ITPE980017A1 - Metodo di differenziazione cromatica dei microrganismi in fluorescenza - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
TITOLO
Metodo di differenziazione cromatica dei microrganismi in fluorescenza.
STATO ANTERIORE DELLA TECNICA
I batteri sono microrganismi procarioti unicellulati che hanno il corpo cellulare contenuto all’interno di una parete cellulare che conferisce loro importanti caratteristiche. Essi vengono comunemente differenziati in Gram-positivi ed in Gram-negativi (da colorazione Gram,microbiologo danese vissuto fra il XIX e il XX secolo) in relazione alle capacità della loro parete cellulare di mantenere o meno il colore in seguito a decolorazione. La possibilità di differenziarli in questa maniera assume importanza clinica, prognostica e soprattutto terapeutica.
Nel 1980 McCarthy e Senne , dimostrarono che in fluorescenza i batteri presenti in alcuni liquidi biologici (sangue ad esempio) potevano essere messi in evidenza più facilmente.
Allo stato non è dato conoscersi metodica di differenziazione dei batteri Gram-positivi da quelli Gramnegativi in fluorescenza.
OBIETTIVO
La metodica in fluorescenza presentata permette di differenziare i batteri Gram-positivi dai Gramnegativi e potrebbe trovare utili applicazioni in microbiologia clinica in quanto maggiormente sensibile della colorazione di Gram in alcune condizioni cliniche (ad esempio :esame batterioscopico del sangue). Si parla di fluorescenza quando l’energia radiante assorbita da una sostanza viene riemessa sotto forma di energia luminosa a lunghezza d’onda maggiore.Alla base del fenomeno della fluorescenza sta l’assorbimento di fotoni da parte della sostanza fluorescente con conseguente utilizzazione dell’energia del fotone per il salto di un elettrone da un’orbita interna (livello energetico basso) ad una esterna (livello più alto).
Obiettivo del procedimento inventato è di ottenere, in fluorescenza, una differenziazione dei batteri in base ai loro differenti caratteri tintoriali.A tal fine si sono utilizzate due sostanze fluorescenti ,una posta sulla lunghezza d’onda del rosso, l’Acridine Orange, l’altra su quella del verde, la Fluoresceina, che insieme realizzano una Equazione Cromatica (Rosso+Verde=Giallo). Partendo supposto che la decolorazione con alcool/acetone (50%-50%)produce solo lievi differenze sui batteri trattati con Acridine Orange (0,01%) si è ricorsi ad un sistema rivelatore capace di evidenziare queste differenze:FEquazione Cromatica Rosso-Verde, ottenibile addizionando il secondo fluorocromo,la Fluoresceina(0,002%).I batteri più resistenti alla decolorazione (Gram-positivi)conserveranno una quota sufficiente di colorante acridinico per essere in equazione ed essi, con l’aggiunta del secondo colorante (verde), appariranno gialli per la combinazione dei due colori.Invece i batteri Gram-negativi, più decolorabili, manterranno una quota di rosso inadeguata alla equalizzazione del giallo ed appariranno in verde, cioè nella banda del colorante presente a questo punto in eccesso.
PROCEDIMENTO E RISULTATO RAGGIUNTO
Sono stati adoperati i seguenti reagenti:
Soluzione di Acridine Orange (0,01%) in Tampone Acetato (pH 4) .
100 mL = Acridine Orange . 10 mg
Tampone Acetato pH 4. 100 mL
(Tampone Acetato pH 4:
Acido Acetico 0,2 mol/L . 82,0 mL
Acetato di Sodio 0,2 mol/L . 18,0 mL )
Soluzione Alcool/ Acetone
100 mL = Alcool Etilico . 50 mL
Acetone . 50 mL
Fluoresceina sodica (0,002%) in soluzione alcoolica (pH 5,5)
100 mL - Fluoresceina sodica . 2 mg
Acido Acetico . 1,5 mL
Tampone Acetato pH 4,62. 0,5 mL
Alcool Etilico . 98 mL
(Tampone Acetato pH 4,62:
Acido Acetico 0,2 mol/L . 52,0 mL
Acetato di Sodio 0,2 mol/L . 48,0 mL )
Procedura di colorazione:
Coprire il vetrino completamente con la soluzione di Acridine Orange (0,01%) , pH 4 , e far agire per 2 minuti.
Lavare accuratamente con acqua.
Utilizzare la soluzione Alcool/ Acetone facendola agire per 10 secondi esatti.
Lavare nuovamente con acqua.
Coprire il vetrino completamente con la soluzione di Fluoresceina sodica (0,002%) , pH 5,5 , e far agire per 2 minuti.
Lavare con acqua accuratamente e prolungatamente.
Lasciare asciugare all’aria e leggere al microscopio a fluorescenza.
Materiale batterico:
per approntare i vetrini da sottoporre a colorazione sono stati utilizzati batteri, stesi sul vetrino con l’aiuto di una goccia di acqua distillata,asciugati all’aria e fissati alla fiamma provenienti da colture su piastra già identificate con certezza per il loro sviluppo su terreni specifici o attraverso altre prove selettive.Le colture prese in esame erano in genere mantenute su piastra per 24-48 ore ma in alcuni casi anche per un tempo più lungo se non doppio. Sono state esaminate anche colonie batteriche pure, isolate da una sola cellula batterica,mantenute in coltura per varie settimane su terreni solidificati a becco di clarino in provetta.Nel complesso sono stati esaminati 25 ceppi batterici, 12 Gram-positivi e 13 Gramnegativi:
BATTERI GRAM-POSITIVI
Staphylococcus aureus (5)
Streptococcus pyogenes (2)
Enterococcus sp. (4)_
Corynebacterium sp. (1)
BATTERI GRAM-NEGATIVI
Escherichia coli IH
Klebsiella pneumoniae (1)
Klebsiella IH
Enterobacter (4)
Pseudomonas 5L IH
(Tra parentesi il numero di ceppi testati per ogni specie.)
Grande attenzione deve essere posta nell’esecuzione dei singoli passaggi di cui è composta la colorazione, vanno evitate le più piccole distrazioni e rispettati con precisione i tempi di colorazione. Particolare cura deve essere posta nel lavaggio finale che va effettuato lungamente ed accuratamente. E’ preferibile adoperare materiale batterico tenuto in piastra per 24-48 ore.
Risultati.
si è potuto constatare che tutti i ceppi Gram-positivi hanno realizzato l’equalizzazione cromatica di un giallo, mentre questa non è stata raggiunta da nessuna delle specie Gram-negative esaminate. Di fatto, ove erano presenti batteri Gram-positivi, più resistenti alla decolorazione, questi erano in grado di mantenere una quota sufficiente di Acridine Orange per essere in equazione , cosicché aggiungendo questa quota di rosso alla quota di verde del secondo colorante ,la Fluoresceina, si è realizzata una equazione cromatica ed essi sono apparsi in giallo, per la combinazione dei due colori.La stessa cosa non si è verificata per i batteri Gram-negativi che ,più sensibili alla decol orazione, avevano conservato una quota minore del primo colorante. In questo caso la quota di rosso del primo colorante è risultata insufficiente a realizzare l’equazione cromatica di un giallo ed essi sono apparsi colorati nella banda del verde, e cioè nella banda del colorante presente a questo punto in eccesso.
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1) il procedimento in oggetto consente con bassi costi é con estrema chiarezza, senza l’utilizzo di sostanze tossiche, di ottenere una differenziazione netta e facile da osservare dei caratteri tintoriali delle varie specie in fluorescenza; 2) il procedimento è nuovo rispetto al tradizionale metodo di Gram, poiché la maggior sensibilità di cui è accreditato il colorante fluorescente ne consente un’utilizzazione nuova e sconosciuta allo stato della attuale tecnica e conoscenza sia in ambito laboratoristico e microbiologico che a scopo puramente diagnostico-clìnico (un esempio in tal senso può essere rappresentato dall’esame batterioscopico del sangue eseguito in corso di patologie gravi quali le setticemie in cui diventano cruciali i tempi dell’ identificazione batterica).
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