ITPD20110258A1 - Metodo per la valutazione farmacogenetica della risposta al trattamento con sali di litio nel disturbo bipolare - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale dal titolo:

Metodo per la valutazione farmacogenetica della risposta al trattamento con sali di litio nel disturbo bipolare

Campo dell’invenzione

L’invenzione à ̈ relativa ad un metodo per la valutazione farmacogenetica della risposta al trattamento con sali di litio in pazienti affetti da disturbo bipolare basato sulla rilevazione di un polimorfismo localizzato sull’introne 1 del gene per il canale cationico neuronale di tipo 1 sensibile all’amiloride (amiloride-sensitive cation channel 1†ACCN1).

Stato della tecnica

Nei sistemi classificativi dei disturbi mentali, il Disturbo Bipolare (DB) rientra tra i disturbi dell’umore e indica un quadro clinico caratterizzato dalla ricorrenza di episodi affettivi maggiori di opposta polarità, che oscillano cioà ̈ da uno stato maniacale ad uno depressivo, accompagnati da alterazioni del pensiero e del comportamento. Gli episodi di alterazione dell’umore sono alternati a periodi più o meno brevi di relativo benessere. La prevalenza del disturbo bipolare nel corso della vita à ̈ stimata al 4-5% nella popolazione generale con un’età media all’esordio di 18 anni per l’uomo e di 20 anni per la donna [1]. Il decorso naturale del DB spesso porta a un progressivo deterioramento delle prestazioni dei soggetti affetti, con compromissione di una o più aree funzionali: perdita del posto di lavoro, interruzione dei rapporti interpersonali, abuso di sostanze, problemi legali, ospedalizzazioni. Inoltre, il suicidio rappresenta la prima causa di morte nei soggetti DB con una mortalità di 3-6 volte superiore rispetto alla popolazione generale.

L’eziopatogenesi del disturbo non à ̈ tuttora conosciuta ma numerose osservazioni mostrano che il DB à ̈ un disturbo complesso ed eterogeneo nel quale fattori biologici e ambientali interagiscono nel modulare la suscettibilità al disturbo. Tale complessità giustifica almeno in parte la mancata identificazione di chiari determinanti molecolari coinvolti nella predisposizione al DB, ma i dati di epidemiologia mostrano un’alta ereditarietà per questo disturbo [2].

Studi di associazione di linkage e caso-controllo hanno suggerito numerosi potenziali loci di suscettibilità e geni candidati per il DB, ma nessuno di questi studi à ̈ stato fino ad ora replicato in modo coerente e inconfutabile [2, 3, 4].

Tramite le attuali metodiche di genotipizzazione per gli studi di associazione “genome-wide scan†(GWAS) sono stati evidenziati alcuni alleli comuni di rischio per la malattia che possono avere un piccolo o medio effetto e che, fino ad ora, hanno spiegato solo una frazione relativamente piccola dalla varianza fenotipica del DB.

Un’altra spiegazione dei numerosi risultati inconcludenti ottenuti nella ricerca delle determinanti genetiche del DB potrebbe essere data dall’elevato grado di eterogeneità clinica che caratterizza questa malattia psichiatrica. In questo contesto, l’uso di sottofenotipi come la risposta al litio, aumentando l’omogeneità fenotipica (e presumibilmente genetica), può facilitare l’identificazione delle varianti genetiche associate [5].

Tra gli stabilizzanti dell'umore, i sali di litio rappresentano il farmaco d'elezione nel trattamento del disturbo bipolare. I sali di litio sono attualmente, infatti, il presidio terapeutico consigliato come prima scelta nella terapia per il trattamento e la prevenzione della malattia bipolare in tutte le linee guida internazionali, compresa quella dell’OMS.

Oltre all’effetto stabilizzante sull’umore, il litio à ̈ ad oggi il farmaco più efficace nella prevenzione del comportamento suicidario, che à ̈ la prima causa di morte nei pazienti affetti da DB. Pertanto, nell’ambito di una diagnosi bipolare il litio viene somministrato anche a quei pazienti che, pur non beneficiando del suo effetto stabilizzante, presentano un rischio per il comportamento suicidario.

Tuttavia, non tutti i pazienti rispondono a questo trattamento e dati clinici mostrano che circa il 30% dei pazienti DB in terapia con litio presenta una risposta clinica completa, con il ritorno allo stato eutimico e assenza di nuovi episodi di malattia in entrambi i versanti, depressivo e maniacale, mentre circa il 80% risponde parzialmente o non risponde affatto al trattamento [6, 7].

Inoltre si à ̈ visto che la risposta al litio sembra essere familiare [8] e associata ad una storia familiare di DB [9]. Tali evidenze cliniche nel loro insieme suggeriscono che ci siano fattori genetici che influenzano la risposta dei pazienti affetti da DB al litio.

Diversi studi hanno cercato di verificare quali siano le basi genetiche della risposta al litio e recentemente in due studi clinici, uno retrospettivo ed uno prospettico, sono stati analizzati due gruppi di pazienti affetti da disturbo bipolare responsivi o non responsivi al litio. In entrambi gli studi si à ̈ trovata una positiva correlazione tra la risposta al litio e un polimorfismo di un singolo nucleotide (SNP) sul gene NTRK2 (neurotrofic tyrosine kinase receptor type 2, GeneID: 4915, RefSeq: NM_001007097.1 NP_001007098.1, NC_000009.11 NT_008470.19) [10, 11]. Ad oggi solo uno studio di analisi genomica à ̈ stato pubblicato sulla risposta al litio. In questo studio sono riportate evidenze di una associazione (< 5 x 10<-4>) della risposta al litio ad una regione sul cromosoma 4q32 comprendente un gene (RefSeq: NC_000004.11 NT_016354.19) che codifica il recettore GRIA2 glutammato/alfa-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolpropionato (AMPA) [12].

Riassumendo, nonostante il litio rappresenti ad oggi la terapia di elezione nel disturbo bipolare, la relativamente alta frazione di pazienti non rispondenti o parzialmente rispondenti e i suoi effetti secondari anche gravi determinano la necessità di identificare strumenti validi per l’valutazione della risposta al litio in soggetti affetti da disturbo bipolare.

Sommario

Gli inventori hanno condotto una caratterizzazione fenotipica della risposta al litio applicando la scala restrospettiva per la valutazione della risposta al trattamento a lungo termine. Usando gli array Affymetrix 6.0 single nucleotide polymorphism (SNP), sono stati genotipizzati circa 900.000 SNP in un campione di 52 pazienti bipolari, selezionati all’interno del campione di 204 pazienti e ugualmente distribuiti agli estremi della scala di risposta al trattamento. Tra gli SNP che sono risultati associati, 11 sono stati selezionati per la validazione e la genotipizzazione à ̈ stata estesa al resto del campione. L’associazione à ̈ stata inoltre verificata usando la scala come tratto quantitativo.50 SNP hanno mostrato associazione nominale con la risposta al litio (p ≤ 10<-5>) nel sottogruppo di 52 soggetti affetti da disturbo bipolare. Alcuni dei segnali di associazione sono poi stati confermati nel campione esteso. L’associazione più robusta, confermata anche dall’analisi della scala come tratto quantitativo, riguarda uno SNP localizzato nell’introne 1 del gene per il canale cationico neuronale di tipo 1, sensibile all’amiloride (ACCN1, GeneID 40, RefSeq: NM_001094.4 NP_001085.2 NC_000017.10 NT_010799.15), codificante per un canale cationico che presenta un’alta affinità per il sodio ed à ̈ permeabile al litio.

I risultati indicano che il gene dell’ACCN1 à ̈ un candidato per la risposta al trattamento al litio e che quindi può essere utilizzato come un marcatore genetico per la predizione dell’efficacia del litio nel trattamento dei pazienti affetti da disturbo bipolare.

È quindi oggetto dell’invenzione un metodo per la diagnosi in un paziente affetto da disturbo bipolare della potenziale risposta al trattamento con i sali di litio, detto metodo comprendente la fase di determinare in un campione il genotipo del paziente al locus genico corrispondente allo SNP rs11869731 del gene del canale cationico neuronale di tipo 1 sensibile all’amiloride (ACCN1).

Breve descrizione delle figure

Figura 1. Struttura del gene ACCN1.

Figura 2. Box plot dell’analisi quantitativa dei punteggi del total score della scala di valutazione retrospettiva per la risposta al litio nel campione dei 204 pazienti bipolari Sardi: stratificazione secondo i genotipi dello SNP rs11869731 del gene ACCN1.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Allo scopo di identificare varianti genetiche associate con la risposta al litio nel disturbo bipolare gli inventori hanno recentemente condotto uno studio di analisi genomica (genome wide scan GWS) in un campione di 204 pazienti bipolari sardi caratterizzati per la risposta al litio applicando la scala restrospettiva per la valutazione della risposta al trattamento a lungo termine [8].

La scala consta di due Criteri: Criterio A, che quantifica il grado di miglioramento nel corso del trattamento, e il Criterio B che tramite la valutazione di 5 variabili consente di stabilire se il miglioramento osservato sia il risultato del trattamento stabilizzante piuttosto che di un miglioramento spontaneo o di un effetto di terapie aggiuntive. Sottraendo il B Score dall’A Score si ottiene il Total Score (TS), una scala composta da 11 punti con un intervallo che va da 0 (non riposta completa) a 10 (risposta completa). In base al TS il campione à ̈ suddiviso in due gruppi definiti Full Responder, se il punteggio à ̈ ≥ 7 e Other se il punteggio à ̈ < 7.

Il primo passo à ̈ consistito in uno scan esplorativo di tutto il genoma su un gruppo di 52 pazienti bipolari selezionati ai due estremi della scala da 11 punti di risposta al trattamento (26 responders, TS ≥ 8; 26 non responders, TS = 0).

Successivamente à ̈ stata validata e genotipizzata in tutto il campione una lista di SNP associati e selezionati secondo criteri di priorità.

Il GWS ha evidenziato, infatti, 50 SNP con associazioni nominalmente significative con la risposta al litio (con valori di p da 10<-5>a 10<-6>).

Allo scopo di validare i risultati del microarray, sono stati, quindi, selezionati 11 SNP e genotipizzati sullo stesso campione composto da 52 soggetti bipolari. La selezione degli SNP à ̈ stata eseguita in base ai seguenti criteri di inclusione: a) p value dell'associazione ≤ 10<-5>; b) posizione dello SNP nel gene (priorità per SNP intronici/esonici); c) possibile rilevanza del gene nei disturbi dell'umore e/o nel meccanismo d'azione del litio.

I risultati più significativi sono stati riportati per i seguenti SNP: rs2811332 (introne 4 del gene TMCC1, GeneID: 23023 1., Ref. Seq: NM_001017395.3 NP_001017395.2, NC_000003.11 NT_005612.16), rs1390913 (192953 bp a valle del gene GNPDA2, GeneID: 132789, Ref. Seq: NC_000004.11 NT_006238.11), rs869156 (introne 4 del gene RASSF4, GeneID: 83937, Ref. Seq: NC_000010.10 NT_033985.7) e rs11869731 (introne 1 del gene ACCN1, GeneID:40, Ref. Seq: NC_000017.10 NT_010799.15).

Gli SNP validati sono stati successivamente genotipizzati sul resto del campione e i due dataset sono stati combinati (204 soggetti in totale).

Lo scopo di questo secondo approccio era quello di testare l'associazione tra gli SNP validati e la risposta al litio in un gruppo di pazienti che rappresentasse l’intera variabilità che caratterizza il fenotipo di risposta. Inoltre, al fine di verificare se i valori medi del punteggio totale (Total Score) differissero in base ai genotipi degli SNP associati, à ̈ stata condotta un’analisi quantitativa, utilizzando la scala di valutazione della risposta come tratto continuo.

I risultati dei diversi approcci hanno evidenziato che lo SNP rs11869731, localizzato nell’introne 1 del gene codificante per l’Amiloride Sensitive Cation Channel 1, Neuronal (ACCN1, cromosoma 17q12, RefSEq: NC_000017.10 NT_010799.15) à ̈ significativamente associato alla risposta al litio (p = 7.8 x 10-<6>nel genome scan, p = 6.0 x 10<-4>nel campione esteso; p = 4.7 x 10<-5>nell’analisi del tratto quantitativo).

Il gene ACCN1 (RefSeq NC_000017.10 NT_010799.15) à ̈ localizzato nella regione cromosomica 17q12 in posizione 31,340,105-32,483,551 (Ensemble database). Il polimorfismo rs11869731 à ̈ localizzato in posizione 32,338,871 (Ensemble database): la frequenza nella popolazione caucasica dell’allele C à ̈ del 78%, mentre quella dell’allele G à ̈ del 22% (HapMap database).

È quindi oggetto dell’invenzione un metodo per la diagnosi in un paziente affetto da disturbo bipolare della potenziale risposta al trattamento con i sali di litio, detto metodo comprendente la fase di determinare in un campione il genotipo del paziente al locus genico corrispondente allo SNP rs11869731 del gene del canale cationico neuronale di tipo 1 sensibile all’amiloride (ACCN1).

Nell'analisi quantitativa il genotipo G/G à ̈ risultato associato con valori di TS medi di 7.35 (full response) mentre i genotipi G/C e C/C sono risultati associati con valori medi di TS di 3 e 4 punti più bassi rispetto al genotipo G/G, rispettivamente. Il polimorfismo à ̈ stato genotipizzato nel campione di pazienti bipolari tramite Microarray Affymetrix Genome wide SNP 6.0 (prob set ID SNP_A-8483155) e successivamente validato tramite PCR utilizzando la tecnica KASPar<TM>(http://www.kbioscience.co.uk/reagents/KASP/KASP.html).

Sotto un altro aspetto l’invenzione concerne un metodo per la diagnosi in un paziente affetto da disturbo bipolare della potenziale risposta al trattamento con i sali di litio, detto metodo comprendente la fase di determinare in un campione il genotipo del paziente al locus genico corrispondente allo SNP rs11869731 del gene del canale cationico neuronale di tipo 1 sensibile all’amiloride (ACCN1) in cui quando tale genotipo à ̈ G/G, della potenziale risposta al trattamento con i sali di litio à ̈ favorevole o corrisponde ad una “full response†. In questo caso e il paziente può essere definito “responder†.

Sotto ancora un altro aspetto, l’invenzione riguarda il metodo in cui quando tale genotipo à ̈ G/C, la potenziale risposta al trattamento con i sali di litio à ̈ parzialmente favorevole e il paziente può essere definito “partial responder†, e in cui quando tale genotipo à ̈ C/C, della potenziale risposta al trattamento con i sali di litio à ̈ sfavorevole e il paziente può essere definito “non responder†.

Sotto ancora un altro aspetto l’invenzione concerne un metodo in cui detto campione comprende un acido nucleico e in cui detto acido nucleico comprende l’introne 1 del gene ACCN1.

Sotto un ulteriore aspetto il metodo secondo la presente invenzione, prevede la fase di determinare in un campione il genotipo del paziente comprende l’uso di almeno un oligonucleotide.

Per la genotipizzazione sono stati utilizzati i seguenti primer:

- 5’-CTGAGTGCTCCTTCTCAGTC-3’ per l’allele C (SEQ ID.NO 1);

- 5’-CTCTGAGTGCTCCTTCTCAGTG-3’ per l’allele G (SEQ ID.NO 2);

- 5’-GAGTGTCTGAAGGGTAAACTGCTGAA-3’ (SEQ ID.NO 3) come primer comune.

E’ importante notare che nello studio qui descritto le associazioni per gli SNP rs2811332 e rs1390913 sono risultate non significative quando la genotipizzazione à ̈ stata estesa all’intero campione di pazienti bipolari, mentre l’associazione dello SNP ACCN1 rs11869731 à ̈ rimasta forte ed à ̈ stata confermata dall’analisi quantitativa della scala. Questa ricerca à ̈ quindi ad oggi la prima che evidenzia un’associazione tra varianti dell’ACCN1 e la risposta al litio nel disturbo bipolare. Il gene ACCN1 codifica per il canale ionico sensibile al pH acido di tipo 2 (ASIC 2), un membro della superfamiglia dei canali al sodio degenerina/epiteliale (DEG/ENacC). Questo canale cationico à ̈ principalmente permeabile al Na<+>e, in misura minore, al Li<+>e al K<+>, ed à ̈ ampiamente espresso nei neuroni. La famiglia degli ASIC comprende almeno tre subunità (ASIC1, ASIC2 e ASIC3) che si assemblano in complessi per formare canali attivati da protoni extracellulari e con differenti sensibilità al pH [13, 14]. Gli ASIC sembrano costituire elementi chiave nella patofisiologia del dolore, nell’ictus ischemico e nelle malattie psichiatriche [15]. È interessante notare che topi transgenici nei quali la sub-unità ASIC1 à ̈ sovra-espressa, presentano alterazione dell’LTP ippocampo-dipendente e della memoria spaziale, come mostrato dai test del labirinto di Morris [15, 16]. Nell’uomo à ̈ stato riportato che il trattamento dei neuroni corticali con soluzione acida induce un sostanziale danno cellulare, che viene attenuato dal blocco dell’ASIC1a [17]. Fino a ora, la maggior parte degli studi si à ̈ focalizzata sull’ASIC1 (ACCN2) mentre si sa ancora poco sulla funzione dell’ASIC2 (ACCN1). Tuttavia, numerosi esperimenti suggeriscono che l’ASIC2 interagisce sia con l’ASIC1 che con l’ASIC3 [14]. Precisamente, à ̈ stato riportato che l’ASIC2 modula le correnti H<+>attivate dell’ASIC1 nei neuroni dell’ippocampo nel topo [18]. Nell’insieme questi risultati suggeriscono che alterazioni nei membri della famiglia ASIC potrebbero essere coinvolte nell’eziologia dei disturbi psichiatrici. A questo proposito à ̈ importante sottolineare che gli inibitori della sub-unità ASIC1 nell’amigdala hanno un effetto antidepressivo in modelli di depressione nel topo, il che suggerisce che la famiglia dei canali ionici acido-sensibili sia un potenziale bersaglio degli antidepressivi [19]. È interessante, inoltre, notare che il gene ACCN1 à ̈ mappato sul cromosoma 17q12, una regione precedentemente associata al DB [20, 21]. I risultati dunque suggeriscono che l’ACCN1 sia un gene coinvolto nella risposta al litio.

PARTE SPERIMENTALE

ESEMPIO 1

Campione e caratterizzazione della risposta clinica al trattamento con il litio

Il campione à ̈ costituito da 204 pazienti bipolari non imparentati tra loro, reclutati presso la Lithium Clinic del Centro di Farmacologia Clinica, Unità di Farmacologia Clinica dell’Ospedale Universitario di Cagliari e del Dipartimento di Neuroscienze “B.B. Brodie†, Università di Cagliari, Italia. Il periodo di reclutamento à ̈ avvenuto dal 1980 al 2006. La durata media del trattamento con Litio nei pazienti à ̈ di 11.49 ± 7.93 anni. La diagnosi di malattia à ̈ stata effettuata da psicofarmacologi clinici seguendo i Research Diagnostic Criteria (RDC) [22] attraverso l’utilizzo della Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia—Lifetime Version (SADS-L) [23] e di una revisione sistematica delle cartelle cliniche dei pazienti. I criteri di inclusione sono stati i seguenti: (a) almeno 12 mesi di monoterapia continuativa con il litio; (b) presenza di almeno un episodio di malattia antecedente all’introduzione della terapia con litio; (c) dati clinici del paziente sufficienti al fine di ottenere una rappresentazione grafica del disturbo attraverso il metodo della NIMH Retrospective Life Chart [24]; (d) livelli plasmatici di litio compresi nel range terapeutico (0,5-1 mEq/l). Lo studio à ̈ stato approvato dal comitato etico locale. Ciascun paziente ha firmato un consenso informato scritto per la partecipazione allo studio. Tutti i pazienti sono di ancestralità sarda da almeno 4 generazioni. Il decorso clinico di ciascun paziente à ̈ stato rappresentato graficamente tramite il metodo della NIMH Life Chart. Sui dati così raccolti à ̈ stata quindi applicata la scala per la valutazione della risposta al litio allo scopo di determinare l’efficacia del trattamento profilattico [8]. La scala quantifica il grado di miglioramento durante il trattamento (Score A) espresso come una misura della variazione della frequenza e della severità degli episodi di malattia. Lo Score A viene pesato per 5 fattori (Score B) che permettono di determinare se i miglioramenti osservati sono dovuti al trattamento stabilizzante piuttosto che ad un miglioramento spontaneo o all’effetto di altri farmaci. Il Total Score (TS), costituito da 11 punti, à ̈ ottenuto dalla sottrazione dello Score B dallo Score A. I pazienti con un TS uguale o superiore a 7 sono identificati come “Full Responder†(FR) mentre i pazienti con TS inferiore a 7 sono identificati come “partial†e “non responder†(e raccolti sotto il nome di “altri†).

Allo scopo di quantificare la correlazione genotipo-fenotipo, sono stati applicati 3 differenti approcci analitici utilizzando la scala per la valutazione della risposta al trattamento: i) selezione dei pazienti ai due estremi della scala della risposta al trattamento con litio al fine di accentuare le diversità fenotipiche e le possibili differenze genetiche tra i due gruppi; ii) dicotomizzazione del fenotipo “risposta†attraverso l’applicazione di un cut-off a TS uguale a 7 o superiore al fine di includere un campione più ampio costituito da pazienti in cui viene rappresentata la totale variabilità della risposta alla terapia; iii) valutazione delle differenze nei TS medi, usando un approccio per tratti quantitativi.

Risultati

Campione

L’intero campione comprendeva 204 pazienti affetti da DB (età media ± DS = 46.7 ± 12.2; Uomini = 65; Donne = 139; media TS ± DS = 4.13 ± 3.08). Sessanta pazienti sono stati classificati come FR al litio e 144 come “altri†. I due gruppi non differivano in termini di età (età media ± SD = 49.78 ± 15.16 vs 45.42 ± 13.66, P = NS) e distribuzione del sesso. Il sotto-campione di 52 pazienti comprendeva 26 “full responders†(TS ≥ 8) e 26 “non responders†(TS = 0) selezionati dall’intero campione. I pazienti appartenenti a ciascun gruppo sono stati selezionati in modo da essere appaiati per sesso ed età (vedi Tab.1).

Tabella 1: Caratteristiche cliniche e demografiche del campione di pazienti sardi caratterizzati da una risposta a lungo termine al trattamento con il litio Campione Genome wide scan (# 52) Campione intero (# 204) FR(#26) NR(#26) FR (# 60) Altri (#144) Età media ± SD 52.0±16.0 49.2± 10.4 49.780± 15.16 45.42± 13.66 Uomini # 6 7 19 46 Donne# 20 19 41 98 TS media ± SD 8.58±0.76 0±0 7.69±0.93 2.66±2.36

FR: full responder; NR: non responders; TS: total score; SD: deviazione standard

ESEMPIO 2

Genome wide scan e validazione degli SNP selezionati

È stato condotto un genome-wide scan esplorativo in un sotto-campione di 52 pazienti bipolari, selezionato dall’intero campione di 204 soggetti tra i soggetti con valori di TS agli estremi della scala di valutazione della risposta al trattamento (TS per i 26 NR = 0; TS per i 26 FR ≥ 8). La genotipizzazione à ̈ stata effettuata attraverso gli array Affymetrix GeneChip SNP 6.0, applicando il protocollo fornito dalla casa produttrice (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA) [Affimetrix http://www.affimetrix.com).

È stata creata una lista di polimorfismi SNP che includeva marker filtrati secondo i seguenti criteri: minor allele frequency (MAF) > 0.01, genotype call rate > 0.97; Hardy Weinberg equilibrium (HWE) p value > 1x10<-4>. Dopo la frequenza e il pruning genotipico, 261452 su 906600 SNPsono stati esclusi da ulteriori analisi. La media call rate per i rimanenti 645148 SNPs era ≥ 98%.

Dopo il controllo di qualità, 261452 su 906600 SNP sono stati esclusi dalle analisi successive. La media dei call rate per i rimanenti 645148 SNP era ≥ 98%. È stato calcolato il fattore d’inflazione (λ) per verificare una possibile stratificazione della popolazione. I test di associazione sono stati effettuati indipendentemente da due esperti, attraverso i software Plink (v 2.05) [Plink; http://pngu.mgh.harvatd.edu./purcell/plink; 25] e Haploview (v 4.2) [26]. Allo scopo di validare ulteriormente i risultati ottenuti dal microarray, abbiamo selezionato 11 SNP tra i 50 risultati più significativamente associati e li abbiamo genotipizzati nello stesso sotto-campione.

Gli SNP sono stati scelti secondo i seguenti criteri: a) p value dell’associazione ≤ 10<-5>; (b) rilevanza del gene più vicino e posizione dello SNP all’interno del gene (dando maggiore priorità agli SNP intronici ed esonici); c) Linkage Disequilibrium (LD), sulla base del quale sono stati esclusi i geni in LD assoluto tra loro (D’ = 1 and r2 > 0.98).

Test di associazione sui dati del genome-wide scan

Cinquanta SNP hanno mostrato associazione nominale con la risposta al litio, con un valore di p non corretto compreso tra 10<-5>e 10<-6>. Una parte di questi polimorfismi à ̈ localizzata all’interno o nelle vicinanze di geni codificanti per recettori accoppiati alla proteina G, canali ionici, proteine adattatrici e con motivi a zinc finger. Alcuni di questi polimorfismi sono stati selezionati per la validazione ed estensione della genotipizzazione, utilizzando i criteri descritti precedentemente nella sezione precedente dell’Esempio 2. Il valore di λ = 1.09 ottenuto indica che nel campione non à ̈ presente una stratificazione significativa.

La genotipizzazione à ̈ stata realizzata usando la tecnica KBioscience Competitive AlleleSpecific PCR genotyping system (KASP), una tecnologia basata sulla fluorescenza e che fornisce risultati attendibili in tempi brevi [Kbioscience; http://www.kbioscience.co.uk].

Validazione con metodo KASP e genotipizzazione dell’intero campione

La percentuale di validazione à ̈ stata calcolata attraverso la comparazione dei genotipi ottenuti dal microarray con quelli ottenuti dal metodo KASP. Un polimorfismo SNP à ̈ stato considerato validato se la proporzione delle incongruenze ottenute usando i due diversi metodi era < 0.2%. Dieci su 11 SNP sono stati validati con successo, mentre lo SNP rs869156 à ̈ stato escluso dall’analisi (genotype-call mismatches = 6%; Tabella. 2). Dopo aver esteso la genotipizzazione all’intero campione, la significatività dell’associazione si à ̈ ridotta o à ̈ scomparsa per la maggior parte degli SNP.

Tabella 2. Risultati di associazione del genome scan esplorativo condotto sul campione di 52 pazienti bipolari sardi caratterizzati per la risposta al trattamento con sali di litio: lista degli 11 SNP selezionati per la validazione

Chr: chromosoma; FR: full responders; NR: non responders; OR: odds ratio; N/A: not available; ZC3H15: zinc finger CCCH-type containing 15; TMCC1: transmembrane and coiled-coil domain family 1; GNPDA2: glucosamine-6-phosphate deaminase 2; TGFBI: transforming growth factor, beta-induced, 68kDa; RASSF4: Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 4; OR51L1: olfactory receptor, family 51, subfamily L, member 1; OR52E2: olfactory receptor, family 52, subfamily E, member 2; SCN8A: sodium channel, voltage gated, type VIII, alpha subunit; ACCN1: Amiloride-sensitive Cation Channel 1, neuronal; RPL7A: ribosomal protein L7a; C21orf131: chromosome 21 open reading frame 131.

Gli SNP che hanno mostrato i valori più bassi di p value sono stati gli SNP rs11869731 (p non corretto = 6.00 x 10<-4>, OR = 2.39: CI 1.46 – 3.89) e rs2826494 (p non corretto = 1.90 x 10<-3>, OR = 2.07, CI 1.30 – 3.29). Data l’elevata percentuale di soggetti di sesso femminile nel nostro campione, à ̈ stata effettuata un’analisi di interazione genere×genotipo tramite regressione logistica usando il software Plink. Non à ̈ stata trovata alcuna interazione significativa tra i marcatori studiati e il sesso (dati non mostrati).

ESEMPIO 3

Genotipizzazione estesa all’intero campione

Per investigare ulteriormente il ruolo degli SNP validati nella risposta al litio, la genotipizzazione à ̈ stata estesa al resto della coorte di pazienti bipolari caratterizzati per la risposta al litio (152 pazienti bipolari) e sono stati uniti i due dataset (204 pazienti bipolari in totale, vedi Tab.1).

In questa fase sono stati inclusi anche i pazienti con valori intermedi nella scala di risposta al litio. Lo scopo di questo approccio à ̈ stato quello di testare se le associazioni significative persistevano o cambiavano applicando il cut-off di TS ≥ 7 [7, 27] per la risposta completa.

ESEMPIO 4

Analisi del tratto quantitativo e genome-wide complex trait analysis (GCTA) Allo scopo di verificare se i genotipi per ciascun locus fossero associati in maniera significativa a valori medi di TS differenti, abbiamo effettuato un’analisi quantitativa considerando gli 11 punti della scala come un tratto continuo. Data la dimensione relativamente ridotta del campione, abbiamo anche condotto un’analisi di permutazione per ottenere un valore di p value empirico. Inoltre abbiamo effettuato una genome-wide complex trait analysis (GCTA) per stimare la proporzione della variabilità fenotipica spiegata dagli SNP genotipizzati con il microarray. A tale scopo abbiamo applicato la restricted maximum likelihood (REML) analysis tramite il software GTCA [28] per testare l’intero dataset, utilizzando tutti gli SNP con MAF compresa tra 0.01 e 0.5.

Risultati

Analisi del tratto quantitativo e genome-wide complex trait analysis (GCTA) Come illustrato nella Tabella 3, quattro SNP (rs11869731, rs2499984, rs16909440 and rs16973410) mostrano un’associazione significativa con il tratto continuo, con valori di p compresi tra 10<-4>e 10<-5>. Il polimorfismo SNP che à ̈ risultato più significativamente associato à ̈ l’rs11869731, con un valore di p empirico dopo 444,555 permutazioni di 4.72 x 10<-5>.

Tabella 3: analisi del tratto quantitativo dei criteri retrospettivi della scala di risposta al trattamento a lungo termine nel campione sardo di 204 pazienti bipolari Chr SNP Value G11 G12 G22 p^ NP 2 rs12693402 Genotipo T/T T/C C/C 0.2667 59

Counts 2 35 163

Frequenza 0.01 0.18 0.82

Media TS 0 4.03 4.27

SD 0 2.96 3.09

3 rs2811332 Genotipo C/C C/G G/G 0.0880 215

Counts 44 94 63

Frequenza 0.22 0.47 0.31

Media TS 3.73 3.87 4.79

SD 3.14 2.99 3.14

4 rs1390913 Genotipo T/T T/C C/C 0.0334 597

Counts 15 80 101

Frequenza 0.08 0.41 0.52

Media TS 4.73 4.61 3.62

SD 2.84 3.14 3.08

5 rs2107506 Genotipo C/C C/G G/G 0.3333 41

Counts 56 81 64

Frequenza 0.28 0.40 0.32

Media TS 3.54 4.38 4.42

SD 3.00 3.01 3.21

11 rs2499984 Genotipo G/G G/A A/A 8.70 x 10<-4>24025

Counts 49 77 70

Frequenza 0.25 0.39 0.36

Media TS 5.33 4.05 3.34

SD 2.66 3.26 2.99

11 rs16909440 Genotipo C/C C/T T/T 5.51 x 10<-4>38337

Counts 45 83 72

Frequenza 0.23 0.42 0.36

Media TS 3.07 3.96 5.03

SD 3.04 3.04 2.94

12 rs4512905 Genotipo T/T T/C C/C 5.64 x 10<-3>3724

Counts 14 84 100

Frequenza 0.07 0.42 0.51

Media TS 5.93 4.38 3.60

SD 2.84 2.95 3.16

17 rs11869731 Genotipo G/G G/C C/C 4.70 x 10<-5>444555

Counts 13 65 122

Frequenza 0.07 0.33 0.61

Media TS 7.31 4.54 3.61

SD 1.55 3.11 2.99

18 rs16973410 Genotipo T/T T/C C/C 3.42 x 10<-4>62496

Counts 4 40 152

Frequenza 0.02 0.20 0.78

Media TS 1.75 2.78 4.55

SD 3.50 2.87 3.00

21 rs2826494 Genotipo G/G G/C C/C 0.0180 1110

Counts 16 84 98

Frequenza 0.08 0.42 0.49

Media TS 5.00 4.64 3.57

SD 3.46 3.02 3.00

Chr; cromosoma; NP: numero di permutazioni; TS: total score; SD: deviazione standard; SNP: polimorfismo a singolo nucleotide

È interessante notare che il genotipo G/G dello SNP rs11869731 à ̈ risultato associato con un TS medio sopra la soglia della risposta completa, con un valore pari a 7.31 (SD = ±1.55), mentre gli altri due genotipi sono risultati associati con un valore significativamente più basso [G/C, TS (media ± SD) = 4.54, ± 3.11; C/C, TS (media ± SD) = 3.61, ± 2.99] (Fig. 1). Questi risultati mostrano che l’associazione tra l’rs11869731 e la risposta alla terapia con litio persiste nonostante i diversi approcci analitici utilizzati.

La genome-wide complex trait analysis condotta applicando l’algoritmo REML mostra una stima della varianza fenotipica pari a 0.25 (SE = ± 0.051). Questi risultati suggeriscono che, considerati insieme, gli SNP con MAF compresa tra 0.01 e 0.5 sono capaci di spiegare un quarto della varianza fenotipica che si osserva nella risposta al litio, un valore notevolmente più alto rispetto a quello spiegato da ciascuno SNP considerato in questo studio.

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Claims (7)

1. Rivendicazioni 1. Metodo per la diagnosi in un paziente affetto da disturbo bipolare della potenziale risposta al trattamento con i sali di litio, detto metodo comprendente la fase di determinare in un campione il genotipo del paziente al locus genico corrispondente allo SNP rs11869731 del gene del canale cationico neuronale di tipo 1 sensibile all’amiloride (ACCN1).
2. 2. Metodo di rivendicazione 1, in cui quando il genotipo del paziente al locus genico corrispondente allo SNP rs11869731 del gene del canale cationico neuronale di tipo 1 sensibile all’amiloride (ACCN1) à ̈ G/G, della potenziale risposta al trattamento con i sali di litio à ̈ favorevole.
3. 3. Metodo di rivendicazione 1, in cui quando il genotipo del paziente al locus genico corrispondente allo SNP rs11869731 del gene del canale cationico neuronale di tipo 1 sensibile all’amiloride (ACCN1) à ̈ G/C, della potenziale risposta al trattamento con i sali di litio à ̈ parzialmente favorevole.
4. 4. Metodo di rivendicazione 1, in cui quando il genotipo del paziente al locus genico corrispondente allo SNP rs11869731 del gene del canale cationico neuronale di tipo 1 sensibile all’amiloride (ACCN1) à ̈ C/C, della potenziale risposta al trattamento con i sali di litio à ̈ sfavorevole.
5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detto campione comprende un acido nucleico.
6. 6. Metodo di rivendicazione 5, in cui detto acido nucleico comprende l’introne 1 del gene ACCN1.
7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in cui la fase di determinare in un campione il genotipo del paziente comprende l’uso di almeno un oligonucleotide.