ITMI981683A1 - Ciclizzatore termico per reazioni biotecnologiche in particolare per poylmerase chain reaction e relativo contenitore per reazioni - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "CICLIZZATORE TERMICO PER REAZIONI BIOTECNOLOGICHE, IN PARTI-COLARE PER POLYMERASE CHAIN REACTION E RELATIVO CONTENITORE PER REAZIONI"

La presente invenzione ha per oggetto un ciclizzatore termico per reazioni biotecnologiche, in particolar modo per reazioni che coinvolgono il DNA, più in particolare per reazioni di amplificazione del DNA ( polymerase chain reaction, POR descritta in US 4638202), sia nella ricerca di base che a scopo diagnostico. L'invenzione riguarda anche i contenitori, in particolare blisters, per tali reazioni, che si rivelano particolarmente adatti anche alla serializzazione dei processi di preparazione dei campioni, alla commercializzazione di miscele di reazione preconfezionate sia liofilizzate che liquide, nonché alla catalogazione e stoccaggio di campioni ottenuti da reazioni biotecnologiche in vitro.

L'amplificazione del DNA è una tecnica che sfrutta la capacità di alcune DNA polimerasi termostabili, estratte da vari generi di microorganismi procarioti termofili, di avere un optimum di attività enzimatica a temperature elevate e di mantenersi inalterate alle temperature che sono necessarie per ottenere in vitro la separazione (denaturazione) delle due eliche del DNA. Al contrario delle DNA polimerasi non termostabili, tali enzimi possono essere sottoposti a variazioni termiche cicliche nell'intervallo compreso tra alcuni gradi sopra lo zero e i 100°C senza subire diminuzioni rilevanti di attività enzimatica. Ciò consente di sottoporre il DNA a una serie di cicli di (a) denaturazione del DNA (90°-95°C), (b) appaiamento con specifici oligonucleotidi ( primers : molecole di DNA a corta sequenza complementari a precise regioni del DNA da amplificare che consentono l'innesco della polimerarizzazione) che innescano la duplicazione di un certo segmento del DNA e (c) estensione dei primer stessi, cicli che producono in vitro l'amplificazione a catena del segmento stesso (da cui reazione a catena della polimerasi,PCR).

Una tipica reazione di amplificazione consiste nel sottoporre la miscela contenente il DNA da amplificare, i primers, i desossiribonucleotidi (i monomeri costituenti il polimero) e il tampone di reazione alle variazioni di temperatura cicliche che sono riassunte nello schema generale di figura 1, illustrante due cicli paradigmatici del processo, e che riporta in ascissa i tempi espressi in secondi e in ordinata le temperature espresse in gradi centigradi.

Il ciclo viene normalmente ripetuto dalle 15 alle 40 volte. La temperatura della prima tappa, in genere compresa tra 90<°>C e 95<°>C, consente la denaturazione del DNA da amplificare (ossia la separazione delle due eliche) . La temperatura della seconda tappa deve consentire ai . primers di appaiarsi al segmento di DNA da amplificare e che tale appaiamento sia selettivo, ossia specifico per la sequenza d'interesse, evitando quindi possibili appaiamenti non specifici che possono avvenire al di sotto della temperatura del meltlng point. La temperatura della terza tappa, in genere intorno ai 72’C deve essere tale da non consentire il distacco dei primers dal DNA e nello stesso tempo da garantire la massima attività dell'enzima che catalizza la reazione di polimerizzazione. La ciclicità della reazione consente l'amplificazione esponenziale del DNA in esame. I campioni di DNA amplificato ottenuti dalla reazione vengono analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio che consente l'identificazione del peso molecolare, ed eventualmente sequenziati per avere la certezza che si tratti della sequenza ricercata.

Occorre rilevare che la reazione è tanto più efficiente - nel senso della specificità del prodotto, nonché della velocità - quanto più rapide sono le transizioni di temperatura. Il processo ideale è quello in cui le rampe di salita della temperatura sono pressoché verticali, così da rendere realizzabile la standardizzazione del processo incrementandone la riproducibilità. Un problema che limita fortemente l'impiego della PCR sia in campo diagnostico (rilevamento di DNA virale, di anomalie cromosomiche ecc. in campioni biologici) che nella ricerca è quello della contaminazione dell'ambiente di lavoro, e quindi dei campioni in esame da parte del DNA già amplificato. Infatti, l'estrema sensibilità della PCR consente virtualmente di rilevare nel campione in esame la presenza di quantità pressoché infinitesimali di DNA (o di un precedente amplificato di PCR) ad esso estraneo, proveniente dall'ambiente di lavoro (pulviscolo atmosferico, aerosol), dall'operatore stesso (goccioline di saliva, materiale adeso ai guanti, ecc.) e dalla strumentazione (micropipette, punte, ecc.). I problemi sopra esposti, risolvibili solo con l'adozione di barriere architettoniche e particolari norme di sicurezza per evitare contaminazioni, assieme alla laboriosità di allestimento della reazione e di analisi dei prodotti della reazione stessa ha, fino ad oggi, limitato fortemente l'utilizzo routinario di questa tecnica nella ricerca e soprattutto nella diagnostica.

La reazione di PCR viene eseguita in particolari apparecchi consistenti in termostati a temperatura variabile, noti come ciclizzatori termici. I contenitori in cui si effettua la reazione sono strettamente vincolati al particolare schema progettuale del ciclizzatore tanto che nella realizzazione di un eventuale contenitore innovativo non si può prescindere da esso. I ciclizzatori termici esistenti si possono suddividere schematicamente in due categorie: quelli che effettuano transizioni termiche mediante variazione della temperatura di un unico supporto su cui sono alloggiati i contenitori delle singole reazioni, e quelli in cui i contenitori vengono spostati da un supporto mantenuto a una data temperatura ad un altro mantenuto a temperatura diversa. I primi si basano su tecnologie di riscaldamento a resistenze (di vario tipo, comprese lampade ad incandescenza) o a effetto Peltier e di raffreddamento ad effetto Peltier oppure a circuito 6 Bianchetti ■ Bracco · Minoja s.r.l..

Bianchetti Giuseppe ed altri con miscela refrigerante integrato da un sistema a ventilatore, oppure da un sistema a circolazione d'aria.

I secondi possono sfruttare sia gli stessi principi che la semplice termostatazione a resistenze elettriche dato che una volta raggiunte le temperature di esercizio non si rende necessario un sistema refrigerante particolarmente sofisticato (se non per realizzare una tappa di refrigerazione a temperatura inferiore alla temperatura ambiente, come p. es. se si vogliono conservare i campioni in seguito all'avvenuta reazione)ed è sufficiente al massimo una continua rimozione del calore in eccesso effettuata p. es. da una semplice ventola. Peraltro neppure questo tipo di ciclizzatore consente transizioni di temperatura molto rapide in quanto i movimenti meccanici necessari per lo spostamento dei campioni da una zona riscaldata all'altra comportano tempi di spostamento relativamente lenti, data la necessità di combinare movimenti traslatori e rotatori.

Per le reazioni di PCR sono stati sinora utilizzati contenitori cilindrici a fondo conico in polipropilene o in polistirene, a parete spessa o sottile e forniti di tappo, con tappo limitatore di volume o meno, oppure piastre multipozzetto in materiale plastico, oppure ancora vescichette in materiale plastico sigillate contro un vetrino su cui J

viene fatto crescere il materiale da analizzare (cellule) o applicati gli estratti da analizzare, oppure capillari in vetro o plastica.

Di fatto l'efficienza delle reazioni di PCR condotte in provette a fondo conico è in genere assai bassa: l'elevata inerzia termica del materiale, la sua scarsa conducibilità e il volume relativaimente elevato della miscela di reazione non consentono infatti variazioni di

temperatura molto rapide con nessun tipo di ciclizzatore, pur con

variazioni di efficienza da un ciclizzatore all'altro.

L'impiego di ambienti di reazione sigillati o con un grosso volume

non utilizzato comporta la necessità di prevenire l'evaporazione del

liquido con conseguente concentrazione dei reagenti. Per prevenire tale

problema in tubi a fondo conico si è ricorsi alle seguenti strategie:a)

l'uso di olii minerali o cere che, flottando sulla superficie della

miscela, prevengono l'evaporazione; b) l'uso di provette con tappo

limitatore di volume allo scopo di ridurre al massimo lo spazio morto di _ aria sovrastante la miscela di reazione; c) l'uso di ciclizzatori dotati

di coperchio riscaldato che previene il cosiddetto fenomeno della parete

fredda in base al quale il liquido tende ad evaporare condensandosi

sotto il tappo della provetta. L'uso di olii minerali o cere comporta

notevoli problemi per il recupero del campione: la necessità di dover

superare lo strato oleoso con i puntali delle micropipette da

laboratorio produce facilmente l'inquinamento del campione prelevato da

parte dell'olio stesso. Le provette con tappo limitatore di volume

presentano un costo più elevato e una conformazione che spesso mal si

adatta ai più comuni ciclizzatori in commercio. La soluzione di

applicare un coperchio riscaldato sul blocchetto termico del

ciclizzatore al fine di rendere omogenea la temperatura in tutto

l'ambiente di reazione costituisce una notevole complicazione dal punto

di vista costruttivo: di conseguenza gli strumenti che ne sono dotati . presentano costi assai elevati.

Le piastre multipozzetto consentono una semplificazione e quindi. una miglior serializzazione della fase di allestimento di un numero elevato di campioni, ma presentano sostanzialmente gli stessi problemi dei tubi singoli, l'uso di vesciche in materiale plastico adese contro la superficie di un vetrino consente il superamento dei problemi sopra esposti, ma comporta però la necessità di dotare l'apparecchio di accessori per la sigillatura, è limitato ad una singola reazione per vetrino, conporta l'uso di un ciclizzatore dedicato allo scopo e viene utilizzato limitatamente ad una specifica variante della metodica di amplificazione che va sotto il nome di IN SITU PCR.

L'uso dei capillari di vetro (è in fase di studio la possibilità di utilizzare capillari di plastica) rappresenta uno dei più recenti miglioramenti del processo in questione. Fino ad oggi tale metodo è stato inpiegato limitatamente a un ciclizzatore ad aria in cui le transizioni di temperatura vengono effettuate mediante una lampada alogena regolabile in intensità che riscalda un flusso d'aria utilizzato per riscaldare in modo preciso una camera in cui possono venire immessi sia i capillari che i tubi a fondo conico. Le prestazioni di tale sistema sono le migliori fino ad ora ottenute con sistemi standard disponibili in commercio qualora vengano utilizzati i capillari, ma decrescono qualora si faccia uso di tubi a fondo conico. I capillari, benché garantiscano le condizioni ottimali di rapporto superficie/volume per gli scambi termici, presentano i seguenti problemi: a)·essi sono disponibili in versioni da 10 e 50 μΐ, ma le condizioni ottimali di amplificazione si ottengono soltanto con quelli da 10 mi; b) il riempimento del capillare avviene sfruttando proprio il fenomeno della capillarità, per cui l'efficienza del riempimento varia con le caratteristiche chimico fisiche della miscela di reazione; c) onde prevenire l'adesione dell'enzima (polimerasi) al vetro del capillare, e la sua conseguente inattivazione o riduzione di attività, si rende necessario aggiungere alla miscela di reazione siero-albumina bovina in concentrazioni piuttosto elevate, ingrediente non necessario nei metodi convenzionali; per ovviare a ciò sono allo studio i capillari in plastica che comunque avranno presumibilmente caratteristiche di conducibilità del calore peggiori rispetto al vetro; d) si rende necessario l'impiego di un accessorio per la sigillatura del capillare, di un accessorio per la sua apertura e recisero del campione a reazione avvenuta, il che rende assai complicate le operazioni di analisi dei campioni.

Scopo dell'invenzione è quello di fornire un ciclizzatore termico e relativo contenitore dei campioni, che consentono di migliorare la performance della PCR e di massimizzare la standardizzazione.

Il ciclizzatore termico e il contenitore per la PCR, secondo l'invenzione, presentano le caratteristiche indicate rispettivamente nelle annesse rivendicazioni 1 e 10.

Realizzazioni vantaggiose dell'invenzione appaiono dalle rivendicazioni dipendenti.

Il ciclizzatore termico secondo l'invenzione è del tipo in cui i contenitori delle singole reazioni vengono messi in contatto ciclicamente con zone a temperature diverse e rappresenta un notevole miglioramento rispetto agli apparecchi tradizionali. Tale apparecchio consente di raggiungere prestazioni simili a quelle del ciclizzatore ad aria con capillari per quanto riguarda l'efficienza delle reazioni, di ridurre notevolmente rispetto a quest'ultimo la laboriosità di allestimento delle miscele di reazione e di avere costi di realizzazione inferiori. Grazie alle sue caratteristiche questo ciclizzatore potrebbe rappresentare un ulteriore passo verso la possibilità di rendere routinaria la reazione di amplificazione del DNA e quindi di diffondere la tecnica della PCR come mezzo di indagine forense, diagnostico e di ricerca sia applicata che di base.

I vantaggi derivanti dall'uso dei contenitori secondo l'invenzione, in particolare blisters - che in una delle loro possibili forme sono di materiale plastico molto sottile con una lamina di chiusura solitamente metallica (ma può anche essere realizzata in materiale plastico) -abbinato al ciclizzatore secondo l'invenzione, sono i seguenti: a) data la sua piccola massa e l'elevata conducibilità della lamina (generalmente alluminio),questo tipo di contenitore garantisce tempi di trasferimento eccezionalmente rapidi; b) giacché nella realizzazione secondo l'invenzione il calore fluisce attraverso la lamina di copertura, nel caso particolare in cui il blister sia realizzato sostanzialmente in forma di emisfero, il calore si diffonde rapidamente e in modo pressoché uniforme in tutta la miscela di reazione; c) il fatto che i blisters siano completamente rieirpibili e sigillabili fa sì che si possa far avvenire la reazione in ambiente a tenuta stagna in sostanziale assenza di evaporazione, come pure l'approssimarsi delle transizioni di temperatura alle condizioni ideali, rende la reazione altamente efficiente, riproducibile e standardizzabile; c) la caratteristica dei blisters di avere una superficie sostanzialmente piana consente, in una delle forme dell'invenzione, di far scivolare, anziché traslare e ruotare, il contenitore su superfici riscaldate alle opportune temperature oppure, in un’altra forma dell'invenzione, di far scivolare le superfici riscaldanti stesse al di sotto dei blisters: questa caratteristica consente di ridurre notevolmente i tempi di spostamento dei campioni e inoltre di semplificare la meccanica del ciclizzatore termico deputata allo spostamento del contenitore.

Il ciclizzatore secondo l'invenzione si conpone delle seguenti componenti:

1) Uno stadio di controllo del processo costituito per esempio da una o più schede microcontroller,da un personal computer,ecc. sia per la regolazione della temperatura degli stadi termostatati, sia per il controllo dello spostamento dei contenitori delle reazioni; tale stadio può essere controllato, ad esempio, per mezzo di una apposita tastiera per l'inserimento dei profili di reazione e per il controllo delle operazioni in generale, e può comprendere inoltre un display per il monitoraggio del processo e per la visualizzazione delle operazioni.

2) Uno stadio comprendente le zone termostatate, dotato di movimento meccanico per lo spostamento dei blisters contenenti le reazioni da una zona all’altra o, in alternativa, per lo spostamento delle zone termostatate rispetto ai contenitori.

L'invenzione verrà ora descritta, a titolo puramente esemplificativo, e quindi non limitativo di realizzazione, con riferimento ai disegni annessi,in cui:

La Figura 1 è un grafico mostrante le variazioni di temperatura cicliche durante una tipica reazione di anplificazione del DNA;

Le figure 2A e 2B sono, rispettivamente, una vista laterale schematica e una vista in pianta schematica di un ciclizzatore termico secondo una prima forma di realizzazione dell'invenzione;

Le Figure 3A e 3B sono una vista laterale e una vista in pianta di un ciclizzatore termico secondo una seconda forma di realizzazione* dell'invenzione; ;Le Figure 4A e 4B sono una vista laterale e una vista in pianta di un ciclizzatore termico secondo una terza forma di realizzazione dell'invenzione; ;La Figura 5 è una vista schematica in elevazione mostrante la fase di riempimento di un blister. ;La Figura 6 è una vista in elevazione laterale di un adattatore per rendere utilizzabili, nel ciclizzatore secondo l'invenzione, provette a fondo conico convenzionali. ;Nel primo esempio di realizzazione dell'invenzione, illustrato nelle Figure 2A e 2B, è previsto che i contenitori, in particolare blisters, uno dei quali è schematicamente mostrato a tratteggio in Figura 2A e indicato con il numero di riferimento 20, protetti da una calotta isolante 12, vengano fatti scivolare meccanicamente da una superficie riscaldata ad un'altra, e che tali superfici siano disposte in serie. Questa particolare disposizione non presenta limitazioni rispetto al numero dei segmenti di temperatura che si possono ;incrementare. Le superiici termostatate metalliche relative a quattro ;possibili segmenti di temperatura, indicate con i numeri di riferimento ;1, 2, 3, e 4 nelle Figure 2A e 2B, sono disposte su un piano di supporto ;9 di un blocco a forma di parallelepipedo 9'. ;Sulle pareti laterali del blocco di supporto 9' sono ricavate ;fessure longitudinali 10, attraverso le quali un carrello porta-blister ;13, completo di giunto 11 e calotta isolante 12 di copertura del blister ;20, è connesso al relativo meccanismo interno di trascinamento. ;In appositi alloggiamenti ricavati all'interno delle superiici_ metalliche termostatate 1, 2, 3,e 4, sono inserite le rispettive sonde ;5, 6, 7,e 8 per il rilevamento delle temperature. ;La direzione di spostamento dei blisters è indicata dalla doppia ;freccia F in Figura 2B. ;Secondo la realizzazione illustrata nelle Figure 3A e 3B, è . previsto di tener fermi i blisters 20, al di sotto della calotta di ;protezione 12, e di far ruotare un rullo 30 a sezione trasversale . poliedrica, le cui facce siano le superiici termostatate, in modo da ;portare tali superfici riscaldate a contatto con il blister 20. ;Il rullo 30 mostrato in Figura 3A, supportato in modo girevole da ;una staffa 31, ha una sezione ottagonale e dispone pertanto di quattro ;superfici termostatate, ancora indicate con i numeri di riferimento 1, ;2, 3, e 4, alternate ad altrettante superfici isolanti 15 realizzabili ;in vari materiali, quali ad esempio porcellana, vetro, polistirolo, ;eccetera. ;I limiti alla possibilità di utilizzare rulli con sezione a più.· facce sono imposti dalle dimensioni della superficie del blister 20 da riscaldare: infatti, tenendo ferme le dimensioni dell'apparecchio ed = incrementando le facce del rullo 30, diminuisce la superficie delle facce stesse. ;La calotta isolante 12 è in questo caso solidale al piano di supporto 9 e può eventualmente sollevarsi (passivamente grazie a molle di sospensione o attivamente grazie ad un servo meccanismo di cui può essere dotato lo strumento) nel momento in cui il rullo 30 ruota facendo emergere uno dei suoi spigoli rispetto al piano 9 del supporto. ;Alternativamente può essere previsto un abbassamento del rullo 30 durante le rotazioni, abbassamento che può essere ottenuto passivamente mediante molle di sospensione su cui può essere montato il rullo, o attivamente mediante un servomeccanismo di cui può essere dotato lo strumento. ;Questa soluzione è più complessa dal punto di vista costruttivo,ma consente di contenere le dimensioni, peraltro già molto contenute, rispetto ad analoghi apparecchi. ;Nell'esempio illustrato nelle figure 4A e 4B è previsto che i blisters 20 vengano fatti scivolare da una superficie riscaldata all'altra, e che tali superfici siano disposte in modo circolare, oppure, alternativamente, che le superfici riscaldate poste su di un disco 9,possano ruotare rispetto al blister solidale ad uno stativo. ;Nelle figure 4A e 4B è riportato, a titolo di esempio, il caso in cui il carrello porta blister, conprendente la calotta isolante 12, un'astina reggi calotta 16, e un perno di rotazione 17, ruota in senso orario,come indicato dalla freccia F', trasportando il blister 20 sulle varie superfici termostatate, delle quali ne sono previste tre nella realizzazione illustrata, indicate con i riferimenti 1, 2 e 3. ;Nell'esempio delle figure 2A e 2B, al termine di un ciclo, ossia quando il blister 20 raggiunge una posizione estrema, esso deve essere riportato rapidamente alla posizione iniziale per l'inizio del nuovo ciclo. Ciò rende necessario un incremento nella velocità per avere un tempo di spostamento da una superficie termostatata all'altra sostanzialmente uniforme. ;Negli altri due esempi riportati nelle Figure 3A, 3B e 4A, 4B, nell'ipotesi che vengano impegnate tutte le superfici disponibili, si ha una sostanziale uniformità dei tempi di spostamento da una superficie all'altra,dal momento che gli spazi da percorrere ciclicamente sono di lunghezza sostanzialmente uguale. Nell'esempio delle Figure 4A e 4B le superfici vengono attraversate con moto circolare dai blisters 20, mentre nell'esempio delle Figure 3A e 3B i blisters 20 vanno a contatto con le superfici riscaldanti di un rullo a sezione poliedrica 30. ;I blisters possono essere realizzati in vari materiali plastici o metallici, alcuni dei quali indeformabili sia alle massime temperature di esercizio previste (circa 100°C) che alle minime temperature di conservazione (-200“C azoto liquido). I blisters presentano i seguenti vantaggi: a) possono essere chiusi da uno strato metallico altamente termoconduttivo rivestito sul versante interno, a contatto con la miscela di reazione,di uno strato plastico; b)possiedono una geometria generaljnente emisferica che garantisce l'uniformità di distribuzione del calore all'interno della miscela di reazione; c)consentono lo svolgersi della reazione in un ambiente perfettamente sigillato e quindi a prova di contaminazioni;d)possono essere realizzati con volumi interni assai piccoli (sino ad appena 5 pi di volume), con conseguente risparmio di reagenti ed incremento dell'efficienza della reazione stessa; e) hanno un costo ridottissimo rispetto ai contenitori tradizionali quali, capillari, provette a fondo conico, piastre multipozzetto ecc.; f) possono essere pre-caricati con le miscele di reazione e conservati fino a -200*C; g) possono essere forati e risigillati sia dal versante della . lamina che funge da coperchio sia dal versante degli alloggiamenti; h) possono essere realizzati in materiale trasparente, e quindi:consentire l'analisi diretta dei prodotti di reazione mediante metodi spettrofotometrici o colorimetrici senza dover necessariamente aprire il contenitore; i) in seguito al punto h prevengono ogni contaminazione ambientale da parte dei prodotti di reazione. In Figura 5 è mostrato un tipico esempio di realizzazione di blisters del tipo a caricamento dal lato degli alloggiamenti. E' previsto anche che i blisters (di tipo convenzionale) possano essere coperti da una lamina provvisoria che possa facilmente essere rimossa e sostituita da una lamina sigillabile dopo che il blister è stato riempito col miscuglio di reazione eppure che vengano forniti aperti e sigillabili con apposita lamina di copertura.

Nella vista schematica di Figura 5, il blister 20, solo a titolo -indicativo, è stato mostrato a profilo sostanzialmente cilindrico, essendo preferito, come detto in precedenza un profilo emisferico.

La faccia 21 del blister di appoggio su un piano 22, è la lamina metallica che normalmente va a contatto con le superfici riscaldanti.

In fase di caricamento del blister 20, la sua estremità cilindrica superiore 25 si inserisce in un foro 23 di una piastra 24 di centraggio e di supporto. Il bordo 26 del foro 23 è sagomato ad imbuto, in modo da facilitare l'inserimento nel blister dell'ago 27 di una siringa 28, con la quale viene immesso nel blister 20 il campione da far reagire. .

Naturalmente la piastra di centraggio e di supporto 24 può essere diversa per ogni dimensione di blister 20, oppure regolabile in altezza. .

Il foro praticato nel blister 20 con l'ago 27 viene successivamente termosaldato.

Sebbene nelle Figure annesse si sia mostrato un unico contenitore, in particolare un blister 20, è evidente che nel ciclizzatore termico secondo l'invenzione vengono vantaggiosamente trattati contemporaneamente più blisters disposti in gruppo.

La Figura 6 illustra un'estensione dell'invenzione all'uso di contenitori convenzionali, ancora indicati con il numero di riferimento, 20,costituiti da provette a fondo conico.

Allo scopo viene utilizzato un adattatore 100, comprendente, ad esempio, una base piana 101 di alluminio, dalla quale si elevano una pluralità di blocchi parallelepipedi 102 in materiale isolante, quale polistirolo, tra i quali vengono sospese le provette 20, ciascuna presentante superiormente, dalla parte opposta al fondo conico, una superficie piana 103 sporgente dal profilo della provetta 20 e poggiante su una coppia di blocchi 102 adiacenti.

Gli effetti vantaggiosi dell'invenzione si esplicano allo stesso . modo di quanto precedentemente descritto, per contatto diretto della

base piana 101 in alluminio con le superiici termostatate del

ciclizzatore termico.

Claims (20)

1. RINVEDICAZIONI 1. Ciclizzatore termico per reazioni biotecnologiche, in particolare per polymerase chain reaction (PCR), comprendente una pluralità di zone termostatate (1, 2, 3 e 4), con le quali vengono portati ciclicamente a contatto contenitori (20) delle singole reazioni, caratterizzato dal fatto che detti contenitori (20)presentano una superficie (21)che va a contatto e in appoggio sulle superfici di dette zone termostatate (1, 2, 3 e 4).
2. 2. Ciclizzatore termico secondo la rivendicazione 1,caratterizzato dal fatto che detta superficie (21) del contenitore (20) e dette superfici di appoggio delle zone termostatate (1,2, 3 e 4) sono piane.
3. 3. Ciclizzatore termico secondo la rivendicazione 1 o 2,caratterizzato dal fatto che detta superficie (21) del contenitore (20) e dette superfici di appoggio delle zone termostatate (1, 2, 3 e 4) sono metalliche.
4. 4. Ciclizzatore termico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detti contenitori hanno una forma emisferica, con calotta in materiale plastico,uno strato plastico rivestendo sul lato interno, a contatto con la miscela di reazione, detta superficie metallica (21).
5. 5. Ciclizzatore termico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che è prevista almeno una calotta isolante di protezione (12), a copertura di detti contenitori (20) durante il trattamento.
6. 6. Ciclizzatore termico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che dette superfici termostatate (1, 2, 3 e 4) sono disposte in serie lungo un percorso rettilineo, circolare, o altro, e sono previsti mezzi per spostare ciclicamente dette superfici termostatate (1, 2, 3 e 4) rispetto al contenitore (20) tenuto in posizione fissa, o alternativamente per spostare il contenitore (20) rispetto a dette superfici termostatate (1, 2, 3 e 4).
7. 7. Ciclizzatore termico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, caratterizzato dal fatto che dette superfici termostatate (1, 2, 3 e 4) costituiscono almeno alcune delle facce di un rullo a sezione trasversale poliedrica, montato rotante intorno.al proprio asse, il contenitore (20) essendo disposto in posizione circonferenziale fissa rispetto al rullo (30).
8. 8. Ciclizzatore termico secondo la rivendicazione 7,caratterizzato dal fatto che sono previsti mezzi che consentono un movimento radiale relativo tra detto rullo (30)e detto contenitore (20).
9. 9. Ciclizzatore termico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto contenitore (20) è un blister.
10. 10. Ciclizzatore termico secando una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, caratterizzato dal fatto che detti contenitori (20) sono provette convenzionali a fondo conico, supportate da un adattatore (100) presentante una base di appoggio (101), che si dispone a contatto con le superfici di dette zone termostatate (1, 2, 3, 4).
11. 11. Ciclizzatore termico secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detta base di appoggio (101) dell'adattatore (100) è in alluminio e dette provette (20) sono supportate tra blocchi adiacenti (102) in materiale isolante, in particolare polistirolo.
12. 12. Metodo per l'esecuzione di reazioni biotecnologiche, in particolare polymerase chain reaction (PCR), mediante un ciclizzatore termico provvisto di una pluralità di superfici termostatate (1, 2, 3 e 4),con le quali viene portato ciclicamente in contatto un contenitore (20) per reazione, caratterizzato dal fatto di utilizzare quale contenitore (20) un contenitore in materiale plastico con una superficie termoconduttiva (21) portabile a contatto in appoggio su dette superfici termostatate (1, 2, 3 e 4).
13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che detto contenitore (20)è un blister.
14. 14. Contenitore per reazioni biotecnologiche, in particolare per polymerase Chain reaction (PCR), realizzato in materiale plastico, con una superficie termoconduttiva (21) portabile a contatto e appoggio su una pluralità di superiici termostatate (1, 2, 3 e 4)di un ciclizzatore termico.
15. 15. Contenitore secondo la rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che detta superficie termoconduttiva (21)è metallica ed è rivestita sul lato interno, a contatto con la miscela di reazione, da uno strato plastico.
16. 16. Contenitore secondo la rivendicazione 14 o 15, caratterizzato dal . fatto di avere una forma emisferica, con detta superficie termoconduttiva (21)piana.
17. 17. Contenitore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 16, caratterizzato dal fatto di essere riempito con la miscela di reazione mediante l'ago (27) di una siringa (28) e successivamente sigillato mediante termosaldatura.
18. 18. Contenitore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 17, caratterizzato dal fatto che detto contenitore è un blister.
19. 19. Adattatore per provette convenzionali (20) a fondo conico,per l'uso in un ciclizzatore termico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11,caratterizzato dal fatto che esso comprende una base di appoggio (101)disponentesi a contatto con dette superfici termostatate (1, 2, 3, 4) del ciclizzatore termico, dalla quale si elevano blocchi (102) in materiale isolante,tra i quali sono supportate dette provette (20).
20. 20. Adattatore secondo la rivendicazione 19, caratterizzato dal fatto che detta base di appoggio (101)e in alluminio e detti blocchi (102)in polistirolo.