ITPZ20120006A1 - YEAST OF SPECIES SACCHAROMYCES CEREVISIAE - Google Patents
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-
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Description
"CEPPO DI LIEVITO DELLA SPECIE SACCHAROMYCES CEREVISIAE" "YEAST STRAIN OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE SPECIES"
CAMPO DI APPLICAZIONE FIELD OF APPLICATION
II presente trovato si riferisce ad un nuovo ceppo della specie Saccharomyces cerevisiae ed ai suoi usi, in particolare, ma non limitativamente, nella panificazione. The present invention refers to a new strain of the Saccharomyces cerevisiae species and to its uses, in particular, but not limited to, in bread making.
STATO DELLA TECNICA STATE OF THE TECHNIQUE
È noto, nella panificazione, che l’uso di lieviti naturalmente presenti nell’impasto e selezionati per parametri tecnologici di interesse consente di migliorare le caratteristiche organolettiche e nutrizionali del pane prodotto. In particolare, generalmente vengono utilizzati ceppi appartenenti alla specie Saccharomyces cerevisiae che giocano un ruolo fondamentale per la produzione di gas (anidride carbonica), per la lievitazione dell’impasto e la produzione di aromi. Attualmente, nella panificazione vengono utilizzati tre tipi di lievito: It is known, in bread making, that the use of yeasts naturally present in the dough and selected for technological parameters of interest allows to improve the organoleptic and nutritional characteristics of the bread produced. In particular, strains belonging to the Saccharomyces cerevisiae species are generally used, which play a fundamental role in the production of gas (carbon dioxide), for the leavening of the dough and the production of aromas. Currently, three types of yeast are used in bread making:
- lievito industriale compresso; - compressed industrial yeast;
-lievito chimico; -chemical yeast;
- lievito naturale o madre acida. - natural yeast or sour mother.
Il lievito industriale à ̈ detto anche lievito di birra, poiché una volta veniva prodotto dagli scarti di lavorazione della birra. Oggi à ̈ prodotto a partire dal melasso, un sottoprodotto della produzione dello zucchero, viene commercializzato sottoforma di panetti di colore grigio scuro di circa 25 g e conservato in luogo fresco e asciutto. In commercio si trova anche il lievito secco attivo, ottenuto mediante essiccazione a letto fluido fino ad un'umidità residua inferiore all'8%, confezionato sottovuoto e caratterizzato da un elevato potere lievitante e conservabilità per 1 anno a temperatura ambiente. Industrial yeast is also called brewer's yeast, as it was once produced from beer processing waste. Today it is produced from molasses, a by-product of sugar production, is marketed in the form of dark gray blocks of about 25 g and stored in a cool and dry place. On the market there is also active dry yeast, obtained by fluid bed drying up to a residual humidity of less than 8%, vacuum packed and characterized by a high leavening power and shelf life for 1 year at room temperature.
Il lievito chimico in polvere viene normalmente utilizzato per la produzione di paste e torte dolci e salate, ma può essere utilizzato anche per la produzione di pane. Esso à ̈ principalmente costituito da una combinazione di una sostanza alcalina (principalmente bicarbonato di sodio o di ammonio) ed una acida (acido tartarico), con la caratteristica di produrre anidride carbonica quando à ̈ sottoposto a calore e viene usato per fare aumentare di volume l’impasto. Powdered chemical yeast is normally used for the production of sweet and savory pastries and cakes, but it can also be used for the production of bread. It is mainly made up of a combination of an alkaline substance (mainly sodium or ammonium bicarbonate) and an acid one (tartaric acid), with the characteristic of producing carbon dioxide when it is subjected to heat and is used to increase volume. the dough.
Il terzo, detto anche lievito madre o pasta acida, à ̈ costituito da una miscela di sola acqua e farina, che viene lasciata riposare in ambiente tiepido per permettere lo sviluppo spontaneo di microrganismi presenti nella farina e nell’ambiente di lavorazione. Tali impasti acidi o "sourdoughs" sono, infatti, impasti ottenuti dalla fermentazione spontanea condotta da microrganismi non selezionati presenti nella farina (batteri lattici e lieviti indigeni) e rappresentano l'inoculo microbico naturale utilizzato per la produzione di pane e altri prodotti da forno. Gli impasti acidi, utilizzati a livello artigianale per la produzione di pani tipici sono costituiti da un complesso sistema biologico, in cui sono presenti lieviti ( Saccharomyces cerevisiae, Candida krusei, Hansenula anomala, etc.), la cui attività influenza il processo di lievitazione, e batteri lattici (LAB) omo ed eterofermentanti ( Lactobacillus sanfranciscensis, Lb. brevis, Lb. fermentum, Lb. pontis, Lb. panis, Lb. mindensis, Lb. plantarum, etc.) che, con i prodotti del loro metabolismo, influiscono positivamente sulle caratteristiche strutturali ed organolettiche del prodotto finito, oltre che sulla conservabilità . Diversi sono i fattori che influenzano il tipo di microflora presente: quantità e qualità delle componenti chimiche della farina, parametri di processo, quali temperatura e tempo di fermentazione, condizioni ambientali che promuovono la selezione di questo complesso sistema biologico, in cui coesistono batteri lattici e lieviti. Questo tipo di inoculo presenta il vantaggio di conferire al prodotto finito caratteristiche sensoriali eccellenti (produzione di acidi organici e precursori di aromi), influenzare positivamente la tessitura della crosta e della mollica (maggiore capacità di trattenere acqua, maggiore elasticità e maggiore lavorabilità ), favorire la shelf-life del prodotto finito mediante la prevenzione di alterazioni microbiche e mediante la riduzione della velocità di raffermamento ma ha anche l'inconveniente dei tempi di lavorazione più lunghi. The third, also called mother yeast or sourdough, consists of a mixture of only water and flour, which is left to rest in a warm environment to allow the spontaneous development of microorganisms present in the flour and in the processing environment. These acid mixtures or "sourdoughs" are, in fact, mixtures obtained from the spontaneous fermentation carried out by unselected microorganisms present in the flour (lactic acid bacteria and indigenous yeasts) and represent the natural microbial inoculum used for the production of bread and other baked goods. The acid mixtures, used on an artisanal level for the production of typical breads, consist of a complex biological system, in which there are yeasts (Saccharomyces cerevisiae, Candida krusei, Hansenula anomala, etc.), whose activity influences the leavening process, and homo- and heterofermentative lactic bacteria (LAB) (Lactobacillus sanfranciscensis, Lb. brevis, Lb. fermentum, Lb. pontis, Lb. panis, Lb. mindensis, Lb. plantarum, etc.) which, with the products of their metabolism, affect positively on the structural and organoleptic characteristics of the finished product, as well as on the shelf life. There are several factors that influence the type of microflora present: quantity and quality of the chemical components of the flour, process parameters, such as temperature and fermentation time, environmental conditions that promote the selection of this complex biological system, in which lactic bacteria and yeasts. This type of inoculum has the advantage of giving the finished product excellent sensory characteristics (production of organic acids and precursors of aromas), positively influencing the texture of the crust and crumb (greater capacity to retain water, greater elasticity and greater workability), favoring the shelf-life of the finished product through the prevention of microbial alterations and through the reduction of the stale speed but also has the drawback of longer processing times.
Uno scopo del presente trovato à ̈ quello di mettere a disposizione un nuovo ceppo di lievito della specie Saccharomyces cerevisiae. An object of the present invention is to provide a new yeast strain of the Saccharomyces cerevisiae species.
Altro scopo del presente trovato à ̈ quello di fornire un nuovo ceppo di lievito della specie Saccharomyces cerevisiae per l’uso nella produzione di prodotti da forno a pasta lievitata, ad esempio nella panificazione. Another object of the present invention is to provide a new yeast strain of the Saccharomyces cerevisiae species for use in the production of leavened dough bakery products, for example in bread making.
Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato. In order to obviate the drawbacks of the known art and to obtain these and further objects and advantages, the Applicant has studied, tested and implemented the present invention.
Salvo che siano definiti altrimenti, tutti i termini tecnici e scientifici utilizzati qui e di seguito hanno lo stesso significato comunemente inteso da una persona di ordinaria esperienza nel campo della tecnica cui appartiene il presente trovato. Anche se metodi e materiali simili o equivalenti a quelli qui descritti possono essere utilizzati nella pratica o nelle prove di verifica del presente trovato, di seguito sono descritti, a titolo di esempio, i metodi e i materiali. In caso di conflitto prevale la presente domanda, incluse le definizioni. I materiali, metodi ed esempi hanno carattere puramente illustrativo e non devono essere intesi in modo limitativo. Unless otherwise defined, all the technical and scientific terms used here and hereafter have the same meaning commonly understood by a person of ordinary experience in the field of the art to which the present invention belongs. Even if methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or in the verification tests of the present invention, the methods and materials are described below, by way of example. In the event of a conflict, this question, including the definitions, prevails. The materials, methods and examples are purely illustrative and should not be construed as limiting.
Il termine “comprendere†e varianti di tale termine come “comprende†, “comprendente†e “comprendendo†sono qui utilizzati per indicare l’inclusione di un elemento intero chiaramente espresso o di elementi interi chiaramente espressi ma non l’esclusione di qualsiasi altro elemento intero o qualsiasi altri elementi interi, a meno che nel contesto o nell’uso sia richiesta un interpretazione esclusiva del termine. The term â € œunderstandingâ € and variants of this term such as â € œincludingâ €, â € œincludingâ € and â € œunderstandingâ € are used here to indicate the inclusion of a clearly expressed integer element or of clearly expressed integer elements but not the Exclusion of any other whole element or any other whole element, unless an exclusive interpretation of the term is required in context or usage.
ESPOSIZIONE DEL TROVATO EXPOSURE OF THE FOUND
Il presente trovato à ̈ espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti, mentre le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell’idea di soluzione principale. The present invention is expressed and characterized in the independent claims, while the dependent claims set out other characteristics of the present invention or variants of the main solution idea.
In accordo con i suddetti scopi, un aspetto del presente trovato à ̈ relativo ad un nuovo ceppo di Saccharomyces cerevisiae M5-15 depositato presso Industriai Yeasts Collection DBVPG in data 10 Febbraio 2012 con numero di accesso 32P, oppure un suo omologo, discendente o mutante. In accordance with the aforementioned purposes, an aspect of the present invention relates to a new strain of Saccharomyces cerevisiae M5-15 deposited at Industriai Yeasts Collection DBVPG on 10 February 2012 with access number 32P, or its counterpart, descendant or mutant .
Si deve considerare che un omologo di Saccharomyces cerevisiae M5-15 sarà da intendersi come riferimento a qualsiasi ceppo avente una omologia di sequenza, determinata a livello genomico completo, maggiore del 40% con la sequenza del Saccharomyces cerevisiae M5-15 (d’ora in avanti riferito come “M5-15†). Preferibilmente, un omologo M5-15 à ̈ un omologo che possiede una omologia di sequenza con M5-15 maggiore del 70%, più preferibilmente maggiore del 85%, ancor più preferibilmente maggiore del 90%, specialmente preferibile maggiore del 95%, ancor più specialmente preferibile maggiore del 99% (o qualsiasi intervallo tra qualsiasi dei suddetti valori). It must be considered that a homolog of Saccharomyces cerevisiae M5-15 will be intended as a reference to any strain having a sequence homology, determined at the complete genomic level, greater than 40% with the sequence of Saccharomyces cerevisiae M5-15 (now forward referred to as â € œM5-15â €). Preferably, an M5-15 homolog is a homolog having a sequence homology with M5-15 greater than 70%, more preferably greater than 85%, even more preferably greater than 90%, especially preferably greater than 95%, even more especially preferable greater than 99% (or any range between any of the above values).
M5-15 rappresenta un nuovo ceppo isolato appartenente alla specie Saccharomyces cerevisiae. I termini M5-15, Saccharomyces cerevisiae M5-15 e S. cerevisiae M5-15 sono utilizzati in modo intercambiabile per riferirsi a questo nuovo ceppo di Saccharomyces cerevisiae. M5-15 represents a new isolated strain belonging to the Saccharomyces cerevisiae species. The terms M5-15, Saccharomyces cerevisiae M5-15 and S. cerevisiae M5-15 are used interchangeably to refer to this new strain of Saccharomyces cerevisiae.
Gli autori del presente trovato hanno isolato e identificato il nuovo ceppo di lievito M5-15 che ha mostrato, ad esempio, una significativa differenza rispetto al lievito di birra abitualmente utilizzato nei panifici, in termini sia di performance fermentativa che di influenza sull’aroma del pane ottenuto. The authors of the present invention have isolated and identified the new strain of yeast M5-15 which showed, for example, a significant difference compared to the brewer's yeast usually used in bakeries, in terms of both fermentation performance and influence on aroma. of the bread obtained.
Pertanto, il presente trovato prevede, secondo un ulteriore aspetto, l'uso di M5-15 come starter microbico selezionato per la produzione del pane od analoghi, simili od assimilabili prodotti da forno a pasta lievitata. Therefore, according to a further aspect, the present invention provides for the use of M5-15 as a selected microbial starter for the production of bread or analogous, similar or assimilable bakery products with leavened dough.
Un ulteriore aspetto del presente trovato riguarda l'uso di M5-15 come starter microbico selezionato per la produzione del pane con un inoculo su scala industriale pari a 1% (w /w) e densità cellulare di 7x10<9>UFC/g al fine di ottenere un pane od analogo, simile od assimilabile prodotto da forno a pasta lievitata, che possa esaltare gli aromi e i sapori tipici. A further aspect of the present invention relates to the use of M5-15 as a microbial starter selected for the production of bread with an inoculum on an industrial scale equal to 1% (w / w) and cell density of 7x10 <9> UFC / g at the purpose of obtaining a bread or similar, similar or comparable bakery product with leavened dough, which can enhance the typical aromas and flavors.
Altro aspetto del presente trovato à ̈ una composizione lievitante per prodotti da forno a pasta lievitata, quali pane, comprendente Saccharomyces cerevisiae M5-15. Ancora, un aspetto del presente trovato à ̈ una composizione lievitante per la fermentazione per prodotti da forno a pasta lievitata, quali pane, comprendente Saccharomyces cerevisiae M5-15. Another aspect of the present invention is a leavening composition for leavened dough bakery products, such as bread, comprising Saccharomyces cerevisiae M5-15. Again, an aspect of the present invention is a leavening composition for fermentation for leavened dough bakery products, such as bread, comprising Saccharomyces cerevisiae M5-15.
Ulteriore aspetto del presente trovato à ̈ un agente miglioratore di aroma per prodotti da forno a pasta lievitata comprendente Saccharomyces cerevisiae M5-15. Rientra nel presente trovato, anche un metodo per la produzione di un impasto per prodotti da forno a pasta lievitata, quale pane, che prevede l’uso di ingredienti che comprendono farina e acqua e, inoltre, Saccharomyces cerevisiae M5-15 oppure una composizione lievitante come sopra espressa ed opzionalmente una composizione per la fermentazione come nella rivendicazione e/o un agente come sopra espressi. A further aspect of the present invention is a flavor improver agent for leavened dough bakery products comprising Saccharomyces cerevisiae M5-15. The present invention also includes a method for the production of a dough for leavened dough bakery products, such as bread, which provides for the use of ingredients which include flour and water and, moreover, Saccharomyces cerevisiae M5-15 or a composition leavening agent as expressed above and optionally a composition for fermentation as in the claim and / or an agent as expressed above.
Ancora, fa parte del presente trovato un impasto per un prodotto da forno a pasta lievitata, quale pane, comprendente farina e acqua e, inoltre, Saccharomyces cerevisiae M5-15 oppure una composizione lievitante come sopra espressa ed opzionalmente una composizione per la fermentazione come nella rivendicazione e/o un agente come sopra espressi. Also part of the present invention is a dough for a leavened dough bakery product, such as bread, comprising flour and water and, furthermore, Saccharomyces cerevisiae M5-15 or a leavening composition as expressed above and optionally a composition for fermentation as in claim and / or an agent as set forth above.
Ancora, à ̈ nello spirito del presente trovato un metodo per la produzione di prodotti da forno a pasta lievitata, quale panificazione, che comprende la preparazione di un impasto comprendente farina e acqua e, inoltre, Saccharomyces cerevisiae M5-15 oppure una composizione lievitante come sopra espressa ed opzionalmente una composizione per la fermentazione come nella rivendicazione 6 e/o un agente come sopra espressi, la lievitazione dell’impasto e la cottura a forno dell’impasto lievitato. Infine, fa parte del presente trovato un prodotto da forno a pasta lievitata, quale pane, ottenibile mediante un metodo come sopra espresso. Furthermore, it is in the spirit of the present invention a method for the production of leavened dough bakery products, such as bread-making, which comprises the preparation of a dough comprising flour and water and, furthermore, Saccharomyces cerevisiae M5-15 or a leavening composition such as expressed above and optionally a composition for fermentation as in claim 6 and / or an agent as expressed above, the leavening of the dough and the baking of the leavened dough. Finally, part of the present invention is a leavened dough bakery product, such as bread, obtainable by means of a method as described above.
ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI ILLUSTRATION OF DRAWINGS
Queste ed altre caratteristiche del presente trovato appariranno chiare dalla seguente descrizione di alcune forme di realizzazione, fornita a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui: These and other characteristics of the present invention will become clear from the following description of some embodiments, provided by way of non-limiting example, with reference to the attached drawings in which:
- la fig. 1 rappresenta frammenti ITS rappresentativi degli isolati analizzati. M = marker “100 bp DNA ladder†(Biolabs); - fig. 1 represents ITS fragments representative of the analyzed isolates. M = marker â € œ100 bp DNA ladderâ € (Biolabs);
- le figg. 2a e 2b rappresentano frammenti molecolari rappresentativi degli isolati, ottenuti dalla restrizione con l’enzima HaeIII (a) e HinfI (b). M = marker “100 bp DNA ladder†(Biolabs); - figs. 2a and 2b represent representative molecular fragments of the isolates, obtained by restriction with the enzyme HaeIII (a) and HinfI (b). M = marker â € œ100 bp DNA ladderâ € (Biolabs);
- le figg. 3a e 3b rappresentano la frequenza (%) dei profili molecolari ottenuti dall’amplificazione della regione interdelta (a) e loro visualizzazione su gel di agarosio (b). M = marker “100 bp DNA ladder†(Biolabs); - figs. 3a and 3b represent the frequency (%) of the molecular profiles obtained from the amplification of the interdelta region (a) and their visualization on agarose gel (b). M = marker â € œ100 bp DNA ladderâ € (Biolabs);
- la fig. 4 rappresenta la frequenza % dei profili molecolari ottenuti dall’analisi della regione interdelta di tutti i campioni in studio. Le sigle L, L1, LB, M (1-6) sono dettagliate nel sottostante paragrafo 2.1. - fig. 4 represents the% frequency of the molecular profiles obtained from the analysis of the interdelta region of all the samples under study. The abbreviations L, L1, LB, M (1-6) are detailed in paragraph 2.1 below.
- le figg. 5a e 5b rappresentano la frequenza (%) dei profili molecolari ottenuti dall’analisi della regione interdelta dei ceppi isolati dai campioni L e L1 dopo conservazione in frigorifero; - figs. 5a and 5b represent the frequency (%) of the molecular profiles obtained from the analysis of the interdependent region of the strains isolated from samples L and L1 after refrigeration;
- la fig. 6 rappresenta l’incremento (%) del volume degli impasti dopo 2 ore (VL) e 4 ore (PL); - fig. 6 represents the increase (%) of the volume of the dough after 2 hours (LV) and 4 hours (PL);
- la fig. 7 rappresenta il profilo mitocondriale del ceppo M5-15. M = marker 1Kb (BioLabs); 1 = M5-15; - fig. 7 represents the mitochondrial profile of the M5-15 strain. M = 1Kb marker (BioLabs); 1 = M5-15;
- la fig. 8 rappresenta il profilo di amplificazione del ceppo starter M5-15 con le coppie di primers DAN 4 (linea 1), SED1 (linea 2) e HSP150 (linea 3). M = marker 100 bp (BioLabs); - fig. 8 represents the amplification profile of the starter strain M5-15 with the primer pairs DAN 4 (line 1), SED1 (line 2) and HSP150 (line 3). M = marker 100 bp (BioLabs);
- le figg. 9a e 9b rappresentano l’incremento (%) del volume degli impasti ottenuti con M5-15 e LB-24 dopo 2 ore (VL) e 4 ore (PL) durante la lievitazione condotta a 26°C (a) e a 30°C (b); - figs. 9a and 9b represent the increase (%) of the volume of the dough obtained with M5-15 and LB-24 after 2 hours (VL) and 4 hours (PL) during leavening conducted at 26 ° C (a) and at 30 ° C (b);
- la fig. 10 rappresenta la determinazione della frazione aromatica degli impasti mediante la tecnica SPME; Nella legenda vengono riportati i nomi dei composti identificati mentre per gli altri non identificati sono riportati i valori medi dei tempi di ritenzione dei composti. - fig. 10 represents the determination of the aromatic fraction of the mixtures by means of the SPME technique; The legend shows the names of the compounds identified while for the others not identified the average values of the retention times of the compounds are reported.
- la fig. 11 rappresenta il profilo molecolare rappresentativo esibito dagli isolati di metà e fine lievitazione. M = marker “100 bp DNA ladder†(Biolabs); - fig. 11 represents the representative molecular profile exhibited by the mid and late leavening isolates. M = marker â € œ100 bp DNA ladderâ € (Biolabs);
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DEL TROVATO DETAILED DESCRIPTION OF THE FOUND
1 CEPPO DI LIEVITO M5-15 1 STRAIN OF YEAST M5-15
Forme di realizzazione del presente trovato riguardano la selezione del nuovo ceppo di lievito M5-15 come starter microbico costituito da un ceppo di lievito indigeno esemplificativamente per la produzione di un prodotto da forno a pasta lievitata, in particolare di pane, ad esempio del tipico pane chiamato “Cornetto di Matera†. Embodiments of the present invention relate to the selection of the new yeast strain M5-15 as a microbial starter consisting of an indigenous yeast strain by way of example for the production of a leavened dough bakery product, in particular bread, for example the typical bread called â € œCornetto di Materaâ €.
2 MATERIALE E METODI 2 MATERIAL AND METHODS
2.1 Campionamento e isolamento di lieviti dominanti 2.1 Sampling and isolation of dominant yeasts
Ai fini sperimentali, sono stati eseguiti presso un panificio di riferimento prelievi di alcuni campioni quali: For experimental purposes, samples were taken from a reference bakery such as:
- lievito madre prodotto mediante macerazione di frutta in acqua con aggiunta di farina, pronto per l’impasto (già in fermentazione) siglato con la lettera L (due isolamenti); - mother yeast produced by maceration of fruit in water with the addition of flour, ready for the dough (already in fermentation) signed with the letter L (two isolations);
-lievito madre rinfrescato (non ancora in lievitazione) siglato come L1; - refreshed mother yeast (not yet leavening) signed as L1;
- lievito di birra commerciale usato abitualmente come starter dal panificio e siglato come LB. - commercial brewer's yeast usually used as a starter by the bakery and signed as LB.
Inoltre, sono stati prelevati alcuni campioni dall’impasto in diverse fasi di fermentazione e in diversi punti dell’impasto, come schematizzato in tabella 1 : Furthermore, some samples were taken from the dough in different stages of fermentation and at different points of the dough, as shown in table 1:
Tabella 1. Modalità di campionamento dall’impasto. Table 1. Method of sampling from the mix.
PUNTO DEL FASE DI FERMENTAZIONE SIGLA DEL PRELIEVO CAMPIONE POINT OF THE FERMENTATION PHASE CODE OF THE SAMPLE COLLECTION
Superfìcie Prima (in vasca di fermentazione) M1 Surface Prima (in fermentation tank) M1
Centro Prima (in vasca di fermentazione) M2 Centro Prima (in fermentation tank) M2
Superficie Seconda (nelle forme) M3 Second surface (in forms) M3
Centro Seconda (nelle forme) M4 Center Second (in the forms) M4
Superficie Terza (nelle forme finali prima M5 Third Surface (in the final forms before M5
della cottura) cooking)
Centro Terza (nelle forme finali prima M6 Center Third (in the final forms before M6
della cottura) cooking)
I campioni sono stati sottoposti all’isolamento dei lieviti presenti. A questo scopo, sono state allestite delle diluizioni seriali dei campioni (da 10<-1>a 10<-6>), utilizzando soluzione fisiologica (0,85% di NaCl in acqua) sterile. The samples were subjected to the isolation of the yeasts present. For this purpose, serial dilutions of the samples were prepared (from 10 <-1> to 10 <-6>), using sterile physiological solution (0.85% NaCl in water).
L’isolamento à ̈ stato condotto sui terreni selettivi e differenziali WL Nutrient Agar e Rosa Bengala (addizionato di cloramfenicolo). A tal scopo à ̈ stato utilizzato il metodo per spandimento, distribuendo, con l’ausilio di una spatola ad L sterile, 0,1 mi di ciascuna diluizione del campione (da 10<-2>a 10<-6>) sulla superficie del terreno agarizzato già solidificato in piastra. Per ogni diluizione sono state effettuate due repliche per ottenere dei dati riproducibili e statisticamente significativi. Le piastre sono state incubate in termostato alla temperatura di 26°C per 5 giorni e, trascorso tale periodo di tempo, le piastre sono state contate ed à ̈ stata valutata la morfologia delle colonie sviluppatesi sul terreno WL. Il risultato della conta à ̈ espresso come numero di unità formanti colonie (UFC) per grammo del campione originale. Inoltre, à ̈ stato effettuato un altro isolamento dai campioni L e L1 dopo conservazione in frigorifero alla temperatura di 4°C per 8 giorni, al fine di testare la resistenza dei ceppi presenti alle basse temperature. Successivamente, un numero significativo di colonie à ̈ stato scelto tra le piastre con diluizione più spinta in modo da avere maggiore probabilità di isolare i lieviti dominanti. In particolare, dall’isolamento effettuato sul WL, sono state scelte, in base alle loro caratteristiche morfologiche, colonie che presentavano morfologia differente, collezionando 143 isolati. Le colonie scelte sono state purificate su terreno YPD (1% estratto di lievito; 2% peptone, 2% glucosio; 2% agar) e conservate in tubi a becco di clarino, mantenuti ad una temperatura di 4 °C, per le analisi successive. Le colonie purificate sono state sottoposte ad identificazione a livello di specie e a caratterizzazione a livello di ceppo mediante analisi molecolare. The isolation was carried out on the selective and differential media WL Nutrient Agar and Rose Bengal (with added chloramphenicol). For this purpose, the spreading method was used, distributing, with the aid of a sterile L-shaped spatula, 0.1 ml of each dilution of the sample (from 10 <-2> to 10 <-6>) on the surface of the agar medium already solidified in the plate. Two replicates were performed for each dilution to obtain reproducible and statistically significant data. The plates were incubated in a thermostat at a temperature of 26 ° C for 5 days and, after this period of time, the plates were counted and the morphology of the colonies developed on the WL medium was evaluated. The count result is expressed as the number of colony forming units (CFU) per gram of the original sample. In addition, another isolation from L and L1 samples was carried out after storage in the refrigerator at 4 ° C for 8 days, in order to test the resistance of the strains present at low temperatures. Subsequently, a significant number of colonies were selected from the plates with higher dilution in order to have a greater chance of isolating the dominant yeasts. In particular, from the isolation carried out on the WL, colonies with different morphology were chosen on the basis of their morphological characteristics, collecting 143 isolates. The selected colonies were purified on YPD medium (1% yeast extract; 2% peptone, 2% glucose; 2% agar) and stored in slope tubes, kept at a temperature of 4 ° C, for subsequent analyzes. . The purified colonies were subjected to identification at the species level and characterization at the strain level by molecular analysis.
22 Analisi molecolare degli isolati di lievito 22 Molecular analysis of yeast isolates
2.2,1 Identificazione a livello di specie 2.2.1 Identification at the species level
I 143 isolati scelti sono stati identificati a livello di specie, mediante analisi PCR della regione ITS (Internally Transcribed Spacer) del DNA ribosomiale (rDNA) e successiva analisi di restrizione con enzimi specifici. Per l’amplificazione della regione ITS, à ̈ stata impiegata la coppia di primers universali ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). L’amplificazione à ̈ stata condotta direttamente dalla colonia di lievito, rinfrescata da 48 h, senza estrazione del DNA, semplicemente allungando la fase iniziale di denaturazione. I prodotti dell’amplificazione sono stati analizzati su gel di agarosio all’1% e come standard à ̈ stato utilizzato il marker “100 bp DNA ladder†(Biolabs). La corsa elettroforetica à ̈ stata effettuata ad un voltaggio costante di 100V per circa 90 minuti. Al termine della corsa, il gel à ̈ stato acquisito con il sistema Gel Logic 100 (Kodak). I prodotti ottenuti dall’amplificazione sono stati sottoposti a digestione con vari enzimi di restrizione, in particolare HaeIII e Hìnf I. I prodotti della restrizione sono stati caricati su un gel di agarosio al 2% e la corsa elettroforetica à ̈ stata condotta ad un voltaggio di 75 V per circa 2 ore. The 143 isolates selected were identified at the species level by PCR analysis of the ITS (Internally Transcribed Spacer) region of ribosomal DNA (rDNA) and subsequent restriction analysis with specific enzymes. For the amplification of the ITS region, the pair of universal primers ITS1 (5â € ™ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3â € ™) and ITS4 (5â € ™ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3â € ™) was used. The amplification was carried out directly by the yeast colony, refreshed for 48 h, without DNA extraction, simply by lengthening the initial denaturation phase. The amplification products were analyzed on 1% agarose gel and the â € œ100 bp DNA ladderâ € (Biolabs) marker was used as standard. The electrophoretic run was performed at a constant voltage of 100V for about 90 minutes. At the end of the run, the gel was acquired with the Gel Logic 100 system (Kodak). The products obtained from the amplification were subjected to digestion with various restriction enzymes, in particular HaeIII and Hìnf I. The restriction products were loaded on a 2% agarose gel and the electrophoretic run was carried out at a voltage of 75 V for about 2 hours.
2,2,2 Caratterizzazione genotipica degli isolati di S. cerevisiae 2,2,2 Genotypic characterization of S. cerevisiae isolates
Al fine di valutare il grado di polimorfismo genetico a livello di ceppo, à ̈ stata effettuata sui lieviti in studio l’analisi del profilo di amplificazione delle sequenze interdelta. Le reazioni di amplificazione sono state effettuate nel termociclatore EuroClone One Gradient con la coppia di primer Î ́2 (5-GTGGATTTTTATTCCAACA-3) e 512 (5-TCAACAATGGAATCCCAAC-3). In order to assess the degree of genetic polymorphism at the strain level, the analysis of the amplification profile of the interdelta sequences was carried out on the yeasts under study. The amplification reactions were performed in the EuroClone One Gradient thermal cycler with the primer pair Î ́2 (5-GTGGATTTTTATTCCAACA-3) and 512 (5-TCAACAATGGAATCCCAAC-3).
L’amplificazione della regione inter- 5 à ̈ stata effettuata direttamente dalla colonia, senza estrazione preliminare del DNA, aumentando il tempo e la temperatura di denaturazione iniziale. La miscela di reazione à ̈ costituita da 5 unità di Taq polimerasi, 10 Î1⁄4l di buffer 5X, 4 Î1⁄4l di MgCl2 (25 mM), 1 Î1⁄4l di dNTP (10 mM) e 2 Î1⁄4l di ciascun primer (25Î1⁄4Îœ). Le prove di PCR sono state eseguite in volumi di reazione di 50 Î1⁄4l. Al termine dell’amplificazione i campioni sono stati mantenuti a 4°C. I prodotti PCR sono stati analizzati mediante corsa elettroforetica in un gel di agarosio all’ 1,2% in tampone TBE 0,5Χ (0.09M Tris-borato, 0.002M EDTA) e osservato, dopo colorazione con bromuro di etidio (10 Î1⁄4g / ml), al transilluminatore Gel 100 Kodak. The amplification of the inter-5 region was carried out directly from the colony, without preliminary DNA extraction, increasing the time and the initial denaturation temperature. The reaction mixture consists of 5 units of Taq polymerase, 10 Î1⁄4l of 5X buffer, 4 Î1⁄4l of MgCl2 (25 mM), 1 Î1⁄4l of dNTP (10 mM) and 2 Î1⁄4l of each primer (25Î1⁄4Îœ). The PCR tests were performed in reaction volumes of 50 Î1⁄4l. At the end of the amplification the samples were kept at 4 ° C. The PCR products were analyzed by electrophoretic run in a 1.2% agarose gel in 0.5Χ TBE buffer (0.09M Tris-borate, 0.002M EDTA) and observed, after staining with ethidium bromide (10 Î1⁄4g / ml), to the Kodak Gel 100 transilluminator.
2.3 Caratterizzazione dei lieviti dominanti per alcuni parametri qualitativi di interesse tecnologico 2.3 Characterization of dominant yeasts for some qualitative parameters of technological interest
Sulla base dei risultati ottenuti dalla precedente caratterizzazione molecolare, sono stati scelti 29 ceppi da saggiare per parametri importanti nel corso della panificazione quali: On the basis of the results obtained from the previous molecular characterization, 29 strains were chosen to be tested for important parameters during baking such as:
- Carattere killer; - Killer character;
-Attività β-D-glucosidasica; - β-D-glucosidase activity;
- Attività amilolitica; - Amylolytic activity;
- Capacità di fermentare gli zuccheri presenti nelle farine, quali glucosio, maltosio e raffmosio. - Ability to ferment sugars present in flour, such as glucose, maltose and raffmosio.
2,3.1 Carattere killer 2.3.1 Killer character
Al fine di valutare il profilo killer, i ceppi di lievito scelti sono stati sottoposti a test di attività killer e di sensibilità alla tossina killer. Entrambi i test si basano su ceppi di riferimento, dotati della caratteristica di essere o killer 0 sensibili. Per quanto riguarda 11 test di attività killer, 0,1 mi di una sospensione cellulare, pari a circa 10<5>cell/ml, di un ceppo sensibile S di riferimento ( S . cerevisiae DBVPG 6500) à ̈ stato distribuito uniformemente per spandimento su un terreno (Malt-Agar) tamponato con tampone citrato-fosfato a pH 4,6 e addizionato dello 0,003 % di blu di metilene, colorante di elezione per discriminare i ceppi killer dai ceppi che non possiedono tale caratteristica, grazie alla formazione di un alone di inibizione dovuto alla presenza di cellule morte. Successivamente, sulla superficie del terreno sono stati inoculati i ceppi di lievito da saggiare (un’ansata di cellule di 24 h). Le piastre sono state incubate a 26°C per 3-5 giorni e l’attività killer del ceppo in esame à ̈ stata valutata in funzione della comparsa o meno di zone di inibizione (alone di inibizione) intorno alle colonie dei ceppi saggiati. Oltre ai ceppi da testare sono stati inoculati su ogni piastra anche i ceppi di lievito denominati K1 ( S . cerevisiae DBVPG 6437) e K2 ( S . cerevisiae DBVPG 6499) come controllo positivo. Per il test di sensibilità killer, invece, si à ̈ proceduto in modo inverso rispetto al metodo precedente. Una sospensione cellulare di 0,1 mi dei ceppi di lievito da saggiare (cellule di 24 h), pari a 10<5>cellule/ml, à ̈ stata distribuita uniformemente per spandimento sullo stesso terreno utilizzato per il test di attività killer. Successivamente, in tre punti diversi della piastra à ̈ stata inoculata un’ansata dei ceppi killer (K1 e K2) e sensibili di riferimento (S) (cellule di 24 h). Dopo incubazione a 26 °C per 3-5 giorni, à ̈ stata valutata la sensibilità del ceppo in esame in funzione della comparsa o meno dell’alone di inibizione intorno alle colonie dei ceppi killer di riferimento. In order to evaluate the killer profile, the selected yeast strains were subjected to tests for killer activity and sensitivity to the killer toxin. Both tests are based on reference strains, endowed with the characteristic of being sensitive or killer 0. As for 11 killer activity tests, 0.1 ml of a cell suspension, equal to about 10 <5> cells / ml, of a sensitive S reference strain (S. Cerevisiae DBVPG 6500) was uniformly distributed by spreading on a medium (Malt-Agar) buffered with citrate-phosphate buffer at pH 4.6 and added with 0.003% of methylene blue, the dye of choice to discriminate killer strains from strains that do not possess this characteristic, thanks to the formation of a halo of inhibition due to the presence of dead cells. Subsequently, the yeast strains to be tested (a 24 h loop of cells) were inoculated on the surface of the medium. The plates were incubated at 26 ° C for 3-5 days and the killer activity of the strain under examination was evaluated according to the appearance or absence of zones of inhibition (halo of inhibition) around the colonies of the tested strains. In addition to the strains to be tested, the yeast strains named K1 (S. Cerevisiae DBVPG 6437) and K2 (S. Cerevisiae DBVPG 6499) were also inoculated on each plate as positive control. For the killer sensitivity test, on the other hand, the procedure was the reverse of the previous method. A cell suspension of 0.1 ml of the yeast strains to be tested (24 h cells), equal to 10 <5> cells / ml, was uniformly distributed by spreading on the same medium used for the killer activity test. Subsequently, an ansata of the killer (K1 and K2) and sensitive reference (S) strains (24 h cells) was inoculated in three different points of the plate. After incubation at 26 ° C for 3-5 days, the sensitivity of the strain under examination was evaluated according to the appearance or otherwise of the zone of inhibition around the colonies of the reference killer strains.
2,3.2 Attività B-D-glucosidasica 2,3.2 B-D-glucosidase activity
In questo studio, l’attività β-D-glucosidasica à ̈ stata determinata tramite l’utilizzo di un terreno specifico, Yeast Nitrogen base (YNB) senza amminoacidi e senza solfato di ammonio, contenente arbutina come unica fonte di carboidrati. Dopo sterilizzazione, al terreno à ̈ stata aggiunta una soluzione di ferro ammonio citrato (FeNH4) all ’ 1 %, sterilizzata a parte per filtrazione. Aliquote di colture fresche di 24 h dei ceppi scelti sono state strisciate sul terreno e le piastre incubate a 26 °C per 2-4 giorni. Su questo terreno l’attività β-D-glucosidasica si determina osservando l’imbrunimento (colorazione scura; marrone) della patina del lievito e valutandone l’intensità della colorazione. In this study, β-D-glucosidase activity was determined by using a specific medium, Yeast Nitrogen base (YNB) without amino acids and without ammonium sulphate, containing arbutin as the only source of carbohydrates. After sterilization, a 1% solution of iron ammonium citrate (FeNH4), separately sterilized by filtration, was added to the soil. Fresh 24 h culture aliquots of the selected strains were streaked on the medium and the plates incubated at 26 ° C for 2-4 days. On this medium the β-D-glucosidase activity is determined by observing the browning (dark color; brown) of the yeast patina and evaluating the intensity of the color.
2.3.3 Attività amilolitica 2.3.3 Amylolytic activity
I 29 ceppi di S. cerevìsiae sono stati saggiati per la loro capacità di produrre amilasi con conseguente idrolisi dell’amido. Il test di tipo qualitativo à ̈ stato effettuato inoculando un’aliquota di sospensione cellulare dei ceppi nel punto centrale di una piastra Petri, contenente un terreno idoneo per lo sviluppo dei lieviti (YPD), addizionato di amido solubile (10g/l). Dopo un periodo di incubazione di 24-48 h a 26°C, à ̈ stato versato in piastra un reattivo a base di iodio (reattivo di Lugol), che colora di blu/viola il terreno di coltura contenente questa macromolecola, senza legarsi ai prodotti derivanti dalla sua idrolisi (destrine, maltosio e glucosio) che, pertanto, non manifestano alcuna colorazione. In presenza di idrolisi dell’amido, dovuta alla produzione di amilasi da parte del ceppo di lievito, si osserva un alone marronegiallastro attorno alla colonia di lievito inoculata sul terreno blu/viola. The 29 strains of S. cerevìsiae were tested for their ability to produce amylase with consequent hydrolysis of starch. The qualitative test was carried out by inoculating an aliquot of cell suspension of the strains in the central point of a Petri dish, containing a medium suitable for the development of yeasts (YPD), with the addition of soluble starch (10g / l). After an incubation period of 24-48 h at 26 ° C, an iodine-based reagent (Lugol's reagent) was poured into the plate, which colors the culture medium containing this macromolecule blue / purple, without binding to the products. deriving from its hydrolysis (dextrins, maltose and glucose) which, therefore, do not show any color. In the presence of starch hydrolysis, due to the production of amylase by the yeast strain, a yellow-brown halo is observed around the colony of yeast inoculated on the blue / purple medium.
2.3.4 Capacità di fermentare gli zuccheri presenti nelle farine, quali glucosio, maltosio e raffinosio 2.3.4 Ability to ferment sugars present in flour, such as glucose, maltose and raffinose
II test à ̈ stato condotto in provette di vetro contenenti 10 mi di terreno base composto da 7,5 g/l di estratto di lievito e da 33,6 g/l di peptone e addizionato di una soluzione sterile del carboidrato di interesse. Nel nostro caso sono state aggiunte soluzioni degli zuccheri potenzialmente presenti nelle farine, in particolare glucosio e maltosio, in maniera da ottenere una concentrazione finale pari a 20 g/l, mentre per il raffinosio con una concentrazione di 40 g/l. Un’aliquota (0,1 ml) della sospensione cellulare dei ceppi di lievito à ̈ stato inoculato in ciascun tubo da saggio in cui à ̈ stata posta una campanella di Drrham capovolta, utile a mettere in evidenza la produzione di gas. I tubi sono stati incubati a 26°C per un tempo massimo di 14 giorni. Inizialmente, i tubi sono stati controllati a brevi intervalli di tempo (ogni 2 ore) e successivamente a 3, 7 e 14 giorni per la valutazione dell’attività fermentativa segnalata dalla presenza di una bolla di gas all’intemo della campanella, con risalita o meno della stessa. The test was carried out in glass tubes containing 10 ml of base medium composed of 7.5 g / l of yeast extract and 33.6 g / l of peptone and added with a sterile solution of the carbohydrate of interest. In our case, solutions of the sugars potentially present in flours, in particular glucose and maltose, were added in order to obtain a final concentration of 20 g / l, while for raffinose with a concentration of 40 g / l. An aliquot (0.1 ml) of the cell suspension of the yeast strains was inoculated into each test tube in which an inverted Drrham bell was placed, useful to highlight gas production. The tubes were incubated at 26 ° C for up to 14 days. Initially, the tubes were checked at short intervals of time (every 2 hours) and subsequently at 3, 7 and 14 days for the evaluation of the fermentation activity signaled by the presence of a gas bubble inside the bell, with ascent or not of the same.
2.4 Prove di panificazione su scala di laboratorio 2.4 Laboratory-scale baking tests
Sulla base dei risultati ottenuti dall’analisi del profilo di amplificazione delle sequenze interdelta e dell’attività amilolitica sono stati scelti 5 ceppi, da saggiare come starter singoli e in miscele, in prove di panificazione su scala di laboratorio, condotte in piccoli volumi di impasti, costituiti da acqua e farina. Come controllo à ̈ stato utilizzato il lievito commerciale impiegato dal panificio (LB-24). On the basis of the results obtained from the analysis of the amplification profile of the interdelta sequences and of the amylolytic activity, 5 strains were chosen, to be tested as single starters and in mixtures, in laboratory-scale baking tests, conducted in small volumes of dough, consisting of water and flour. The commercial yeast used by the bakery (LB-24) was used as a control.
Ciascun ceppo/miscela à ̈ stato inoculato in terreno YPD liquido e lasciato sviluppare, in agitazione, per tutta la notte. Il brodo colturale à ̈ stato poi centrifugato per recuperare le cellule e queste sono state sospese in soluzione fisiologica sterile al fine di calcolare la concentrazione cellulare della sospensione ottenuta, mediante lettura spettrofotometrica a 660 nm. Gli impasti sono stati preparati miscelando 100 g di farina di semola di grano duro con 70 mi di acqua e 1 g di NaCl. Ogni impasto à ̈ stato inoculato con la sospensione cellulare (10<8>cell/g) di ciascun ceppo/miscela scelto ed impastato fino ad omogeneizzazione completa dei costituenti. Successivamente, l’impasto à ̈ stato posto in cilindri graduati di vetro da 250 mi sigillati con paraffini, per evitare la perdita di CO2prodotta durante la fermentazione, ed incubato a 26°C per 24 ore. Un impasto non inoculato à ̈ stato impiegato come controllo. Sugli impasti à ̈ stato determinato, dal momento dell’ inoculo fino al termine della lievitazione, l’aumento del volume ad ogni ora per le prime 4 ore e una lettura finale a 24 ore. Each strain / mixture was inoculated in liquid YPD medium and allowed to develop, under stirring, overnight. The culture broth was then centrifuged to recover the cells and these were suspended in sterile physiological solution in order to calculate the cell concentration of the suspension obtained, by spectrophotometric reading at 660 nm. The doughs were prepared by mixing 100 g of durum wheat semolina flour with 70 ml of water and 1 g of NaCl. Each mixture was inoculated with the cell suspension (10 <8> cells / g) of each selected strain / mixture and mixed until complete homogenization of the constituents. Subsequently, the mixture was placed in 250 ml graduated glass cylinders sealed with paraffins, to avoid the loss of CO2 produced during fermentation, and incubated at 26 ° C for 24 hours. An uninoculated slurry was used as a control. From the moment of inoculation until the end of leavening, the increase in volume was determined on the dough at every hour for the first 4 hours and a final reading at 24 hours.
2.5 Messa a punto dello starter M5-15 2.5 Setting up the M5-15 starter
In base ai risultati ottenuti da tutte le prove precedenti, à ̈ stato individuato il ceppo M5-15 che ha prodotto i risultati migliori. Questo ceppo, dopo una fase di pre-inoculo (un’ansata di cellule precedentemente rinfrescate) in 75 ml di YPD liquido, à ̈ stato moltiplicato nel fermentatore in dotazione del laboratorio, contenente 1 litro di terreno YPD, utilizzando le seguenti modalità operative: temperatura di 26°C e agitazione a 180 rpm. Alla fine del processo di moltiplicazione cellulare, durato 6 ore, la biomassa à ̈ stata recuperata mediante centrifugazione. Nelle varie fasi operative, sono stati effettuati diversi isolamenti per valutare e confrontare il numero di cellule presenti: - Isolamento dal pre-inoculo; Based on the results obtained from all previous tests, the strain M5-15 that produced the best results was identified. This strain, after a pre-inoculation phase (a loop of previously refreshed cells) in 75 ml of liquid YPD, was multiplied in the fermenter provided by the laboratory, containing 1 liter of YPD medium, using the following operating methods : temperature of 26 ° C and stirring at 180 rpm. At the end of the cell multiplication process, which lasted 6 hours, the biomass was recovered by centrifugation. In the various operational phases, various isolations were carried out to evaluate and compare the number of cells present: - Isolation from the pre-inoculum;
- Isolamento dalla brodocoltura al momento dell’inoculo in bioreattore; - Isolation from broth culture at the moment of inoculation in a bioreactor;
- Isolamento dalla brodocoltura alla fine del processo di moltiplicazione cellulare; - Isolamento da un grammo di biomassa ottenuta. - Isolation from broth culture at the end of the cell multiplication process; - Isolation from one gram of biomass obtained.
Tutti gli isolamenti sono stati effettuati mediante la tecnica dello spandimento su terreno YPD, dopo opportuna diluizione del campione in esame. Le piastre sono state incubate a 26°C per 48 ore, dopodiché si à ̈ proceduto alla conta delle colonie sviluppate. All isolations were carried out using the YPD soil spreading technique, after suitable dilution of the sample under examination. The plates were incubated at 26 ° C for 48 hours, after which the developed colonies were counted.
Al fine di valutare la capacità lievitante del lievito prodotto nel bioreattore, la biomassa raccolta alla fine della fase di produzione à ̈ stata aggiunta ad impasti preparati in laboratorio. Gli impasti sono stati preparati miscelando 200 g di farina di semola di grano duro con 140 mi di acqua e 2 g di NaCl. Ogni impasto à ̈ stato inoculato con 2 g della biomassa prodotta ed impastato fino ad omogeneizzazione completa degli ingredienti. Successivamente, l’impasto à ̈ stato posto in cilindri graduati di vetro da 500 mi sigillati con parafilm, per evitare la perdita di CO2prodotta durante la fermentazione, ed incubato a 26°C per 24 ore. Un impasto non inoculato à ̈ stato impiegato come controllo. Sugli impasti à ̈ stato determinato, dal momento dell’inoculo fino al termine della lievitazione, l’aumento del volume ogni ora per le prime 4 ore e una lettura finale a 24 ore. In order to evaluate the leavening capacity of the yeast produced in the bioreactor, the biomass collected at the end of the production phase was added to doughs prepared in the laboratory. The doughs were prepared by mixing 200 g of durum wheat semolina flour with 140 ml of water and 2 g of NaCl. Each mixture was inoculated with 2 g of the biomass produced and kneaded until the ingredients were completely homogenized. Subsequently, the mixture was placed in 500 ml graduated glass cylinders sealed with parafilm, to avoid the loss of CO2 produced during fermentation, and incubated at 26 ° C for 24 hours. An uninoculated slurry was used as a control. From the moment of inoculation until the end of leavening, the increase in volume was determined on the dough every hour for the first 4 hours and a final reading at 24 hours.
2,6 Caratterizzazione completa del lievito starter 2.6 Complete characterization of the starter yeast
2.6.1 Caratterizzazione genetica del ceppo di lievito indigeno. M5-15 2.6.1 Genetic characterization of the indigenous yeast strain. M5-15
2. 6.1,1 Analisi mtDNA-RFLP 2. 6.1.1 mtDNA-RFLP analysis
I lieviti sono un gruppo di organismi con un alto grado di variabilità sia nella dimensione che nella forma del loro DNA mitocondriale (mtDNA), che costituisce il 10-15% del DNA totale. In S.cerevisiae, il DNA mitocondriale presenta un elevato grado di polimorfismo di lunghezza causato dal fatto che regioni genomiche alleliche, spesso, differiscono per sostituzioni di singole coppie di basi, delezioni, inserzioni o riarrangiamenti. L’incidenza di tali mutazioni viene ben evidenziata mediante analisi del profilo di restrizione del mtDNA con endonucleasi di restrizione (mtDNA-RFLP) che, tagliando in siti specifici, generano un insieme di frammenti, di lunghezza variabile e specifica per ciascun ceppo. La tecnica più usata à ̈ quella che prevede l’estrazione del DNA totale e la sua restrizione con endonucleasi che tagliano in corrispondenza di siti di riconoscimento ricchi in guanina e citosina. Yeasts are a group of organisms with a high degree of variability in both the size and shape of their mitochondrial DNA (mtDNA), which makes up 10-15% of the total DNA. In S.cerevisiae, mitochondrial DNA exhibits a high degree of length polymorphism caused by the fact that allelic genomic regions often differ in single base pair substitutions, deletions, insertions or rearrangements. The incidence of these mutations is well highlighted by analysis of the restriction profile of mtDNA with restriction endonuclease (mtDNA-RFLP) which, by cutting in specific sites, generate a set of fragments, of variable length and specific for each strain. The most used technique is that which involves the extraction of total DNA and its restriction with endonucleases that cut at recognition sites rich in guanine and cytosine.
Il protocollo utilizzato per l’estrazione del DNA à ̈ piuttosto laborioso e si articola in diverse fasi operative, di seguito sintetizzate: The protocol used for DNA extraction is rather laborious and is divided into several operational phases, summarized below:
- crescita dei ceppi da saggiare in 20 mi di terreno YPD liquido e agitazione a 180 rpm per una notte; - growth of the strains to be tested in 20 ml of liquid YPD medium and stirring at 180 rpm for one night;
- trattamento della sospensione cellulare, ottenuta dopo centrifugazione (6000 giri per 10 min), con gli enzimi Zimoliasi 20T e RNasi A (10 mg/ml) e incubazione ai tempi e temperature specifiche degli enzimi; - treatment of the cell suspension, obtained after centrifugation (6000 rpm for 10 min), with the enzymes Zymoliasis 20T and RNase A (10 mg / ml) and incubation at the specific times and temperatures of the enzymes;
- aggiunta di acetato di potassio 3M e isopropanolo; centrifuga a 14000 giri per 10 min e lavaggio del pellet con etanolo al 70%; centrifuga a 14000 giri per 1 min ed essiccamento per una notte. - addition of 3M potassium acetate and isopropanol; centrifuge at 14000 rpm for 10 min and washing of the pellets with 70% ethanol; centrifuge at 14000 rpm for 1 min and drying overnight.
4 Il DNA così estratto viene esaminato su gel di agarosio all’1%. La corsa elettroforetica viene effettuata ad un voltaggio costante di 100V per 90 min. Dopo la fase di estrazione, il DNA ottenuto à ̈ stato sottoposto a digestione mediante l’enzima di restrizione RsaI, in quanto dai dati riportati in letteratura risulta essere l’enzima più adatto per differenziare ceppi di S. cerevisiae. 4 The DNA thus extracted is examined on a 1% agarose gel. The electrophoretic run is performed at a constant voltage of 100V for 90 min. After the extraction phase, the DNA obtained was subjected to digestion by means of the restriction enzyme RsaI, as from the data reported in the literature it appears to be the most suitable enzyme to differentiate S. cerevisiae strains.
La miscela di reazione à ̈ costituita da: The reaction mixture consists of:
- 3 Î1⁄4l di DNA; - 3 Î1⁄4l of DNA;
- 2 Î1⁄4l di enzima di restrizione; - 2 Î1⁄4l of restriction enzyme;
- 2 Î1⁄4l di buffer specifico dell’enzima; - 2 Î1⁄4l of specific enzyme buffer;
- 0,5 Î1⁄4l di BSA, sostanza che serve ad aumentare l’efficienza dell’enzima; - 0.5 Î1⁄4l of BSA, a substance that serves to increase the efficiency of the enzyme;
- 12,5 Î1⁄4l di acqua distillata per raggiungere il volume finale di 20 Î1⁄4l. - 12.5 Î1⁄4l of distilled water to reach the final volume of 20 Î1⁄4l.
La miscela di reazione à ̈ stata incubata, per una notte, alla temperatura specifica dell’enzima, che in questo caso à ̈ di 37°C. I frammenti ottenuti dall’analisi di restrizione sono stati separati su un gel di agarosio allo 0,8% in 0,5 X TBE buffer con corsa elettroforetica condotta ad un voltaggio di 75 V per 240 minuti. The reaction mixture was incubated overnight at the specific enzyme temperature, which in this case is 37 ° C. The fragments obtained from the restriction analysis were separated on a 0.8% agarose gel in 0.5 X TBE buffer with an electrophoretic run conducted at a voltage of 75 V for 240 minutes.
2.6.1.2 Amplificazione dei geni SED1, DAN4 e HSP150 mediante PCR 2.6.1.2 Amplification of SED1, DAN4 and HSP150 genes by PCR
Il DNA estratto utilizzando la matrice InstaGene matrix (Bio-Rad), à ̈ stato sottoposto ad amplificazione dei geni di parete SED1, DAN4 e HSP 150. Tali geni contengono i cosiddetti minisatelliti (VNTR, Variable Number of Tandem Repeats), regioni di DNA costituite da sequenze ripetute, le cui singole unità misurano generalmente da 10 a 100 bp e presentano elevata identità di sequenza. Si tratta di regioni ad alta frequenza di ricombinazione e, per effetto di Crossing over ineguale, conversione genica e slittamento della replicazione del DNA, sono soggette ad aumenti o diminuzioni del numero di unità ripetute e quindi a polimorfismo di lunghezza. La variabilità nel numero di unità ripetute tra i componenti di una popolazione rende i minisatelliti bersagli molecolari preferenziali per l’identificazione The DNA extracted using the InstaGene matrix (Bio-Rad), was subjected to amplification of the SED1, DAN4 and HSP 150 wall genes. These genes contain the so-called minisatellites (VNTR, Variable Number of Tandem Repeats), regions of DNA made up of repeated sequences, whose single units generally measure from 10 to 100 bp and have high sequence identity. These are regions with a high frequency of recombination and, due to the effect of unequal Crossing over, gene conversion and DNA replication slippage, they are subject to increases or decreases in the number of repeated units and therefore to length polymorphism. The variability in the number of repeated units among the components of a population makes minisatellites preferential molecular targets for identification
e la caratterizzazione degli individui. In particolare, si à ̈ osservato che i geni DAN4, and the characterization of individuals. In particular, it was observed that the DAN4 genes,
HSP150 e SED1, codificanti proteine di parete, sono soggetti a espansione/contrazione HSP150 and SED1, encoding wall proteins, are subject to expansion / contraction
dei minisatelliti in ceppi di S. cerevisìae, in conseguenza dell’aumento o della of minisatellites in S. cerevisìae strains, as a consequence of the increase or of the
diminuzione del numero di unità ripetute costituenti i minisatelliti. Ne consegue che decrease in the number of repeated units making up the minisatellites. It follows that
ceppi diversi di S. cerevisìae possono essere distinti sulla base della diversa lunghezza different S. cerevisìae strains can be distinguished on the basis of different lengths
di uno o più di questi geni. Uno dei vantaggi di tale metodo à ̈ che gli ampliconi non of one or more of these genes. One of the advantages of this method is that the amplicons do not
devono essere sottoposti a restrizione prima di essere analizzati su gel di agarosio e ciò they must be restricted before being tested on agarose gel and that
si traduce in termini di rapidità nell’ottenimento dei risultati. Il protocollo seguito per it translates into terms of speed in obtaining results. The protocol followed for
l’analisi, già descritto in letteratura, à ̈ stato da noi modificato per quanto riguarda la the analysis, already described in the literature, has been modified by us as regards the
composizione della miscela di reazione. La miscela utilizzata à ̈ stata la stessa per tutte composition of the reaction mixture. The mixture used was the same for all of them
le coppie di primers ed à ̈ riportata in tabella 2. La reazione di amplificazione à ̈ stata the pairs of primers and is reported in table 2. The amplification reaction was
svolta in un volume finale di 50 Î1⁄4l e, al termine dell’amplificazione, il campione à ̈ carried out in a final volume of 50 Î1⁄4l and, at the end of the amplification, the sample is
stato analizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio con una concentrazione di was analyzed by agarose gel electrophoresis with a concentration of
agarosio pari all’ 1,4 %. _ _ agarose equal to 1.4%. _ _
Tabella 2. Composizione della miscela di reazione Table 2. Composition of the reaction mixture
COMPONENTI Q-TA(Î1⁄4l) COMPONENTS Q-TA (Î1⁄4l)
H2O 26,75 H2O 26.75
Buffer (5x) 10 Buffer (5x) 10
MgCl2 (25mM) 4 MgCl2 (25mM) 4
Primer f (5Î1⁄4Îœ) 2,5 Primer f (5Î1⁄4Îœ) 2.5
Primer r (5Î1⁄4Îœ) 2,5 Primer r (5Î1⁄4Îœ) 2.5
dNTP (10mM) 1 dNTP (10mM) 1
GoTaq (5U/Î1⁄4l) 0,25 GoTaq (5U / Î1⁄4l) 0.25
COMPONENTI 3 COMPONENTS 3
Nella tabella 3 sono riportate le sequenze nucleotidiche dei primers e i programmi Table 3 shows the nucleotide sequences of the primers and the programs
di amplificazione utilizzati. of amplification used.
Tabella 3. Condizioni operative utilizzate per l' amplificazione dei geni HSP150, DAN4 e SED1 . Table 3. Operating conditions used for amplification of the HSP150, DAN4 and SED1 genes.
PRIMERS PROGRAMMA DI AMPLIFICAZIONE PRIMERS AMPLIFICATION PROGRAM
Nome Sequenza nucleotidica (5 ’ ...3 ’) I°ciclo:Di ciclo N° Estensione cicli finale Name Nucleotide sequence (5 â € ™ ... 3 â € ™) 1st cycle: Di cycle N ° Extension of final cycles
HSP150f CACTTTGACTCCAACAGCCACTTACA 94°C, D: 94°C, 45sec 35 HSP150f CACTTTGACTCCAACAGCCACTTACA 94 ° C, D: 94 ° C, 45sec 35
7min A: 65°C, 30sec 72°C, 7min E: 72°C, 1min 7min A: 65 ° C, 30sec 72 ° C, 7min E: 72 ° C, 1min
HSP150r TACCGGACAAACATTGGTAGAAGACA HSP150r TACCGGACAAACATTGGTAGAAGACA
DAN4f AGCGCTTTCAAAGGATGGTATTTACA 94 °C, D: 94°C, 45sec 72°C, 7min 7min A: 70°C, 30sec DAN4f AGCGCTTTCAAAGGATGGTATTTACA 94 ° C, D: 94 ° C, 45sec 72 ° C, 7min 7min A: 70 ° C, 30sec
(-0.5°C ad ogni (-0.5 ° C at each
DAN4r AAAGT AGACCCGAAGGAAGAAACAG ciclo) DAN4r AAAGT AGACCCGAAGGAAGAAACAG cycle)
E: 72°C, 1min E: 72 ° C, 1min
26 26
D: 94°C, 45sec D: 94 ° C, 45sec
A: 66°C, 30sec A: 66 ° C, 30sec
E: 72°C, 1min E: 72 ° C, 1min
SED1f ATGAAATTATCAACTGTCCTATTATCT 94°C, D: 94°C1 1min 35 72°C, 7min GCCGG 3min A: 64°C, 1min SED1f ATGAAATTATCAACTGTCCTATTATCT 94 ° C, D: 94 ° C1 1min 35 72 ° C, 7min GCCGG 3min A: 64 ° C, 1min
E: 72°C, 2min E: 72 ° C, 2min
SED1r TTATAAGAATAACATAGCAACACCAG SED1r TTATAAGAATAACATAGCAACACCAG
CCAAACC CCAAACC
Legenda: f = primer forward; r = primer reverse; Di = denaturazione iniziale; D = denaturazione; A = annealing; E = estensione. Legend: f = forward primer; r = reverse primer; Di = initial denaturation; D = denaturation; A = annealing; E = extension.
La corsa elettroforetica à ̈ stata effettuata ad un voltaggio costante di 100 V per circa 90 minuti. The electrophoretic run was performed at a constant voltage of 100 V for about 90 minutes.
2.6.2 Caratterizzazione enzimatica del ceppo di lievito indigeno. M5-15 2.6.2 Enzymatic characterization of the indigenous yeast strain. M5-15
2.6.2.1 Attività proteolitica 2.6.2.1 Proteolytic activity
L’attività proteolitica, ossia la capacità del lievito di idrolizzare le proteine in piccoli peptidi e aminoacidi, che sono fondamentali per la crescita microbica e precursori per lo sviluppo di composti aromatici, à ̈ stata determinata in piastra (determinazione qualitativa) utilizzando un terreno sintetico costituito da Yeast Nitrogen Base (YNB) senza aminoacidi e senza solfato di ammonio (6,7 g/L), Glucosio (5 g/L), Caseina (5 g/L), Agar (20 g/L) e pH 7,0. La caseina à ̈ aggiunta separatamente al terreno dopo sterilizzazione a 110 °C per 6 minuti. Il ceppo da saggiare (un’ansata) viene inoculato sul terreno solido e le piastre incubate a 26 °C per 5 giorni. Dopo incubazione, si versa sulla superficie del terreno una soluzione di HCl 0,1N, che causa la precipitazione della caseina, e il terreno assume una colorazione biancastra. La formazione di un alone di chiarificazione attorno alla colonia evidenzia la capacità del ceppo di lievito di idrolizzare la caseina. The proteolytic activity, that is the ability of the yeast to hydrolyze proteins into small peptides and amino acids, which are fundamental for microbial growth and precursors for the development of aromatic compounds, was determined in plate (qualitative determination) using a medium synthetic consisting of Yeast Nitrogen Base (YNB) without amino acids and without ammonium sulphate (6.7 g / L), Glucose (5 g / L), Casein (5 g / L), Agar (20 g / L) and pH 7.0. Casein is added separately to the medium after sterilization at 110 ° C for 6 minutes. The strain to be tested (an ansata) is inoculated on the solid medium and the plates incubated at 26 ° C for 5 days. After incubation, a 0.1N HCl solution is poured onto the surface of the medium, causing the precipitation of the casein, and the medium takes on a whitish color. The formation of a clarification halo around the colony highlights the ability of the yeast strain to hydrolyze casein.
2.6.2.2 Attività peptidasica 2.6.2.2 Peptidase activity
L’attività peptidasica esercita una significativa influenza sulla stabilità proteica del pane, favorisce la fermentazione alcolica in seguito all’incremento di azoto assimilabile e, inoltre, aumenta il contenuto di precursori di alcuni composti secondari della fermentazione quali esteri ed alcoli superiori. L’analisi quantitativa à ̈ stata eseguita nel modo seguente: le cellule cresciute in fase stazionaria in YPD liquido sono state raccolte mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), lavate due volte con tampone potassio fosfato sterile 50 mmol/L, pH 7, e risospese nello stesso tampone per ottenere una sospensione cellulare standardizzata (DO660 = 1) da utilizzare per il dosaggio degli enzimi. Le attività delle aminopeptidasi generali (PepNC), prolina iminopeptidasi (Pepi), glutamil aminopeptidasi (Pepa) e X-prolil dipeptidil aminopeptidasi (PepX) sono state misurate utilizzando come substrati sintetici Lys-pnitroanilide (-p-NA), Pro-p-NA, Glu-p-NA e Gly-Pro-p-NA o ArgPro-p-NA, rispettivamente. Per il dosaggio sono stati mescolati 30 Î1⁄4L di substrato ad una concentrazione finale di 20 mmol/L in metanolo, 195 Î1⁄4L di tampone potassio fosfato (50 mmol/L, pH 7,0), 95 pL di sodio azide al 0,05% (w/v) e 75 pL di sospensione cellulare. Dopo l’incubazione a 30°C per 4 ore, la reazione à ̈ stata interrotta con 900 pL di acido acetico al 10% (v/v); il rilascio di p-nitroanilina (p-NA) nei sumatanti (12000 x g, 5 min) à ̈ stata misurata spettrofotometricamente a 410 nm. I dati ottenuti sono stati confrontati con una curva di taratura costruita utilizzando soluzioni di p-NA (range 0,1 - 20,0 mmol/L p-NA). Una unità di attività enzimatica (Î1⁄4katal) à ̈ stata definita come la quantità di enzima necessario per liberare 1 pmol di p-NA per secondo. The peptidase activity exerts a significant influence on the protein stability of the bread, favors alcoholic fermentation following the increase in assimilable nitrogen and, moreover, increases the content of precursors of some secondary fermentation compounds such as esters and higher alcohols. Quantitative analysis was performed as follows: cells grown in stationary phase in liquid YPD were collected by centrifugation (12000 x g, 5 min), washed twice with sterile 50 mmol / L potassium phosphate buffer, pH 7 , and resuspended in the same buffer to obtain a standardized cell suspension (DO660 = 1) to be used for the enzyme assay. The activities of general aminopeptidases (PepNC), proline iminopeptidases (Pepi), glutamyl aminopeptidases (Pepa) and X-prolyl dipeptidyl aminopeptidases (PepX) were measured using as synthetic substrates Lys-pnitroanilide (-p-NA), Pro-p-NA NA, Glu-p-NA and Gly-Pro-p-NA or ArgPro-p-NA, respectively. For the assay, 30 Î1⁄4L of substrate was mixed at a final concentration of 20 mmol / L in methanol, 195 Î1⁄4L of potassium phosphate buffer (50 mmol / L, pH 7.0), 95 pL of sodium azide at 0.05% (w / v) and 75 pL of cell suspension. After incubation at 30 ° C for 4 hours, the reaction was stopped with 900 µL of 10% (v / v) acetic acid; the release of p-nitroaniline (p-NA) in the sumpatants (12000 x g, 5 min) was measured spectrophotometrically at 410 nm. The data obtained were compared with a calibration curve constructed using p-NA solutions (range 0.1 - 20.0 mmol / L p-NA). A unit of enzyme activity (Î1⁄4katal) was defined as the amount of enzyme needed to release 1 pmol of p-NA per second.
2.6.2.3 Attività fitasica 2.6.2.3 Phytase activity
Nei cereali, la maggior parte del fosforo totale à ̈ presente come acido fitico (esafosfato mio-inositolo), situato negli strati esterni del chicco. L’acido fitico à ̈ considerato un composto anti-nutrizionale per la sua capacità di formare complessi altamente insolubili con ioni metallici Ca<2+>, Fe<2+>, Mg<2+>, Zn<2+>che non possono, quindi, essere assorbiti dall’uomo. Per questo, la degradazione dell’acido fitico in fosforo inorganico e mio-inositolo à ̈ auspicabile durante la fermentazione degli impasti. Dal momento che i dati riportati finora in letteratura riguardano solo studi sull’attività fitasica espressa dai batteri, per eseguire l’analisi à ̈ stato utilizzato il protocollo riportato su tali articoli, apportando le necessario modifiche. In particolare, l’attività fitasica à ̈ stata misurata utilizzando fitato di sodio come substrato. Il dosaggio à ̈ stato effettuato mescolando 600 Î1⁄4L di substrato (Na-fitato 3 mmol/L in Na-acetato 0,2 mol/L, pH 4,0) e 150 Î1⁄4L di sospensione cellulare, ottenuta da cellule in fase stazionaria cresciute overnight in YPD liquido, raccolte mediante centrifugazione, lavate due volte con soluzione salina sterile e risospese in acqua deionizzata sterile, per ottenere sospensioni cellulari aventi un valore di assorbanza a 660 nm (A660) pari a 1,0. Dopo 2 ore di incubazione a 45°C, la reazione à ̈ stata stoppata con 750 Î1⁄4L di acido tricloroacetico al 5% (w/v). Il fosfato inorganico rilasciato à ̈ stato misurato addizionando 750 Î1⁄4l di colorante preparato ogni giorno mescolando 4 ml di ammonio molibdato all’ 1,5% (w/v) in una soluzione di acido solforico al 5,5% (v/v) e 1ml di una soluzione solfato di ferro al 2,7% (w/v). L'assorbanza à ̈ stata misurata a 700 nm. I dati ottenuti sono stati confrontati con una curva di calibrazione preparata usando il potassio diidrogeno fosfato anidro, seccato a 105°C (0,4393g/1000ml), a concentrazioni comprese nel range 0,0-0, 1 mg/l. Una unità di attività fitasica (Î1⁄4katal) à ̈ stata definita come la quantità di enzima necessario per liberare 1 Î1⁄4mol di fosforo inorganico al secondo. In cereals, most of the total phosphorus is present as phytic acid (myo-inositol hexaphosphate), located in the outer layers of the grain. Phytic acid is considered an anti-nutritional compound due to its ability to form highly insoluble complexes with metal ions Ca <2+>, Fe <2+>, Mg <2+>, Zn <2+> which do not they can, therefore, be absorbed by man. For this reason, the degradation of phytic acid into inorganic phosphorus and myo-inositol is desirable during the fermentation of the dough. Since the data reported so far in the literature concern only studies on the phytase activity expressed by bacteria, the protocol reported on these articles was used to perform the analysis, making the necessary changes. In particular, the phytase activity was measured using sodium phytate as substrate. The assay was carried out by mixing 600 Î1⁄4L of substrate (Na-phytate 3 mmol / L in Na-acetate 0.2 mol / L, pH 4.0) and 150 Î1⁄4L of cell suspension, obtained from cells in stationary phase grown overnight in liquid YPD, collected by centrifugation, washed twice with sterile saline and resuspended in sterile deionized water, to obtain cell suspensions having an absorbance value at 660 nm (A660) equal to 1.0. After 2 hours of incubation at 45 ° C, the reaction was stopped with 750 Î1⁄4L of 5% (w / v) trichloroacetic acid. The released inorganic phosphate was measured by adding 750 Î1⁄4l of dye prepared every day by mixing 4 ml of 1.5% (w / v) ammonium molybdate in a solution of 5.5% (v / v) sulfuric acid v) and 1ml of a 2.7% (w / v) iron sulphate solution. The absorbance was measured at 700 nm. The data obtained were compared with a calibration curve prepared using anhydrous potassium dihydrogen phosphate, dried at 105 ° C (0.4393g / 1000ml), at concentrations in the range 0.0-0.1 mg / l. A unit of phytase activity (Î1⁄4katal) was defined as the amount of enzyme needed to release 1 Î1⁄4mol of inorganic phosphorus per second.
2,6, 2,4 Determinazione della frazione aromatica del impasto prodotto utilizzando il lievito starter selezionato. 2,6, 2,4 Determination of the aromatic fraction of the dough produced using the selected starter yeast.
In questa fase, il lievito indigeno selezionato M5-15 à ̈ stato saggiato in prove di panificazione su scala di laboratorio in confronto al lievito commerciale abitualmente impiegato dal panificio di riferimento (LB-24), per valutare l’influenza del ceppo di lievito sulla frazione aromatica. Per le prove di panificazione à ̈ stato seguito il protocollo riportato al punto 2.4. In this phase, the selected indigenous yeast M5-15 was tested in laboratory-scale baking tests in comparison with the commercial yeast usually used by the reference bakery (LB-24), to evaluate the influence of the yeast strain. on the aromatic fraction. The protocol described in point 2.4 was followed for the baking tests.
In questa fase sono state saggiate due diverse temperature di incubazione, 26°C e 30°C, dal momento che in letteratura à ̈ riportato che, a temperature più elevate, gli impasti sono caratterizzati da un profilo aromatico più complesso. Un impasto non inoculato à ̈ stato impiegato come controllo e le prove sono state eseguite in triplo per ottenere dei dati statisticamente significativi. Sugli impasti à ̈ stato determinato, dal momento dell’inoculo fino al termine della lievitazione, l’aumento del volume ad ogni ora per le prime 4 ore e una lettura finale a 24 ore. Il vigore (VL) e il potere lievitante (PL) sono stati valutati dopo 2 e 4 ore, rispettivamente. In this phase, two different incubation temperatures were tested, 26 ° C and 30 ° C, since in the literature it is reported that, at higher temperatures, the doughs are characterized by a more complex aromatic profile. An uninoculated slurry was used as a control and the tests were performed in triplicate to obtain statistically significant data. From the moment of inoculation until the end of leavening, the increase in volume was determined on the dough at every hour for the first 4 hours and a final reading at 24 hours. Vigor (VL) and leavening power (PL) were evaluated after 2 and 4 hours, respectively.
Gli impasti finali sono stati analizzati per la componente aromatica mediante gascromatografia, utilizzando la tecnica SPME (solid-phase microextraction technique). Questa tecnica di microestrazione in fase solida dello spazio di testa prevede una prima fase di concentrazione/estrazione dei componenti volatili presenti nel campione mediante l’esposizione allo spazio di testa di una fibra in silice fusa, rivestita da un film relativamente sottile di fase stazionaria polimerica. Durante questa fase si stabilisce un equilibrio tra le concentrazioni degli analiti presenti nello spazio di testa del campione e il rivestimento dei polimeri sulla fibra. La quantità di analita adsorbita sulla fibra dipende dallo spessore del polimero e dal tempo/temperatura di esposizione. Dopo un opportuno tempo di estrazione, la fibra viene ritirata nell’ago e rimossa dalla vial contenente il campione per essere inserita direttamente nell’iniettore del GC per la successiva fase di desorbimento. The final doughs were analyzed for the aromatic component by gas chromatography, using the SPME technique (solid-phase microextraction technique). This solid phase micro-extraction technique of the headspace involves a first phase of concentration / extraction of the volatile components present in the sample by exposing a fused silica fiber to the headspace, coated with a relatively thin film of stationary phase. polymer. During this step, a balance is established between the concentrations of the analytes present in the headspace of the sample and the coating of the polymers on the fiber. The quantity of analyte adsorbed on the fiber depends on the thickness of the polymer and the exposure time / temperature. After an appropriate extraction time, the fiber is withdrawn into the needle and removed from the vial containing the sample to be inserted directly into the GC injector for the subsequent desorption phase.
In confronto ai metodi tradizionali, questa nuova tecnica offre alcuni vantaggi come l’alta sensibilità e riproducibilità , non richiede solventi e combina l’estrazione e la pre-concentrazione in una singola fase senza pretrattamento del campione. Inoltre, à ̈ poco costoso, veloce e richiede piccoli volumi di campione. Compared to traditional methods, this new technique offers some advantages such as high sensitivity and reproducibility, requires no solvents and combines extraction and pre-concentration in a single step without sample pretreatment. Plus, it's inexpensive, fast, and requires small sample volumes.
Nel presente studio, per ciascuna analisi SPME, 2 g di ciascun campione di impasto, ottenuti dall 'inoculo dei due ceppi e alle due diverse temperature saggiate, sono stati introdotti in una vial da 20 ml e l'ago SPME à ̈ stato introdotto attraverso il seto della vial. La vial à ̈ stata poi immersa in un bagneto a 60°C e la fibra SPME, ricoperta con un film di 100 Î1⁄4m di polidimetilsilossano, à ̈ stata esposta allo spazio di testa per 60 min. Quando il processo di estrazione à ̈ stato completato, la fibra à ̈ stata inserita nella porta dell' iniettore (impostata a 280°C) del gas-cromatografo Agilent 6850, munito di un rilevatore a ionizzazione di fiamma e di una colonna capillare in silice fusa DB-WAXETR, per il desorbimento termico delle sostanze volatili per 5 min in modalità splitless. In the present study, for each SPME analysis, 2 g of each mixture sample, obtained from the inoculation of the two strains and at the two different temperatures tested, were introduced into a 20 ml vial and the SPME needle was introduced through the silk of the vial. The vial was then immersed in a 60 ° C bath and the SPME fiber, covered with a 100 Î1⁄4m film of polydimethylsiloxane, was exposed to the headspace for 60 min. When the extraction process was completed, the fiber was inserted into the injector port (set at 280 ° C) of the Agilent 6850 gas chromatograph, equipped with a flame ionisation detector and a silica capillary column. fused DB-WAXETR, for the thermal desorption of volatile substances for 5 min in splitless mode.
In questa fase, à ̈ stata eseguita un’analisi qualitativa dei principali composti volatili, quali acetaldeide, diacetile, acetone, acetato di etile, etanolo, isobutanolo e 3-metil butanolo, composti la cui produzione à ̈ correlata in modo particolare all’attività dei lieviti. Tali composti sono stati identificati mediante confronto con degli standard iniettati prima di eseguire le analisi sui campioni e corrispondenti ai composti volatili, che vengono così determinati mediante registrazione dei tempi di ritenzione. In this phase, a qualitative analysis of the main volatile compounds was performed, such as acetaldehyde, diacetyl, acetone, ethyl acetate, ethanol, isobutanol and 3-methyl butanol, compounds whose production is particularly related to ™ yeast activity. These compounds were identified by comparison with the standards injected before performing the analyzes on the samples and corresponding to the volatile compounds, which are thus determined by recording the retention times.
2.7 Prove sperimentali di produzione 2.7 Experimental production tests
Infine, à ̈ stata condotta una prova di panificazione direttamente presso un panificio, inoculando un volume adeguato di impasto con la coltura starter M5-15, caratterizzata e prodotta presso il laboratorio dell’Università . In particolare, la prova à ̈ stata condotta su 20 Kg di farina con un inoculo pari all’ 1 % del ceppo M5-15. Per la produzione in laboratorio della quantità necessaria (200 g) del lievito da utilizzare in panificio, si à ̈ proceduto seguendo la procedura precedentemente descritta (punto 2.5). Successivamente, al fine di verificare che la lievitazione era stata realmente condotta dal lievito aggiunto all’impasto, sono stati prelevati 2 campioni di impasto, a metà e a fine lievitazione. Per ciascun campione à ̈ stata eseguita la fase di isolamento su terreno differenziale WL, seguendo la procedura riportata al punto 2.1. Da ciascun campione à ̈ stato scelto un numero significativo di colonie dalle piastre con diluizione più spinta, in modo da avere maggiore probabilità di trovare i lieviti dominanti. Le colonie scelte sono state purificate su terreno YPD e sottoposte a caratterizzazione a livello di ceppo mediante analisi del profilo di amplificazione delle sequenze interdelta, utilizzando la coppia dei primers delta2-delta12, seguendo la procedura riportata al punto 2.2.2. Finally, a baking test was conducted directly at a bakery, by inoculating an adequate volume of dough with the starter culture M5-15, characterized and produced in the University laboratory. In particular, the test was carried out on 20 kg of flour with an inoculum equal to 1% of the M5-15 strain. For the production in the laboratory of the necessary quantity (200 g) of the yeast to be used in the bakery, we proceeded following the procedure described above (point 2.5). Subsequently, in order to verify that the leavening had really been carried out by the yeast added to the dough, 2 dough samples were taken, halfway through and at the end of the leavening. For each sample, the isolation phase on WL differential soil was carried out, following the procedure reported in point 2.1. From each sample a significant number of colonies were chosen from the plates with the highest dilution, in order to have a higher probability of finding the dominant yeasts. The selected colonies were purified on YPD medium and subjected to strain-level characterization by analysis of the amplification profile of the interdelta sequences, using the pair of delta2-delta12 primers, following the procedure described in point 2.2.2.
3 RISULTATI 3 RESULTS
3.1 Analisi molecolare degli isolati di lievito 3.1 Molecular analysis of yeast isolates
3.1.1 Identificazione a livello di specie 3.1.1 Identification at the species level
Il DNA ribosomiale (rDNA) à ̈ una sequenza bersaglio ideale per l’identificazione molecolare dei lieviti e altri organismi. Infatti, oltre ad essere presente in tutti gli organismi, à ̈ soggetto ad un processo evolutivo relativamente lento che consente la presenza sia di sequenze altamente conservate anche in specie molto diverse che permettono la comparazione di specie non strettamente correlate, sia di sequenze variabili, utili per confrontare specie più strettamente correlate. In sintesi, l’rDNA à ̈ dotato di elevato polimorfismo interspecifico (in specie diverse) e limitato polimorfismo intraspecifico (all’interno della specie). In fig. 1 sono riportati alcuni frammenti molecolari rappresentativi degli isolati analizzati. Tutti gli isolati, tranne tre, hanno esibito frammenti caratterizzati da un peso molecolare pari a circa 850 bp e, in base a quanto riportato in letteratura, queste dimensioni molecolari permettono l’attribuzione al genere Saccharomyces (lanes 1-4; 6-12). Hanno fatto eccezione solo 3 isolati che hanno esibito un frammento di peso molecolare pari a circa 450 bp (lane 5). L’amplificazione della regione ITS da sola non à ̈ una tecnica sufficiente a distinguere le specie di lieviti analizzate poiché in alcuni casi gli ampliconi ottenuti da specie e generi diversi sono di uguale o simile lunghezza e per questo non sempre à ̈ possibile identificare gli isolati solo sulla base della dimensione degli ampliconi. Quindi per una corretta identificazione degli isolati analizzati, i prodotti di amplificazione sono stati digeriti con specifici enzimi di restrizione, che riconoscono sequenze specifiche sul DNA bersaglio e generano profili di restrizione caratteristici per ogni specie di lievito. Nel nostro studio, gli isolati sono stati sottoposti a restrizione con l’enzima HaeIII, poiché questo à ̈ l’enzima più utilizzato per l’identificazione delle specie di Saccharomyces. Le dimensioni molecolari dei frammenti ottenuti dall’analisi di restrizione sono stati confrontati con i dati riportati in letteratura. Ribosomal DNA (rDNA) is an ideal target sequence for the molecular identification of yeasts and other organisms. In fact, in addition to being present in all organisms, it is subject to a relatively slow evolutionary process that allows the presence both of highly conserved sequences even in very different species that allow the comparison of species that are not strictly related, and of variable sequences, useful to compare more closely related species. In summary, rDNA has a high interspecific polymorphism (in different species) and limited intraspecific polymorphism (within the species). In fig. 1 shows some molecular fragments representative of the analyzed isolates. All the isolates, except three, exhibited fragments characterized by a molecular weight equal to about 850 bp and, according to what is reported in the literature, these molecular dimensions allow the attribution to the genus Saccharomyces (lanes 1-4; 6-12 ). Only 3 isolates were exceptions, exhibiting a molecular weight fragment of about 450 bp (lane 5). The amplification of the ITS region alone is not a sufficient technique to distinguish the yeast species analyzed since in some cases the amplicons obtained from different species and genera are of the same or similar length and for this reason it is not always possible to identify isolates only on the basis of amplicon size. Therefore, for a correct identification of the analyzed isolates, the amplification products were digested with specific restriction enzymes, which recognize specific sequences on the target DNA and generate characteristic restriction profiles for each yeast species. In our study, isolates were restricted with the HaeIII enzyme, as this is the most widely used enzyme for identifying Saccharomyces species. The molecular dimensions of the fragments obtained from the restriction analysis were compared with the data reported in the literature.
Nelle figg. 2a e 2b sono riportati, a titolo di esempio, i frammenti ottenuti dalla restrizione con HaeIII (fig. 2a) e HinfI (fig. 2b) per alcuni degli isolati. Gli isolati che avevano esibito un frammento ITS delle dimensioni molecolari di 850 bp, dopo restrizione con HaeIII, hanno mostrato tutti lo stesso profilo, caratterizzato da bande con dimensioni molecolari di circa 320, 230, 180, 150 bp (fig. 2a: lanes 1-4; 6-12), mentre con l’enzima HinfI hanno esibito frammenti delle dimensioni molecolari di 360, 350 e 120 bp (fig. 2b: lanes 2-5). Questi frammenti di restrizione sono caratteristici di Saccharomyces cerevisiae. Nel caso dei 3 isolati non appartenenti alla specie S. cerevisiae (lane 5, fig. 2), l’enzima HaeIII non ha riconosciuto siti di taglio (fig. 2a: lane5), mentre l’analisi di restrizione con l’enzima HinfI (fig. 2b) ha prodotto un profilo caratterizzato da due bande di peso molecolare di circa 230 e 220 bp (fig. In figs. 2a and 2b show, by way of example, the fragments obtained from the restriction with HaeIII (fig. 2a) and HinfI (fig. 2b) for some of the isolates. The isolates that had exhibited an ITS fragment with a molecular size of 850 bp, after restriction with HaeIII, all showed the same profile, characterized by bands with molecular sizes of about 320, 230, 180, 150 bp (Fig.2a: lanes 1 -4; 6-12), while with the HinfI enzyme they exhibited fragments with molecular dimensions of 360, 350 and 120 bp (fig. 2b: lanes 2-5). These restriction fragments are characteristic of Saccharomyces cerevisiae. In the case of the 3 isolates not belonging to the S. cerevisiae species (lane 5, fig. 2), the HaeIII enzyme did not recognize cleavage sites (fig. 2a: lane5), while the restriction analysis with the ™ enzyme HinfI (fig. 2b) produced a profile characterized by two molecular weight bands of about 230 and 220 bp (fig.
2b: lane 1 e 6). In base a quanto riportato in letteratura, queste dimensioni molecolari permettono l’attribuzione al genere Candida (fig. 2b: lane 1 e 6). 2b: lanes 1 and 6). On the basis of what has been reported in the literature, these molecular dimensions allow the attribution to the genus Candida (fig. 2b: lanes 1 and 6).
3.1.2 Caratterizzazione genotipica degli isolati di S. cerevisiae 3.1.2 Genotypic characterization of S. cerevisiae isolates
Largamente utilizzate come bersaglio di amplificazione tramite PCR sono le regioni altamente ripetute del genoma di S. cerevisiae, note come interdelta. Attualmente questo tipo di analisi à ̈ considerato uno dei metodi più idonei per la caratterizzazione molecolare di S. cerevisiae, essendo rapido (non à ̈ necessaria l’estrazione del DNA dai ceppi) e non richiedendo la digestione degli ampliconi, che possono essere visualizzati direttamente su gel di agarosio; inoltre, numerosi studi presenti in letteratura hanno evidenziato il suo alto potere discriminatorio. Mediante l’utilizzo di primers complementari alla sequenza Î ́, à ̈ possibile amplificare le sequenze interdelta in modo da ottenere profili di amplificazione ceppo-specifici. I risultati ottenuti dalla caratterizzazione molecolare dei lieviti sono di seguito schematizzati, con riferimento alla fase dell’isolamento: Widely used as PCR amplification targets are the highly repeated regions of the S. cerevisiae genome, known as interdelta. Currently this type of analysis is considered one of the most suitable methods for the molecular characterization of S. cerevisiae, being rapid (DNA extraction from the strains is not necessary) and does not require digestion of the amplicons, which can be visualized directly on agarose gel; moreover, numerous studies in the literature have highlighted its high discriminatory power. By using primers complementary to the Î ́ sequence, it is possible to amplify the interdelta sequences in order to obtain strain-specific amplification profiles. The results obtained from the molecular characterization of yeasts are summarized below, with reference to the isolation phase:
- 1° Isolamento dei lieviti dal lievito madre (L) - 1st Isolation of yeasts from mother yeast (L)
I lieviti provenienti dal 1° isolamento effettuato dal lievito madre hanno esibito tre profili diversi, mostrati in fig. 3b, con la frequenza mostrata nel grafico in fig. 3 a: - 29,6% degli isolati ha esibito il profilo indicato dal numero romano I; The yeasts coming from the 1st isolation carried out by the mother yeast exhibited three different profiles, shown in fig. 3b, with the frequency shown in the graph in fig. 3 a: - 29.6% of the blocks showed the profile indicated by the Roman numeral I;
- 59,2% il profilo II; - 59.2% profile II;
- 11,1% il profilo III, che non à ̈ stato più ritrovato nel II<°>isolamento. - 11.1% profile III, which was no longer found in the II <°> isolation.
- 11° Isolamento dal lievito madre, dal lievito di birra commerciale e dagli impasti. Dall’analisi dell’amplificazione della regione interdelta dei lieviti isolati in questa seconda fase, si à ̈ evidenziata la presenza di tre profili molecolari, I, II e IV la cui distribuzione percentuale à ̈ riportata in fig. 4. Come à ̈ possibile osservare dalla distribuzione dei diversi profili, il profilo dominante à ̈ quello indicato con la sigla I. Tutti i lieviti isolati dal lievito di birra utilizzato nel panificio hanno esibito questo profilo di amplificazione; quindi à ̈ possibile affermare che la maggior parte degli isolati ha esibito il pattern specifico del ceppo starter commerciale utilizzato dal panificio. Il profilo II à ̈ stato ritrovato solo tra gli isolati dai campioni L, L1 e M5 con una maggiore frequenza in L (40%), mentre il profilo IV à ̈ stato esibito dagli isolati dei campioni M1, M4, M5 e in misura minore da M6 (8,6%). In base a questi risultati à ̈ possibile affermare che alcuni profili (I e II) erano comuni tra il I e il II° isolamento dalla madre, mentre altri sono stati ritrovati solo in un isolamento (profilo III solo nel I° isolamento, profilo IV solo nel II° isolamento). - 11 ° Isolation from mother yeast, commercial brewer's yeast and doughs. From the analysis of the amplification of the interdelta region of the yeasts isolated in this second phase, the presence of three molecular profiles, I, II and IV, whose percentage distribution is shown in fig. 4. As it is possible to observe from the distribution of the different profiles, the dominant profile is that indicated with the initials I. All the yeasts isolated from the brewer's yeast used in the bakery have exhibited this amplification profile; therefore it is possible to state that most of the isolates exhibited the specific pattern of the commercial starter strain used by the bakery. Profile II was found only among isolates from samples L, L1 and M5 with a higher frequency in L (40%), while profile IV was exhibited by isolates from samples M1, M4, M5 and to a lesser extent from M6 (8.6%). Based on these results, it is possible to state that some profiles (I and II) were common between I and II isolation from the mother, while others were found only in isolation (profile III only in the first isolation, profile IV only in the second isolation).
Per quanto riguarda la caratterizzazione molecolare dei ceppi isolati dai campioni L e L1 dopo conservazione in frigorifero per 8 giorni, i risultati sono riportati nelle figg. As regards the molecular characterization of the strains isolated from samples L and L1 after storage in the refrigerator for 8 days, the results are reported in figs.
5a e 5b, dalle quali à ̈ possibile osservare che il profilo dominante à ̈ risultato essere il II con una frequenza del 100% tra gli isolati del campione L e dell’88,2% per il campione LI. In base a questi risultati, si potrebbe concludere che il biotipo indicato con II potrebbe essere quello maggiormente resistente alle temperature di refrigerazione. Nel campione L1 à ̈ stato ritrovato, seppure in misura minore (solo l' %), il profilo I specifico del ceppo starter commerciale. 5a and 5b, from which it is possible to observe that the dominant profile was found to be II with a frequency of 100% among the isolates of the L sample and of 88.2% for the LI sample. Based on these results, it could be concluded that the biotype indicated with II could be the one most resistant to refrigeration temperatures. In sample L1 the specific profile I of the commercial starter strain was found, albeit to a lesser extent (only%).
3,2 Caratterizzazione dei lieviti dominanti per alcuni parametri qualitativi di interesse tecnologico 3.2 Characterization of dominant yeasts for some qualitative parameters of technological interest
3.2.1 Carattere killer 3.2.1 Killer character
Alcuni lieviti appartenenti principalmente alla specie S. cerevisiae, vengono definiti “killer†, in quanto producono tossine proteiche o glicoproteiche capaci di inibire lo sviluppo e causare la morte di lieviti sensibili di specie e generi diversi. Per tale ragione, il carattere killer rappresenta un parametro importante che permette al lievito di prendere il sopravvento in substrati contenenti altri microrganismi ed à ̈ un utile strumento naturale per controllare la microflora indesiderata. In S. cerevisiae sono state trovate diverse tossine killer: K1, K2, K3 e K28, anche se i più studiati sono i ceppi produttori delle tossine K1 e K2. Da un punto di vista molecolare, tutte le tossine dei ceppi killer hanno caratteristiche simili: si tratta di macromolecole sensibili alle proteasi, poco resistenti al calore, la maggior parte delle quali à ̈ stabile e attiva solo a valori di pH acidi. La rilevazione del fenotipo killer può essere effettuata impiegando differenti tecniche di screening, molte delle quali si basano sull’aggiunta di specifici coloranti ad un terreno di crescita agarizzato ed opportunamente tamponato. L’analisi del profilo killer ha messo in evidenza l’assenza di tale attività in tutti i ceppi di lievito saggiati. Per quanto riguarda, invece, il test di sensibilità killer, i risultati ottenuti hanno evidenziato una condizione di neutralità di tutti i ceppi nei confronti di K1 e di sensibilità a K2, evidenziata dalla presenza di alone di inibizione intorno alla colonia del ceppo analizzato. Some yeasts belonging mainly to the S. cerevisiae species are defined as â € œkillerâ €, as they produce protein or glycoprotein toxins capable of inhibiting the development and causing the death of sensitive yeasts of different species and genera. For this reason, the killer character represents an important parameter that allows yeast to take over in substrates containing other microorganisms and is a useful natural tool to control unwanted microflora. Several killer toxins have been found in S. cerevisiae: K1, K2, K3 and K28, although the most studied are the toxin producing strains K1 and K2. From a molecular point of view, all the toxins of killer strains have similar characteristics: they are macromolecules sensitive to proteases, not very resistant to heat, most of which are stable and active only at acid pH values. The detection of the killer phenotype can be carried out using different screening techniques, many of which are based on the addition of specific dyes to an agarized and appropriately buffered growth medium. The analysis of the killer profile highlighted the absence of this activity in all the tested yeast strains. As regards, however, the killer sensitivity test, the results obtained showed a condition of neutrality of all strains towards K1 and sensitivity to K2, highlighted by the presence of an inhibition halo around the colony of the strain analyzed.
3.2.2 Attività β-D-glucosidasica 3.2.2 β-D-glucosidase activity
Dal momento che gli impasti acidi sono complessi sistemi biologici in cui si svolgono diverse attività microbiche, à ̈ stata effettuata anche una valutazione di attività enzimatiche quale, ad esempio, l’attività β-D-glucosidasica correlata alla liberazione di alcune sostanze che contribuiscono all’aroma del pane. La valutazione delle attività enzimatiche nei lieviti può essere eseguita con metodiche di analisi sia qualitative che quantitative. L’analisi qualitativa permette di effettuare uno screening preliminare rapido per valutare l’espressione positiva o negativa dell’attività enzimatica in un lievito. L’analisi quantitativa permette, invece, di quantificare l’attività di enzima espressa da un ceppo di lievito. Since acid mixtures are complex biological systems in which various microbial activities take place, an evaluation of enzymatic activities was also carried out such as, for example, the β-D-glucosidase activity related to the release of some substances that contribute with the aroma of bread. The evaluation of enzymatic activities in yeasts can be performed with both qualitative and quantitative methods of analysis. The qualitative analysis allows to carry out a rapid preliminary screening to evaluate the positive or negative expression of the enzymatic activity in a yeast. Quantitative analysis, on the other hand, allows us to quantify the enzyme activity expressed by a yeast strain.
I risultati ottenuti hanno evidenziato che tutti i ceppi testati non sono dotati di attività β-D-glucosidasica, mostrando una patina di colorazione chiara, a differenza del lievito di riferimento utilizzato, che ha presentato tale attività (colorazione marrone della patina di lievito). The results obtained showed that all the tested strains do not have β-D-glucosidase activity, showing a light colored patina, unlike the reference yeast used, which showed this activity (brown color of the yeast patina).
3.2.3 Attività amilolitica 3.2.3 Amylolytic activity
Molti microrganismi sono in grado di produrre enzimi che, rilasciati all’esterno della cellula, sono in grado di diffondersi nell’ambiente circostante e di determinare l’idrolisi delle macromolecole organiche presenti nel substrato. Nel caso in questione, i 29 ceppi di S. cerevisiae sono stati saggiati per la loro capacità di produrre amilasi con conseguente idrolisi dell’amido. Il 56,7% dei ceppi saggiati ha mostrato di possedere attività amilolitica. Many microorganisms are able to produce enzymes which, released outside the cell, are able to diffuse into the surrounding environment and to determine the hydrolysis of the organic macromolecules present in the substrate. In the case in question, the 29 S. cerevisiae strains were tested for their ability to produce amylase with consequent starch hydrolysis. 56.7% of the tested strains showed to have amylolytic activity.
3.2,4 Capacità di fermentare gli zuccheri presenti nelle farine, quali glucosio, maltosio e 3.2,4 Ability to ferment sugars present in flour, such as glucose, maltose and
La valutazione dell’abilità fermentativa dei lieviti à ̈ un saggio di tipo qualitativo che consente di verificare la capacità di una coltura microbica di produrre anidride carbonica, in assenza di ossigeno, in un terreno nutritivo che contenga lo zucchero in esame, come unica fonte di energia cellulare. Nel nostro caso, i ceppi scelti sono stati saggiati per la loro capacità di fermentare gli zuccheri presenti nella farina, quali glucosio, maltosio e raffmosio ottenendo, dopo 14 giorni di incubazione dei tubi, i seguenti risultati: The evaluation of the fermentation ability of yeasts is a qualitative assay that allows to verify the ability of a microbial culture to produce carbon dioxide, in the absence of oxygen, in a nutrient medium that contains the sugar in question, as the only source. of cellular energy. In our case, the strains chosen were tested for their ability to ferment the sugars present in the flour, such as glucose, maltose and stale, obtaining, after 14 days of incubation of the tubes, the following results:
- Fermentazione del glucosio: il 60% dei ceppi ha fermentato il glucosio; - Glucose fermentation: 60% of the strains fermented glucose;
- Fermentazione del maltosio: solo il 13,3% dei ceppi ha fermentato il maltosio; - Fermentation of maltose: only 13.3% of the strains fermented maltose;
- Fermentazione del raffmosio: solo qualche ceppo ha mostrato una debole capacità di fermentare questo zucchero. - Fermentation of raffmosum: only a few strains have shown a weak ability to ferment this sugar.
3.3 Prove di panificazione su scala di laboratorio 3.3 Laboratory-scale baking tests
Sulla base dei risultati ottenuti, in particolare, dall’analisi del polimorfismo genetico e dell’attività amilolitica (tabella 4) sono stati scelti 5 ceppi. I ceppi scelti sono stati saggiati in prove di panificazione su scala di laboratorio, sia come starter singoli che come miscele di più ceppi. _ Based on the results obtained, in particular, from the analysis of genetic polymorphism and amylolytic activity (table 4), 5 strains were selected. The selected strains were tested in laboratory-scale baking trials, both as single starters and as blends of multiple strains. _
Tabella 4. Parametri considerati per la scelta dei ceppi da saggiare come starter. Table 4. Parameters considered for the choice of strains to be tested as starter.
CAMPIONE ATTIVITÀ’ AMILOLITICA PROFILO MOLECOLARE AMYLOLYTIC ACTIVITY SAMPLE MOLECULAR PROFILE
P-4 assente III P-4 absent III
L-1 presente I L-1 present I
L1 - 19 presente II L1 - 19 present II
L-4’ assente II L-4â € ™ absent II
M5-15 presente (debolmente) IV M5-15 present (weakly) IV
LB-24 presente I LB-24 present I
La velocità di lievitazione à ̈ stata valutata monitorando l’aumento del volume dell’impasto ad ogni ora per le prime quattro ore e la performance fermentativa in termini di vigore (VL) e potere lievitante (PL) dopo 2 ore e 4 ore, rispettivamente. Dall’osservazione del grafico in fig. 6, nel quale viene riportato l’aumento percentuale del volume di impasto per campione dopo 2 ore (VL) e 4 ore (PL), si evince che il ceppo M5-15 ha esibito una migliore performance fermentativa con un vigore lievitante pari al 31.3% e un potere lievitante del 42%. Inoltre, à ̈ da sottolineare che sia questo ceppo che il ceppo P-4 hanno esibito una performance fermentativa superiore a quella del ceppo commerciale (LB-24), per cui à ̈ possibile affermare che nel corso di quest’attività di ricerca sono stati ritrovati due lieviti indigeni in possesso di interessanti caratteristiche tecnologiche. The leavening speed was evaluated by monitoring the increase in the volume of the dough every hour for the first four hours and the fermentation performance in terms of vigor (VL) and leavening power (PL) after 2 hours and 4 hours , respectively. From the observation of the graph in fig. 6, which shows the percentage increase in the volume of dough per sample after 2 hours (VL) and 4 hours (PL), it can be seen that the M5-15 strain exhibited a better fermentation performance with a leavening vigor equal to 31.3% and a leavening power of 42%. Furthermore, it should be emphasized that both this strain and the P-4 strain exhibited a fermentation performance superior to that of the commercial strain (LB-24), so it is possible to state that during this research activity they Two indigenous yeasts have been found with interesting technological characteristics.
3.4 Messa a punto dello starter 3.4 Setting up the starter
Il ceppo M5-15 Ã ̈ stato scelto come starter per le prove successive, in quanto in tutti i tests ha prodotto i risultati migliori. Nelle diversi fasi operative della moltiplicazione cellulare in fermentatore, sono stati effettuati diversi isolamenti per valutare e confrontare il numero di cellule presenti in ogni fase e i risultati ottenuti sono riportati in tabella 5: Strain M5-15 was chosen as the starter for the subsequent tests, as it produced the best results in all tests. In the different operational phases of cell multiplication in the fermenter, various isolations were carried out to evaluate and compare the number of cells present in each phase and the results obtained are shown in table 5:
Tabella 5. Conta vitale delle colonie isolate nelle diverse fasi operative. Table 5. Vital count of isolated colonies in the different operational phases.
Fase di isolamento Conta vitale in piastra Isolamento dal pre-inoculo 5,3*10<7>UFC/ml Isolamento dalla brodocoltura al momento dell 'inoculo in 7,0* 10<6>UFC/ml bioreattore Isolation phase Vital count in plate Isolation from pre-inoculum 5.3 * 10 <7> CFU / ml Isolation from broth culture at the time of inoculation in 7.0 * 10 <6> CFU / ml bioreactor
Isolamento dalla brodocoltura alla fine del processo di 2,0*10<7>UFC/ml moltiplicazione cellulare Isolation from broth culture at the end of the process of 2.0 * 10 <7> CFU / ml cell multiplication
Isolamento da un grammo di biomassa ottenuta 7,2*10<9>UFC/g La biomassa raccolta alla fine della fase di produzione à ̈ stata aggiunta ad impasti preparati in laboratorio e la rapidità con cui lo starter ha condotto la fermentazione à ̈ stata determinata misurando nel tempo l’incremento in volume dell’impasto. La biomassa ha esibito una buona attività fermentativa, con un incremento in volume dell’impasto del 64% dopo 2 ore (vigore lievitante) e del 46% dopo 4 ore (potere lievitante). Isolation from one gram of biomass obtained 7,2 * 10 <9> CFU / g The biomass collected at the end of the production phase was added to doughs prepared in the laboratory and the speed with which the starter carried out the fermentation was determined by measuring the increase in the volume of the dough over time. The biomass showed a good fermentation activity, with an increase in the volume of the dough of 64% after 2 hours (leavening strength) and of 46% after 4 hours (leavening power).
3.5 Caratterizzazione completa del lievito starter 3.5 Complete characterization of the starter yeast
3.5.1 Caratterizzazione genetica del ceppo di lievito indigeno. M5-15 3.5.1 Genetic characterization of the indigenous yeast strain. M5-15
Sono state svolte delle prove di caratterizzazione sul ceppo di lievito indigeno, M5-15, isolato e selezionato come sopra discusso. In modo particolare, il ceppo à ̈ stato sottoposto ad una serie di analisi molecolari quali, l’analisi di restrizione del DNA mitocondriale (mtDNA-RFLP) e l’amplificazione dei geni contenenti minisatelliti (DAN4, SED1 e HSP150), tecniche che, dai dati riportati in letteratura, consentono la caratterizzazione di ceppi appartenenti alla specie S. cerevisiae. Characterization tests were carried out on the indigenous yeast strain, M5-15, isolated and selected as discussed above. In particular, the strain was subjected to a series of molecular analyzes such as the restriction analysis of mitochondrial DNA (mtDNA-RFLP) and the amplification of genes containing minisatellites (DAN4, SED1 and HSP150), which, from the data reported in the literature, allow the characterization of strains belonging to the S. cerevisiae species.
Il profilo di restrizione del DNA mitocondriale del ceppo M5-15 à ̈ riportato in figura 7, mentre in figura 8 à ̈ riportato il profilo ottenuto dall’amplificazione del gene DAN4 (linea 1), SED1 (linea 2) e HSP150 (linea 3). The restriction profile of the mitochondrial DNA of the M5-15 strain is shown in figure 7, while in figure 8 the profile obtained by the amplification of the gene DAN4 (line 1), SED1 (line 2) and HSP150 (line 3).
3.5.2 Caratterizzazione enzimatica del ceppo di lievito indigeno. M5-15 3.5.2 Enzymatic characterization of the indigenous yeast strain. M5-15
Dal momento che gli impasti acidi sono complessi sistemi biologici in cui si svolgono diverse attività microbiche, à ̈ stata effettuata anche una valutazione di attività enzimatiche accessorie, al fine di migliorare le caratteristiche qualitative del pane e per una caratterizzazione completa del lievito indigeno selezionato. In particolare, sono state valutate l’attività proteolitica e peptidasica, correlate alla formazione di composti importanti per l’aroma del pane, e la presenza dell’enzima fitasi che gioca un ruolo rilevante per il valore nutrizionale del pane. Per quanto riguarda l’attività proteolitica, il ceppo M5-15 non ha manifestato alcuna attività ; inoltre, questo ceppo ha esibito valori irrilevanti di attività peptidasica. Since acid doughs are complex biological systems in which various microbial activities take place, an evaluation of accessory enzymatic activities was also carried out, in order to improve the qualitative characteristics of the bread and for a complete characterization of the selected indigenous yeast. In particular, the proteolytic and peptidase activity, related to the formation of compounds important for the aroma of bread, and the presence of the phytase enzyme that plays a relevant role for the nutritional value of bread were evaluated. As regards the proteolytic activity, the M5-15 strain did not show any activity; moreover, this strain exhibited negligible values of peptidase activity.
Questo risultato era atteso, in quanto il ceppo aveva dato risposta negativa per l’attività proteolitica. Infatti, considerando che l’attività peptidasica à ̈ direttamente correlata alla capacità del lievito di idrolizzare le proteine in corti peptidi e aminoacidi, l’assenza di attività proteolitica comporta assenza anche di attività peptidasica. This result was expected, as the strain had given a negative response for proteolytic activity. In fact, considering that peptidase activity is directly related to the yeast's ability to hydrolyze proteins into short peptides and amino acids, the absence of proteolytic activity also involves the absence of peptidase activity.
L’attività fitasica à ̈ stata determinata, oltre che sul ceppo M5-15, anche sul ceppo commerciale solitamente impiegato in panificio (LB-24), al fine di confrontare il comportamento del ceppo da noi saggiato con quello di un ceppo commerciale. I ceppi M5-15 e LB-24 hanno mostrato livelli di attività fitasica simili tra di loro, con valori pari a 0,179 Î1⁄4katal/ml per M5-15 e 0,254 Î1⁄4katal/ml per LB-24. Confrontando questi valori con quelli ritrovati per i batteri, à ̈ possibile affermare che entrambi i ceppi sono in possesso di una buona attività fitasica. The phytase activity was determined not only on the M5-15 strain, but also on the commercial strain usually used in bakeries (LB-24), in order to compare the behavior of the strain we tested with that of a commercial strain. Strains M5-15 and LB-24 showed similar levels of phytase activity, with values equal to 0.179 Î1⁄4katal / ml for M5-15 and 0.254 Î1⁄4katal / ml for LB-24. Comparing these values with those found for bacteria, it is possible to state that both strains have good phytase activity.
3.5.2.4 Determinazione della frazione aromatica deH’impasto prodotto utilizzando il lievito starter selezionato. 3.5.2.4 Determination of the aromatic fraction of the dough produced using the selected starter yeast.
Nel corso delle prove di panificazione su scala di laboratorio, condotte inoculando il ceppo M5-15 in confronto al lievito commerciale LB-24, sono stati valutati parametri correlati alle performance fermentative dei due ceppi alle due diverse temperature saggiate. During the laboratory-scale bread-making tests, conducted by inoculating the M5-15 strain in comparison with the commercial yeast LB-24, parameters related to the fermentation performance of the two strains at the two different temperatures tested were evaluated.
Dall’osservazione dei grafici nelle figg. 9a e 9b, nei quali viene riportato l’aumento percentuale del volume di impasto dopo 2 ore (VL) e 4 ore (PL), sia per la lievitazione condotta a 26°C (fig. 9a) che per quella a 30°C (fig.9b), si evince che il ceppo M5-15 ha esibito una migliore performance fermentativa a 30°C con un vigore lievitante pari al 46,2% (rispetto a 29,5 % della fermentazione condotta con lo stesso ceppo a 26°C) e un potere lievitante del 54,4%. Il ceppo M5-15 à ̈ risultato migliore anche in confronto al ceppo commerciale LB-24, che ha esibito un vigore lievitante pari al 32,6% nella fermentazione condotta a 30°C (rispetto a 24,8% della fermentazione condotta con lo stesso ceppo a 26°C) e un potere lievitante pari a 51,1. From the observation of the graphs in figs. 9a and 9b, which show the percentage increase in the volume of dough after 2 hours (VL) and 4 hours (PL), both for the leavening carried out at 26 ° C (fig. 9a) and for that at 30 ° C (fig.9b), it can be seen that the M5-15 strain exhibited a better fermentation performance at 30 ° C with a leavening vigor equal to 46.2% (compared to 29.5% of the fermentation conducted with the same strain at 26 ° C) and a leavening power of 54.4%. The M5-15 strain also performed better in comparison to the commercial strain LB-24, which exhibited a leavening vigor equal to 32.6% in the fermentation conducted at 30 ° C (compared to 24.8% of the fermentation conducted with the same strain at 26 ° C) and a leavening power of 51.1.
Gli impasti finali sono stati analizzati per la frazione volatile mediante SPME e nel grafico in fìg. 10 vengono riportati i composti aromatici prodotti dai due ceppi in studio, M5-15 e LB-24, alle due temperature saggiate. Dall’osservazione del grafico si evidenzia come il ceppo indigeno M5-15 ha esibito un profilo aromatico più complesso rispetto ai profili ritrovati dall’altro ceppo (ad entrambe le temperature) e dello stesso ceppo alla temperatura più elevata. Negli impasti ottenuti con il ceppo M5-15 alla temperatura di 26°C sono stati ritrovati 26 composti aromatici. In particolare, sono stati identificati i seguenti composti: acetaldeide, diacetile, acetone, acetato di etile, etanolo, isobutanolo, 3-metil butanolo. Inoltre, sono stati ritrovati numerosi altri composti, che evidenziano la maggiore potenzialità aromatica del ceppo M5-15 rispetto al ceppo LB-24. Per quanto riguarda gli impasti ottenuti alla temperatura di fermentazione di 30°C inoculando lo stesso ceppo M5-15 sono stati ritrovati, invece, solo 12 composti diversi. Negli impasti ottenuti inoculando il ceppo LB-24 à ̈ stata ritrovata una situazione simile sia a 26 che a 30°C. in questi impasti sono stati rilevati 13 composti aromatici, la metà di quelli prodotti da M5-15 nella lievitazione a 26°C. The final mixtures were analyzed for the volatile fraction by SPME and in the graph in fìg. 10 shows the aromatic compounds produced by the two strains under study, M5-15 and LB-24, at the two tested temperatures. From the observation of the graph it is evident that the indigenous strain M5-15 exhibited a more complex aromatic profile than the profiles found by the other strain (at both temperatures) and of the same strain at the higher temperature. 26 aromatic compounds were found in the mixtures obtained with strain M5-15 at a temperature of 26 ° C. In particular, the following compounds have been identified: acetaldehyde, diacetyl, acetone, ethyl acetate, ethanol, isobutanol, 3-methyl butanol. In addition, numerous other compounds have been found, which show the greater aromatic potential of the M5-15 strain compared to the LB-24 strain. As regards the mixtures obtained at the fermentation temperature of 30 ° C by inoculating the same strain M5-15, only 12 different compounds were found. In the mixtures obtained by inoculating the LB-24 strain, a similar situation was found both at 26 and at 30 ° C. 13 aromatic compounds were found in these mixtures, half of those produced by M5-15 in leavening at 26 ° C.
3.6 Prove sperimentali di produzione 3.6 Experimental production tests
3.6,1 Validazione della performance del ceppo M5-15 in panificazione 3.6.1 Validation of the performance of the M5-15 strain in bread making
Infine, à ̈ stato valutato il comportamento del ceppo M5-15 direttamente in panificio, al fine di verificare che le caratteristiche del ceppo scelto vengano conservate anche in situazioni operative reali. Infatti, à ̈ stata condotta una prova di panificazione direttamente presso il panificio di riferimento ai fini sperimentali, inoculando un volume adeguato di impasto con la coltura starter M5-15 del presente trovato. Nel corso della lavorazione in panificio, al fine di verificare che la lievitazione era stata realmente condotta dal lievito aggiunto all’impasto, sono stati prelevati 2 campioni di impasto, a metà e a fine lievitazione, al fine di effettuare un controllo microbiologico del processo. Per ciascun campione à ̈ stata eseguita la fase di isolamento ed un numero significativo di colonie sviluppate sono state sottoposte ad analisi del profilo di amplificazione delle sequenze interdelta. Finally, the behavior of the M5-15 strain was evaluated directly in the bakery, in order to verify that the characteristics of the chosen strain are preserved even in real operating situations. In fact, a baking test was carried out directly at the reference bakery for experimental purposes, by inoculating an adequate volume of dough with the starter culture M5-15 of the present invention. During the processing in the bakery, in order to verify that the leavening had really been carried out by the yeast added to the dough, 2 dough samples were taken, halfway and at the end of leavening, in order to carry out a microbiological control of the process. For each sample the isolation phase was performed and a significant number of developed colonies were subjected to analysis of the amplification profile of the interdelta sequences.
I risultati ottenuti sono riportati in fig. 11, dalla quale à ̈ possibile osservare che tutti gli isolati saggiati hanno esibito lo stesso profilo molecolare dello starter M5-15 utilizzato per la prova di panificazione. The results obtained are shown in fig. 11, from which it is possible to observe that all the tested isolates exhibited the same molecular profile of the M5-15 starter used for the baking test.
Le tecniche di biologia molecolare utilizzate in questo studio sono risultate particolarmente utili per la caratterizzazione dei lieviti in quanto, analizzando direttamente la molecola di DNA del lievito, hanno permesso di ottenere l’impronta digitale molecolare univoca e riproducibile del ceppo di lievito starter. Queste tecniche, inoltre, sono state fondamentali per il controllo microbiologico durante il processo di produzione del pane, che rappresenta uno step fondamentale, poiché “conoscere†il lievito che ha prodotto quel determinato tipo di pane permette di associare le caratteristiche del pane ai lieviti che lo hanno prodotto. Tali tecniche, inoltre, essendo dotate di elevata sensibilità , riproducibilità e versatilità , permettono al panificatore di tutelare la qualità finale del prodotto, esaltare le caratteristiche compositive del materiale di partenza, nell’ottica della conservazione della tipicità del pane. The molecular biology techniques used in this study were particularly useful for the characterization of yeasts as, by directly analyzing the yeast DNA molecule, they allowed to obtain the unique and reproducible molecular fingerprint of the starter yeast strain. Furthermore, these techniques were fundamental for the microbiological control during the bread production process, which represents a fundamental step, since â € œknowingâ € the yeast that produced that particular type of bread allows you to associate the characteristics of the bread with yeasts that produced it. Moreover, these techniques, being endowed with high sensitivity, reproducibility and versatility, allow the baker to protect the final quality of the product, enhance the compositional characteristics of the starting material, with a view to preserving the typicality of the bread.
Il ceppo indigeno M5-15 del presente trovato, selezionato sulla base degli ottimi risultati ottenuti su scala di laboratorio, ha esibito un’ottima performance anche nelle condizioni operative dell’ambiente reale “panificio†, aprendo la strada ad un suo eventuale e possibile utilizzo futuro nella produzione aziendale, in sostituzione del lievito di birra commerciale attualmente impiegato, al fine di ottenere un prodotto di qualità nel rispetto della tipicità . The indigenous strain M5-15 of the present invention, selected on the basis of the excellent results obtained on a laboratory scale, exhibited an excellent performance even in the operating conditions of the real â € œbakeryâ € environment, paving the way for its eventual and possible future use in company production, to replace the commercial brewer's yeast currently used, in order to obtain a quality product while respecting the typicality.
3.6,2 Processo di lavorazione adottato nella prova sperimentale. 3.6.2 Manufacturing process adopted in the experimental test.
Il processo di lavorazione utilizzato dal panificio include le seguenti fasi: The manufacturing process used by the bakery includes the following steps:
- Impastamento: si introducono nell'impastatrice a "braccia tuffanti" la semola rimacinata di grano duro, il sale, il lievito del presente trovato, e una parte di acqua. Si impastano gli ingredienti per circa 30 minuti aggiungendo di volta in volta altra acqua fino ad ottenere una massa mediamente tenace ed estensibile. - Kneading: the re-milled durum wheat semolina, the salt, the yeast of the present invention, and a part of water are introduced into the "dipping arms" mixer. The ingredients are mixed for about 30 minutes, adding more water from time to time until a medium-tough and extensible mass is obtained.
- Riposo in vasca: si lascia "riposare" la massa così ottenuta coprendola con teli di tessuto, ad esempio cotone o lana, per circa 45 minuti affinché si "rilassi" e avvenga una prima lievitazione. - Rest in the tub: the mass thus obtained is left to "rest" by covering it with fabric sheets, such as cotton or wool, for about 45 minutes so that it "relaxes" and a first leavening takes place.
- Spezzatura e lievitazione: si riversa la massa sul banco da lavoro e la si divide in pezzi ai quali si conferisce una preforma sferica del peso voluto. Questi, saranno posti su tavole di legno od altro materiale ricoprendoli con un telo di tessuto, ad esempio cotone, e si lasceranno lievitare per circa 90 minuti (la durata della fase di lievitazione può variare in base alla temperatura e all’umidità presenti nel laboratorio). - Dividing and leavening: the mass is poured onto the work bench and divided into pieces to which a spherical preform of the desired weight is given. These will be placed on wooden boards or other material covering them with a cloth, for example cotton, and left to rise for about 90 minutes (the duration of the leavening phase may vary according to the temperature and humidity present in the laboratory).
- Infomamento e cottura: raggiunta la lievitazione ottimale, le preforme vengono poste su un banco d'acciaio, od altro idoneo materiale, dove subiranno un'ulteriore manipolazione per dar loro la forma definitiva (cosiddetta "alta" o "a cornetto") e successivamente introdotte nel forno dove rimarranno in cottura per circa 90 minuti. I forni a gas o a legna saranno preventivamente riscaldati ad una temperatura compresa tra 250 °C e 270 °C e rimarranno per circa 30 minuti con valvola aperta per la fuoriuscita del vapore in eccesso che si sviluppa durante la prima fase di cottura. - Infomation and cooking: once optimal leavening has been reached, the preforms are placed on a steel bench, or other suitable material, where they will undergo further manipulation to give them the final shape (so-called "high" or "croissant") and subsequently introduced in the oven where they will remain in cooking for about 90 minutes. The gas or wood-fired ovens will be previously heated to a temperature between 250 ° C and 270 ° C and will remain for about 30 minutes with the valve open for the excess steam that develops during the first cooking phase to escape.
- Particolari delle materie prime: il lievito del presente trovato, sale marino raffinato, acqua, semole rimacinate di grano duro provenienti dal territorio lucano. - Details of the raw materials: the yeast of the present invention, refined sea salt, water, re-milled durum wheat semolina from the Lucanian territory.
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| IT000006A ITPZ20120006A1 (en) | 2012-09-26 | 2012-09-26 | YEAST OF SPECIES SACCHAROMYCES CEREVISIAE |
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2006325562A (en) * | 2005-05-23 | 2006-12-07 | Satoru Watanabe | Natural baker's yeast |
| JP2010068739A (en) * | 2008-09-17 | 2010-04-02 | Obihiro Univ Of Agriculture & Veterinary Medicine | Method for producing bread and bread obtained by the same |
| KR20110078056A (en) * | 2009-12-30 | 2011-07-07 | 매일유업주식회사 | A novel yeast and preparation method for bread using it |
-
2012
- 2012-09-26 IT IT000006A patent/ITPZ20120006A1/en unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006325562A (en) * | 2005-05-23 | 2006-12-07 | Satoru Watanabe | Natural baker's yeast |
| JP2010068739A (en) * | 2008-09-17 | 2010-04-02 | Obihiro Univ Of Agriculture & Veterinary Medicine | Method for producing bread and bread obtained by the same |
| KR20110078056A (en) * | 2009-12-30 | 2011-07-07 | 매일유업주식회사 | A novel yeast and preparation method for bread using it |
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