ITRM20070481A1 - "sequenza peptidica bioattiva da impiegare in sostituzione della calcitonina umana" - Google Patents

Description

Descrizione dell’Invenzione Industriale avente per titolo: "Sequenza peptidica bioattiva da impiegare in sostituzione della calcitonina umana

Campo dell’invenzione

La presente invenzione riguarda una sequenza peptidica bioattiva da impiegare in sostituzione della calcitonina umana. Questa sequenza ha la caratteristica di presentare una ridotta tendenza all’aggregazione rispetto alla corrispondente calcitonina umana.

Definizioni

Nella presente descrizione si farà uso delle seguenti abbreviazioni e/o definizioni (in ordine alfabetico):

Affinità fra amminoacidi = analogia delle proprietà chimiche di alcuni amminoacidi, per es. quelli con catena laterale "acida o carica negativamente" (D, E), "alifatica" (A, I, L, V), "ammidica" (N, Q), "aromatica" (F, H, Y, W), "basica o carica positivamente" (K, R), o "idrossilica" (S, T); cAMP = adenosina monofosfato ciclico;

CD = dicroismo circolare;

CT = calcitonina;

hCT = calcitonina umana;

NMR = risonanza magnetica nucleare;

phCT = calcitonina umana modificata secondo la presente invenzione; Polimorfismo = forme differenti di una proteina indotte da una limitata variazione della struttura primaria; tale variazione può anche modificare la funzione svolta dalla proteina;

Posizioni di consenso = siti della sequenza polipeptidica che "con maggiore probabilità" presentano delle proprietà specifiche;

sCT = calcitonina di salmone;

Sostituzione conservativa = cambio di un amminoacido con un altro simile in grandezza e proprietà chimiche;

Struttura primaria = sequenza amminoacidica del polipeptide;

Struttura secondaria = struttura indotta dalle relazioni steriche degli amminoacidi che sono vicini nella sequenza amminoacidica;

Struttura terziaria = ripiegamento della catena polipeptidica in una disposizione tridimensionale specifica.

Gli amminoacidi delle catene polipeptidiche saranno indicati con il loro codice a lettera singola.

Arte nota

Un discreto numero di peptidi bioattivi e proteine è attualmente in uso per il trattamento di specifiche patologie. In alcuni casi, tuttavia, l’uso di questi peptidi è di limitata utilità per la loro tendenza ad aggregare in fase di preparazione, di stoccaggio e/o di somministrazione a pazienti, e tali aggregati presentano spesso un’attività nulla rispetto alla forma non aggregata, con una potenziale tossicità. L’aggregazione di peptidi e proteine farmacologicamente attivi nella forma nativa ha por tato all’uso terapeutico di analoghi di altre specie, con una minore tendenza a formare aggregati. Lo svantaggio di usare peptidi da fonti alternative è la possibile induzione di resistenza immunogenica (sviluppo di anticorpi contro la molecola usata), e quindi la riduzione dell’ efficacia dell’azione farmacologia dovuta alla risposta immunitaria indotta dall’analogo non umano utilizzato.

Un esempio di tali peptidi è la calcitonina (CT), un ormone di 32 amminoacidi prodotto dalle cellule C della tiroide dei mammiferi e coinvolta nella regolazione del calcio e della dinamica ossea. La CT causa un breve ma rapido abbassamento dei livelb del calcio e del fosfato nel sangue promovendo l’incorporazione di tab ioni nella matrice ossea [Sexton, P. M., Findlay, D. M. and Martin, T. J. (1999) Curr. Med. Chem. 6, 1067-1093],

La CT di salmone (sCT) è attualmente usata, al posto di quella umana (hCT), nel trattamento dell’osteoporosi, della malattia di Paget ( osteitis deformans ), dell’ipercalcemia (un alto livello di calcio nel sangue), dei dolori muscoloscheletrici e come analgesico. L’ipercalcemia può essere l’effetto secondario di alcuni tipi di cancro (seno, polmone, rene, cervice uterina, utero, ovaio, mieloma), iperparatiroidismo primario, aumentato turnover osseo che induce un’elevata secrezione di fostatasi alcalina e idrossiprolina; progressione di lesioni ossee o fratture ripetute. Come analgesico è usata nella terapia del dolore contro stati metastatici in fase avanzata, in particolare nell’osteosarcoma. L’effetto anoressizzante della CT è ben documentato [Chebkani, P. K., Haver, A. C. and Reidelberger, R. D. (2007) Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.

in press; Lutz, T. A., Tschudy, S., Rushing, P. A. and Scharrer, E. (2000) Peptides 21, 233-238],

L’uso della sCT in sostituzione dell’hCT è legato all’elevata tendenza dell’hCT ad autoaggregarsi a concentrazioni anche molto basse, sia in vivo che in vitro, e a precipitare sotto forma di fibrille insolubili [Arvinte, T., Cudd, A. and Drake, A. F. (1993) J. Biol. Chem. 268, 6415-6422], Ciò costituisce un serio problema in fase di produzione e somministrazione farmacologica, poiché nella forma aggregata l’hCT non è in grado di esercitare la sua azione biologica ma può addirittura indurre un’indesiderata risposta immunitaria e probabilmente generare citotossicità, secondo quanto osservato per altri polipeptidi terapeutici nella loro forma aggregata [Braun, A., Kwee, L., Labow, M. A. and Alsenz, J. (1997) Pharm. Res. 14, 1472-1478; Curatolo, L., Valsasina, B., Caccia, C., Raimondi, G. L., Orsini, G. and Bianchetti, A. (1997) Cytokine 9, 734-739; Brange, J., Andersen, L., Laursen, E. D., Meyn, G. and Rasmussen, E. (1997) J. Pharm. Sci. 86, 517-525], Benché presenti una velocità di aggregazione estremamente bassa, la sCT è tuttavia farmacologicamente meno attiva dell’hCT, sempre che si riesca a prevenire l’aggregazione di quest’ultima utilizzando condizioni drastiche di preparazione [Cudd, A., Arvinte, T., Das, R. E. G., Chinni, C. and Maclntyre, I. (1995) J. Pharm. Sci. 84, 717-719], difficili però da implementare nella produzione, conservazione, distribuzione e uso dell’hCT. La sCT presenta una scarsa identità di sequenza con la variante umana (16 residui su 32, che corrisponde al 50% di omologia di sequenza). Per questa ragione un trattamento prolungato con la sCT può indurre effetti collaterali come l’anoressia e il vomito [Yamamoto, Y., Nakamuta, H., Koida, M., Seyler, J. K. and Orlowski, R. C. (1982) Jpn. J. Pharmacol. 32, 1013-1017; Feletti, C. and Bonomini, V. (1979) Nephron 24, 85-88], e reazioni immunitarie sviluppando anticorpi contro la CT non umana [Singer, F. R., Aldred, J. P., Neer, R. M., Krane, S. M., Potts, J. T., Jr. and Bloch, K. J. (1972) J. Clin. Investig. 51, 2331-2338], Quando ciò accade è necessario aumentare la dose delle somministrazioni col pericolo che il trattamento possa diventare inefficace.

Sono note e alla portata del tecnico del ramo le procedure fondate sull’introduzione di sostituzioni amminoacidiche tali da alterare strutture locali nella struttura tridimensionale del(la) polipeptide (proteina), impedendo così la formazione di strutture ritenute critiche per l’induzione dell’aggregazione. Tuttavia queste tecniche non possono essere applicate in maniera diretta e univoca alla struttura della CT in quanto, a causa del ridotto numero di amminoacidi della catena, essa non presenta una struttura terziaria (tridimensionale) ben definita, e nel fluido naturale di trasporto (in genere soluzioni acquose) la catena polipeptidica assume una struttura disordinata ("random coil"), con ciò non permettendo di individuare facilmente e con ragionevole prevedibilità le possibih correlazioni fra sostituzione e attività metabohca.

È noto che per la progettazione di un nuovo polipeptide, gli amminoacidi da sostituire sono di solito quelli che consentono una riduzione totale del numero di residui idrofobici totali e/o l’aumento della carica netta del peptide. Entrambe le scelte tendono ad aumentare la solubilità e a ridurre l’aggregazione. In particolare, l’introduzione di residui basici dovrebbe essere preferita, poiché per tali sostituzioni l’effetto della carica è valido anche a bassi valori di pH. Ovviamente, l’aumento della carica può richiedere sostituzioni non conservative. Sotto sono indicate le sostituzioni conservative degli amminoacidi (identificate col codice a lettera singola):

AMMINOACIDI

Alifatici apolari: A G I L P V

polari neutri: C M N Q S T

polari carichi: D E K R

Aromatici: F H W Y

Queste sostituzioni, unanimamente accettate dalla comunità scientifica, sono state in parte utilizzate anche nei due brevetti qui appresso citati.

Nella domanda di brevetto WO02083734, denominato "Peptides", vengono proposte alcune varianti dell’hCT con omologia di almeno il 70% col peptide nativo. Tuttavia viene descritto esaustivamente un solo peptide, denominato 6chR, caratterizzato da mutazioni nelle posizioni 11, 12, 15, 16, 17 e 19 dell’hCT, che privilegiano quindi la regione centrale. Anche gli altri polipeptidi descritti conservano la filosofia di mutare la regione centrale; tuttavia è il peptide 6chR a mostrare le proprietà antifibrillanti più interessanti e ad essere caratterizzato estensivamente. Rispetto all’hCT, esso presenta 6 mutazioni, con un’identità di sequenza con hCT dell’81%. L’omologo secondo la presente invenzione contiene invece solamente 5 mutazioni (omologia di sequenza dell’84%) con capacità di attivare l'ΑΜΡ ciclico (cAMP) e una cinetica di fibrillazione (vedi sotto) uguali, se non migliori, di 6chR, riuscendo a produrre quindi un mutante ancora più simile all’hCT.

L’insegnamento della suddetta domanda di brevetto è quello di mutare a caso la struttura primaria (la sequenza di amminoacidi) in base a considerazioni generali sulla natura chimica (affinità) degli amminoacidi, per ottenere una variazione delle proprietà fibrillanti dei peptidi. Ciò produce un elevato numero di analoghi dell’hCT non tutti utilizzabili farmacologicamente.

L’insegnamento della domanda di brevetto WO2005035566 denominato "Calcitonin peptides with reduced self aggregation activity", si muove nella stessa direzione della domanda precedente. In particolare, in essa sono descritti due nuovi peptidi analoghi della CT umana e denominati 5P e 6S. In questi peptidi le mutazioni sono localizzate nei siti 11, 17, (20), 24, 27 e 29. Nei siti 11, 17, 24, 27 e 29 vengono proposti residui scelti tra P, G, S, T, Q, N, R, K, D e E, mentre per il 20 viene scelto indipendentemente uno tra P, G, S, T, Q, N, R, K, D, H e E. Il suggerimento degli autori è che per i siti 11, 17 e 24 siano selezionati D o R. Per il sito 20 si suggeriscono H, D o R, mentre per il 27 e 29 si propongono S, T, D o R. In definitiva, si consiglia di inserire residui idrofilici essenzialmente carichi in alcune posizioni ritenute utili per evitare la formazione di aggregati molecolari basati su interazioni tra residui idrofobici e per aumentare la solubilità. La hCT nativa, infatti, ai siti 11, 17, 20, 24, 27 e 29 presenta T, N, H, Q, I e V: i primi due e il quarto degli amminoacidi sono polari neutri, il quinto e il sesto sono apolari e solamente il terzo è carico in base al pH. Le posizioni sono state identificate come "posizioni di consenso" dopo un’analisi legata alla natura chimica dell’ amminoacido da sostituire. Entrambi gli analoghi 5P e 6S poggiano sullo screening chimico di diverse posizioni nella sequenza amminoacidica ignorando tutte le implicazioni strutturali. In particolare, la possibilità di scelta dell’ amminoacido da inserire sembra essere troppo ampia ed aleatoria, basata esclusivamente su "posizioni di consenso". Inoltre, l’attivazione di cAMP da parte di 6chR, 6S e 5P riportata in WO2005035566, sembra essere meno efficace di quella qui riportata per phCT.

Uno dei problemi delle due domande di brevetto sopra discusse è che il loro insegnamento è molto ampio, con indicazioni non univoche né dirette. Sarebbe opportuno avere criteri di scelta più restrittivi per le modifiche di sequenza da apportare nella progettazione di analoghi dell’hCT, in modo da orientare più rapidamente la scelta delle sostituzioni nella formulazione di analoghi.

Era quindi sentita l’esigenza di fornire una sequenza peptidica, basata su poche mutazioni (<6) e semplici criteri di scelta, da impiegare in campo farmaceutico, in particolare per ottenere un peptide in sostituzione della sCT, che superasse gli inconvenienti sopra evidenziati. I problemi legati alla scelta dei residui da mutare sono stati risolti usando come linea guida l’induzione nella hCT di una struttura tridimensionale simile a quella della sCT, l’analogo che non fibrilla. Come progettato, tale struttura indotta nell’hCT ha portato ad una drastica riduzione della capacità di aggregazione dell’analogo rispetto all’hCT nativa, mantenendo al contempo un’attività farmacologia più elevata dell’omologo strutturale appartenente alla stessa famiglia (sCT).

Sommario dell’invenzione

Costituisce pertanto oggetto della presente invenzione una forma modificata di un peptide bioattivo (l'hCT) che mostra un’elevata solubilità e una ridotta tendenza ad aggregare. Tale analogo, denominato phCT, mostra un’elevata omologia di sequenza con la forma umana del polipeptide rispetto alla sCT, con una tendenza praticamente nulla all’aggregazione rispetto all’hCT.

L’analogo, denominato phCT, ha la sequenza SEQ ID No 3:

CGNLSTCMLGTLTQDFHKFHTFPQTNTGVGTP

Altro oggetto dell’invenzione sono le sequenze polinucleotidiche che codificano la phCT, le sequenze che ibridizzano, quelle complementari, quelle genomiche e i cDNA ed RNA corrispondenti a dette sequenze, facilmente ricavabili da esperti del settore. Tali sequenze polinucleotidiche e polipeptidiche possono essere usate in campo farmaceutico.

L’invenzione comprende anche un metodo per il trattamento delle patologie e disfunzioni ossee descritti sopra, per es. la malattia di Paget ( osteitis deformans ), l’osteoporosi, l’ipercalcemia e l’uso come analgesico. In particolare il metodo comprende anche la somministrazione della CT modificata o gli acidi nucleici codificanti i polipeptidi dell’invenzione che presentano attività farmaceutica.

L’invenzione fornisce inoltre un potenziale metodo per ridurre l’appetito in un individuo, per esempio nel trattamento dell’obesità, e comprendente la somministrazione del peptide phCT o dell’acido nucleico codificante la phCT. Inoltre è contemplata anche la possibilità della preparazione di un farmaco per la riduzione dell’appetito nel trattamento dell’obesità.

Ancora altro oggetto sono le composizioni farmaceutiche comprendenti le sequenze polinucleoti diche e polipeptidiche sopra dette o sequenze più ampie che le comprendono. Le composizioni del’invenzione possono anche comprendere ulteriormente carrier farmaceuticamente accettabili. Rientrano nell’ambito della presente invenzione i vettori, inclusi vettori di espressione, contenenti i polinucleotidi deh’invenzione; cellule geneticamente ingegnerizzate che contengono tali polinucleotidi e cellule geneticamente ingegnerizzate per esprimere tali polinucleotidi.

L’invenzione si riferisce anche a metodi per produrre il polipeptide phCT comprendenti gli stadi per far crescere in coltura le cellule dell'invenzione in un adatto mezzo di coltura e purificare il polipeptide dalla coltura.

Altro oggetto delfinvenzione è un metodo per il trattamento o la prevenzione di condizioni patologiche che comprende la somministrazione delle composizioni secondo l’invenzione a soggetti che ne abbiano bisogno. In particolare i trattamenti sono quehi connessi con le alterazioni del meccanismo di regolazione del calcio nell’organismo di un mammifero, preferibilmente l’uomo.

Ulteriore oggetto risiede nell’impiego in campo farmaceutico dei polipeptidi e polinucleotidi sopra indicati in particolare per il trattamento delle affezioni correlate con le alterazioni del metabolismo del calcio nei mammiferi, specialmente l’uomo.

Ulteriori oggetti risultano evidenti dalla descrizione dettagliata dell’invenzione .

Breve descrizione delle figure

FIGG. 1 e 2: Struttura secondaria delle 3 calcitonine valutata mediante dicroismo circolare (CD) in acqua (Fig. 1), in metanolo (Fig. 2A) e in soluzione di SDS (Fig. 2B). Nel confronto, phCT mostra un contenuto elicoidale maggiore rispetto alla sCT (Fig. 1) e all’hCT nativa in tutti i solventi studiati (Figg. 1 e 2).

FIG. 3: Confronto tra le strutture della sCT e della phCT ottenute mediante "distance geometry" e calcoli di dinamica molecolare basate su dati di risonanza magnetica nucleare (NMR). Il confronto evidenzia come le sostituzioni introdotte nell’hCT, secondo i propositi iniziali, inducano effettivamente il ripiegamento della regione C terminale (identificata con C) sull’elica centrale simulando perfettamente la struttura tridimensionale della sCT.

FIG. 4: Confronto della cinetica di fibrillazione dell’hCT con phCT ed sCT mediante misure di fluorescenza della tioflavina aggiunta alle soluzioni. Il livello basale della fluorescenza dei campioni di phCT ed sCT su un periodo superiore alle 800 ore suggerisce che il mutante forma fibrille con cinetica simile alla sCT e non all’hCT da cui deriva strettamente. Al contrario, hCT raggiunge la fluorescenza massima in circa 48 ore a sostegno della cinetica veloce di fibrillazione.

FIG. 5: Livello intracellulare di cAMP indotto da hCT, sCT e phCT in cellule T47D.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Secondo la presente invenzione è stato modificato un peptide bioattivo (l'hCT) con lo scopo di ridurre la sua tendenza ad aggregare e a formare fibrille. In particolare, la nuova sequenza polipeptidica mostra un’elevata percentuale di identità (85%) con la sequenza nativa (struttura primaria), ed è stata ottenuta sostituendo alcuni amminoacidi con quelli corrispondenti (cioè nelle stesse posizioni) della sCT per indurre, nell’analogo umano, una struttura tridimensionale simile a quella assunta dalla sCT.

L’invenzione fornisce quindi un polipeptide bioattivo (hCT modificata, phCT, SEQ ID No 3) con un’omologia di sequenza > 85% con l’hCT (SEQ ID No 1), che presenta una drastica riduzione della tendenza all’aggregazione rispetto all’hCT nativa con innegabili vantaggi dal punto di vista applicativo.

La sequenza peptidica individuata (SEQ ID NO. 3, phCT) è la seguente:

CGNLSTCMLGTLTQDFHKFHTFPQTNTGVGTP-NH2con 5 mutazioni (nelle posizioni 12, 17, 26, 27 e 31) distribuite nelle regioni centrale e carbossi (C-) terminale (in grassetto sono indicati gli amminoacidi della sCT inseriti nell’hCT per generare la phCT).

Di solito, per scopi farmacologici, i peptidi modificati devono conservare dal 70% al 90% di omologia di sequenza col peptide nativo, e le modifiche sono di solito fatte per sostituzione degli amminoacidi corrispondenti. Un analogo della CT col 70% di omologia può mutare 10 residui (su 32), mentre col 90% può variare 3 residui (su 32). Le mo difiche devono comunque essere al minimo (6 residui o meno) in modo tale che il peptide modificato possa conservare l’attività del peptide nativo.

Da nostri studi precedenti [Amodeo, P., Motta, A., Strazzullo, G., and Castiglione Morelli, M. A. (1999) J. Biomolec. NMR 13, 161-174] risulta che la sCT, in presenza di sistemi solvente strutturanti (sodio dodecil solfato acquoso, metanolo, trifluoroetanolo, ecc.), assume un’elica nella regione centrale (residui 9-19), con la parte C-terminale (residui 24-32) ripiegata verso l’elica, assumendo così una struttura tridimensionale dall’aspetto cuneiforme. Al contrario, l’hCT assume un’elica più corta nella parte centrale (residui 13-19) senza alcuna interazione di questa con la regione C-terminale. L’idea di base per la progettazione dell’analogo dell’hCT è stata quella di indurre in phCT una struttura tridimensionale simile a quella presente nella sCT, struttura che riteniamo possa impedire l’interazione diretta tra molecole e quindi la fibrillazione. Dal confronto con la sCT sono state progettate per l’hCT modifiche che mirano al rafforzamento dell’elica centrale presente nella CT ma che non alterano il dominio ammino (N-) terminale compreso tra i residui 1 e 7. Per questo motivo abbiamo scelto di modificare l’hCT inserendo (utilizzando per gli amminoacidi il codice a lettera singola) una L nella posizione 12 (al posto di una Y), una H nella posizione 17 (al posto di una N), una N e una T nelle posizioni 26 e 27 (al posto di A e I, rispettivamente), e una T al sito 31 (al posto di una A). Le posizioni mutate 26, 27 e 31 hanno prodotto una riduzione della natura idrofobica della regione 26-32, sfavorendo così l’aggregazione della regione terminale, così come riportato per i decapeptidi ricavati dalla regione C-terminale di hCT e sCT [Moriarty, D. F, Vagts, S. and Raleigh, D. P. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 245, 344-348], Inoltre, la presenza di amminoacidi idrofilici nella porzione C-terminale ha favorito la formazione di legami a idrogeno interni, utili alla stabilizzazione dell’interazione elica-regione terminale. Le altre due sostituzioni hanno prodotto il rafforzamento dell’elica (la L nella posizione 12) grazie all’introduzione di un amminoacido carico (H al sito 17), che ha anche fatto da controparte nell’interazione cercata e favorito la solubilità dell’analogo progettato.

È stato osservato che il nuovo peptide presentava almeno la stessa attività del peptide originario sCT non modificato, non manifestava aggregazioni e presentava attività sensibilmente maggiore al suo omologo hCT. La variazione dell’attività indotta dalla modifica può essere verificata mediante saggi di attività biologica in vitro o in sistemi animali modello. Nel nostro caso, l’attività biologica della phCT è stata valutata misurando la variazione del livello di cAMP nella linea cellulare T47D (vedi sotto). Infatti, la CT nativa esplica la sua attività biologica aumentando, tra l’altro, il livello di cAMP. Di conseguenza, se il trattamento con CT induce un aumento di cAMP ciò implca che il peptide sotto esame è in grado di esplicare un’attività biologica simile a quella della CT nativa [Lamp, S. J., Findlay, D. M., Moseley, J. M. and Martin, T. J. (1981) J. Biol. Chem. 256, 12269-12274],

In generale, un polpeptide può essere prodotto per sintesi chimica o con tecniche di ingegneria genetica in vitro o in vivo.

Il peptide dell’invenzione, analogamente ad una CT nella sua forma nativa o mutata, può essere ottenuto, completamente o in parte, per sintesi peptidica chimica sia in fase liquida che in fase solida. La descrizione dei metodi è ben documentata [Guzmàn, F., Barberis, S. and Illanes, A. (2007) Elect. J. Biotechnol. 10, 279-314; Roberge, J. Y., Beebe, X. and Danishefsky, S. J. (1995) Science 269, 202-204; Stewart, J. M. and Young, J. D. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; Bodanzsky, M. and Bodanzsky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York; Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Ine., Foster City, California; Caruthers, M. H., Beaucage, S. L., Efcavitch, J. W., Fisher, E. F., Matteucci, M. D. and Stabinsky Y. (1980) Nucleic Acids Symp Ser. 7, 215-223; Horn, T., Vasser, M. P., Struble, M. E. and Crea R. (1980) Nucleic Acids Symp Ser. 7, 225-232; and Merrifield, J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154], I polipeptidi qui descritti possono essere preparati anche per combinazione di metodi: fase solda, fase lquida e chimica in soluzione.

È anche possibile produrre le calcitonine mediante sintesi automatica utilizzando, per esempio, un sintetizzatore automatico del tipo ABI 431 A Peptide Synthesizer, Applied Biosystems.

Ciascuna CT può avere un gruppo protettore ("capping group") per esempio un gruppo acetile all’estremità N-terminale e/o un gruppo ammidico all’estremità C-terminale. Dopo la sintesi, la CT può essere purificata mediante tecniche di HPLC [per. es., Creighton, T. E. (1996) Proteins: Structures and Molecular Properties 2<nd>edition, W. H.

Freeman and Co., New York, NY] o altre tecniche simili disponibili nel settore. La sequenza amminoacidica dei peptidi sintetici può essere confermata mediante la degradazione di Edman o tecniche di spettrometria di massa.

In alternativa, questi peptidi possono essere prodotti per mezzo di tecnologie del DNA ricombinante utilizzando un acido nucleico che contiene una sequenza nucleotidica codificante secondo metodiche ben consolidate [Sambrook, J. and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3<rd>edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2<nd>edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY],

Per acido nucleico si intende cDNA, DNA genomico o RNA, a doppio o singolo filamento ("doublé- or single-stranded").

L’acido nucleico può essere parzialmente o totalmente sintetico, in base al design. I codoni nucleotidici che codificano ciascun amminoacido sono ben noti nell’arte, inoltre secondo la degenerazione del codice genetico, parecchi polinucleotidi possono codificare lo stesso polipeptide. Ogni persona esperta è capace di identificare e/o progettare una sequenza adatta alla codifica di una specifica sequenza polipeptidica come quella dell’invenzione .

Gli acidi nucleici possono essere prodotti per via sintetica, coinvolgendo passaggi successivi secondo la sequenza desiderata, aggiungendo un nucleotide alla volta. Le tecniche da utilizzare in questo caso, incluse quelle automatiche, sono ben note nel settore. Gli acidi nucleici sintetizzati possono essere aggiunti l’uno all’altro per ottenere polinucleotidi più lunghi.

In alternativa, l’acido nucleico può essere prodotto mediante PCR o altre tecniche del DNA ricombinante.

Un acido nucleico codificante una CT modificata come quella qui descritta, può essere ottenuto mediante mutagenesi sito-specifica. Ciò può essere realizzato mediante PCR utilizzando un ohgonucleotide primer che porta la mutazione desiderata. L’uso di questo primer nella PCR introduce i cambi desiderati nella sequenza nucleotidica del prodotto amplificato. Possono essere apportate anche altre variazioni di sequenza per introdurre ad esempio siti di riconoscimento per enzimi di restrizione necessari per il clonaggio.

I polinucleotidi che codificano i polipeptidi dell’invenzione, utihzzando opportuni enzimi (di restrizione, hgasi ecc.), possono essere opportunamente clonati in vettori (plasmidi, cosmidi, ecc) e utilizzati dopo purificazione.

Un acido nucleico ottenuto secondo una delle procedure sopra descritte viene sequenziato per confermare la sequenza nucleotidica. Tecniche di sequenziamento sono ben note nel settore [Sambrook, J. and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Marmai, 3<rd>edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2<nd>edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY],

Per far esprimere una proteina da un gene clonato si usano i cosiddetti vettori di espressione (plasmidi, fagi, cosmidi , fasmidi e cromosomi artificiali), contenenti tutte le sequenze regolatrici necessarie allo scopo. Esistono vettori di espressione per sistemi procariotici, eucariotici o in grado di operare in entrambi (vettori "shuttle"). In tutti i casi, si tratta di vettori in cui un gene che codifica la proteina o il peptide di interesse viene posto sotto il controllo di forti sequenze regolative appartenenti ad un altro gene.

Il mercato offre un’ampia scelta di vettori per il clonaggio genico e l’espressione proteica. I vettori di espressione, così come quelli di clonaggio che contengono i polinucleotidi dell’invenzione, sono preparati facilmente secondo i protocolli ben noti nell’arte e sono quindi inclusi nella presente invenzione.

È possibile scegliere o costruire vettori contenenti appropriate sequenze regolatrici, che includano sequenze promoter, frammenti terminatori, sequenze di poliadenilazione, sequenze enhancer, geni marker ed altre sequenze ritenute utili. Per dettagli ulteriori consultare Sambrook, J. and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3<rd>edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. and Struhl, K. (1998) Current Protocols in Molecular Biology, 2<nd>edition. John Wiley & Sons, New York, NY.

Un vettore può essere introdotto in una cellula ospite utilizzando tecniche convenzionali (elettroporazione, precipitazione con calcio fosfato, transfezione con DEAE-destrano, ecc.).

È possibile ottenere il peptide di interesse sotto forma di una proteina chimerica cioè due polipeptidi diversi, fusi in modo da ottenere un’unica catena polipeptidica. Anche in questo caso si procede attraverso procedure ben note ed avendo a disposizione una vasta gamma di vettori commerciali preparati ad hoc per cui tali chimere sono da considerarsi un ulteriore aspetto di questa invenzione.

La procedura di espressione prevede la preparazione di cellule (eucariotiche o procariotiche) trasformate con i vettori che contengono i polinucleotidi dell’invenzione. Poiché queste cellule geneticamente modificate possono essere ottenute secondo le tecnologie note, le cellule che contengono tali vettori per la replicazione e l’espressione di un acido nucleico codificante la CT sono anch’esse da considerarsi un ulteriore aspetto di questa invenzione. Queste cellule possono essere microbiche come quelle del batterio E. coli, oppure cellule da mammifero come le CHO, COS7, P388, HepG2, KB, EL4 o Hela, cellule di insetti, lievito come Saccharomyces o cellule di piante, tipicamente colture quali di frumento, granturco o colza. Possono anche essere usati sistemi di espressione quali Baculovirus o vaccini. Le cellule trasformate possono esse poste in coltura in condizioni standard utilizzando mezzi di coltura disponibili commercialmente secondo le direttive delle case produttrici.

Una CT ottenuta mediante espressione in cellule ospiti può essere purificata mediante metodologie standard e/o seguendo i protocolli specifici per il sistema di espressione utilizzato secondo i suggerimenti forniti dalle case produttrici.

I polinucleotidi della presente invenzione potrebbero anche essere usati in terapia genica. Tali polinucleotidi potrebbero essere utilizzati per un trattamento in vivo o ex vivo. Il vettore (che può essere virale o non virale) contenente il transgene viene somministrato direttamente nel torrente circolatorio del paziente, nel caso di approccio in vivo, mentre viene messo a contatto con cellule o tessuti preventivamente prelevati dal paziente, i quali, una volta trattati in vitro, vengono ri-somministrati al paziente, nel caso di approccio ex vivo.

Le cellule potrebbero anche essere coltivate ex vivo alla presenza delle proteine della presente invenzione per proliferare o produrre l’effetto desiderato sull’ attività in tali cellule. Le cellule trattate potranno allora essere introdotte in vivo per gli scopi terapeutici.

La proteina della presente invenzione (da qualunque fonte derivi, includendo senza limitazioni le fonti ricombinanti e non-ricombinanti) può essere somministrata ad un paziente, da sola, o in composizioni farmaceutiche in cui è mescolata con adatti carrier o eccipienti adatti a dosi tali da migliorare o trattare una serie di affezioni. Tali composizioni possono anche contenere, oltre alla proteina e al carrier, diluenti, filler, sali, tamponi, stabilizzanti, solubilizzanti ed altri componenti ben noti nell’arte. Col termine "farmaceuticamente accettabili" si intendono materiali non tossici e che non interferiscono con l’efficacia dell’attività biologica degli ingredienti attivi. Le caratteristiche del carrier dipenderanno dalla via di somministrazione.

Le tecniche per la formulazione e la somministrazione dei composti dellinvenzione possono essere facilmente reperite [Gennaro, A. R.

(ed) (2000) Remington: thè Science and Practice of Pharmacy, 20<th>edition. Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore, MA; Gennaro, A. R. (ed) (2000) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20<th>edition. Mack Publishing Co., Easton, PA], Inoltre, una dose efficace dal punto di vista terapeutico si riferisce a quella quantità di composto sufficiente al miglioramento dei sintomi, per esempio, trattamento, cura, prevenzione o miglioramento dello stato medico relativo. Quando ci si riferisce ad un singolo ingrediente attivo, somministrato da solo, una dose efficace dal punto di vista terapeutico si riferisce a quell’ingrediente da solo.

Le vie di somministrazione adatte possono, per esempio, includere l’ingestione orale, rettale, vaginale, transmucosale, o intestinale; parenterale, comprese iniezioni intramuscolari, sottocutanee, intramidollari, intratecali, intraventricolari, endovenose, intraperitoneali, intranasali, o intraoculari. La somministrazione del polipeptide della presente invenzione impiegabile nelle composizioni farmaceutiche o nei metodi di trattamento secondo protocolli standard, può essere effettuata in una molteplicità di vie convenzionali, quali ingestione orale, inalazione, applicazione topica o cutanea, sottocutanea, intraperitoneale, parenterale o endovenosa.

Potenzialmente utile nelle varie forme di artrite primarie, secondarie e in patologie che simulano gli effetti dell’artrite, si può ritenere che il composto possa essere somministrato in maniera locale piuttosto che sistemica, per esempio, mediante iniezione del composto direttamente nelle giunzioni artritiche e/o nel tessuto fibrotico, spesso mediante formulazioni a rilascio ritardato. Ancora, si può somministrare il farmaco con un "delivery System", per esempio, liposomi rivestiti con anticorpi specifici, designati, per esempio, in modo da avere come bersaglio il tessuto artritico o fibrotico.

Le composizioni farmaceutiche per l’uso possono essere formulate in modo convenzionale per mezzo di uno o più carrier fisiologicamente accettabili, compresi gli eccipienti e gli adiuvanti che facilitano la preparazione dei principi attivi. Queste composizioni farmaceutiche possono essere prodotte in un modo in sé noto, per esempio, per mezzo dei processi convenzionali di miscelazione, dissoluzione, granulazione, confettamento, emulsionamento, incapsulamento, intrappolamento o liofilizzazione. La formulazione adeguata dipende dalla via di somministrazione scelta. Quando una dose terapeuticamente efficace di proteina è somministrata oralmente, la proteina dell’invenzione sarà sotto forma di tavolette, capsule, polvere, soluzioni o elisir. Quando somministrata in forma di tavolette, la composizione farmaceutica dell’invenzione può contenere ulteriormente un carrier solido quali una gelatina o un altro adiuvante. Le tavolette, capsule e polveri preferibilmente contengono circa 5-95% in peso di proteina, preferibilmente circa 25-90%. Quando somministrata in olio minerale liquido, possono essere aggiunti olio di soia, olio di sesamo oppure oli sintetici. La formulazione liquida della composizione farmaceutica può più ulteriormente contenere soluzione fisiologica, destrosio o soluzioni saccaridiche, o glicoli quali glicol etilenico, glicole propilenico o glicole polietilenico. Nella CT somministrata in forma liquida, la composizione farmaceutica contiene preferibilmente circa 0.5-90% in peso di proteina e più preferibilmente circa 1-50%.

Quando una quantità efficace di proteina viene somministrata tramite l’iniezione endovenosa, cutanea o sottocutanea, la proteina sarà sotto forma duna soluzione acquosa apirogena, parenteralmente accettabile. La preparazione di tali soluzioni parenteralmente accettabili della proteina, con riferimento a pH, isotonicità, stabilità e simili, sono alla portata dell’esperto del settore. Composizioni farmaceutiche preferite per le iniezioni endovenose, cutanee, o sottocutanee conterranno preferibilmente, oltre al principio attivo della presente invenzione, anche un veicolo isoto lattato, o l’altro veicolo noto nell’arte. La composizione farmaceutica di presente invenzione può anche contenere stabilizzanti, preservanti, tamponi, antiossidanti, o altri additivi conosciuti nell’arte. Per le iniezioni, il principio attivo può essere formulato in soluzioni acquose, preferibilmente in tamponi fisiologicamente accettabili quali la soluzione di Hanks o la soluzione di Ringer, o soluzione fisiologica tamponata. Per la somministrazione transmucosale si utilizzano i liquidi adatti a penetrare la barriera da permeare. Tali liquidi penetranti sono in generale noti nell’arte.

Per la somministrazione per via orale, il principio attivo può essere formulato combinando il principio attivo con i carrier farmaceuticamente accettabili ben noti nell’arte. Tali carrier permettono la formulazione in tavolette, pillole, confetti, capsule, liquidi, gel, sciroppi, slurrie, sospensioni e simili, adatti all’ingestione orale da parte del paziente da trattare. Le preparazioni farmaceutiche per uso orale possono essere approntate con eccipienti solidi ottenuti, eventualmente macinando la miscela risultante e processando la miscela di granuli, dopo l’aggiunta degli adiuvanti adatti, se si vogliono ottenere le tavolette o i confetti. Eccipienti adatti sono, in particolare, filler quali zuccheri (lattosio, saccarosio, mannitolo, sorbitolo), preparati della cellulosa [fecola di granturco, amido di grano, fecola di patate, amido di riso, gelatina, gomma adragante, idrossipropilmetilcellulosa, metilcellulosa, carbossimetilcellulosa sodica e/o polivinilpirrolidone (PVP)]. In caso si possono aggiungere agenti disgreganti, quab polivinil-pirrolidone reticolato, agar, acido alginico o sali corrispondenti, quale l’alginato di sodio. I confetti sono rivestiti con adatti composti noti. Per questo scopo si possono impiegare soluzioni concentrate di zucchero, che possono facoltativamente contenere gomma arabica, talco, biossido di titanio, polivinilpirrolidone, gel di carbopol, glicole pohetilenico e/o, soluzioni di lacca e adatti solventi o miscele di solventi. Coloranti o pigmenti possono essere aggiunti alle tavolette o ai rivestimenti dei confetti per identificare o caratterizzare le differenti combinazioni di dosi dei composti attivi.

Le preparazioni farmaceutiche che possono essere usate oralmente includono capsule di gelatina, rigide o morbide, capsule sigillate fatte di gelatina e un plastificante, quali glicerolo o sorbitolo. Le capsule rigide possono contenere gli ingredienti attivi in miscela con un riempitivo quale il lattosio, leganti quali gli amidi e/o lubrificanti quali talco o stearato di magnesio e, facoltativamente, stabilizzanti. Nelle capsule molli, i componenti attivi possono essere dissolti o sospesi in liquidi adatti, quab oli grassi, paraffine liquida, o glicoli polietilenici liquidi; più eventuali stabilizzanti. Tutte le formulazioni per la somministrazione per via orale dovranno contenere i dosaggi opportuni per questo tipo di somministrazione. Per la somministrazione orale, le composizioni possono avere la forma di tavolette o losanghe formulate in modo convenzionale.

Per la somministrazione per inalazione, i principi attivi della presente invenzione potranno essere veicolati convenientemente in forma di aerosol e spray in confezioni pressurizzate o in nebulizzatori, con propellenti quali diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, anidride carbonica o altro gas adatto. Le capsule e le cartucce, per esempio di gelatina, per uso inalatorio o insufflatorio possono essere formulate in modo da contenere una miscela del principio attivo in polvere e una base adatta in polvere, ad esempio di lattosio o amido.

Il principio attivo può essere formulato per somministrazione parenterale tramite l’iniezione, per esempio, iniezione di un bolo o infusione continua. Le formulazioni per l’iniezione possono essere presentate nella forma di dose unitaria, per esempio, in ampolle o in contenitori multidose, con un preservante aggiunto. Le composizioni possono essere in forma di sospensioni, soluzioni o emulsioni in veicoli oleosi o acquosi e possono contenere agenti formulanti quali gli agenti di sospensione, di stabilizzazione e/o di dispersione.

Le formulazioni farmaceutiche per l’uso parenterale includono le soluzioni acquose del principio attivo nella forma solubile in acqua. Inoltre, si possono anche preparare sospensioni del principio attivo come sospensioni oleose adatte per iniezione. I solventi o veicoli lipofili adatti includono i petroli grassi quale l’olio di sesamo, o esteri sintetici degli acidi grassi, quali oleato di etilie o trigliceridi, o liposomi. Le sospensioni acquose per iniezione possono contenere sostanze che aumentano la viscosità della sospensione, quali la carbossimetil-cellulosa di sodio, sorbitolo, o destrano. Facoltativamente, la sospensione può anche contenere stabilizzanti o agenti adatti ad aumentare la solubilità dei principi attivi per tenere conto della preparazione di soluzioni molto concentrate. Alternativamente, l’ingrediente attivo può essere in forma di polvere per la costituzione con un veicolo adatto, per esempio, acqua apirogena sterile, prima dell’uso.

Il principio attivo può essere fornito come sali farmaceuticamente accettabili. Sali farmaceuticamente accettabili sono quei sali che mantengono l’efficacia e le proprietà biologiche degli acidi liberi e che sono ottenuti per reazione con basi inorganiche o organiche quali l’idrossido di sodio, l’idrossido di magnesio, l’ammoniaca, la trialchilammina, la dialchilammina, la monoalchilammina, gli amminoacidi bibasici, l’acetato di sodio, il benzoato di potassio, la triethanolammina e simili. La quantità di principio attivo della presente invenzione nella composizione farmaceutica dipenderà dalla natura e dalla severità della condizione da trattare e dalla natura dei trattamenti precedenti cui il paziente è stato sottoposto. Infine, la valutazione del medico deciderà la quantità di principio attivo e la tempistica per il trattamento del ogni paziente. Generalmente, dopo la somministrazione iniziale del farmaco, è possibile prevedere lo stesso principio attivo o uno diverso in 1, 2, 3 o più somministrazioni separate di almeno 6, 12 ore, 1, 2, 5, 14 giorni, 1 mese o più.

La dose può essere determinata in base a vari parametri, tenendo presente specialmente la sostanza da somministrare ma anche l’età, il peso, e le condizioni del paziente da trattare, la via di somministrazione e il regime. Il medico determinerà il modo di somministrazione e il dosaggio relativo a ciascun paziente. Una dose idonea può tuttavia variare da 10 μg a 10 g, per es. da 100 μg a 1 g del principio attivo. Questi valori possono rappresentare la quantità totale somministrata durante tutto il trattamento o possono rappresentare la dose relativa a ciascuna somministrazione nel trattamento.

Le varie composizioni farmaceutiche usate per mettere in pratica il metodo della presente invenzione potranno contenere da 10 ng/ml a 10 pg/ml, fino a circa 0.50 mg/ml, fornendo preferibilmente da 100 pg fino a 250 mg/kg di peso corporeo prò die. Per le composizioni della presente invenzione che sono utili per le ossa, le cartilagini, i tendini o la rigenerazione dei legamenti, il metodo terapeutico include la somministrazione della composizione, sistemicamente, o localmente come impianto o dispositivo. Una volta somministrata, la composizione terapeutica dell’invenzione è, naturalmente, in forma apirogena e fisiologicamente accettabile. Inoltre, la composizione può preferibilmente essere incapsulata o iniettata in forma viscosa per veicolarla sull’osso, sulla cartilagine o sui tessuti danneggiati. Somministrazioni topiche possono essere adatte per la guarigione delle ferite e la riparazione dei tessuti. Agenti terapeutici utili oltre il principio attivo dell’invenzione che possono essere facoltativamente inclusi nella composizione come precedentemente descritto, possono essere alternativamente o ulteriormente somministrati in sequenza o simultaneamente. Preferibilmente per la formazione della cartilagine e/o dell’osso, la composizione includerà una matrice in grado di veicolare la composizione dell’invenzione localmente sull’osso e/o sulla cartilagine danneggiata, per riformare la struttura ossea e cartilaginea e poi essere adeguatamente riassorbita nel corpo.

La proteina phCT secondo l’invenzione consente una produzione e una manipolazione facilitate, e, col controllo dell’aggregazione, permette di impiegare dosi minori del farmaco che la contiene per ottenere lo stesso effetto, riducendo così la probabilità di indurre farmaco-resistenza. Inoltre, l’elevata identità di sequenza con l’hCT nativa consente al peptide modificato di avere un’attività fisiologica più simile a quella della nativa e quindi di minimizzare gli effetti collaterali e/o risposte indesiderate.

Gli esempi seguenti sono da considerare illustrativi e non limitativi della portata dell’invenzione.

PARTE SPERIMENTALE

Sintesi

Le calcitonine naturali hCT (umana, SEQ ID No 1) e sCT (salmone, SEQ ID No 2), e quella della presente invenzione phCT (SEQ ID No 3):

SEQ ID No 1: CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH2SEQ ID No 2: CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2 SEQ ID No 3: C GNLSTCMLGTLTQDFHKFHTFPQTNTGV GTP-NH2sono state sintetizzate in fase solida, con un ciclo 1-7 N-terminale e la prolina ammidata al C-terminale. I peptidi sono stati purificati per cromatografia (high performance liquid chromatography, HPLC) a fase inversa e caratterizzati mediante spettrometria di massa MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI; time-of-flight, TOF).

Studi strutturali

La caratterizzazione strutturale di hCT, phCT e sCT è stata ottenuta mediante dicroismo circolare (CD) e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR).

Le misure di CD sono state eseguite utilizzando uno spettropolarimetro JASCO-J710 collegato ad una cella termostatata. Gli spettri sono stati registrati nella regione del lontano UV (200-250 nm) a 300 K e pH 7.4 (10 mM Tris, 100 nM NaCl), con una concentrazione peptidica di 10 μΜ in una cella con un percorso ottico di 10 mm di lunghezza. Le misure sono state eseguite immediatamente dopo la dissoluzione dei campioni e da ogni spettro è stato sottratto, come riferimento, quello della soluzione tampone. È stata usata un’ampiezza di banda di 1.0 nm e una velocità di scansione di 10 nm/min. La precisione dei dati è stata migliorata sommando 5 scansioni, e i risultati sono stati riportati come ellitticità media per residuo (0). La predizione delle percentuali di struttura secondaria è stata ottenuta impiegando il software k2d [Andrade, M. A., Chacón, P. and Moràn, F. (1993) Protein Eng. 6, 383-390],

Gli spettri NMR sono stati acquisiti in 90%<1>Η2O/10%<2>Η2O e and 100%<2>H2O utilizzando una concentrazione di 1.0 x IO<3>M in presenza di SDS, aggiunto solido alle soluzioni di CT nel rapporto molare peptide-SDS di circa 1:120.

Gli spettri sono stati registrati a 600 MHz su uno spettrometro Bruker DRX-600 equipaggiato con un CryoProbe TCI dotato di sistema gradiente lungo l’asse Z. Come riferimento interno è stato utilizzato il 3-(trimetilsilil)-(2,2,3,3-<2>H4) propionato sodico. L’assegnamento dei segnali è stato ottenuto mediante spettri TOCSY [Braunschweiler, L. and Ernst, R. R. (1983) J. Magri. Reson. 53, 521-528], mentre i dettagli strutturali sono stati ricavati da spettri NOESY [Jeener, J., Meier, B. H., Bachmann, P. and Ernst, R. R. (1979) J. Chem. Phys. 71, 4546-4553],

Le informazioni ottenute dagli spettri NOESY (dove le intensità dei segnali dipendono dall’inverso della sesta potenza della distanza tra i nuclei in esame) sono state utilizzate per generare delle strutture tridimensionali con MOLMOL [Koradi, R., Billeter, M. and Wuthrich, K. (1996) J. Mol. Graph. 14, 51-55], successivamente raffinate mediante un protocollo di calcolo (AMBER6) comprendente "restrained simulated annealing" e minimizzazione energetica [Simmerling, C. L., Darden, T. A., Merz, K. M., Stanton, R. V., Cheng, A. L., Vincent, J. J., Crowley, M., Tsui, V., Radmer R., Duan, Y., Pitera, J., Massova, L, Seibel, G. L., Singh, U. C., Weiner, P. K. and Kollman, P. A. (1999) AMBER6, University of California, San Francisco, CA],

Studi sull’aggregazione

La formazione di fibrille da parte di hCT, sCT e phCT (0.10, 0.20 e 0.20 mg/ml, 20 °C, in 20 mM K2HPO4, pH 7.4, contenente 100 mM NaCl) in funzione del tempo è stata esaminata utilizzando misure di CD [Kamihira, M., Naito, A., Tuzi, S., Nosaka, Y. A. and Saito, H. (2000) Protein Sci. 9, 867-877] della componente monomerica assegnata alla struttura disordinata ("random coil") osservata a 205 nm.

Per concentrazioni più basse abbiamo usato misure della fluorescenza della tioflavina T ("ThT fluorescence"). Le calcitonine, ad una concentrazione di 420 μΜ, sono state sciolte in 1, 1,1, 3,3,3, -esafluoroisopropanolo e incubate a temperatura ambiente per 10 min. Aliquote delle soluzioni dei peptidi sono state diluite 10 volte in tampone Tris con 0.75 μΜ di ThT. I valori di fluorescenza sono stati misurati con un fluorimetro Jobin Yvon Horiba Fluoromax 3 immediatamente dopo la preparazione delle soluzioni finali e a vari intervalli di tempo, utilizzando un’eccitazione di 450 nm e un’emissione 480 nm.

Induzione da parte delle CT di cAMP nelle cellule T47D

Le cellule T47D sono state poste in coltura con DMEM ("Dulbecco’s modified Eagle’s medium") contenente 4.5 g/1 di glucosio e Ham’s F12 medium (1:1), con l’aggiunta di L-glutammina 2 mM, 10% FCS ("heat-inactivated fetal calf serum"), 25 pg/ml gentamicina e dexamethasone 100 nM, quest’ultimo per aumentare l’espressione di recettori della CT. Le cellule sono state cresciute in atmosfera umidificata con 5% CO2e 95% aria a 37 °C. Per le misure di cAMP, 100.000 cellule per pozzetto sono state piastrate in multiwell da 24 pozzetti raggiungendo la confluenza. Successivamente, le cellule sono state incubate in 200 μΐ del mezzo di binding insieme a isobutylmethylxanthine 1 mM per 15 min, 37 °C, in assenza e in presenza di ciascun peptide (precedentemente sciolto in PBS contenente 20 mg/ml di D-mannitolo). Dopo l’aspirazione del mezzo, si è proceduto all’estrazione di cAMP. Gli estratti di cAMP sono stati concentrati in uno SpeedVac, ricostituiti e il cAMP determinato mediante RIA come descritto [Moran, J., Hunziker, W. and Fischer, J. A. (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75, 3984-3988],

RISULTATI

Studi strutturali

La Figura 1 mostra gli spettri di CD dei 3 peptidi a pH 7.4, 300 K. La predizione della struttura secondaria indica per hCT, sCT e phCT un contenuto di a elica del 12.3%, 21.9% e 23.5%, rispettivamente. La percentuale di elica stimata mediante NMR, in base alla distribuzione di Chemical shift (dati non mostrati), rispecchia i valori ottenuti dagli spettri di CD. Anche in solventi strutturanti, quali il metanolo e l’SDS, la phCT mostra un contenuto elicoidale maggiore rispetto alla hCT nativa (Figura 2).

Uno dei punti chiave della presente invenzione era l’ottenimento di un mutante dell’hCT a più alto contenuto elicoidale rispetto al peptide nativo. I dati sopra riportati indicano chiaramente che la molecola progettata ha raggiunto le finalità che ci eravamo prefissi. Altro punto importante era l’induzione di una struttura terziaria in phCT simile a quella di sCT, che non forma fibrille. Abbiamo in precedenza riportato che solventi strutturanti quali metanolo e SDS acquoso inducono nella sCT un’interazione della regione C-terminale con l’elica centrale. Essa è stata identificata in base ai contatti tra le seguenti coppie di residui: H17-T31, K18-N26 e L19-N26 [Castiglione Morelli, M. A., Pastore, A. and Motta, A. (1992) J. Biomolec. NMR 2, 335-348], La struttura tridimensionale del peptide phCT è stata studiata mediante esperimenti NMR NOESY. Tali esperimenti rilevano le interazioni spaziali mediante rilassamento nucleare, evidenziando così contatti tra amminoacidi distanti nella molecola. Le strutture della sCT e della phCT, calcolate come sopra indicato, mostrano una sostanziale somiglianza tra le strutture tridimensionali (Figura 3), confermando che gli amminoacidi introdotti nella hCT sono stati in grado di indurre il ripiegamento della regione C-terminale sull’elica centrale. Infatti, essi hanno dato luogo ai contatti H17-V29, L19-N26 e T21-T31, che danno conto della struttura mostrata in Figura 3.

Studi sull’aggregazione

La cinetica di aggregazione di phCT è stata monitorata in vitro mediante misure di CD e di fluorescenza della tioflavina, precedentemente aggiunta alle soluzioni. Il confronto con misure corrispondenti sulla hCT non modificata e sulla sCT può essere considerato un valido controllo dell’effetto delle modifiche progettate.

La formazione di fibrille da parte di hCT (0.10 e 0.20 mg/ml, 20 °C in 20 mM K2HPO4, pH 7.4, contenente 100 mM Na1l), in funzione del tempo, è stata esaminata inizialmente utilizzando misure di CD. La componente monomerica assegnata alla struttura disordinata (random coil, osservata 205 nm) diminuisce gradualmente in 6 ore a 0.2 mg/ml, come riportato in letteratura, e rimane inalterata anche a concentrazioni più basse fino a 24 ore. Per phCT e sCT, studiate nelle stesse condizioni, l’elhtticità a 205 nm rimane inalterata per 24 ore sia a 0.1 sia a 0.2 mg/ml, suggerendo per esse una cinetica di fibrillazione molto più lenta di quella della hCT.

La cinetica è stata seguita anche a concentrazioni più basse utilizzando la fluorescenza della tioflavina T ("ThT fluorescence"). La Figura 4 mostra che hCT aumenta il valore della fluorescenza, raggiungendo il livello massimo in meno di 48 ore, suggerendo un processo rapido di fibrillazione. Al contrario, il comportamento di phCT è identico a quello di sCT, ed entrambi i peptidi mostrano un basso valore di fluorescenza durante tutto l’intervallo dell’esperimento (circa 860 ore). Questo risultato conferma che il processo di fibrillazione di phCT è molto più lento di quello dell’hCT nativa ed è assolutamente identico a quello della sCT. I campioni sono stati in seguito esaminati mediante Transmission Electron Microscopy per l’an alisi della struttura delle fibrille (dati non mostrati). L’hCT ha formato immediatamente placche amiloidee con frequenza elevata immediatamente dopo l’inizio dell’incubazione. Al contrario, le fibrille di sCT sono risultate molto scarse anche dopo 60 giorni dall’incub azione. Analogo comportamento è stato osservato per phCT e, a conferma dei dati di CD e di fluorescenza, dopo 60 giorni phCT mostra strutture amorfe e scarsissimi aggregati, molto corti e rari.

In base ai dati riportati si può affermare che il tempo richiesto per la formazione di fibrille da parte del mutante phCT è almeno 2 ordini di grandezza superiore rispetto a quello richiesto per la hCT nativa e assolutamente confrontabile, se non superiore, alla sCT.

Attività fisiologica

Il passo successivo è stato quello di stimare l’attività di phCT, valutando se essa è paragonabile a quella di una CT ("calcitonin-like") per essere utilizzata in terapia. L’attività è stata monitorata in vitro in cellule di carcinoma della mammella T47D misurando il livello di cAMP indotto da hCT, sCT e phCT. Infatti, tra le sue azioni, la CT aumenta l’attività della fosfatasi alcalina e i livelli di cAMP [Wohlwend, A., Malmstròm, K., Henke, H., Murer, H., Vassalli, J. D. and Fischer, J. A. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 131, 537-542],

Sono state analizzate diluizioni differenti degli estratti cellulari per coprire l’intero range di stimolazioni indotte delle calcitonine. I risultati sono riportati nella Figura 5. In tutti i casi, la stimolazione osservata è circa 3 ordini di grandezza rispetto ai livelli basali. I tre peptidi mostrano chiari effetti di stimolazione confermando l’attività simil-CT del peptide ingegnerizzato phCT. Tuttavia, l’effetto di stimolazione ottenuto incubando le cellule con phCT è chiaramente più alto di hCT e di sCT, quest’ultima impiegata nel trattamento farmacologico.

Tutti i risultati riportati dimostrano che la strategia seguita per il design del mutante phCT è valida e molto potente per la progettazione di nuove forme di CT che, conservando un’elevata omologia di sequenza con la forma umana, possano mostrare una notevole riduzione della cinetica di fibrillazione e conservare o addirittura migliorare la propria attività, rendendo queste CT candidati ideali per l’uso terapeutico integrando o sostituendo le attuali forme di CT usate nella terapia.

Tenuto conto che la sCT (Miacalcin, Novartis) è stata approvata dalla Food and Drug Administration (FDA) americana per il trattamento dell’osteoporosi (nella composizione iniettabile e intranasale) e per il trattamento della malattia di Paget e dell’ipercalcemia (nella composizione iniettabile) [Levine, J. P. (2006) Clin. Cornerstone 8, 40-53; Zizic, T. M. (2004) Am. Fam. Physician 70, 1293-1300] e che nello studio "Prevent Recurrence of Osteoporotic Fracture (PROOF)" [Chesnut, C. H. Ili, Silverman, S., Andriano, K., Genant, H., Gimona, A., Harris, S., Kiel, D., LeBoff, M., Maricic, M., Miller, P., Moniz, C., Peacock, M., Richardson, P., Watts, N. and Baylink, D. (2000) Am. J. Med. 109, 2670-2676], che esaminava gli effetti della sCT intranasale per la prevenzione delle fratture da osteoporosi, è stato riportato che in donne in menopausa da più di 5 anni, l’uso di sCT intranasale, con una dose di 200 IU una volta al giorno, previene il rischio di nuove fratture vertebrah riducendole del 33-36% rispetto a donne trattate con placebo [Delaney, M. F. (2006) Am. J. Obstet. Gynecol. 194, S12-S23; Mulder, J. E., Kolatkar, N. S. and LeBoff, M. S. (2006) Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab. 2, 670-680]; visto inoltre che negli Stati Uniti vengono prescritte circa 5 milioni di dosi di CT ogni anno sia per la prevenzione che per il trattamento dell’osteoporosi [citato in Stevenson, M., Lloyd Jones, M., De Nigris, E., Brewer, N., Davis, S. and Oakley, J. (2005) Health Technol. Assess. 9,1-160] e che la CT presenta proprietà analgesiche che la rendono utile nei pazienti con dolori collegati a fratture vertebrah, specialmente nella fase acuta [Keen R. (2007) Best Pract. Res. Clin. Rheumatol. 21,109-122], si ritiene la phCT un ottimo sostituto degli analoghi ad oggi in commercio in quanto la possibilità di eliminare gli effetti collaterali associati all’uso della sCT utilizzando la phCT dell’invenzione apre nuove possibilità terapeutiche nel trattamento e nella prevenzione di tutte le patologie citate.

Claims (33)

1. RIVENDICAZIONI 1. Polinucleotide isolato che codifica per la proteina phCT avente sequenza SEQ IN NO 3.
2. 2. Polinucleotide avente una sequenza che ib ri dizza, oppure è gnomica oppure è un cDNA oppure è un RNA del polinucleotide della riv. 1.
3. 3. Polinucleotide comprendente il polinucleotide delle riv. 1 o 2.
4. 4. Vettore comprendente il polinucleotide secondo le riv. 1-3.
5. 5. Cellule comprendenti il vettore secondo la riv. 4.
6. 6. Batteri trasformati con il vettore secondo la riv. 4.
7. 7. Organismi pluricellulari contenenti le cellule secondo la riv. 5.
8. 8. Polipeptide phCT avente sequenza SEQ IN NO 3.
9. 9. Polipeptide comprendente la sequenza SEQ IN NO 3.
10. 10. Anticorpi per i polipeptide secondo le riv. 8 o 9.
11. 11. Polipeptide secondo le riv. 8 o 9 o polinucleotide secondo le riv. 1-3 da impiegare per uso farmaceutico.
12. 12. Procedimento per la preparazione del polipeptide phCT comprendente gli stadi di: far crescere le cellule secondo la riv. 5 in un mezzo di coltura e purificare il polipeptide dalla coltura.
13. 13. Composizioni farmaceutiche comprendenti le sequenze polinucleotide secondo le riv. 1-3 o polipeptidiche secondo le riv. 8 o 9 o da impiegare per uso farmaceutico.
14. 14. Composizioni secondo la riv. 13 comprendenti ulteriormente carriers farmaceuticamente accettabili.
15. 15. Composizioni secondo le riv. 13- 14 comprendenti ulteriormente diluenti, filler, sali, soluzioni tampone, stabilizzanti, solubilizzanti.
16. 16. Composizioni secondo le riv. 13- 15 formulate per l’ingestione orale, rettale, vaginale, transmucosale, intestinale; intranasale, intraoculare, parenterale, comprese iniezioni endovenose, intramuscolari, intraperitoneali, sottocutanee, intramidollari, intratecali o intraventricolari; per inalazioni, per applicazioni topiche, cutanee, sottocutanee o somministrazioni locali, mediante iniezione direttamente nelle giunzioni artritiche e/o nel tessuto fibrotico,.
17. 17. Composizioni secondo le riv. 13- 15 formulate per formulazioni a rilascio ritardato, come sistemi di delivery, quali i liposomi rivestiti.
18. 18. Composizioni secondo le riv. 13- 15 per la prevenzione e il trattamento delle affezioni correlate con le alterazioni del metabolismo del calcio nei mammiferi, in particolare l’uomo.
19. 19. Composizioni secondo le riv. 13- 15 per la prevenzione e il trattamento dell ’ipercalcemia dovuta ai tumori quali i mielomi, il cancro del seno, del polmone, del rene, della cervice uterina, dell’utero e dell’ovaio; all ’iperparatiroidismo primario; all’ aumentato turnover osseo che induce una patologica secrezione di fostatasi alcalina e idrossiprolina.
20. 20. Composizioni secondo le riv. 13- 15 per la prevenzione e il trattamento delle lesioni ossee o fratture ripetute.
21. 21. Composizioni secondo le riv. 13- 15 per la prevenzione e il trattamento delle patologie e disfunzioni ossee, in particolare la malattia di Paget (osteitis deformans), l’osteoporosi, l’ipercalcemia, i dolori muscoloscheletrici e l’osteosarcoma.
22. 22. Composizioni secondo le riv. 13- 15 come analgesico nell’osteosarcoma.
23. 23. Composizioni secondo le riv. 13- 15 per la prevenzione e il trattamento delle forme di artrite primaria, secondaria e delle patologie che simulano gli effetti dell’artrite.
24. 24. Composizioni secondo le riv. 13- 15 come anoressizzanti.
25. 25. Composizioni secondo le riv. 13- 15 per ridurre l’appetito, per esempio nel trattamento dell’obesità.
26. 26. Impiego delle composizioni secondo le riv. 13-25 per la preparazione di farmaci per la prevenzione e il trattamento delle affezioni correlate con le alterazioni del metabolismo del calcio nei mammiferi, in particolare l’uomo.
27. 27. Impiego delle composizioni secondo le riv. 13-25 per la preparazione di farmaci per la prevenzione e il trattamento dell’ipercalcemia dovuta ai tumori quali i mielomi, il cancro del seno, del polmone, del rene, della cervice uterina, dell’utero e dell’ovaio; all’iperparatiroidismo primario; all’ aumentato turnover osseo che induce una patologica secrezione di fostatasi alcalina e idrossiprolina.
28. 28. Impiego delle composizioni secondo le riv. 13-25 per la preparazione di farmaci per la prevenzione e il trattamento delle lesioni ossee o fratture ripetute.
29. 29. Impiego delle composizioni secondo le riv. 13-25 per la preparazione di farmaci per la prevenzione e il trattamento delle patologie e disfunzioni ossee, in particolare la malattia di Paget (osteitis deformans), l’osteoporosi, l’ipercalcemia, i dolori muscoloscheletrici e l’osteosarcoma.
30. 30. Impiego delle composizioni secondo le riv. 13-25 per la preparazione di farmaci analgesici nell’osteosarcoma.
31. 31. Impiego delle composizioni secondo le riv. 13-25 per la preparazione di farmaci per la prevenzione e il trattamento delle forme di artrite primaria, secondaria e delle patologie che simulano gli effetti dell’artrite.
32. 32. Impiego delle composizioni secondo le riv. 13-25 per la preparazione di farmaci anoressizzanti.
33. 33. Impiego delle composizioni secondo le riv. 13-25 per la preparazione di farmaci per ridurre l’appetito, per esempio nel trattamento dell’obesità.