ITMO20130117A1 - Composizione e metodo per prevenire infezioni di tessuti vegetali causate da erwinia amylovora - Google Patents

Description

Composizione e metodo per prevenire infezioni di tessuti vegetali

causate da Erwinia amylovora

La presente invenzione concerne un sistema congiunto per attuare terapia fagica alle infezioni di Erwinia amylovora responsabile del colpo di fuoco batterico sulle pomacee, comprendente una composizione e un metodo per prevenire infezioni di tessuti vegetali, in particolare infezioni di fiori e frutti in piante di interesse agronomico, causate da Erwinia amylovora .

In patologia vegetale, il termine “colpo di fuoco†, o “colpo di fuoco batterico†, identifica una delle più gravi malattie infettive delle pomacee (ad esempio pero, melo) causate dal batterio Erwinia amylovora (Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al.).

Nel seguito – sia nella descrizione che nelle rivendicazioni – sono considerate come “pomacee†piante appartenenti a specie della sottofamiglia Maloideae della famiglia Rosaceae, incluse nella lista ufficiale delle piante ospiti di Erwinia amylovora (EPPO, List A2. Erwinia amylovora data sheet, 2013).

Dal 1994 la suddetta malattia infettiva à ̈ endemica in Italia settentrionale (Emilia-Romagna e altre regioni della valle padana) ed ogni anno espone la frutticoltura al rischio di danni significativi, sia diretti che indiretti. Esempi di danni diretti sono le perdite di raccolto provocate dall’infezione, nonchà ̈ i costi da sostenere per la lotta contro Erwinia amylovora, mentre un esempio di danno indiretto à ̈ quello inferto alla capacità produttiva futura di un frutteto in cui à ̈ presente la malattia.

Erwinia amylovora colpisce più frequentemente gli impianti giovani, provocando di regola la morte degli alberi. Le infezioni primarie del ciclo annuale di questo patogeno avvengono sui fiori, che rimangono suscettibili all’infezione fino a inizio caduta petali, ossia per un periodo di circa due settimane. Da un singolo fiore l’infezione può progredire basipetamente lungo l’asse della infiorescenza, causare cancri – ossia necrosi dei tessuti corticali – fino a coinvolgere le branche principali e il tronco, inducendo avvizzimento di tutte la parti aeree. Dai fiori infetti e dai suddetti cancri evadono cellule del patogeno fornendo l’inoculo per nuove infezioni durante la restante stagione vegetativa. Nelle cultivar suscettibili l’ infezione può causare l’avvizzimento dell’ intero albero.

Per motivi fitoiatrici e ambientali, risulta significativamente difficile affrontare e/o prevenire le infezioni da Erwinia amylovora nelle pomacee effettuando trattamenti chimici durante la fase di fioritura. Infatti, essendo vietato l'uso di antibiotici, la farmacopea agricola rende disponibili unicamente composti rameici e induttori di resistenza (quali, ad esempio, Fosetil-alluminio, Bion), il cui uso à ̈ tuttavia limitato da concreti svantaggi.

Uno svantaggio dell’uso dei composti rameici à ̈ che questi ultimi sono spesso fitotossici e causano un sostanziale accumulo di rame - ossia di un metallo pesante - nell’ambiente e negli operatori, con conseguenti rischi per la salute umana e l’integrità degli ecosistemi. Uno svantaggio dell’uso degli induttori di resistenza à ̈ che questi ultimi sono poco efficaci, verosimilmente perché le foglie, generatrici dei segnali per la resistenza sistemica e principali organi-bersaglio dei principi attivi, sono scarsamente presenti sull’albero durante la fioritura principale.

Più in generale, un significativo svantaggio dei trattamenti chimici durante la fioritura à ̈ l’interferenza o l’inibizione dei processi di impollinazione, di germinazione del polline, di sviluppo del budello pollinico, di fecondazione degli ovari, di allegagione, oltre agli effetti negativi sulla attività degli insetti pronubi.

In alternativa ai trattamenti chimici, à ̈ possibile usare cultivar resistenti per proteggere i fiori delle pomacee dalle infezioni di Erwinia amylovora. Tuttavia, una pluriannuale sperimentazione europea ha messo in luce che non sempre la suscettibilità all'infezione dei fiori e dei germogli à ̈ correlata positivamente nelle diverse cultivar (Thibault B., M. Le Lezec, 1990. Sensibilite au feu bacterien des principales varietes de pommier et de poirer utilisees in Europe. Agrimed Research Programme. Fire Blight of Pomoideae (Erwinia amylovora, Burrill, Winslow et al.) Applied Research in Europe (1978–88). Coordinator: J.P. Paulin. EEC Commission, EUR 12601 EN).

Ad integrare o a sostituire i metodi noti sopra descritti (trattamenti chimici; impiego di cultivar resistenti) sono stati proposti metodi di lotta biologica, basati sull’uso di prodotti contenenti sospensioni (opportunamente concentrate) di batteri oppure di batteriofagi. Ad esempio, à ̈ noto il ceppo C9-1 di Pantoea vagans, il cui genoma comprende geni per la biosintesi di metaboliti dotati di attività antibatterica (ossia pantocina A e dapdiamide E) e che asperso sulle pomacee durante la fioritura, può fornire risultati simili a quelli ottenibili mediante l’uso di antibiotici.

Uno svantaggio non trascurabile dei prodotti a base di batteri consiste nel potenziale rischio che questi, una volta immessi nell'ambiente, risultino nocivi alla salute umana, perché alcuni ceppi sono patogeni opportunisti per l’uomo, capaci cioà ̈ di causare infezioni in individui immunodepressi.

I batteriofagi - denominati anche fagi o particelle fagiche - sono virus in grado di infettare batteri e causarne la morte per lisi. In particolare, sono definiti “batteriofagi virulenti†o “batteriofagi litici†i batteriofagi che causano immediatamente la morte per lisi dei batteri infettati, mentre sono definiti “batteriofagi temperati†i batteriofagi che, infettando i batteri, sono in grado di integrare temporaneamente il proprio genoma in quello della cellula batterica ospite.

Nel seguito - sia nella descrizione che nelle rivendicazioni - i termini “batteriofago†, “fago†e “particella fagica†sono da considersi sinonimi e del tutto equivalenti. Analogamente, sia nella descrizione che nelle rivendicazioni, i termini “batteriofago purificato†, “fago purificato†e “particella fagica purificata†– utilizzati per identificare un batteriofago ottenuto in forma pura – sono da considersi sinonimi e del tutto equivalenti. Più esattamente, con i termini “batteriofago purificato†o “fago purificato†o “particella fagica purificata†si intende un clone di particelle fagiche equivalenti tra loro ottenute tramite propagazione di una singola particella fagica iniziale su un ceppo di batterio propagatore.

Un singolo fago può infettare una cellula batterica, moltiplicarsi all’interno di quest’ultima e produrre decine di copie di se stesso. La cellula batterica infettata si riempie di fagi, muore e la sua parete si disintegra, liberando nell’ambiente esterno una pluralità di fagi pronti ad entrare in contatto con, e aggredire, nuove cellule batteriche. Questo meccanismo di infezione e di lisi à ̈ illustrato schematicamente nella Figura 1.

US4783406 descrive un metodo per il trattamento del colpo di fuoco basato sull'uso del fago ERA103 e, in particolare, sull’uso dell’enzima polisaccaride depolimerasi, che, codificato dal genoma del fago ERA103, depolimerizza il polisaccaride capsulare (ossia lo strato polisaccaridico che avvolge esternamente la parete cellulare) di Erwinia amylovora. Per produrre questo enzima, occorre innanzitutto propagare il fago ERA103 in colture di Erwinia amylovora – ossia infettare Erwinia amylovora con ERA103 così da riprodurre quest’ultimo – e ottenere corrispondenti lisati batterici grezzi. Da questi ultimi l’enzima polisaccaride depolimerasi viene estratto e successivamente purificato tramite precipitazione con ammonio solfato, ultracentrifugazione e cromatografia di filtrazione su gel.

Dato che il polisaccaride capsulare di Erwinia amylovora à ̈ correlato positivamente alla virulenza di questo patogeno, sarebbe possibile contrastare le infezioni vegetali causate da Erwinia amylovora tramite l’azione combinata del fago ERA103 e dell’enzima codificato da quest’ultimo. Questa azione combinata sarebbe ottenibile somministrando alle piante una composizione contenente sia il fago ERA103 che la polisaccaride depolimerasi in forma purificata.

Un significativo svantaggio connesso all’applicazione del metodo descritto in US4783406 consiste nella necessità di somministrare alle piante sia l’enzima che il fago - al fine di ottenere un trattamento efficace - e quindi nella conseguente necessità di ottenere la polisaccaride depolimerasi codificata da ERA103 attuando l’elaborata procedura di purificazione sopra descritta. Ciò rende il metodo descritto in US4783406 sostanzialmente dispendioso per tempi e costi.

Un ulteriore svantagio consiste nel fatto che l’enzima, una volta somministrato ed esposto ai fattori ambientali di campo, viene facilmente denaturato, il che rende il metodo descritto in US4783406 sostanzialmente inefficace.

Per la lotta al colpo di fuoco delle pomacee causato da Erwinia amylovora, l’invenzione si propone di:

- Mettere a disposizione un metodo alternativo o complementare rispetto a quelli già noti.

- Fornire un metodo di lotta biologica migliore rispetto ad altri per specificità di azione ed ecocompatibilità.

- Migliorare l’azione dei metodi di terapia fagica fornendo un metodo potenzialmente efficace a tempo indeterminato per la naturale presenza, sulle piante da proteggere, della specie del batterio propagatore, o di altre specie affini, infettabili dal fago.

- Fornire un metodo di lotta biologica che consenta di prevenire il colpo di fuoco delle pomacee.

Uno scopo dell’invenzione à ̈ migliorare i metodi per il trattamento, nelle pomacee, del colpo di fuoco battterico causato da Erwinia amylovora.

Un altro scopo à ̈ migliorare i metodi di lotta biologica utilizzabili per il trattamento del colpo di fuoco.

Un ulteriore scopo à ̈ migliorare i metodi di lotta biologica utilizzabili per il trattamento del colpo di fuoco e basati sull’uso di batteriofagi.

Uno scopo ancora ulteriore à ̈ fornire un metodo di lotta biologica che consenta di prevenire il colpo di fuoco nelle pomacee.

Nel seguito – sia nella descrizione che nelle rivendicazioni – le espressioni “prevenire e trattare il colpo di fuoco batterico†, “prevenire e trattare il colpo di fuoco batterico da Erwinia amylovora†e “prevenire e trattare infezioni di tessuti vegetali causate da Erwinia amylovora†sono da considersi del tutto equivalenti.

Analogamente, in ciascuna delle suddette espressioni, i termini “prevenire e trattare†possono essere sostituiti dai termini equivalenti “prevenzione e trattamento di†.

In un primo aspetto dell’invenzione, à ̈ previsto un fago per uso nella prevenzione e trattamento di infezioni di tessuti vegetali causate da Erwinia amylovora, come definito nella rivendicazione 1.

In un secondo aspetto dell’invenzione, à ̈ previsto un ceppo batterico per uso come ceppo propagatore del fago secondo l’invenzione, come definito nella rivendicazione 3.

In un terzo aspetto dell’invenzione, à ̈ prevista una composizione per prevenire e trattare il colpo di fuoco batterico causato da Erwinia amylovora, come definita nella rivendicazione 4.

In un quarto aspetto dell’invenzione, à ̈ previsto un metodo per prevenire e trattare il colpo di fuoco batterico causato da Erwinia amylovora, come definito nella rivendicazione 7. Grazie a questi aspetti, vengono resi disponibili un fago litico, un rispettivo ceppo batterico propagatore, una composizione ed un metodo di lotta biologica che consentono di prevenire e trattare efficacemente il colpo di fuoco batterico causato da Erwinia amylovora nelle pomacee.

In particolare, l’invenzione fornisce un sistema fago-batterio propagatore per ottenere una composizione contenente il fago, efficace per prevenire e trattare le infezioni di Erwinia amylovora, agente del colpo di fuoco delle pomacee.

La composizione ed il metodo secondo l’invenzione consentono di superare gli svantaggi del metodo descritto in US4783406, in quanto non à ̈ necessario somministrare il fago litico secondo l’invenzione in combinazione con altri principi attivi al fine di ottenere un’azione efficace contro Erwinia amylovora.

In particolare, non à ̈ necessario estrarre e purificare sostanze - ad esempio enzimi -prodotte dal fago litico e utilizzarle in combinazione con quest’ultimo, come invece previsto nel caso del fago ERA103. Pertanto, il metodo secondo l’invenzione risulta sostanzialmente più semplice e meno dispendioso da attuare rispetto ai metodi noti basati sull’uso di batteriofagi.

La composizione ed il metodo secondo l’invenzione possono essere applicati durante la fase di fioritura sulle colture di pomacee, sia biologiche che tradizionali, senza rischi per l’ambiente e/o la salute degli operatori. Le applicazioni possono essere fatte anche durante l’intera stagione vegetativa per proteggere qualsiasi tipo di ferita sugli alberi.

Infatti, il fago litico secondo l’invenzione si moltiplica solo in presenza di popolazioni di batteri-bersaglio, ossia Erwinia amylovora (bersaglio primario) o di specie batteriche tassonomicamente molto affini (bersagli secondari).

In assenza di popolazioni di batteri-bersaglio, il fago litico secondo l’invenzione scompare rapidamente dalla nicchia ecologica in cui à ̈ stato applicato (ad esempio foglie, germogli, rami e frutti di pomacee).

In presenza di soli bersagli secondari, il fago litico secondo l’invenzione può propagarsi e presenziare la nicchia ecologica prevenendo nuove infezioni di Erwinia amylovora, rendendo efficace a tempo indeterminato anche una sola applicazione.

Inoltre, il fago litico secondo l’invenzione può essere applicato alle colture di pomacee contemporaneamente ad altri prodotti per la lotta biologica, contenenti organismi procarioti od eucarioti usati come antagonisti o competitori di Erwinia amylovora o di microorganismi patogeni differenti da Erwinia amylovora, potenziando eventualmente l’effetto dei suddetti prodotti.

L’invenzione potrà essere meglio compresa e attuata con riferimento agli allegati disegni, che ne illustrano una forma esemplificativa e non limitativa di attuazione, in cui:

Figura 1 rappresenta schematicamente il meccanismo di infezione e moltiplicazione di un fago litico o virulento, come quello secondo l’invenzione;

Figura 2 mostra una piastra con placche singole di lisi provocate dal fago secondo l’invenzione su una patina o strato di batteri;

Figure 3 e 4 sono due microfotografie elettroniche del fago secondo l’invenzione.

Figura 5 à ̈ una fotografia mostrante i profili ottenuti tramite analisi PCR effettuate su DNA del fago e del ceppo propagatore secondo l’invenzione.

Figura 6 à ̈ un diagramma di flusso illustrante gli effetti di un’infezione da Erwinia amylovora su fiori di pomacea (pero o melo) trattati con la composizione secondo l’invenzione e su fiori di pomacea (pero o melo) non trattati.

Per realizzare la composizione secondo l’invenzione e per attuare il metodo secondo l’invenzione, à ̈ previsto l’uso di un fago litico e di un corrispondente ceppo batterico propagatore, ciascuno dei quali à ̈ stato isolato, purificato e testato sperimentalmente dagli Inventori.

Nel seguito verranno descritti in dettaglio: il fago secondo l’invenzione, il ceppo propagatore secondo l’invenzione, la composizione secondo l’invenzione e il metodo secondo l’invenzione.

Il fago secondo l’invenzione - denominato fago M9 dagli Inventori - à ̈ stato isolato nel 2009 durante un monitoraggio effettuato in 22 località italiane (nelle regioni Emilia – Romagna, Veneto, Friuli Venezia Giulia) e mirante a individuare eventuali fagi litici specifici per E.amylovora.

Il monitoraggio à ̈ stato effettuato prevalentemente in frutteti, nei quali erano presenti, o si erano verificati negli anni precedenti, epidemie di colpo di fuoco. Durante il monitoraggio sono stati prelevati 207 campioni di terreno o di materiale patologico ed à ̈ stato usato come batterio indicatore della presenza di fagi il ceppo di E.amylovora OMP-BO 1077/7, isolato nel 1994 (in alberi di pero) e associato al primo caso ufficiale di colpo di fuoco nella valle padana. Sono stati applicati i metodi descritti da Gill et al. (Gill J.J. et al. 2003-Bacteriophages of Erwinia amylovora Applied and Environmental Microbiology, 69 (4), 2133-2138), apportando alcune modifiche. In particolare, à ̈ stata usata una sonda metallica per prelevare campioni di terreno ad una profondità costante di 0-25 cm (invece di 10-20 cm, come descritto nel protocollo di Gill et al.) I campioni di terreno sono stati prelevati alla distanza di circa 1 metro dalla base dei tronchi degli alberi o degli arbusti.

Il fago M9 à ̈ stato isolato dal terreno alla base di alberi di pero dell’età di 6 anni in un frutteto in provincia di Forlì – Cesena. Questo frutteto era stato soggetto, nel 2008, ad una epidemia di colpo di fuoco e la conseguente batteriosi era ancora presente al momento dell’isolamento del fago M9.

Il fago M9 Ã ̈ stato isolato applicando la tecnica del doppio strato su Agar A (Nutrient Broth 0,8%, Casamino Acids 0,5%, Yeast Extract 0,1%, Agar 0,8% e 1,5%, pH 7 prima della sterilizzazione; senza sali di metalli pesanti) (Stolp H. and M. P. Starr, 1964. Bacteriophage reactions and speciations of phytopathogenic Xanthomonads, Phytopathologische Zeitschrift, 51, 442-478).

Dopo l’isolamento, il fago M9 à ̈ stato purificato su piastre a doppio strato di Agar A (Civerolo, 1990. Bacteriophages. p.209-210. In: Methods in Phytobacteriology. Ed.i Klement, Rudolph e Sands. Akademiai Kiado, Budapest) effettuando più passaggi di singola placca, cioà ̈ di singola area di lisi, e conservato in lisato a 4°-6°C. Un esempio delle placche prodotte dal fago secondo l’invenzione su uno strato di batteri (appartenenti al ceppo propagatore secondo l’invenzione) à ̈ mostrato in Figura 2.

Il fago M9, così isolato e purificato, à ̈ rimasto vitale per almeno 6 mesi, con minime diminuzioni di concentrazione, e in alcuni lisati il fago M9 à ̈ sopravvissuto per 12 mesi, in concentrazione di poco inferiore a quella del lisato fresco.

Per caratterizzare fenotipicamente il fago M9, un campione di lisato fagico – ottenuto dopo aver infettato con il suddetto fago il ceppo propagatore – à ̈ stato filtrato una prima volta tramite filtro avente diametro dei pori pari a 0,45 Î1⁄4m e una seconda volta tramite filtro avente diametro dei pori pari a 0,22 Î1⁄4m. Il lisato ad alta concentrazione di particelle fagiche, doppiamente filtrato, limpido, à ̈ stato quindi colorato con acetato di uranile e osservato al microscopio elettronico a trasmissione FEI TECNAI G-12. Come mostrato nella Figura 3, il capside del fago M9 à ̈ privo di coda, ha una forma isodiametrica riferibile a icosaedro, un diametro pari a 50-70 nm e una struttura interna costituita da una zona centrale circoscritta e una zona anulare periferica concentrica.

Come mostrato nella Figura 4, la superficie esterna del capside presenta delle protuberanze, osservate in molte particelle fagiche del summenzionato campione.

In base alle dimensioni, morfologia e struttura interna, il fago M9 secondo l’invenzione à ̈ ascrivibile alla famiglia Tectiviridae.

Il fago M9 à ̈ stato inoltre caratterizzato analizzando il suo DNA, estratto dal lisato mediante il metodo di Gill et al. (Gill J.J. et al. 2003 - Bacteriophages of Erwinia amylovora Applied and Environmental Microbiology, 69 (4), 2133-2138), opportunamente modificato. In particolare, prima di eseguire il metodo sopracitato, aliquote di 10 ml di lisato fagico, filtrato due volte (attraverso filtri con porosità di 0,45 Î1⁄4m e poi con porosità di 0,22 Î1⁄4m), sono state centrifugate a 18000 x g per 120 minuti a 4°C. Il pellet ottenuto à ̈ stato risospeso con 700 Î1⁄4l di SM Buffer indicato da S.M. Lehman et al. (Lehman et al.

2009 Complete Genome of the Broad-Host-Range Erwinia amylovora Phage ΦEa21-4 and Its Relationship to Salmonella Phage Felix O1. Applied and Environmental Microbiology, 75 (7), 2139-2147). Il DNA così estratto à ̈ stato sottoposto ad analisi BOX-PCR e ad analisi ERIC-PCR, eseguite secondo il protocollo di Rademaker e Bruijn (Rademaker, J.L.W. e F.J.De Bruijn, 1997. Characterization and classification of microbes by rep-PCR genomic fingerprinting and computer-assisted pattern analysis. In DNA Markers: Protocols, Applications and Overviews. Ed. Caetano-Anollés, G. and Gresshoff, P.M. pp.

1–26. New York, NY: John Wiley & Sons, Inc.).

Al fine di ottenere un controllo di specificità, il DNA estratto da una coltura pura del ceppo propagatore (ceppo 7815G di Pantoea vagans) à ̈ stato sottoposto alle medesime analisi BOX-PCR e ERIC-PCR.

Dopo separazione su gel di agarosio (assieme ai marcatori di dimensione del DNA, o ladder, 100 bp e 1 Kb), seguita da colorazione con bromuro di etidio e fotografia al transilluminatore, i prodotti ottenuti tramite le summenzionate analisi PCR hanno fornito i profili mostrati nella Figura 5, in cui:

- i profili 1, 8 e 15 corrispondono al ladder 1Kb;

- i profili 7 e 14 corrispondono al ladder 100 bp;

- i profili 2, 3, 4 e 5 corrispondono ai prodotti di analisi BOX-PCR di differenti estrazioni di DNA del fago M9;

- i profili 10, 11 e 12 corrispondono ai prodotti di analisi ERIC-PCR di differenti estrazioni di DNA del fago M9;

- il profilo 6 corrisponde al prodotto di analisi BOX-PCR del DNA estratto dalla coltura pura del ceppo propagatore;

- il profilo 13 corrisponde al prodotto di analisi ERIC-PCR del DNA estratto dalla coltura pura del ceppo propagatore.

La Figura 5 evidenzia che:

- differenti estrazioni del DNA del fago M9 hanno prodotto profili identici;

- i profili BOX-PCR del fago M9 sono caratterizzati da circa 20 bande ben visibili, che sono distribuite per tutta la lunghezza del profilo e, in particolare, sono comprese tra 8000 bp a 250 bp;

- i profili ERIC-PCR del fago M9 comprendono circa 7-8 bande, che sono piuttosto deboli e comprese tra 1300 bp e 100 bp;

- i profili BOX-PCR ed ERIC-PCR del fago M9 sono chiaramente distinguibili dai medesimi tipi di profili del ceppo propagatore per numero e/o posizione delle bande.

Cinque bande differenziali dei profili BOX-PCR e due bande del profilo ERIC-PCR del DNA fagico, comprese tra 750 bp e 100 bp, sono state rimosse dal gel di agarosio, purificate e sequenziate (presso i laboratori della Società Eurofins MWG Operon).

Le sette sequenze, denominate 1 BOX, 2 BOX, 3 BOX 4, 3 BOX 7, 7 BOX, 7 ERIC- 1R, 8 ERIC 1R, sono riportate di seguito.

Sequenza 1 BOX:

GGGCCAAAAAGGGGACGGGAAAGTTTTGTGGAGTGTTTTCTATAGTGAATCGA GTTAGAGCAGGGATATTCACGATTATCGTTTCATACCCACCTCCCTTCCCCGAG GGGACCCGACGGGCCCGAATGAATGGGATAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAG AGACAGATCCATTCTATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTATCCAGGG ATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTG GTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGT GTCCGGTGAGGG;

Sequenza 2 BOX:

AGAACCTGGGAACAATCCGCGATTATTCCCTCTGCCGGGTGAAAACCGGAAAT TCACCTAATAATCTAAAAACAGAAAAACCCCAAATCGCCCCGCTTCCAAAAGC TTCGCTACTAACTAATCTTTCCGGCTGTTCCGGTTATTTTGCAACTTTCACTAAA ATGGTCGACTATAGAGAATCCCCGAATTCCCTGTAATTCCTTAACTATTTTTAT ATAAAAAAAATAACGAAATGTGTATTTTCACTCTCTTATCACTGCGCTTATTTT TTATACATGTGATGAGTATCCCGTGAATGTGAAATAACACATGTGTCACTCTCT TATTAAAAAATGCAAACACCTATCCTCTTTGAGAATATCCACAAAAATCTACTT ATTGTGATGCACTTTTGTCTACCCGAGAATATCATATTTCAATA;

Sequenza 3 BOX 4:

GAAGCCTTTGGAGTCCCCCCTCTTCTGCCCTCGACAGGTTAAATCGGTGGATCC ATACTGCTTATAAAATACAGATAACTTCTATCCGCCTGTGCCAAACCCGAAAG TTCACACCTTGACCTAAATTTGTCTGCTGTTACCGATATTTTAAGGAACTAAAA CTCAAAATTGTAACGTGTGAGACAACAACACTATATATTCCGATAATATTAAT CCTCATGACCGTGTACCTCTTATAACACCTTGTACATATAACTCTCTTCTCCCCT GCAATTATATAAAACACATGTGAATGTATCCCGTTAAAGAGATAAAAAAAAGG CAACACTCCAACTTCAACATGTATAAACTACTTTACCTACTTAATATCTTATTTT ATGACTTCTATTGTTATTAATTTTATCCTTTTGAATATGGCAAATAAGCCATAA ATTATTGGTATAAATTACAATGCCAAAATATATGGAAAGGATCTCATCCCTTTC CTTATTTCCACTTCCCTCTTTCTCCTAATATTTAAATCAGAAATATTAATTACTT ATTC;

Sequenza 3 BOX 7:

GGAAAGCCGTGCGGATGGTAGGTTCCTGGATGTCGGTGACCCTTAGCCTCTAA TCCCATGGCTGCAACCTTAGCCTTTTGGTTCTGAATGGAAACAGGGGGTTGCA AGCCAGGGAATCCTTGTGGTCCAAAGATCCTCCCTTTTATTGAAAGGATCCCCT GAGTCAACGGTGGCTTTATTTTTGCGTTCTTGATTAGATTAATCATAAACTCCC CGTCCCCAGCTTTTGGGAACCACCGCGGGCTGCTAAAGGACCTGCAGATCCGG GTAAAACTTTTTTGGGGAGGTCCACATTAAATTAGGGTGGGGGGTGTGTCTCC CAAACTACCGATTTCCAACAATTTGTTTTGAGACCGAAAAGCGATCTCGTTCGT TTTCTGGACCCAGAAGAAATTTTGTACCTTACGGAATCTTGCGGCCGGCTCCCT CGGGAGTCTTGAAGTCCAGCACCTTCCCCGCTCCTAATGATATGACAAACTCTA TGTGCCGGGCATGACCTGTAGCGGAACGA;

Sequenza 7 BOX:

GGGATTCTAAGGGGGGTTGACGATGTGCGTGCACTTACACACCGGTCTCGGAG TACTTGTCTCCGTGCTGGAGCCTTGCTATACTGTGGACTATATAGGAATCTCTA ATCTTAGAGGCCTTAGGTCTCAAAAATTTTTTCTTTGAACAGTGTCTTCCCCCA CTGACTTTCTGAGCTTCTCTCACAGGGTCAGGAGTAAAAAAAATATCAATGCC CCCTCCCCAGGTTGCCCTTAGTAAATTCCAATCTTCAAACGCCACCTGGAAGCC TGCGGGAGACCCCCTGTTTCTATAAGAAAAAGATTACCGAGAAACTCAGGGTC TCCCATAGGATTCTCATCCCTTCTTATTGTATTGCAAATAACCAGAGCCCTGTG GTTAACTAAACTGCCCTTAAAAAAGGAACAGAGTACATTAGGTTACGAAAACC GTCCCTCGGTTCGA;

Sequenza 7 ERIC- 1R:

CCTGCCGGGGAGTTAGAATGGTTTTTTGCAGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTT AGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGG ACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGA CAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTATCCAGGGATC CACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTG CCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTC CGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCT GCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACC TACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCTACCACATGAAGCAGCACGACTT CTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA AGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACAC CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAAC ATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCAT GGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCCGCCACAA CATCAAGGACGGCACCGTGCAACTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCA TCGGCGACGGCCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACTCAGTC CGCCCTGAGCAAAGACCCAACGAGAAAGCGCGATCACATGGTCTTGCTGGAGT TCGTGACCGCCGCGGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGC GGCCGCGTCCAATTTAACTTTA;

Sequenza 8 ERIC 1R:

ATTCGTGGGGGCGTGGTGCCTTCATGTATGTTGTACCCCCGGTCTCATTCTGCT TGGCCATCCGCCTGGAACTTTCCGATTCTGTGGCTTTCCGGCCATTTCTTTTAGA ATCGCCTTCTGCCTAACCCTTTTTCCTTCTATGGTTCCTTCCGTACCGGGAAATG GACGTGTCTGGTCTGCGTTCTTGAGTAGAAAAACTCGCCACCCGCCCGCCCCA AAATTTCCTCCCTCGACGTTGTCTCTGAAGGGCACCGGGACGGGCGGTGGAGA TCCCCGGTTGGTGTCTTATGTACTCTGTGCGGGGGCAAGATCTTCCCATTGACT CTGGTCTTCGATTATTGTTTTGCGTAGCTGGTGCCCCTTGGTCCCATGGCTGCA CAGAGTCATATTCATTAGTTAATTACGCAACTGAAAAATCGGTTCTGGCGCCG GCAAAGAATGCCTTCAGAATCTGAAATGGAGATAAACACAGGGAGGACGTTG GTGGTTTTCCTTGAAGGCATTACGATAC.

Le suddette sequenze sono inoltre descritte in un Sequence Listing (redatto conformemente allo Standard ST.25 WIPO), che à ̈ allegato alla presente domanda di brevetto e in cui le sequenze 1 BOX, 2 BOX, 3 BOX 4, 3 BOX 7, 7 BOX, 7 ERIC- 1R, 8 ERIC 1R sono rispettivamente denominate SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7.

In accordo con l’opinione espressa da Balogh et al. (Balogh B., J. B. Jones, F.B. Iriarte and M.T. Momol, 2010. Phage therapy for plant disease control. Current Pharmaceutical Biotechnology 11, 48-57), le summenzionate sette sequenze e i caratteri fenotipici (rilevati tramite microscopia elettronica a trasmissione) sono ritenuti sufficienti per caratterizzare il fago secondo l’invenzione.

Utilizzando un software di allineamento di tipo noto (DNASTARR LASERGENETM MegAlign), le sette sequenze sono state comparate con i genomi (presenti nella banca dati NCBI) delle specie (appartenenti ai generi Tectivirus e Corticovirus) di batteriofagi noti e fenotipicamente simili al fago secondo l’invenzione.

I caratteri fenotipici e i risultati della suddetta comparazione hanno consentito di identificare il fago M9 come membro del genere Tectivirus, famiglia Tectiviridae (International Commitee on the Taxonomy of Viruses, 2005 Virus Taxonomy. Editor Fauquet C.M. et al., Elsevier Academic Press; Å1⁄2iedaitÄ— G., H.M. Kivelä, J. K.H. Bamford and D.H. Bamford, 2009. Purified membrane-containing procapsids of bacteriophage PRD1 package the viral genome. Journal of Molecular Biology 386 (3), 637-647).

Il fago M9 Ã ̈ stato depositato in data 10/04/2013 presso la collezione DMSZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr, 7B, 38124 Braunschweig, Germania) con numero DSM 27111.

Il ceppo propagatore secondo l’invenzione – denominato ceppo 7815G dagli Inventori – à ̈ stato isolato da cancri corticali di alberi di pero avvizziti per colpo di fuoco, in un pereto alla foce del fiume Isonzo in Friuli Venezia Giulia.

Il batterio à ̈ stato purificato con più passaggi di singola colonia su piastre di King’s medium B (Lelliott R.A. e D.E. Stead, 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. p.176. Blackwell Scientific Publications) e identificato in base ai profili elettroforetici degli esteri metilici degli acidi grassi presso il laboratorio FERA (The Food and Enviroment Research Agency di Sand Hutton, York, Regno Unito) e ad una sequenza di 1500 pb del rDNA 16S presso il laboratorio BaseClear (BH Leiden, Olanda).

In base ai profili degli acidi grassi il batterio à ̈ stato riferito alla specie Pantoea agglomerans (probabiltà 0,93); in base alle sequenze rDNA 16S il batterio ha mostrato somiglianza 100% con le specie P. agglomerans e P. vagans; il ceppo 7815G ha mostrato avere indel (mutazione per inserzione/delezione di nucleotidi) tra le basi 1299-1487 rispetto a P. agglomerans.

Uno studio di caratteri fenotipici differenziali (Brady et al., 2009. Pantoea vagans sp.nov., Pantoea eucalypti sp.nov., Pantoea deleyi sp.nov. and Pantoea anthophila sp.nov. Int. J. System. Evol. Microb. 69,2339-2345) (utilizzazione del malato e del tartrato; Skerman, 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. Williams & Wilkins, Baltimore) ha mostrato che il ceppo 7815G condivideva con P. vagans sviluppo di alcalinità da malonato, ma non da tartrato.

In base a tutti i risultati il ceppo propagatore à ̈ stato identificato come una forma assimilabile a Pantoea vagans.

Il ceppo propagatore à ̈ stato caratterizzato tramite i profili degli ampliconi ottenuti con analisi Rep-PCR, ERIC-PCR e BOX-PCR, eseguite secondo il protocollo di Rademaker e Bruijn (Rademaker, J.L.W. e F.J.De Bruijn, 1997. Characterization and classification of microbes by rep-PCR genomic fingerprinting and computer-assisted pattern analysis. In DNA Markers: Protocols, Applications and Overviews. Ed. Caetano-Anollés, G. and Gresshoff, P.M. pp.1–26. New York, NY: John Wiley & Sons, Inc.).

Il ceppo propagatore à ̈ stato inoltre sottoposto al saggio di ipersensibilità su foglie di tabacco (Klement et al., 1990. Mechanism of resistance In: Methods in phytobacteriology.p.470. Ed.i Klement, Rudolph e Sands. Akademiai Kiado, Budapest), infiltrando una sospensione di cellule di 24 ore a 25C° ad elevata concentrazione (108 cellule/ml) in foglie di tabacco var. “White Burley†. Il batterio non ha indotto necrosi confluente ipersensibile dopo 24 ore a 25°C, bensì unicamente clorosi delle aree internervali infiltrate (dopo 3-4 giorni).

L’esito del suddetto saggio di ipersensibilità ha quindi mostrato che il batterio propagatore secondo l’invenzione non à ̈ fitopatogeno.

Il ceppo batterico 7815G Ã ̈ stato depositato in data 10/04/2013 presso la collezione DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr, 7B, 38124 Braunschweig, Germania) con numero DSM 27090.

La composizione secondo l’invenzione comprende il fago M9, e più precisamente un lisato fagico ottenuto propagando il fago M9 su una coltura pura di Pantoea vagans 7815G. Con il termine “lisato fagico†, o semplicemente “lisato†, si intende una coltura liquida di Pantoea vagans 7815G di 24 ore, in cui à ̈ stato propagato il fago M9. In conseguenza dell’infezione con il fago M9, la maggior parte o la totalità delle cellule del batterio sono morte per la lisi del citoplasma e della parete cellulare, mentre le particelle fagiche sono fuoriuscite dalle cellule batteriche lisate e si trovano libere, sospese nel brodo di coltura. In laboratorio, il fago M9 si propaga sul ceppo 7815G in coltura liquida (brodo A) aerobica a 25°C, fino ad ottenere, dopo 24 ore in agitatore rotativo, lisati fagici aventi concentrazioni pari a 108-109 UFP/ml, dove per UFP si intende Unità Formanti Placca, ossia unità formanti aree singole di lisi sulla patina batterica di Pantoea vagans (Figura 2). Dopo 24 ore il lisato grezzo viene centrifugato a 8000 g per 20 minuti a 4 C°. Il supernatante limpido viene filtrato a 0,45 µm e poi a 0,22 µm. Si ottiene così un lisato sterile, assai limpido, conservabile in frigorifero a 4-6 C° per mesi.

Va notato che, in laboratorio, à ̈ possibile produrre il lisato fagico sopra descritto propagando il fago M9 sul ceppo 7815G in un brodo nutritivo di semplice composizione, come ad esempio il brodo NBSYE (Gill J.J. et al. 2003). Inoltre, prove preliminari di laboratorio hanno dimostrato che il ceppo 7815G può essere allevato anche in brodi c.d. “poveri†(poco costosi), usando prodotti e materiali facilmente reperibili in ambiente agricolo (es. liquidi di macerazione di mangimi per animali, centrifugati e sterilizzati in autoclave).

A livello industriale, il fago M9 può essere propagato sul ceppo 7815G in coltura liquida (brodo) aerobica per 24 ore a 25°C - o ad una temperatura affine, ad esempio 22°-30°C per un numero di ore idoneo - usando un bioreattore ad agitazione di tipo noto, per ottenere, tramite filtrazione, lisati fagici aventi concentrazioni pari a 108-109 UFP/ml.

Poichà ̈ il fago M9 viene propagato su un ceppo batterico non patogeno, il metodo di preparazione sopra descritto non à ̈ oggetto di particolari limitazioni o restrizioni, essendo unicamente necessario applicare, nel luogo di produzione, le prescrizioni sanitarie per la sicurezza degli operatori previste comunemente nei laboratori batteriologici.

Tramite il metodo di preparazione (laboratoristico o industriale) sopra descritto, Ã ̈ possibile ottenere un prodotto liquido ad alta concentrazione di principio attivo, ossia ad una concentrazione di particelle fagiche M9 pari a 108-109 UFP/ml.

Il suddetto prodotto liquido può essere usato in giornata, se conservato a temperatura ambiente, e nei giorni successivi alla data di produzione, se conservato in un frigorifero a 4-6°C. Prove di conservazione del lisato fagico sterile per filtrazione a 4-6 C°, con conteggio delle UFP ancora attive, hanno indicato che la sopravvivenza del fago M9 à ̈ soddisfacente per l’uso: entro 6 mesi la diminuzione di concentrazione di particelle fagiche à ̈ minima, dopo 12 mesi la concentrazione à ̈ ancora dell’ordine di almeno 10<5>UFP/ml. Il metodo secondo l’invenzione comprende la somministrazione del prodotto liquido sopra descritto - ossia il lisato fagico sterilizzato per filtrazione - su pomacee, in particolare sugli alberi durante la fioritura. La somministrazione può essere effettuata per immersione (nel prodotto liquido) nel caso di pomacee di piccola taglia (come, ad esempio, piante micropropagate e acclimatate), oppure per aspersione soprachioma nel caso di alberi o cespugli, tramite metodi e dispositivi noti in agricoltura e ponendo attenzione alla pulizia dei contenitori e degli apparati di distribuzione, in particolare per evitare che metalli pesanti vengano in contatto con il fago.

Va notato che il ceppo propagatore 7815G secondo l’invenzione à ̈ un ceppo non fitopatogeno, epifita e saprofita, che vive comunemente nella medesima nicchia ecologica di Erwinia amylovora, vale a dire nella fillosfera delle pomacee, in particolare associato ai tessuti corticali.

Pertanto, quando il lisato fagico viene somministrato alle piante da trattare, il fago M9 può trovare due differenti bersagli: le popolazioni del patogeno Erwinia amylovora (bersaglio primario) e le popolazioni di Pantoea vagans o Pantoea agglomerans (bersagli secondari), ambedue le popolazioni essendo in grado di propagare, e quindi perpetuare sulle piante, il fago M9.

Di conseguenza, effettuando trattamenti preventivi – ossia in assenza di infezioni di Erwinia amylovora – il fago M9 secondo l’invenzione avrà la possibilità, almeno teorica, di perpetuarsi sulle piante a tempo indeterminato sfruttando le popolazioni del bersaglio secondario ed essere già presente, ubiquitario, sulle medesime piante, in caso di immigrazione di Erwinia amylovora.

Inoltre, à ̈ possibile somministrare alle pomacee la composizione secondo l’invenzione durante tutta la stagione vegetativa (e quindi non solo durante la fioritura), per proteggere dalle infezioni ferite nella parte epigea delle piante, causate da eventi metereologici (ad esempio, grandinate) o da interventi agronomici.

In generale, una somministrazione alle piante del fago M9 durante tutta la stagione vegetativa consente di ridurre la popolazione microbica del patogeno e, conseguentemente, di ridurre la pressione del colpo di fuoco nell’ambiente.

Le conseguenze di un’infezione da Erwinia amylovora su fiori di pomacea trattati con la composizione secondo l’invenzione e su fiori di pomacea non trattati sono riassunte nella Figura 6: nei fiori non trattati con il fago secondo l’invenzione si verificano numerose infezioni, che si diffondono alle branche portanti i fiori e determinano un’elevata frequenza di morte di alberi. Al contrario, per effetto del trattamento con il fago secondo l’invenzione, si verificano poche infezioni nei fiori e le branche portanti i fiori sono sostanzialmente protette dall’infezione di Erwinia amylovora, con conseguente bassa frequenza di morte degli alberi.

Di seguito sono illustrati gli esiti di tre prove sperimentali fatte dagli Inventori, che hanno dimostrato innanzitutto l’attività litica del fago secondo l’invenzione nei confronti di Erwinia amylovora. L’efficacia della composizione à ̈ stata saggiata su una collezione di ceppi di Erwinia amylovora isolati in diverse località della Italia settentrionale, su pere immature e sui fiori di giovani peri. La sperimentazione ha avuto lo scopo di valutare lo spettro di azione del fago M9 nei confronti di differenti ceppi di E. amylovora e di dimostrare correlazione positiva tra l’attività del fago in vitro e quella in vivo (su organi staccati dall’albero) e in planta (su organi sull’albero vivente).

Attività litica del fago M9 sui ceppi di Erwinia amylovora

Il fago M9 Ã ̈ stato saggiato in vitro nei confronti di una collezione di 22 ceppi di Erwinia amylovora.

I suddetti ceppi sono rappresentativi delle popolazioni del patogeno presenti in Italia Settentrionale, incluse le province di Trento e di Bolzano.

Il fago M9 ha mostrato una intensa attività litica (area di lisi confluente limpida) nei confronti di tutti i ceppi.

Nella seguente Tabella 1 (in cui: E-R = Emilia-Romagna; F.V.G. = Friuli Venezia Giulia) sono riportati i dati identificativi dei 22 ceppi:

Tabella 1

N° ceppo

E. amylovora Pianta ospite Anno

isolamento Provincia / Regione 4520 Cotognastro 2002 Bolzano/Alto Adige 4521 Melo 2002 Bolzano/ Alto Adige 4525 Melo 2002 Bolzano / Alto Adige 5356 Cotognastro 2003 Torino / Piemonte 6422 Pero o Crategus 2006 Lombardia 6423 Pero 2006 Lombardia 6424 Pero 2006 Lombardia 6426 Biancospino 2006 Lombardia 6806 Biancospino 2007 Rovigo / Veneto 6807 Pero 2007 Rovigo / Veneto 6814 Melo 2007 Rovigo / Veneto 6816 Biancospino 2007 Treviso / Veneto 6817 Sorbo 2007 Rovigo / Veneto 6853 Melo 2007 Ravenna / E-R 6854 Melo 2007 Reggio E. / E-R 6855 Melo 2007 Modena / E-R 6858 Melo 2007 Piacenza / E-R 6862 Melo 2007 Ferrara / E-R 6883 Melo 2007 Bologna E-R 6884 Pero 2007 Bologna / E-R 7813 Pero 2009 Gorizia / F.V.G.

7814 Pero 2009 Gorizia / F.V.G.

Efficacia del fago M9 nel ridurre le infezioni sulle pere Per la prova in vivo, il fago M9 Ã ̈ stato inoculato su pere verdi immature cv. Abate Fetel, a dose controllata (5µl di sospensione a 108 UFP/ml, pari a circa 5.105 particelle fagiche), entro piccoli fori equatoriali.

Nei suddetti fori equatoriali à ̈ stata introdotta, dopo qualche minuto (T0) o dopo 24 ore (T24), una dose controllata di 5 µl (concentrazione di circa 106 CFU/ml) di sospensione del ceppo di Erwinia amylovora OMP-BO 1077/7.

Sono state effettuate due prove parallele e contemporanee.

I fori equatoriali sono stati fatti con un punteruolo calibrato, ossia costruito in modo da creare una stretta cavità conica, avente profondità fissa di 8 mm, nei tessuti delle pere. Come controllo sono state usate pere trattate con acqua sterile (controllo negativo), o con streptomicina a 150 ppm (controllo positivo), e successivamente con il ceppo di Erwinia amylovora OMP-BO 1077/7.

Dopo 7 giorni in camera umida a 25°C, posta in cella climatica con 14 h di fotoperiodo, le pere trattate sono state tagliate trasversalmente in corrispondenza dei punti di inoculazione (fori equatoriali) e sono stati misurati i diametri delle aree idropiche, di colore verde–oliva, rotondeggianti, in corrispondenza del tratto terminale delle ferite.

Le due prove sono state fatte secondo lo schema del blocco randomizzato con 4 ripetizioni per tesi di 12 pere cadauna: ad esempio, la tesi “fago M9, T24†(ossia, pere trattate con il fago M9 e inoculate dopo 24 h con il ceppo OMP-BO 1077/7) à ̈ consistita in totale di 48 frutti. La temperatura di 25C° e la camera umida (U.R. prossima al 100%) erano assai favorevoli o ottimali alla colonizzazione dei tessuti delle pere da parte di Erwinia amylovora.

La prova à ̈ stata ripetuta con il medesimo protocollo.

I risultati della prova sono mostrati in Tabella 2, in cui i numeri romani (I-IV) indicano le ripetizioni e lettere differenti (a; b) indicano differenze statistiche significative tra le medie:

Tabella 2

T0 T24 Medie I II III IV I II III IV T0 T24 Fago M9 17,25 14,8 12,11 15,33 1,08 0 0 2,5 14,87a 0,89 b<Streptom.>5,5 11,33 8,9 13,33 0 0 0 0 3,76 b 0 b Acqua 21,75 19,45 19,16 15,91 2,16 2,41 2,25 2,41 19,06a 2,30 a

Con riferimento al tempo T0, l’analisi statistica ha mostrato una differenza significativa tra le medie delle tre tesi (P = 0,0029) con un livello di confidenza del 95%. Il test dei range multipli ha indicato che la media della tesi “acqua†à ̈ statisticamente differente da quella della tesi “streptomicina†, ma non statisticamente differente da quella della tesi “fago M9†. Al tempo T0 il trattamento con il fago M9 ha ridotto del 22% l’area di tessuto infetto, mentre il trattamento con streptomicina ha ridotto del 49% l’area di tessuto infetto.

Con riferimento al tempo T24, l’analisi statistica ha mostrato una differenza significativa tra le medie delle tre tesi (P=0,0034) con un livello di confidenza del 95%. Il test dei range

1121097in_Descrizione

multipli ha indicato che le medie della tesi “fago M9†e della tesi “streptomicina†sono differenti statisticamente da quella della tesi “acqua†, ma non sono differenti statisticamente tra di loro.

I risultati delle prove in vivo effettuate su pere immature staccate dall’albero indicano pertanto che, al tempo T24, il fago M9 ha ridotto del 61% l’area del tessuto infetto, mentre la streptomicina ha bloccato la colonizzazione del tessuto da parte di Erwinia amylovora. Dopo 24 ore a 25C° era già iniziato il processo di riparazione delle ferite, come à ̈ dimostrato dalla riduzione dell’area di tessuto infetto anche nelle pere trattate con acqua (da 19.06 a 2,30). Tenendo conto della riduzione dell’area di tessuto infetto per effetto del processo di riparazione, à ̈ possibile calcolare la riduzione netta ottenuta grazie all’azione del fago M9: tale riduzione à ̈ approssimativamente uguale al 46,5%.

Va notato che una temperatura di 25°C e un’umidità relativa prossima al 100% sono condizioni assai favorevoli alle infezioni di E. amylovora.

In sintesi, il trattamento delle pere immature con il fago M9 à ̈ risultato significativamente efficace quando à ̈ stato effettuato 24 ore prima dell’inoculazione di Erwinia amylovora. Il risultato della prova suggerisce che l’azione del fago M9, quando applicato a ferite fresche, possa agire in modo sinergico con le barriere di difesa attuate dalla pianta durante il processo di riparazione tissutale.

Efficacia del fago M9 nel ridurre le infezioni sui fiori Per la prova in planta sono stati usati 12 peri dell’età di 3 anni, cv. Abate Fetel innestati su cotogno M29, allevati in vasi singoli all’aperto in vivaio.

Circa a metà fioritura del quarto anno (8 Aprile 2010), i peri sono stati usati per valutare l’efficacia del fago M9 nel ridurre l’incidenza delle infezioni fiorali. All’epoca della prova, ogni corimbo presentava 6-8 fiori, in massima parte già aperti.

Per la prova à ̈ stato usato lo schema del blocco randomizzato con 3 tesi di 4 ripetizioni cadauna, dove in ogni pero erano stati marcati preventivamente 10 corimbi, appendendo un cartellino all’asse di ciascun corimbo.

All’aperto, i tre gruppi di 4 peri separatamente sono stati aspersi rispettivamente con una sospensione del fago M9 avente concentrazione uguale a 108 UFP/ml, con acqua distillata (controllo negativo) e con streptomicina a 100 ppm (controllo positivo).

I tre gruppi di 4 peri sono stati collocati in serra, in una cella a luce naturale, con temperatura diurna di 23 ± 2 C° e temperatura notturna di 16 – 18 C° (temperature simili a quelle di un normale periodo di fioritura in frutteto).

Dopo 24 ore, i peri sono stati portati all’aperto e tutte le infiorescenze marcate sono state asperse con una sospensione del ceppo di Erwinia amylovora OMP-BO 1077/7 avente concentrazione uguale a 5.106 UFC/ml.

Dopo l’aspersione, i peri sono stati collocati nuovamente in cella a luce naturale, con temperatura diurna di 23 ± 2 C° e temperatura notturna di 16 – 18 C°. E’ stata mantenuta una alta umidità relativa pari al 95-100% per 48 ore, mediante stillicidio continuo di acqua generante aerosol nell’ambiente.

Dopo 7 giorni, per ogni corimbo marcato à ̈ stato calcolato il rapporto (frequenza) tra il numero dei fiori anneriti – ossia infetti – e il numero totale (6 – 8) dei fiori; à ̈ stata inoltre calcolata la frequenza media nei 10 corimbi di ogni pero.

Campioni di infiorescenze, scelti in modo casuale nelle tre tesi, sono stati usati per confermare in laboratorio la presenza di Erwinia amylovora OMP-BO 1077/7 nei fiori anneriti.

La conferma delle infezioni à ̈ stata ottenuta mediante reisolamento su piastre di agar nutritivo addizionato con saccarosio 5% (NSA) e identificazione delle colonie levaniformi con analisi PCR (McManus P.S. e A.L. Jones, 1995. Detection of Erwinia amylovora by nested PCR and 4 PCR-dot-blot and reverse-blot hybridization. Phytopathology 85: 618-623).

I risultati della prova sono mostrati in Tabella 3, in cui i numeri romani (I-IV) indicano i 4 peri e lettere differenti (a; b) indicano differenze statistiche significative tra le medie:

Tabella 3

Frequenze medie di fiori infetti

TESI in 10 corimbi per pero MEDIE I II III IV

Fago M9 0,366 0,355 0,104 0,374 0,30 a Streptomicina 0,153 0,277 0,204 0,213 0,21 a Acqua 0,405 0,580 0,646 0,515 0,53 b

L’analisi statistica ha mostrato una differenza significativa tra le medie delle tre tesi (P=0,0036) con un livello di confidenza del 95%. Il test dei range multipli ha indicato che le medie della tesi “fago M9†e della tesi “streptomicina†sono omogenee e differiscono significativamente dalla tesi “acqua†.

I risultati della prova in planta, effettuata sui fiori di pero, evidenziano pertanto che il trattamento con il fago M9 ha ridotto del 43% la frequenza delle infezioni di E. amylovora sui corimbi fiorali. Inoltre, si desume che il trattamento con streptomicina ha ridotto apparentemente del 60% la frequenza delle infezioni, sebbene il valore medio non à ̈ significativamente differente da quello ottenuto tramite trattamento con il fago M9.

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Fago M9, depositato con numero DSM 27111, per uso nella prevenzione e trattamento di infezioni di tessuti vegetali causate da Erwinia amylovora.
2. 2. Fago secondo la rivendicazione 1, il cui genoma comprende almeno una delle sequenze nucleotidiche di SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7.
3. 3. Ceppo di Pantoea vagans 7815G, depositato con numero DSM 27090, per uso come ceppo propagatore del fago M9 secondo la rivendicazione 1, oppure 2.
4. 4. Composizione per prevenire e trattare infezioni di tessuti vegetali causate da Erwinia amylovora, comprendente il fago M9 secondo la rivendicazione 1, oppure 2.
5. 5. Composizione secondo la rivendicazione 4, in cui detto fago M9 Ã ̈ presente in una concentrazione pari ad almeno 108-109 UFP/ml.
6. 6. Composizione secondo la rivendicazione 4, oppure 5, comprendente un lisato fagico ottenuto propagando detto fago M9 nel ceppo di Pantoea vagans 7815G secondo la rivendicazione 3.
7. 7. Metodo per prevenire e trattare infezioni di tessuti vegetali causate da Erwinia amylovora, comprendente somministrare il fago M9 secondo la rivendicazione 1, oppure 2, a detti tessuti vegetali.
8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 7, comprendente propagare detto fago M9 tramite un ceppo propagatore e ottenere un lisato fagico contenente detto fago M9, detto lisato fagico essendo somministrabile a detti tessuti vegetali.
9. 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui detto lisato fagico contiene detto fago M9 in una concentrazione pari ad almeno 108-109 UFP/ml.
10. 10. Metodo secondo la rivendicazione 8, oppure 9, in cui detto ceppo propagatore à ̈ il ceppo di Pantoea vagans 7815G secondo la rivendicazione 3.
11. 11. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 7 a 10, in cui detto somministrare comprende aspergere o immergere detti tessuti vegetali.
12. 12. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 7 a 11, in cui detti tessuti vegetali appartengono a specie della sottofamiglia Maloideae della famiglia Rosaceae, incluse nella lista ufficiale delle piante ospiti di Erwinia amylovora (EPPO, List A2. Erwinia amylovora data sheet, 2013).
13. 13. Sistema fago-batterio propagatore per ottenere una composizione contenente il fago, per uso nella prevenzione e trattamento di infezioni di tessuti vegetali causate da Erwinia amylovora, in cui detto fago à ̈ il fago M9 secondo la rivendicazione 1, oppure 2, e detto batterio à ̈ il ceppo di Pantoea vagans 7815G secondo la rivendicazione 3.