione di un regime convettivo forzato attraverso i vortici che permettono di replicare lo stesso principio in dimensioni molto ridotte. Una volta nota la traiettoria del fluido all’ interno della camera, il pilotaggio dei vortici in questione permette di far spostare il fluido nelle posizioni successive in tempi controllati, in modo tale da regolare dall’esterno la permanenza delle molecole in zone a temperatura nota. L’invenzione si compone di una camera di reazione in vetro e due elettrodi metallici posti alla sua base. La camera contiene acqua e particelle biologiche submicrometriche da amplificare al fine di averne una quantità sufficiente per procedere all’analisi desiderata. Gli elettrodi sono alimentati a tensione alternata AC. Il movimento del fluido è dovuto al fenomeno dell’elettroosmosi [10], La camera di reazione è stata dimensionata in seguito alla contemporanea risoluzione dei problemi elettrico e termico poiché il fluido si muove per effetto dell’elettroosmosi transitando in regioni di spazio a diversa temperatura comprese tra parete superiore e inferiore della camera.

Descrizione di una realizzazione esemplificativa

Fa seguito uno specifico caso costruttivo, avente una pura funzione esemplificativa e mirante a dimostrare la semplicità di realizzazione di tale invenzione.

Per far sì che le molecole contenute nel fluido subiscano il ciclaggio termico desiderato è opportuno controllare la loro traiettoria all’interno della camera in cui si vengono a creare delle zone a temperatura variabile, tali da poter realizzare le sequenze di Melting-Annealing-Extension.

In seguito alla risoluzione di entrambi i problemi anche un opportuno dimensionamento della camera può portare all’aumento della percentuale di fluido che realizza PCR.

Volendo amplificare sequenze di DNA per rilevare mutazioni che portino alla presenza di placche aterosclerotiche e pertanto di malattie cardiovascolari che da esse conseguono, sono necessarie le seguenti temperature:

• tra novantaquattro e novantotto gradi centigradi per la denaturazione (o Melting) del DNA e • tra sessantasette e sessantanove gradi centigradi per l’Annealing e l’Extension.

Il dimensionamento della camera è stato raggiunto con l’ottimizzazione del problema termico innanzitutto, e poi della geometria della stessa. Considerando che la temperatura più alta da imporre, non può essere superiore a novantanove gradi centigradi, perché se aumentasse di un ulteriore grado si arriverebbe all’ebollizione dell’acqua contenente le molecole da amplificare, la ricerca della combinazione ottimale delle temperature è stata possibile variando soltanto la più bassa e cioè quella da imporre sulla parete superiore della camera. La necessità di intervenire su tale temperatura è giustificata anche dal fatto che il fluido deve transitare in una fascia termica molto più ristretta per le basse temperature rispetto a quella delle alte e pertanto risulta minore la percentuale di molecole che transitano in tale zona, proprio a causa delle sue dimensioni. Dai risultati ottenuti si deduce che per la camera in esame (avente dimensioni pari a duecentoventicinque x cento micrometriquadrati) il volume massimo di fluido che compie PCR si ha per una temperatura di trentasei gradi centigradi (il calcolo è eseguito in ambiente Matlab). Abbassando ulteriormente tale temperatura la percentuale diminuisce.

Bibliografia

[1] E. Vespoorte, “Microfluidic chips for clinical and forensic analysis”, ELECTROPHORESIS, VOL. 23, 2002

[2] R. Service, “Lab. on a chip: Corning soon: The pocket DNA sequencer”, SCIENCE, VOL. 282, NO. 5338, 1998

[3] T. Dinh, G. Griffin, D. Stokes, and A.Wintenberg, “Multi-functional biochip for medicai diagnostics and pathogen detection”, SENS. ACTUATORS B, VOL. 90, 2003

[4] L. Kricka, “Microchips, microarrays, biochips, and nanochips: Personal laboratories for thè 21st century”, CLIN. CHIM. ACTA, VOL. 307, 2001

[5] Martin U. Kopp, Andrew J. de Mello, Andreas Manz, “Chemical amplification: continuous-Flow PCR on a Chip”, SCIENCE, VOL 280, 15 MAY 1998

[6] Madhavi Krishnan, Victor M. Ugaz, Mark A. Bums, “ Methods of perfonning biochemical reactions in a convective flow field”, PUB. No.: US 2005/0074782 Al, PUBDATE : APRIL7, 2005 [7] E. Yariv, G. Ben-Dov, K. D. Dorfinan,“Polymerase chain reaction in naturai convection systems: A convection-di.usion-reaction model”, EUROPHYSICS LETTERS, VOL 71, NO 6, 15 SEPTEMBER 2005

[8] D. Braun, N. L. Goddard, A. Libchaber,PHYS. REV. LETT.,VOL. 91, NO. 158103, 2003

[9] M. Krishnan et al., ANAL. CHEM., VOL.76, NO.6254, 2004

[10] N. G. Green, A. Ramos, A. Gonz'alez, H. Morgan, and A. Castellanos,“ Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. Π. A linear double-layer analysis”, PHYSICAL REVIEW E, 66, 026305, 2002

Didascalia per la Figura 1

Figura 1. Illustrazione schematica della camera di reazione. Le biomolecole immerse nel fluido 1.3 transitano nelle tre zone termiche di interesse per l’amplificazione chimica (1.5, 1.6, 1.7), create dall ’ applicazione di due diverse temperature su due lati (1.1, 1.2) della camera direzione.

Il tempo di permanenza del fluido in specifiche zone di temperatura è controllato attraverso il meccanismo AC applicato direttamente sugli elettrodi 1.4.

Claims (6)

1. Rivendicazioni 1) la presente invenzione riguarda la proposta di un metodo innovativo per realizzare l’amplificazione chimica di DNA e molecole biologiche su un dispositivo integrato.
2. 2) Il metodo in accordo alla rivendicazione 1 trova la sua attuazione in una camera di reazione miniaturizzata dotata di specifici elettrodi.
3. 3) La camera è sottoposta a due temperature distinte che generano un gradiente termico.
4. 4) La circolazione di fluido (che permette l amplificazione chimica) nella camera in accordo alla rivendicazione 2 è resa possibile dalla contemporanea presenza di uno specifico gradiente termico (rivendicazione 3)e dall’applicazione di una tensione AC sugli elettrodi (che genera, attraverso il fenomeno dell’ elettroosmosi, un regime di convezione forzata del fluido presente all’intemo della camera che si manifesta nella creazione di un’unica cella convettiva di fluido).
5. 5) Il meccanismo di controllo della permanenza delle biomolecole in specifiche zone a temperatura nota e per un preciso lasso di tempo è reso possibile dall’accensione e dallo spegnimento degli elettrodi (di cui alla rivendicazione 4) attraverso il controllo della tensione AC e pertanto della rotazione del fluido.
6. 6) Un metodo matematico per il calcolo delle temperature da imporre sui due lati della camera al fine di individuare la maggiore percentuale di fluido in transito nelle zone sottoposte alle temperature di interesse.