ITMI942076A1

ITMI942076A1 - Procedimento per la riduzione del contenuto di nicotina mediante l'azione di microrganismi

Info

Publication number: ITMI942076A1
Application number: IT94MI002076A
Authority: IT
Original assignee: Jaccard Leon
Priority date: 1993-10-12
Filing date: 1994-10-12
Publication date: 1996-04-12
Also published as: ITMI942076A0; IT1270652B

Abstract

L'invenzione concerne un procedimento per la riduzione del contenuto di nicotina in substrati solidi o liquidi mediante l'azione diretta od indiretta di microrganismi.In particolare vengono trattati dei residui vegetali prodotti durante la lavorazione del tabacco, ottenuti per percolazione con soluzioni acquose di materiali solidi polvirulenti e/o di fanghi classificati quali "tossici e nocivi" dalla legislazione vigente per l'eccessivo contenuto di nicotina.Secondo l'invenzione questi substrati vengono sottoposti all'azione di un nuovo microrganismo Arthrobacter spp indicato con il BCCM N_ e/o dei suoi estratti acellulari.

Description

Descrizione della domanda di brevetto per Invenzione Industriale dal Titolo: Procedimento per la riduzione del contenuto di nicotina mediante l'azione di microrganismi

CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione concerne un procedimento per la riduzione del contenuto di nicotina in substrati solidi o liquidi tossici e nocivi per la presenza di tale composto, prodotti da varie attività agro-industriali, in modo da trasformarli in residui e/o liquidi destinabili alla normale depurazione e/o utilizzabili nel settore agronomico. Il processo consiste nell'applicazione di un sistema biologico che sfrutta proprietà indotte in un nuovo microrganismo nicotinofilo isolato da un terreno coltivato a tabacco; a tale scopo è stato impiegato un sistema di ricerca per l'isolamento di microrganismi capaci di crescere su mezzi contenenti nicotina a cui si sono applicati sistemi di selezione ed adattamento per impiegarli in condizioni particolari di crescita. La presente invenzione consente di ridurre i costi di smaltimento di questi residui e/o reflui con possibilità di ottenere da questi scarti non più tossici e nocivi un ulteriore incremento di reddito se utilizzati nel settore agronomico.

STATO DELLA TECNICA

La maggior parte delle attività interessate al trattamento di materiali contenenti nicotina producono residui e/o reflui con elevate concentrazioni di ques'alcaloide. I reflui si formano in genere durante le normali lavorazioni del tabacco, quando si vuol ridurre il contenuto di nicotina da materiali vegetali destinati alla produzione di sigarette a basso tenore di nicotina oppure dal trattamento dei residui solidi della lavorazione del tabacco (Vedi la domanda di brevetto parallela della stessa depositante con il titolo "Denicotinizzazione di residui solidi poivirulenti e/o di fanghi"). La denicotinizzazione di solidi, liquidi e/o sospensioni, oltre che per trattamento chimico-fisico (vedasi ad esempio i brevetti americani US 3139435 e US 4848373)■ si effettua con metodi biologici in cui si sfruttano le proprietà di microrganismi capaci di crescere con, e demolire, l'alcaloide nicotina. Fra i microrganismi nicotinofili che operano diversi pathway di degradazione, esistono differenti applicazioni per la denicotinizzazione di tessuti vegetali del tabacco sia in sospensioni acquose sia direttamente sul solido per la produzione di sigarette a basso tenore di nicotina (si veda ad esempio il brevetto americano US 4011141). In questi casi i microrganismi vengono scelti sulla base del rendimento quali-quantitativo in modo da non alterare le caratteristiche di fumabilità del tabacco e con il mantenimento della concentrazione di nicotina nel solido a valori superiori dei limiti di tossicità stabiliti nell'elenco delle sostanze classificate tossiche e nocive la cui presenza nei rifiuti speciali rende tali rifiuti "tossici e novivi".

PARTE SPERIMENTALE

Secondo la presente invenzione, e come specificato nella parte caratterizzante della rivendicazione 1, la fase biologica di denicotinizzazione viene operata da un nuovo microrganismo che è stato selezionato su di un mezzo contenente nicotina e che è definito Arthrobacter spp indicato con il BCCM N. e/o dei suoi estratti acellulari. Dei microrganismi capaci di utilizzare questo alcaloide sono stati infatti ottenuti mediante tecniche di arricchimento microbico, partendo da campioni di suolo della Virginia coltivato con tabacco, come verrà ora spiegato con l'aiuto di una serie di esempi di realizzazione del suddetto concetto inventivo.

A 50 grammi di suolo sono stati addizionati 450 mi di mezzo (MI) contenente 0,4 g. KH2P04, 1.33 g. K2HP04, 0,1 g. (NH^ S04. 0,1 g. estratto di lievito, 1 mi di soluzione salina, 100 mi di acqua a cui si è aggiunto 0,4 g. di nicotina. Successivi inoculi in soluzioni fresche dello stesso tipo e senza l'estratto di lievito (M2), temperature di incubazione pari a 30*C e condizioni di agitazione pari a 100 rpm, hanno permesso di selezionare dalla microflora del terreno microrganismi capaci di crescere in presenza di nicotina. Prelievi dagli ultimi arricchimenti sono stati piastrati su terreni MI ed M2 agarizzati (1,5# agar) e su Piate Count Agar (PCA) della Difco; le colonie che crescevano più vigorosamente sono state ristrisciate per diverse volte fino a colonie pure e saggiate successivamente per la degradazione della nicotina. I microrganismi presenti sono stati suddivisi in tre gruppi: (1) quelli che hanno dimostrato la maggior capacità di crescita su MI, M2 e PCA; (2) quelli capaci di crescere su MI e PCA; (3) quelli capaci di crescere soltanto su PCA. Per quanto rigurda i microrganismi del gruppo 1 e 2, quello che è risultato crescere più attivamente su M2, è stato depositato presso la BCCM con codice di accesso.

L'identificazione della specie è stata effettuata secondo le caratteristiche morfologiche e biochimiche dettate da Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Voi. 2, pag. 1288-1301 (1986), Williams & Wilkins, classificazione che colloca tale microrganismo come Arthrobacter spp.

11 microrganismo è stato sottoposto a trattamenti miranti a modificare le caratteristiche di degradazione della nicotina in mezzi estremi.

La crescita del microrganismo è stata effettuata tra temperature comprese tra 20“C e 40oC sottoponendo la coltura ad agitazione e facendo variare il pH tra 5 e 9■ Ciò ha permesso di determinare i valori ideali di queste grandezze.

Successivi trattamenti chimico-fisici e di selezione sulla specie si sono operati al fine di migliorare la capacità ossidativa sulla nicotina. La valutazione delle migliori capacità degradative della nicotina da parte dei mutanti è stata verificata in mezzi solidi, in soluzioni e/o sospensioni acquose con differenti caratteristiche.

A dimostrazione della selezione operata sulla stessa specie, riguardante l'attività di denicotinizzazione rispetto alla tipologia del mezzo ed in funzione dello stato fisiologico del microrganismo, si riportano una serie di esempi a carattere non limitativo che riguardano le proprietà del microrganismo Arthrobacter spp in scala di laboratorio.

ESEMPIO 1

In tabella 1 si riporta l'attività di crescita e di denicotinizzazione del ceppo siglato BCCH N. nel mezzo di crescita (MI) con concentrazioni di nicotina diverse. Tale ceppo è cresciuto in beute contenenti 500 mi di mezzo MI a cui si addizionano quantità diverse di nicotina.

Il ceppo trasferito da un agar slant di mantenimento è rivitalizzato in YT medium (Triptone 8g/l, Estratto di lievito 5g/l, Sodio Cloruro 2,5 g/1) ed inoculato in 500 mi di brodo MI addizionato con quantità crescenti di nicotina. Durante il periodo di incubazione la temperatura è mantenuta intorno ai 30°C e l’agitazione a circa lOOrpm.

ESEMPIO 2

In tabella 2 e 3 sono riportati andamenti di crescita e di denicotinizzazione microbica in un mezzo (M3) contenente una sospensione acquosa derivante dal sistema non biologico per la riduzione del contenuto di nicotina in solidi e/o fanghi di origine vegetale come riferito all'esempio 4 del brevetto parallelo della stessa depositante depositato con il titolo "Denicotinizzazione di residui solidi polvirulenti e/o di fanghi"; la soluzione acquosa viene addizionata di sali minerali e di piccole quantità di fonte azotata (M3) pari alla concentrazione presente in MI. Nella tabella 2 si riportano i valori riguardanti il ceppo BCCM N . . inoculato come nell'esempio 1. I dati della tabella 3 sono riferiti ad un mutante selezionato, mantenuto e cresciuto su un mezzo simile a quello della crescita (M3); tale ceppo è posto nelle stesse condizioni colturali del ceppo BCCM N. ; la riduzione del contenuto di nicotina operata dal mutante si esplica da concentrazioni maggiori rispetto al ceppo originale.

ESEMPIO 3

Le tabelle 4 e 5 si riferiscono ad un mezzo costituito dalla stessa sospensione acquosa dell'esempio precedente in cui il contenuto in nicotina viene regolato con acqua deionizzata senza aggiunta di sali minerali e/o fonti azotate (M4); il carico organico della soluzione acquosa valutato come C.O.D. dall'inizio alla fine del processo degradativo di massima efficienza si mantiene in un intervallo compreso tra 500 e 20.000. I dati riportati in tabella 4 sono riferiti al ceppo BCCM N.

nelle stesse condizioni colturali degli esempi 1 e 2, mentre quelle della tabella 5 sono riferiti ad un mutante selezionato e mantenuto su questa stessa tipologia di brodi colturali; la crescita di questo microrganismo è stata impostata nelle stesse condizioni degli esempi 1 e 2.

ESEMPIO 4

11 ceppo BCCM N. è stato fatto crescere sul mezzo MI a cui è stata addizionata la nicotina in quantità di 0,2 mg/ml. Posto ad incubare come nell'esempio 5. si è proceduto alla separazione della biomassa mediante centrifugazione (Haereus Cryofuge 20-3) a 10000 rpm per 10 minuti. Il solido precipitato è stato lavato due volte in 50 mM di Tris-HCl {pH 6,85) e sottoposto a rottura mediante Bead Beater (Biospe Products) con bilie da 0,1 mm di diametro. Il liquido, invece, è stato filtrato con filtri Sartorius da 0,2 micron e sottoposto ad analisi per il contenuto di nicotina residua, il cui valore è risultato essere intorno a 96 ppm. I campioni cosi preparati sono stati utilizzati per la valutazione della capacità degradativa della nicotina presente in residui solidi derivati dalla lavorazione del tabacco come riferito in tabella 1 del brevetto parallelo della stessa depositante depositato con il titolo "Denicotinizzazione di residui solidi polverulenti e/o fanghi". L'esperimento è stato condotto pesando esattamente 0,500 g. di residuo solido, setacciato con vaglio da 500 micron, in tre diverse porzioni; a ciascuno di essi sono stati aggiunti 2 mi rispettivamente di liquido filtrato, estratto cellulare omogeneizzato e acqua deionizzata come controllo. Queste sospensioni, sigillate, sono state mantenute per 10 ore a temperatura ambiente in leggera agitazione. La successiva determinazione del contenuto di nicotina ha dato i seguenti valori: 14,14 mg/g per il controllo con acqua deionizzata, 12 mg/g per la sospensione con liquido di coltura centrifugato e filtrato, 13.56 mg/g per il campione solido addizionato agli estratti cellulari.

ESEMPIO 5

In questa prova l’attività ossidativa sulla nicotina è stata saggiata valutando la reazione tra il reagente di Tillmans e gli estratti acellulari del microrganismo preparati mediante sonicazione pulsante per 1 minuto {Sonifler B15 - Branson) e successiva centrifugazione per 10 minuti a 13000 rpm (Eppendorf 54150 ) di un'aliquota coltura con densità cellulare > 10° cfu/ml. La cinetica viene seguita spettrofotometricamente misurando la riduzione nel tempo della densità ottica a 578 mm di una soluzione tamponata del reagente di Tilmans con addizionati gli estratti acellulari del microrganismo. La Figura 1 rappresenta l'andamento della cinetica di un microrganismo di controllo costituito da Eschevichia coli DH5a (Promega) in cui non si verifica attività dopo l'aggiunta dell'induttore nicotina (A), mentre attività viene rilevata quando allo stesso controllo si addiziona un'aliquota di estratto acellulare purificato di un mutante del ceppo BCCM N.

TABELLA 1

TABELLA 4

n.d.: non determinabile perchè al di sotto della soglia minima di rilevamento analitico ufc: unità formanti colonie

ppm: parti per milione

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la riduzione del contenuto di nicotina in substrati solidi o liquidi mediante l'azione diretta od indiretta di microrganismi caratterizzato dal fatto che il substrato viene sottoposto all'azione del microrganismo Arthrobacter spp indicato con il BCCM N. e/o dei suoi estratti acellulari.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto substrato è un estratto acquoso di residui vegetali prodotti durante la lavorazione del tabacco, in particolare prodotti mediante percolazione con soluzione acquosa di materiali solidi poivirulenti e/o di fanghi classificati quali "tossici e nocivi" per la presenza di alte concentrazioni di nicotina dalle normative di leggi vigenti (N" 67/548 CEE, N“ 81/957 CEE, N° 83/467 CEE, Leggi italiane quali D.P.R. N“ 915/82, Decreto appi. Comitato interministeriale 27.7*1984 e Decreto Ministeriale 3*12.85).
3* Procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzate dal fatto che il pH iniziale dell'estratto acquoso è compreso tra 5 e 9 e preferibilmente tra 6,5 e 7.5*
4. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che la temperatura dell'estratto acquoso è compresa tra 20"C e 40’C e preferibilmente tra 28“C e 37°C.
5* Procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che l’estratto acquoso, durante il processo, viene costantemente aerato e/o mantenuto in agitazione.
6. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che l'estratto acquoso inoculato con i microrganismi, dopo un tempo necessario per la massima crescita e denicotinizzazione, viene applicato ai residui solidi di lavorazione del tabacco tali e quali e/o dopo il loro trattamento di denicotinizzazione per percolazione con soluzione acquosa di materiali solidi polverulenti e/o di fanghi contenenti alte concentrazioni di nicotina (esempi 3 e 4).
7. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che i fanghi che si formano per decantazione con l'applicazione del processo vengono messi a contatto con i residui vegetali tal quali prodotti durante la lavorazione del tabacco o trattati come da brevetto parallelo della stessa depositante depositato con il titolo "Denicotinizzazione di residui solidi polverulenti e/o fanghi".