ITMI20131410A1 - Composti e composizioni per l'uso nella inibizione dell' interazione lbc-rhoa - Google Patents
Composti e composizioni per l'uso nella inibizione dell' interazione lbc-rhoaInfo
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-
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-
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-
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Description
Barzanò & Zanardo
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“Composti e composizioni per l’uso nella inibizione dell’interazione Lbc-RhoA”
------
La presente invenzione si riferisce a composti di 5 formula (III) e/o loro sali e/o loro derivati, od a composti di formula (IV) e/o loro sali e/o loro derivati, per l’uso nella inibizione dell’interazione Lbc-RhoA ed alle composizioni farmaceutiche comprendenti gli stessi:
<R>2 R1
R7
N N O
R10<O>R3N N
O R
R1
6O OH O
10 R5R4 R9<R>8
(III) (IV)
La presente invenzione si riferisce anche a composti di formula (III) e/o loro sali e/o loro derivati, od a composti di formula (IV) e/o loro sali 15 e/o loro derivati, per l’uso nel trattamento del cancro ed alle composizioni farmaceutiche comprendenti gli stessi.
Breve descrizione dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce a composti di 20 formula (III) e/o loro sali e/o loro derivati, od a composti di formula (IV) e/o loro sali e/o loro derivati, per l’uso nella inibizione dell’interazione Lbc-RhoA ed alle composizioni farmaceutiche comprendenti gli stessi:
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<R>2 R1
R7
N N
R10<O>R3
O
R6
R5R4 R9<R>8
(III)
La presente invenzione si riferisce anche a composti di formula (III) e/o loro sali e/o loro 5 derivati, od a composti di formula (IV) e/o loro sali e/o loro derivati, per l’uso nel trattamento del cancro ed alle composizioni farmaceutiche comprendenti gli stessi.
Stato dell’arte
10 Le proteine Rho (Ras homolog) comprendono la famiglia principale della superfamiglia Ras di GTPasi piccole (rif. 1). Esse funzionano come interruttori bimolecolari adottando diversi stati conformazionali in risposta alla interazione con GDP o con GTP.
15 Diversamente dallo stato Rho-GDP, quello Rho-GTP trasduce attivamente i segnali interagendo con effettori a valle, che mediano una gamma di diverse funzioni cellulari tra le quali la progressione del ciclo cellulare e la trascrizione genica, l’adesione e 20 la migrazione, la fagocitosi, la citochinesi, l’estensione e retrazione dei neuriti, la morfogenesi e polarizzazione cellulare, la crescita e sopravvivenza cellulare (rif. 2). La ciclicità tra gli stati di interazione con GDP e con GTP è controllata
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principalmente da due classi di molecole regolatrici: le proteine attivanti le GTPasi (GAP), che aumentano la relativamente lenta attività GTPasica intrinseca delle proteine Rho, ed i fattori di scambio del nucleotide 5 guaninico (GEF), che catalizzano lo scambio di GDP con GTP in vivo. Le GAP sopprimono l’attività delle Rho, mentre i GEF promuovono l’attività delle Rho.
La maggior parte dei RhoGEF, 69 membri distinti, condividono un dominio catalitico omologo a quello 10 della oncoproteina Dbl (dominio DH, Figura 1) (rif. 3).
È ormai noto che i GEF della famiglia Dbl non sono gli unici attivatori delle Rho GTPasi. Il numero di nuove molecole che agiscono da GEF, come i membri delle famiglie Dock e SWAP, è in crescita e, forse, verranno 15 trovate altre classi di RhoGEF (rif. 3). Nella maggior parte dei GEF della famiglia Dbl, il dominio DH è posizionato immediatamente N-terminale ad una dominio di omologia della plecstrina (PH) (Figura 1A e 1B). Sono state determinate le strutture dei domini tandem 20 PH/DH di diversi RhoGEF, sia nello stato isolato che in complesso con le loro GTPasi substrato (depositati nella Banca Dati di Proteine (http://www.rcsb.org)).
La ricchezza di dati strutturali ha consentito avanzamenti nella comprensione dei meccanismi 25 molecolari utilizzati dai GEF della famiglia Dbl per promuovere lo scambio di GDP con GTP. È stato ipotizzato che lo facciano ruotando su se stesse le regioni di scambio (switch) delle GTPasi al fine di rilasciare GDP e Mg<2+>(rif. 4). I dati strutturali 30 consentono anche una comprensione, seppure preliminare, di come i domini DH mostrino una rilevante selettività tra le varie proteine Rho. Sorprendentemente, il RhoGEF
FIN/136560 Barzanò & Zanardo
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associato alla Leucemia (Leukemia-associated RhoGEF (LARG)) ed i suoi stretti omologhi, la proteina Lbc di ancoraggio della chinasi-A (A-kinase anchoring protein-Lbc (AKAP-Lbc)), il RhoGEF-PDZ (PDZ) e il RhoGEF-p115 5 (p115), sono RhoGEF RhoA-selettivi direttamente regolati dalle proteine Gα12/13attivate (ovvero solo da Gα12nel caso di AKAP-Lbc) e si suggerisce che svolgano un ruolo nella trasformazione oncogenica indotta dai recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) (rif. 5-9).
10 Le evidenze raccolte nel corso dell’ultimo decennio hanno chiaramente stabilito che le Rho GTPasi svolgono un ruolo importante in molti aspetti dello sviluppo del cancro e della progressione tumorale (rif.
10-11). Pertanto, l’inibizione dell’attivazione di 15 singole Rho GTPasi mediante i loro specifici GEF potrebbe rappresentare una strategia promettente per inibire la segnalazione mediata da Rho nelle cellule tumorali. In questo particolare contesto, alcuni anni fa è stata scoperta la funzione oncogenica del RhoGEF 20 AKAP-Lbc, di seguito denominato Lbc (rif. 12). Più tardi, diverse evidenze hanno fatto nuova luce sul potenziale ruolo di Lbc nel processo di sviluppo dei tumori (rif. 13-20).
L’obiettivo principale della presente invenzione è 25 quello di sopprimere i segnali oncogenici promossi da Lbc mediante piccole molecole che possano inibire in modo specifico la capacità di Lbc di legare e attivare RhoA. Questo è stato ottenuto mediante lo screening virtuale high-throughput (HTVS) di librerie di composti 30 accoppiato ad analisi esperte di interazione ligandoproteina. Quattro degli articoli riguardanti HTVS su piccole proteine G oppure, in un solo caso, sul RhoGEF
FIN/136560 Barzanò & Zanardo
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LARG sono stati pubblicati nel corso degli ultimi due anni, sostenendo la validità della presente strategia (rif. 21-24). Pertanto, la nostra invenzione consiste in piccole molecole in grado di competere con RhoA 5 nell’interazione con Lbc (cioè inibitori di interazione proteina-proteina (PPI)). Poiché non è ancora disponibile alcuna struttura cristallografica per Lbc, in questo studio è stato predetto un modello strutturale del complesso Lbc-RhoA sulla base della 10 significativa similarità di sequenza con il sistema LARG-RhoA. La combinazione di analisi strutturale e di mutagenesi per scansione ad alanina in vitro, nonché i saggi per rilevare l’esistenza e funzionalità della interazione proteina-proteina, ha rivelato una regione 15 circoscritta di Lbc come responsabile del riconoscimento e/o dell’attivazione di RhoA (Figure 1A e 1B). Data l’abbondanza di residui carichi positivamente in questa regione, abbiamo impostato una libreria di composti carichi negativamente per HTVS 20 diretti contro la regione target di Lbc. Le analisi specialistiche delle modalità di docking hanno condotto ad un composto (composto guida) e a sei analoghi che sono in grado di inibire significativamente l’interazione Lbc-RhoA in lisati cellulari. Il composto 25 guida è inoltre stato trovato essere in grado di inibire significativamente l’attivazione di RhoA indotta da Lbc in cellule intatte, la formazione promossa da Lbc di fibre di stress di actina nei fibroblasti, la trasformazione indotta da Lbc di 30 cellule NIH-3T3 e la migrazione delle cellule di cancro della prostata. Collettivamente, siamo riusciti a definire uno scheletro chimico in grado di ridurre
FIN/136560 Barzanò & Zanardo
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efficacemente le proprietà oncogeniche di Lbc.
Breve descrizione delle figure
Figura 1 – Struttura predetta di Lbc: identificazione di una regione chiave per l’attivazione 5 di RhoA, che è stata utilizzata come target nello screening dei composti.
Figura 2 - Composti sottomessi ai test in vitro dopo lo screening virtuale su 850.000 composti carichi negativamente provenienti dalla banca dati ZINC.
10 Figura 3 – I composti A13 e A21 inibiscono l’interazione Lbc-RhoA.
Figura 4 – Strutture e attività di A13 e dei suoi analoghi stretti A31-A50.
Figura 5 – A13 e A21 mostrano modalità sovrapposte 15 di interazione con il dominio DH di Lbc.
Figura 6 - Curve dose-risposta per determinare la concentrazione massima di A13 in grado di inibire al cinquanta percento l’interazione Lbc-RhoA e l’attivazione di RhoA indotta da Lbc in cellule 20 intatte.
Figura 7 – Effetti del composto A13 sull’interazione di RhoA con LARG, PDZ e p115.
Figura 8 - Inibizione della capacità di Lbc di indurre la formazione di fibre di stress e la 25 trasformazione cellulare in fibroblasti NIH-3T3 utilizzando il composto A13.
Figura 9 – A13 blocca la migrazione delle cellule del cancro della prostata.
Figura 10 - Allineamento di sequenza tra Lbc e 30 LARG utilizzato per la modellizzazione (modeling) comparativa di Lbc.
Figura 11 - Capacità di legare RhoA dei mutanti
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del dominio DH di Lbc.
Figura 12 - Capacità di attivare RhoA dei mutanti del dominio DH di Lbc.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
5 Le predizioni della struttura del complesso Lbc-RhoA sono state guidate dalla mutagenesi per scansione ad alanina al fine di identificare gli amminoacidi di Lbc responsabili del riconoscimento e dell’attivazione di RhoA. La mutagenesi in vitro ha interessato 33 10 amminoacidi che costituiscono l’86% della superficie del DH nascosta da RhoA. In linea con la predizione mediante modeling computazionale, i dodici amminoacidi risultati essere rilevanti per il riconoscimento e/o l’attivazione di RhoA da parte di Lbc si concentrano in 15 una regione circoscritta che rappresenta il 38% della superficie del DH nascosta da RhoA (Figure 1A e 1B).
Tale regione, la quale interagisce essenzialmente con l’inter-switch di RhoA (Figura 1C), è stata utilizzata come target di esperimenti di high-20 throughput docking (cioè mediante il programma di docking: AutoDock Vina) con lo scopo di individuare piccole molecole selettive in grado di competere con RhoA nell’interagire con Lbc. Lo screening virtuale è stato condotto su 850.000 composti carichi 25 negativamente provenienti dalla banca dati ZINC (http://zinc.docking.org). I composti anionici sono stati privilegiati rispetto a quelli neutri e cationici a causa delle caratteristiche elettrostatiche della superficie target, che è essenzialmente carica 30 positivamente. Il filtraggio delle soluzioni di docking si è basato su una combinazione di punteggio di docking, numero di contatti con gli amminoacidi
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importanti per il legame (binding) e l’attivazione di RhoA, così come sulle analisi esperte visive delle modalità di docking. Queste ultime hanno preso in considerazione anche l’affidabilità della conformazione 5 e dell’orientamento delle nove migliori pose di docking ottenute per ciascun ligando. Prima del filtraggio, la ridondanza dei composti è stata minimizzata raggruppandoli per similarità (cioè mediante il programma SUBSET (http://cactus.nci.nih.gov/subset/)) 10 previa trasformazione degli stessi in stringhe di bit.
Un indice di Tanimoto pari a 0,97 è stato scelto come cutoff di similarità per il raggruppamento. Pertanto, un set ridotto costituito dai composti rappresentativi di ciascun gruppo di simili è stato sottoposto al 15 filtraggio basato su descrittori. Quest’ultimo ha preso in considerazione il punteggio di docking sia da solo che in combinazione con un descrittore di forma/dimensione definito ad hoc, come ad esempio il numero di contatti target-ligando all’interno di un 20 cutoff ≤4,5 Å. Così, 655 composti hanno superato uno dei filtri in quanto caratterizzati da un punteggio di docking ≤-9 kcal/mole. Le analisi esperte visive finali di tali composti, che hanno privilegiato i composti contenenti un acido carbossilico e/o una sulfammide, 25 hanno condotto alla selezione di trenta composti per il saggio in vitro (vedi Figura 2).
Detti trenta composti sono strutturalmente differenti, con l’eccezione dei composti A07 e A10, selezionati per il loro punteggio di docking e, in 30 misura minore, di A13 e A29, che condividono un frammento comune (vedi Figura 2). Esperimenti di GST-pulldown su lisati cellulari hanno dimostrato la
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capacità dei composti di inibire l’interazione tra Lbc e RhoA. Estratti di cellule HEK-293 che sovra-esprimono Lbc Flag-taggato sono stati incubati con RhoA GST-taggata purificata in assenza o presenza di 100 µM dei 5 composti selezionati. Un composto, A13, è risultato capace di inibire per oltre il 90% l’interazione di Lbc con GST-RhoA (Figure 2 e 3).
Composto A13 - struttura di formula (I)
Nome IUPAC di A13 4-[(4Z)-3-metil-5-osso-4-[[5-[3-10 (trifluorometil)fenil]furan-2-il]metilidene]pirazol-1-il]benzoato
HOOC
N N
<O>CH3
O
F3C
(I)
Inoltre, A21 ha mostrato il 46% di inibizione.
15 Nessun binding è stato osservato con GST da solo (Figure 2 e 3).
Composto A21 - struttura di formula (II) Nome IUPAC di A21: 2-[5-[(E)-(1-naftalen-1-il-2-ossido-4,6-diossopirimidin-5-iliden)metil]furan-2-20 il]benzoato
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O
N N
COOH
O OH
O
(II)
Nella posa di docking predetta, sia l’acido benzoico che l’anello pirazolico del composto A13 5 avente la formula di struttura (I) interagiscono con l’hotspot K2152, essendo il carbossilato in R2 coinvolto anche in un legame a ponte d’idrogeno con T2151 (vedere le formule strutturali in Figura 4). L’altro anello fenilico si inserisce in una cavità 10 formata da T2005, R2011, R2135, L2137, C2142 e L2145;
quest’ultimo interagisce con il gruppo CF3(Figura 1B). Per quanto riguarda il composto parzialmente attivo A21, avente la formula di struttura (II), esso possiede una modalità di docking che si sovrappone ad A13 15 (Figura 5). In particolare, a) l’anello furanico si sovrappone all’anello pirazolico di A13; b) l’anello fenilico dell’acido benzoico si sovrappone all’anello fenilico dell’acido benzoico di A13, essendo il carbossilato coinvolto in un ponte salino con K2152 che 20 a sua volta è coinvolto anche in un legame a ponte di idrogeno con l’atomo di ossigeno furilico; c) l’anello pirimidinilidenico si sovrappone parzialmente all’anello furanico di A13; e d) infine, la porzione naftalenica si inserisce nella stessa cavità 25 riconosciuta dal fenile trifluorometil-sostituito di
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A13 (Figura 5).
L’efficacia di A13 nell’inibire l’interazione tra Lbc e RhoA nonché la capacità di Lbc di attivare RhoA in cellule intatte, è stata valutata per un intervallo 5 di concentrazione da 1 pM a 100 µM, utilizzando saggi di cattura GST-pulldown e Rhotekin, rispettivamente (Figura 6). Il binding Lbc-RhoA è inibito ad una IC50 di 3,6 µM (Figura 6A, pannello superiore e Figura 6B), mentre la formazione RhoA-GTP indotta da Lbc è inibita 10 ad una IC50 di 2,3 µM (Figura 6C, pannello superiore e Figura 6D). Questi risultati indicano che A13 può attraversare la barriera della membrana plasmatica per inibire efficacemente Lbc all’interno delle cellule.
La selettività del composto A13 nell’inibire 15 l’interazione tra RhoA ed i membri della sottofamiglia Lbc di RhoGEF è stata valutata mediante saggi GST-pulldown. Estratti di cellule HEK-293 che sovraesprimono Lbc, LARG, PDZ e p115 Flag-taggati sono stati incubati con RhoA purificata GST-taggata in assenza o 20 in presenza di A13 100 µM. Oltre al complesso RhoA-Lbc, il composto è risultato capace di inibire anche l’interazione di RhoA con LARG e PDZ a valori di IC50 di 4,2 µM e 11,4 µM, rispettivamente (Figura 7A e B). Al contrario, A13 non influenza il binding tra RhoA e 25 p115 (Figura 7A e B). I confronti delle strutture di Lbc, LARG (PDB ID: 1XTD e 1X86), PDZ (1XCG e 3KZ1) e P115 (3ODO) rivelano divergenze significative nel loop α4/β5 tra il P115 e gli altri tre GEF. Secondo la posa di docking predetta, questa porzione di Lbc riconosce 30 la funzione tri-fluoro-metilica di A13. Pertanto, la conformazione del loop α4/β5 in P115 ridurrebbe il sito di binding di A13, il che spiegherebbe in parte perché
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il composto non agisce da PPI per l’interazione p115-RhoA.
Per indagare se A13 possa inibire le risposte cellulari promosse dalla via Lbc-RhoA, è stato 5 inizialmente misurato l’effetto del trattamento con A13 sulla capacità di Lbc di indurre la formazione di fibre di stress di actina nei fibroblasti NIH3T3. Fibroblasti a digiuno di siero che esprimono GFP o Lbc GFP-taggato sono stati incubati per 24 ore in assenza o in presenza 10 di A13 100 µM. Le fibre di actina sono state visualizzate mediante colorazione delle cellule con falloidina coniugata con rosso-Texas. Come precedentemente indicato (rif. 25), Lbc-GFP promuove la formazione di fibre di stress di actina nei fibroblasti 15 (Figura 8A). Risultato interessante, il trattamento con A13 abolisce completamente questi effetti confermando il dato che esso può efficacemente inibire la capacità di Lbc di indurre la riorganizzazione del citoscheletro di actina.
20 Numerose evidenze indicano che Lbc induce la trasformazione cellulare e che questo effetto richiede l’attivazione di RhoA. Sulla base di questi dati si è ulteriormente determinato se A13 possa inibire la trasformazione dei fibroblasti NIH-3T3 indotta dalla 25 sovra-espressione di Lbc Flag-taggato. I fibroblasti sono stati incubati per 14 giorni con l’1% di siero in assenza o in presenza di A13 10 µM. La trasformazione cellulare è stata visualizzata valutando quantitativamente la comparsa di foci. Come mostrato 30 nella Figura 8B, il trattamento di cellule che sovraesprimono Lbc con A13 riduce del 70% il loro potenziale di formazione di foci. Ciò suggerisce che questo
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composto, interferendo con l’interazione tra Lbc e RhoA, può efficacemente ridurre le proprietà oncogeniche di Lbc. Infine, la capacità del composto A13 di bloccare la migrazione delle cellule è stata 5 determinata mediante scratch test (Figura 9). Dato interessante, A13 inibisce la migrazione delle cellule del cancro della prostata a 10 µM (Figura 9), confermando così il suo potenziale anti-cancro.
Per migliorare la IC50 e la selettività di A13 e 10 per suggerire relazioni struttura-attività (Structure-Activity Relationships (SAR)), è stata determinata anche la capacità di 20 analoghi stretti di A13 disponibili in commercio di inibire l’interazione Lbc-RhoA in vitro (Figura 4). Le strutture di detti 15 composti, cioè dei composto da A31 a A50, sono mostrate nella Figura 4 insieme ai loro effetti sul binding Lbc-RhoA.
Va sottolineato che la selezione dei composti tra quelli disponibili in commercio è stata dettata dalla 20 necessità di compiere un’analisi SAR significativa. La disponibilità commerciale, tuttavia, ha rappresentato un limite significativo alla scelta.
Quasi tutti i composti selezionati eccetto A31, A34 e A41 (che condividono un sostituente ingombrante 25 in R4), così come i composti A49 e A50 (privi del carbossilato in R1o R2), sono in grado di inibire il binding Lbc-RhoA di ≥ 45% (Figura 4). Tra questi, sei composti, A33, A38, A40, A43, A45 e A46, sono risultati capaci di inibire il binding Lbc-RhoA di ≥ 75% (Figura 30 4). Questi composti sono stati, quindi, sottoposti a determinazioni di IC50 in lisati cellulari, risultando possedere IC50 nel basso intervallo micromolare (Figura
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4).
I sei composti sono stati anche testati per la loro capacità di inibire l’interazione tra RhoA e gli altri tre RhoGEF: LARG, PDZ e p115. Essi hanno mostrato 5 un comportamento simile a quello di A13, nel senso che riescono a inibire il binding di RhoA con LARG e PDZ ma non con p115 (vedere Figura 4).
L’analisi SAR sottolinea chiaramente l’importanza del gruppo carbossilato in posizione R1o, meglio, in 10 posizione R2per l’attività di PPI. In altre parole, i composti di formula III devono possedere un gruppo carbossilato in R1oppure in R2per esercitare una significativa inibizione dell’interazione Lbc-RhoA. Un gruppo sulfonammidico in R2è atteso mimare in parte il 15 gruppo carbossilato, assumendo che la vicinanza di K2152 lo renda deprotonato, cioè carico negativamente. La sostituzione con SO2NH2del COO- in R2inibisce il binding Lbc-RhoA solo del 50% (Figura 4). Per quanto riguarda la posizione R3, l’analisi SAR è poco 20 informativa dal momento che i più interessanti analoghi disponibili in commercio non possiedono sostituenti diversi da -CF3o -CH3. Tuttavia, l’analisi della modalità di docking predetta per A13 suggerisce che, in R3, una alchil-ammide (ad esempio –(CH2)2CONH2, -25 (CH2)3CONH2)), oppure un’alchil-ammina protonata (ad esempio –(CH2)3NH3<+>)) oppure un’alchil-guanidina protonata (ad esempio -(CH2)3NHC(NH2)2<+>) può contribuire a migliorare IC50 e/o selettività. I sostituenti ingombranti in R4sembrano non essere tollerati 30 probabilmente sia a causa delle repulsioni steriche con Lbc che a causa di una riduzione dei gradi di libertà rotazionali dell’anello fenilico sostituito in orto (in
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R4). Infatti, i sostituenti idrogeno o fluoro sono preferiti rispetto a metile, nitro o bromo (Figura 4). Tra le sostituzioni testate in R5, sono preferiti i gruppi debolmente polari e lipofili (ad esempio -CF3, -5 COOC2H5, -COOCH3) rispetto a quelli polari o carichi (ad esempio -NO2e -COO-). Per quanto riguarda il sostituente R6, l’informazione principale che emerge dall’analisi SAR è che, quando R4e R5non sono sostituiti (cioè contengono un atomo di idrogeno), un 10 gruppo carico negativamente (ad esempio un carbossilato) favorisce l’attività da PPI più dei sostituenti neutri e lipofili (ad esempio –CH3, -COOCH(CH3)2, -Cl). In sintesi, affinchè i composti di formula III siano efficaci come inibitori 15 dell’interazione Lbc-RhoA, devono essere soddisfatti i seguenti requisiti strutturali: a) presenza di un gruppo carbossilato in R1oppure in R2; b) presenza di un idrogeno o al massimo di un fluoro in R4; e c) presenza di un gruppo idrofobico ed ingombrante in R5.
20 Infine, stabilire se la presenza di un carbossilato in R6sia di vero aiuto richiederebbe un’analisi SAR più estesa. Nella Figura 4, i sostituenti R7-R10sono stati inclusi in quanto essi sono attualmente il target degli esperimenti di ottimizzazione del composto guida basati 25 sulla struttura del complesso predetto. A questo proposito, la modalità di docking predetta tra A13 e Lbc suggerisce che sarebbe opportuno testare i seguenti sostituenti: a) un carbossilato in R7come alternativa al carbossilato in R1oppure in R2; b) un carbossilato 30 (ad esempio -(CH2)2COO-, oppure -(CH2)3-COO-)) in R8oppure in R9, meglio in R8; c) un carbossilato (ad esempio -(CH2)2COO-, oppure -(CH2)3-COO-)) in R10in
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alternativa al carbossilato in R6.
Per quanto riguarda la selettività verso Lbc, tenendo conto di: a) le variazioni di sequenza nel predetto sito di binding tra Lbc e gli altri tre GEF; 5 b) la predetta modalità di docking di A13; e c) le analisi SAR, è consigliabile provare sostituzioni alternative in R3, R8e R10in combinazione con le sostituzioni favorevoli già emerse dall’analisi SAR.
Sono oggetto della presente invenzione i composti 10 di formula generale (III) e/o loro sali e/o loro derivati per l’uso nella inibizione dell’interazione Lbc-RhoA:
<R>2 R1
R7
N N
R10<O>R3
O
R6
R5R4 R9<R>8
(III)
15 dove:
R1viene scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH e -SO2NH2; preferibilmente R1è -H quando R2è -COOH oppure R1è -COOH quando R2è -H;
R2viene scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH 20 e -SO2NH2; preferibilmente R2è -H quando R1è -COOH oppure R2è -COOH quando R1è -H;
R3viene scelto nel gruppo costituito da C1-C4alchile, C1-C4alchile alogenato, C2-C4alchilammidi (preferibilmente alchilammidi primarie), C3-C4
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alchilammine (preferibilmente alchilammine primarie) e C2-C3alchilguanidine; preferibilmente R3è C1-C4alchile oppure C1-C4alchile alogenato e, più preferibilmente, R3è -CH3oppure -CF3;
5 R4è scelto nel gruppo costituito da -H, C1-C4alchile, C1-C4alchile alogenato, alogeno e -NO2; preferibilmente R4è -H oppure -F;
R5è scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH, -SO2NH2, alogeno, -CF3e -COOR, dove R è -CH3, -C2H510 oppure C1-C4alchile; preferibilmente R5è -H, -COOCH3, -COOC2H5oppure -CF3;
R6è scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH, alogeno, C1-C4alchile, C1-C4alchil etere, -SO2NH2e -COOR, dove R è -CH3, -C2H5oppure C1-C4alchile; 15 preferibilmente R6è -H, -COOH oppure Cl;
R7è H, -COOH oppure -SO2NH2, preferibilmente, R7è H quando R1o R2è -COOH oppure R7è -COOH quando R1e R2sono entrambi H;
R8e R9possono essere H oppure -(CH2)n-COOH, dove 20 n varia da 1 a 3, preferibilmente R8e R9non sono simultaneamente sostituenti che contengono un carbossilato;
R10è -COOH oppure -CH2-COOH.
Secondo particolari forme di realizzazione della 25 presente invenzione, i composti A13 e i suoi analoghi denominati A33, A38, A40, A43, A45 e A46 e e/o i loro sali e/o i loro derivati sono composti particolarmente preferiti per l’uso nella inibizione della interazione Lbc-RhoA. Con riferimento alla formula generale (III), 30 i significati di R1-R10per detti composti preferiti sono:
composto A13: R1è H; R2è COOH; R3è CH3; R4è H;
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R5è CF3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H;
composto A33: R1è H; R2è COOH; R3è CF3; R4è H; R5è H; R6è COOH; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H;
composto A38: R1è H; R2è COOH; R3è CH3; R4è H; 5 R5è COOC2H5; R6è Cl; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H;
composto A40: R1è H; R2è COOH; R3è CF3; R4è H; R5è COOCH3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; composto A43: R1è H; R2è COOH; R3è CH3; R4è F; R5è H; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H;
10 composto A45: R1è COOH; R2è H; R3è CH3; R4è H;
R5è CF3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H;
composto A46: R1è COOH; R2è H; R3è CH3; R4è H; R5è COOCH3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H.
Sono oggetto della presente invenzione le 15 composizioni farmaceutiche comprendenti i composti di formula generale (III) e/o loro sali e/o loro derivati, in particolare i composti denominati A13 e i suoi analoghi denominati A33, A38, A40, A43, A45 e A46, per l’uso nella inibizione dell’interazione Lbc-RhoA.
20 Sono oggetto della presente invenzione i composti di formula generale (III) e/o loro sali e/o loro derivati, in particolare i composti A13 e i suoi analoghi denominati A33, A38, A40, A43, A45 e A46, per l’uso nel trattamento del cancro.
25 Un altro oggetto della presente invenzione sono le composizioni farmaceutiche comprendenti i composti di formula generale (III) e/o loro sali e/o loro derivati, in particolare i composti denominati A13 e i suoi analoghi denominati A33, A38, A40, A43, A45 e A46, per 30 l’uso nel trattamento del cancro.
Oggetto della presente invenzione sono i composti di formula generale (IV) e/o loro sali e/o loro
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derivati, per l’uso nella inibizione dell’interazione Lbc-RhoA:
O
N N
R1O OH
O
(IV)
5 dove
R1viene scelto nel gruppo costituito da –COOH e acido C1-C4alchil carbossilico.
Composti secondo la formula (IV) particolarmente preferiti sono il composto A21, dove R1è –COOH, e i 10 suoi stretti analoghi.
Oggetto della presente invenzione sono le composizioni farmaceutiche comprendenti i composti di formula generale (IV) e/o loro sali e/o loro derivati, in particolare il composto denominato A21 e i suoi 15 analoghi, per l’uso nella inibizione dell’interazione Lbc-RhoA.
Sono oggetto della presente invenzione i composti di formula generale (IV) e/o loro sali e/o loro derivati, in particolare il composto denominato A21 e i 20 suoi stretti analoghi, per l’uso nel trattamento del cancro.
Altro oggetto della presente invenzione sono le composizioni farmaceutiche comprendenti i composti di formula generale (IV) e/o loro sali e/o loro derivati, 25 in particolare il composto denominato A21 e i suoi
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stretti analoghi, per l’uso nel trattamento del cancro.
Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione comprendono i composti sopra identificati di formula generale (III) o (IV) e sono per gli usi sopra 5 definiti. Essi possono essere sotto forma di sali e complessi farmaceuticamente accettabili e possono essere somministrati in un carrier farmaceuticamente accettabile e ad un dosaggio adeguato. Tali composizioni farmaceutiche possono essere preparate con 10 metodi e contengono carrier che sono ben noti nella tecnica. Un compendio generalmente riconosciuto di tali metodi ed ingredienti è Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, editor, 20<a>ed., Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, Pa., 15 2000. Un carrier, una composizione o un veicolo farmaceuticamente accettabili, come un filler liquido o solido, un diluente, un eccipiente o un materiale incapsulante un solvente, sono adibiti a portare o trasportare il composto in oggetto da un organo, o da 20 una parte del corpo, ad un altro organo, o ad un’altra parte del corpo. Ogni carrier deve essere accettabile, nel senso di essere compatibile con gli altri ingredienti della formulazione e non nocivo per il soggetto sottoposto al trattamento.
25 Esempi di materiali che possono servire come carrier farmaceuticamente accettabili comprendono gli zuccheri, come lattosio, glucosio e saccarosio; gli amidi, come amido di mais e amido di patate; la cellulosa e i suoi derivati, quali sodio 30 carbossimetilcellulosa, etilcellulosa e acetato di cellulosa; la gomma adragante in polvere; il malto; la gelatina; il talco; gli eccipienti, come burro di cacao
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e cere per supposte; gli olii, come olio di arachidi, olio di cotone, olio di cartamo, olio di sesamo, olio di oliva, olio di mais e olio di soia; i glicoli, come il glicole propilenico; i polioli, come glicerina, 5 sorbitolo, mannitolo e glicole polietilenico; gli esteri, come etil oleato ed etil laurato; l’agar; gli agenti tamponanti, quali idrossido di magnesio e idrossido di alluminio; l’acido alginico; l’acqua apirogena; la soluzione fisiologica isotonica; la 10 soluzione di Ringer; l’alcol etilico; le soluzioni a pH tamponato; i poliesteri, i policarbonati e/o le polianidridi; e altre sostanze compatibili non tossiche impiegate nelle formulazioni farmaceutiche. Possono anche essere presenti nelle composizioni agenti 15 umettanti, emulsionanti e lubrificanti, come sodio laurilsolfato e stearato di magnesio, così come agenti coloranti, agenti di rilascio, agenti di rivestimento, dolcificanti, aromatizzanti e profumanti, conservanti ed antiossidanti.
20 Le composizioni della presente invenzione possono essere somministrate per via parenterale (ad esempio, mediante iniezione endovenosa, intraperitoneale, sottocutanea o intramuscolare), per via topica (che comprende la via boccale e sublinguale), per via orale, 25 intranasale, intravaginale o rettale, a seconda delle pratiche mediche standard.
Il livello di dosaggio selezionato dipenderà da una varietà di fattori che includono l’attività del particolare composto della presente invenzione 30 impiegato, la via di somministrazione, il momento di somministrazione, la velocità di escrezione o metabolismo del particolare composto che viene
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impiegato, la durata del trattamento, altri farmaci, composti e/o materiali utilizzati in combinazione con il particolare composto impiegato, l’età, il sesso, il peso, lo stato di salute generale e la storia medica 5 precedente del paziente in trattamento e fattori simili ben noti nelle arti mediche.
Un medico o un veterinario aventi una esperienza ordinaria nella tecnica possono facilmente determinare e prescrivere la quantità efficace delle composizioni 10 farmaceutiche richiesta. Per esempio, il medico o il veterinario potrebbero iniziare con dosi di composto a livelli inferiori rispetto a quello richiesto per ottenere l’effetto terapeutico desiderato ed aumentare gradualmente il dosaggio fino al raggiungimento 15 dell’effetto desiderato. Questo è considerato essere entro l’abilità del tecnico e si può rivedere la letteratura esistente su un composto specifico o su composti simili per determinarne il dosaggio ottimale. Descrizione dettagliata delle figure
20 Figura 1 - Struttura predetta di Lbc:
identificazione di una regione chiave per l’attivazione di RhoA, che è stata utilizzata come target nello screening dei composti. A) Sono mostrate rappresentazioni “a cartoons” della struttura predetta 25 di Lbc. Le sfere centrate sui carboni Cα nel dominio DH indicano i 12 amminoacidi dei 33 testati che giocano un ruolo importante nel riconoscimento e/o nell’attivazione di RhoA. In dettaglio, il grigio scuro indica quegli amminoacidi la cui sostituzione con 30 alanina altera drasticamente sia il riconoscimento che l’attivazione di RhoA da parte di Lbc. D’altro canto, il grigio più chiaro indica quegli amminoacidi la cui
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sostituzione con alanina compromette moderatamente il riconoscimento e l’attivazione di RhoA o pregiudica significativamente solo l’attivazione di RhoA da parte di Lbc. B) La superficie molecolare del modello 5 strutturale di Lbc è mostrata nella stessa orientazione e colorazione utilizzati nel pannello sinistro. Viene anche mostrata la modalità di docking del composto A13 predetta, quest’ultimo rappresentato come bastoncini neri. C) È mostrata una rappresentazione “a cartoons” 10 del complesso predetto tra Lbc e RhoA. Viene mostrato solo il dominio DH di Lbc e sono etichettate solo le parti di tale dominio coinvolte nella interazione con RhoA. Le due proteine sono bianche. Le regioni su Lbc e RhoA più significativamente coinvolte nella interfaccia 15 sono, rispettivamente, grigia e nera.
Figura 2 - Composti inviati ai test in vitro dopo lo screening virtuale su 850.000 composti carichi negativamente provenienti dalla banca dati ZINC. Viene mostrato l’effetto di ciascun composto sul binding Lbc-20 RhoA insieme alla media ± S.E. di 3-8 esperimenti indipendenti. Si legga la legenda della Figura 3 per maggiori dettagli sugli esperimenti.
Figura 3 – I composti A13 e A21 inibiscono l’interazione Lbc-RhoA. Cellule HEK-293 che esprimono 25 Lbc Flag-taggato sono state mantenute a digiuno di siero per 24 ore e lisate. Gli estratti cellulari sono stati incubati con biglie di glutatione-sefarosio accoppiate a RhoA GST-taggata in presenza di DMSO 1% (controllo) o concentrazione 100 µM dei 30 composti 30 identificati mediante lo screening virtuale e mostrati nella Figura 2. I livelli relativi di Lbc Flag-taggato associato a RhoA-GST sono stati rilevati mediante
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Western blot e quantificati mediante densitometria. I risultati sono la media ± S.E. di 3-8 esperimenti indipendenti.
Figura 4 – Strutture e attività di A13 e dei suoi 5 stretti analoghi A31-A50.
Figura 5 - A13 e A21 mostrano simili modalità di interazione con il dominio DH di Lbc. Gli amminoacidi funzionalmente rilevanti emersi dalla mutagenesi per scansione ad alanina sono evidenziati, colorati a 10 seconda dell’effetto funzionale della loro mutazione (si legga la legenda della Figura 1). A13 e A21 sono di colore nero e grigio chiaro, rispettivamente.
Figura 6 - Curve dose-risposta per determinare la concentrazione massima di A13 in grado di inibire al 15 cinquanta percento l’interazione Lbc-RhoA e l’attivazione di RhoA indotta da Lbc in cellule intatte. A) Cellule HEK-293 che esprimono Lbc Flagtaggato sono state mantenute a digiuno di siero per 24 ore e lisate. Gli estratti cellulari sono stati 20 incubati con biglie di glutatione-sefarosio accoppiate a RhoA GST-taggata in presenza di DMSO 1% o di concentrazioni crescenti di A13. I livelli relativi di Lbc-Flag associato a RhoA-GST (pannello superiore) ed espressi in estratti cellulari (pannello centrale) sono 25 stati rilevati mediante Western blot utilizzando anticorpi monoclonali anti-Flag. Viene mostrata una colorazione delle proteine di controllo indicante i quantitativi di RhoA-GST utilizzati nel test di pulldown (pannello inferiore). B) L’analisi 30 quantitativa di Lbc-Flag associato a RhoA-GST è stata effettuata mediante densitometria. I risultati sono la media ± S.E. di tre esperimenti indipendenti. C)
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Cellule HEK-293 trasfettate con il vettore vuoto pFlag o con un plasmide codificante Lbc Flag-taggato sono state mantenute a digiuno di siero per 24 ore in presenza di DMSO 1% o di concentrazioni crescenti di 5 A13 e lisate. Le RhoA GTP-legate sono state purificate per affinità dagli estratti cellulari utilizzando biglie di glutatione-sefarosio accoppiate a GST-RBD. Le RhoA legate sono state rilevate con un anticorpo monoclonale anti-RhoA (pannello superiore). Le quantità 10 relative di proteine totali RhoA e Lbc-Flag nei lisati cellulari sono state valutate utilizzando anticorpi monoclonali anti-RhoA (pannello centrale) e anti-Flag (pannelli inferiori), rispettivamente. D) L’analisi quantitativa di RhoA-GTP associata alle biglie di RBD è 15 stata effettuata mediante densitometria. I valori sono stati normalizzati ai contenuti di RhoA e di Lbc-Flag degli estratti cellulari. I risultati sono espressi come media ± S.E. di quattro esperimenti indipendenti. Figura 7 – Effetti del composto A13 sull’interazione di 20 RhoA con LARG, PDZ e p115. A) Cellule HEK-293 che esprimono costrutti di Lbc, LARG, PDZ e p115 Flagtaggati sono state mantenute a digiuno di siero per 24 ore e lisate. Gli estratti cellulari sono stati incubati con biglie di glutatione-sefarosio accoppiate 25 a RhoA GST-taggata in assenza (controllo) o in presenza di A13 100 µM. I livelli relativi di proteine Lbc, LARG, PDZ e p115 associate con la RhoA-GST (pannello superiore) ed espresse in estratti cellulari (pannello centrale) sono stati rilevati mediante Western blot 30 utilizzando anticorpi monoclonali anti-Flag. Viene mostrata una colorazione delle proteine di controllo indicante i quantitativi di RhoA-GST utilizzati nel
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test di pulldown (pannello inferiore). B) L’analisi quantitativa delle proteine RhoGEF Flag-taggate associate a RhoA-GST è stata effettuata mediante densitometria. I valori sono stati normalizzati al 5 contenuto di proteine RhoGEF-Flag degli estratti cellulari. I risultati sono la media ± S.E. di tre esperimenti indipendenti. *p<0,05 rispetto alla quantità di proteine Lbc, LARG, PDZ e p115 Flag-taggate legate alla RhoA-GST in condizioni di controllo. C) 10 Valori di IC50 per l’effetto inibitorio di A13 sull’interazione di Lbc, LARG, PDZ e p115 con RhoA. I dati sono riportati come valori medi di IC50 ± S.E. di tre esperimenti indipendenti.
Figura 8 - Inibizione della capacità di Lbc di 15 indurre la formazione di fibre di stress e la trasformazione cellulare in fibroblasti NIH-3T3 utilizzando il composto A13. A) Fibroblasti NIH-3T3 sono stati trasfettati con cDNA codificante GFP o Lbc-GFP. Le cellule transfettate sono state mantenute a 20 digiuno di siero per 24 ore in assenza o in presenza di A13 100 µM e successivamente fissate, permeabilizzate e colorate con falloidina Texas-rosso per rilevare l’actina. L’espressione di GFP e Lbc-GFP è stata visualizzata direttamente mediante eccitazione a 25 fluorescenza a 488 nm. B) Questo pannello mostra i risultati dell’analisi della formazione di foci di cellule NIH-3T3 stabilmente trasfettate con il vettore vuoto pFlag (controllo) o con il cDNA codificante Lbc-Flag e successivamente trattate in assenza o presenza 30 di A13 10 µM. La formazione di foci è stata valutata dopo 21 giorni di coltura. C) Viene mostrata la quantificazione dei tre saggi indipendenti di
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formazione di foci. La trasformazione cellulare indotta da Lbc-Flag è stata impostata al 100%. Le barre di errore rappresentano gli errori standard. P<0,05 rispetto al numero di foci misurati nelle cellule 5 esprimenti Lbc-Flag.
Figura 9 – A13 blocca la migrazione delle cellule del cancro della prostata. È stato effettuato uno scratch test per indagare la capacità di risoluzione del graffio a 0 ore, 12 ore, 24 ore, 36 ore e 48 ore.
10 Cellule PC3 sono state distribuite in piastre da dodici pozzetti, coltivate fino all’80% di confluenza. Il graffio è stato fatto con un puntale e le immagini (obiettivo 4X) sono state scattate immediatamente (0 ore). Alle cellule è stato consentito di risolvere il 15 danno in 48 ore durante le quali sono state mantenute a 37 °C. I composti A13 e A2 (come controllo negativo) sono stati aggiunti 12 ore prima di effettuare il graffio a concentrazione di 10 µM. I risultati sono la media ± S.E. di tre esperimenti indipendenti. P è <0,05 20 quando le tre determinazioni in presenza di A13 vengono confrontate con il gruppo di controllo oppure con le determinazioni in presenza di A2. In dettaglio, la % dell’area del graffio a 24 ore, 36 ore e 48 ore è stata, rispettivamente, di 19,64 ± 6,24, 1,85 ± 0,70 e 25 0,00 ± 0,00 in condizioni di controllo, 16,51 ± 4,56, 0,74 ± 0,42 e 0,00 ± 0,00 in presenza del composto inattivo A2, e 50,67 ± 6,23, 42,1 ± 7,80 e 28,21 ± 10,24 in presenza di A13. Questo indica che A13 inibisce la migrazione delle cellule del cancro.
30 Figura 10 - Allineamento di sequenza tra Lbc e LARG impiegato per il modeling comparativo di Lbc. Le α-eliche e i filamenti-β canonici sono colorati in
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grigio chiaro e grigio scuro, rispettivamente. Le lettere minuscole indicano gli amminoacidi di LARG che sono stati eliminati per consentire l’inserimento di sei amminoacidi in Lbc. Le lettere in grassetto 5 indicano i 33 amminoacidi considerati dalla mutagenesi per scansione ad alanina in vitro. Il bordo nero delimita il dominio PH. Gli asterischi indicano gli amminoacidi conservati.
Figura 11 - Capacità di legare RhoA dei mutanti 10 del dominio DH di Lbc. (A, C, E, G) Cellule HEK-293 che esprimono costrutti di Lbc Flag-taggato di tipo nativo (wild type) o mutato sono state mantenute a digiuno di siero per 24 ore e lisate. Gli estratti cellulari sono stati incubati con biglie di glutatione-sefarosio 15 accoppiate a RhoA GST-taggata. I livelli relativi di proteine Lbc associate a RhoA-GST (pannello superiore) ed espresse in estratti cellulari (pannello centrale) sono stati rilevati mediante Western blot utilizzando anticorpi monoclonali anti-Flag. Viene mostrata una 20 colorazione delle proteine di controllo indicante i quantitativi di RhoA-GST utilizzati negli esperimenti di pulldown (pannello inferiore). (B, D, F, H) L’analisi quantitativa delle proteine Lbc-Flag associate alla RhoA-GST è stata effettuata mediante 25 densitometria. I valori sono stati normalizzati al contenuto di Lbc-Flag degli estratti cellulari. I risultati sono la media ± S.E. di 4-8 esperimenti indipendenti. *P<0,05 rispetto alla quantità di Lbc-Flag legata a RhoA-GST.
30 Figura 12 - Capacità di attivare RhoA dei mutanti del dominio DH di Lbc. (A, C, E, G) Cellule HEK-293 che esprimono costrutti di Lbc Flag-taggato di tipo wild
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type o mutato sono state mantenute a digiuno di siero per 24 ore e lisate. Gli estratti cellulari sono stati incubati con biglie di GST-RBD. RhoA legata è stata rilevata utilizzando un anticorpo monoclonale anti-RhoA 5 (pannello superiore). Le quantità relative di proteine totali RhoA e Lbc-Flag nei lisati cellulari sono state determinate utilizzando anticorpi monoclonali anti-RhoA (pannello centrale) e anti-Flag (pannelli inferiori), rispettivamente. (B, D, F, H) L’analisi quantitativa di 10 RhoA-GTP associata alle biglie di RBD è stata effettuata mediante densitometria. I valori sono stati normalizzati ai contenuti di RhoA e di Lbc-Flag degli estratti cellulari. I risultati sono espressi come media ± S.E. di quattro esperimenti indipendenti.
15 *P<0.05 rispetto ai livelli di Rho-GTP misurati in cellule che esprimono Lbc-Flag di tipo wild type.
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I seguenti esempi sono forme di realizzazione non limitative dell’invenzione.
25 ESEMPI
Esempio 1 – Predizione del modello strutturale del complesso Lbc-RhoA mediante modeling comparativo.
Nella presente invenzione, è stato predetto un modello strutturale del complesso Lbc-RhoA mediante 30 modeling comparativo (per mezzo di MODELLER (http://salilab.org/modeller/)), utilizzando come riferimento la struttura cristallografica del complesso
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LARG-RhoA (codice PDB: 1X86 (rif. 26)). La percentuale di amminoacidi che sono chimico-fisicamente simili o identici tra la proteina riferimento (LARG) e la proteina target (Lbc) è del 57%, mentre l’identità di 5 sequenza nel il dominio tandem DH-PH è del 28% (essendo le identità nei domini DH e PH, rispettivamente, del 29% e del 27%).
La struttura di RhoA era presente durante il modeling comparativo di Lbc. Per modellare l’inserzione 10 di sei amminoacidi di Lbc nell’estremità C-terminale dell’elica α2, il tratto amminoacidico 856-859 di LARG, corrispondente al loop α2/α3 (riportato in caratteri minuscoli nella Figura 10) è stato eliminato. L’inserimento è stato, quindi, modellato come 15 prolungamento di due giri dell’elica α2, mediante l’imposizione di vincoli di α-elica al tratto 2062-2069 di Lbc. È opportuno notare, tuttavia, che questa porzione non è coinvolta nell’interfaccia con RhoA, rendendo così le indeterminazioni strutturali alquanto 20 accettabili. Il modello iniziale di Lbc è stato ottenuto dall’allineamento di sequenza mostrato nella Figura 10. Durante il rifinimento del modello, sono stati costruiti 100 modelli di Lbc randomizzando tutte le coordinate cartesiane dei residui standard nel 25 modello iniziale. Il modello risultante dalla combinazione ottimale di basso valore della Funzione Oggettiva calcolata da MODELLER (il secondo valore più basso tra i 100 calcolati), basso contenuto di angoli torsionali della catena principale in cattiva 30 conformazione e punteggio relativamente alto del 3D-Profile (un indicatore del grado di accordo tra sequenza primaria e struttura terziaria) è stato
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selezionato per l’analisi dell’interfaccia Lbc-RhoA e per gli HTVS di librerie di composti. Il modello selezionato è stato sottoposto ad aggiustamento automatico degli angoli torsionali delle catene 5 laterali in conformazione non consentita (mediante il pacchetto Quanta (www.accelrys.com)).
Coerentemente con il riferimento LARG, Lbc è composto da un dominio DH, caratterizzato da sei αeliche organizzate in un’architettura a fascio up-down 10 e un dominio PH, caratterizzato da un’architettura a rotolo fatta da sette filamenti-β antiparalleli (Figura 1A e Figura 10).
Nel complesso Lbc-RhoA predetto, la quasi totalità della superficie di Lbc nascosta da RhoA (94.3%) 15 appartiene al dominio DH, mentre solo il 5,7% è contribuito dal dominio PH. La superficie del DH nascosta da RhoA coinvolge α1, α3, loop α4/α5, α5 e α6 (Figura 1C). In dettaglio, a) l’elica α1 di Lbc riconosce il loop α1/β1 (cioè lo switch I (swI)) di 20 RhoA, b) la metà C-terminale dell’elica α3 di Lbc riconosce il loop β3/α2 (cioè lo switch II (swII)) di RhoA, c) il loop α4/α5 e l’elica α5 di Lbc riconoscono sia swI che la β-hairpin β2/β3 (cioè l’inter-switch) di RhoA, e d) l’elica α6 di Lbc riconosce lo swII di RhoA 25 (Figura 1C). Il dominio DH espone a RhoA gli amminoacidi carichi positivamente complementari agli amminoacidi carichi negativamente sulla superficie della proteina G. Secondo il modello strutturale, il loop α4/α5 e l’elica α5 di Lbc giocano un ruolo 30 centrale nella realizzazione della complementarità elettrostatica e di forma con RhoA. Infatti, un certo
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numero di amminoacidi carichi positivamente e idrofobici in queste porzioni di Lbc riconoscono gli amminoacidi carichi negativamente e idrofobici dello swI e dell’inter-switch di RhoA. In dettaglio, le 5 interazioni elettrostatiche fondamentali tra Lbc e RhoA risiedono nei seguenti ponti salini: a) R2135<Lbc>-E40<RhoA>, R2136<Lbc>-D45<RhoA>, R2136<Lbc>-E54<RhoA>e K2152<Lbc>-D59<RhoA>. D’altra parte, il core idrofobico del complesso Lbc-RhoA è un costituito da L2144, L2145 e L2156. Il primo partecipa 10 al sito di binding di W58, un amminoacido dell’interswitch rivelatosi essere essenziale per l’interazione Lbc-RhoA. Infine, ci si aspetta che anche le coppie E2141<Lbc>-W58<RhoA>e Q2148<Lbc>-N41<RhoA>contribuiscano al complesso Lbc-RhoA mediante legami a ponte di idrogeno.
15 Collettivamente, il modello strutturale suggerisce che i principali attori nel riconoscimento Lbc-RhoA siano limitate regioni delle due proteine, cioè il loop α4/α5 e l’elica α5, di Lbc, e swI ed inter-switch, di RhoA (Figura 1C).
20 Sulla base delle previsioni derivanti dal modeling computazionale, è stata effettuata mutagenesi per scansione ad alanina per definire il ruolo degli amminoacidi del DH che partecipano nell’interfaccia Lbc-RhoA. Sono stati considerati i 33 amminoacidi di 25 α1, α3, loop α4/α5, α5 e α6 (vedi Figura 11), che costituiscono l’86 % della superficie del DH nascosta da RhoA.
Sono stati effettuati esperimenti in vitro utilizzando il modulo GEF isolato di Lbc, che mostra 30 attività RhoGEF costitutiva (rif. 5, 27, 28).
Per valutare inizialmente l’impatto delle diverse mutazioni sulla capacità di Lbc di legare RhoA, sono
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stati condotti esperimenti di pulldown incubando estratti di cellule HEK-293 sovra-esprimenti costrutti di Lbc Flag-taggato di tipo wild type o mutato con RhoA GST-taggata purificata. I risultati indicano che le 5 mutazioni di K2112, E2141, L2145 e T2151 riducono l’interazione tra Lbc e RhoA di circa il 30-50% (Figura 11C e 11E, e Figura 11D e 11F; colorati in grigio chiaro nella Figura 1A e 1B). D’altra parte, una inibizione più significativa è indotta dalle mutazioni 10 di R2135, R2136, L2144, Q2148, K2152 e L2156, che riducono la capacità di Lbc di legare RhoA fino al 90% (Figura 11E e 11F; colorati in grigio scuro nella Figura 1A e 1B). Al contrario, il binding è lievemente o non influenzato dalle mutazioni all’interno di αN1, 15 α1, α3 e α6 (Figura 11A e 11G, così come Figura 11B e 11H). Non è stato osservato alcun binding tra i diversi costrutti Lbc Flag-taggati e il solo GST (dati non riportati). Questi risultati confermano le predizioni del modello strutturale, ovvero che i principali 20 determinanti del binding a RhoA si trovano nel loop α4/α5 e nell’elica α5.
Per determinare l’impatto delle mutazioni sulla capacità di Lbc di promuovere l’attivazione di RhoA all’interno delle cellule, sono stati sovra-espressi 25 costrutti di Lbc-Flag di tipo wild type o mutato in cellule HEK-293 e, dopo una deprivazione di siero per 24 ore, è stata valutata la loro capacità di attivare RhoA mediante il test di cattura della Rhotekin, che utilizza una fusione di GST con il dominio di binding 30 di Rho della Rhotekin al fine di far precipitare per affinità RhoA legata a GTP dagli estratti cellulari (rif. 29). Come mostrato in precedenza (rif. 5, 28), la
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sovra-espressione di Lbc-Flag promuove un significativo aumento nella formazione di RhoA-GTP rispetto alle cellule trasfettate mock (Figura 12A, 12C, 12E e 12F, pannello superiore, corsia 2). In linea con gli effetti 5 delle mutazioni sulla interazione Lbc-RhoA presentati sopra, la mutazione di K2112, R2135, R2136, E2141, L2144, L2145, Q2148, T2151, K2152 e L2156 in alanina inibisce significativamente la capacità di Lbc di promuovere l’attivazione di RhoA all’interno delle 10 cellule (Figura 12C e 12E, nonché Figura 12D e 12F).
Sorprendentemente, le mutazioni di H2009 e R2149 (colorate in grigio chiaro nella Figura 1), nonostante il loro marginale impatto sull’interazione tra Lbc e RhoA (Figura 11A e 11E, così come Figura 11B e 11F), 15 influenzano fortemente l’attivazione di RhoA mediata da Lbc (Figura 12A e 12E, nonché Figura 12B e 12F). Ciò suggerisce che questi residui potrebbero partecipare selettivamente alla reazione di scambio del nucleotide guaninico coinvolta nell’attivazione di RhoA.
20 In sintesi, la combinazione di modeling computazionale e di esperimenti in vitro ha consentito di identificare una regione circoscritta sul dominio DH di Lbc come importante per la sua attività di GEF. Tale regione, essendo complessivamente carica positivamente, 25 è stata utilizzata come target per HTVS di composti carichi negativamente che potrebbero competere con RhoA per legare Lbc.
Barzanò & Zanardo Milano S.p.A.
30
FIN/136560
Claims (12)
- Barzanò & Zanardo - 39 - RIVENDICAZIONI 1. Composti di formula generale (III) e/o loro sali e/o loro derivati per l’uso nella inibizione dell’interazione Lbc-RhoA: <R>2 R1 R7 N N R10<O>R3 O R6 R5R4 R59<R>8 (III) dove: R1viene scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH e -SO2NH2; preferibilmente R1è -H quando R2è -COOH 10 oppure R1è -COOH quando R2è -H; R2viene scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH e -SO2NH2; preferibilmente R2è -H quando R1è -COOH oppure R2è -COOH quando R1è -H; R3viene scelto nel gruppo costituito da C1-C415 alchile, C1-C4alchile alogenato, C2-C4alchilammidi (preferibilmente alchilammidi primarie), C3-C4alchilammine (preferibilmente alchilammine primarie) e C2-C3alchilguanidine; preferibilmente R3è C1-C4alchile oppure C1-C4alchile alogenato e, più 20 preferibilmente, R3è -CH3oppure -CF3; R4è scelto nel gruppo costituito da -H, C1-C4alchile, C1-C4alchile alogenato, alogeno e -NO2; preferibilmente R4è -H oppure -F; R5è scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH, - FIN/136560 Barzanò & Zanardo - 40 - SO2NH2, alogeno, -CF3e -COOR, dove R è -CH3, -C2H5oppure C1-C4alchile; preferibilmente R5è -H, -COOCH3, -COOC2H5oppure -CF3; R6è scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH, 5 alogeno, C1-C4alchile, C1-C4alchil etere, -SO2NH2e -COOR, dove R è -CH3, -C2H5oppure C1-C4alchile; preferibilmente R6è -H, -COOH oppure Cl; R7è H, -COOH oppure -SO2NH2, preferibilmente, R7è H quando R1o R2è -COOH oppure R7è -COOH quando R1e 10 R2sono entrambi H; R8e R9possono essere H oppure -(CH2)n-COOH, dove n varia da 1 a 3, preferibilmente R8e R9non sono simultaneamente sostituenti che contengono un carbossilato; 15 R10è -COOH oppure -CH2-COOH.
- 2. Composti per l’uso secondo la rivendicazione 1 aventi una delle seguenti strutture: composto A13: R1è H; R2è COOH; R3è CH3; R4è H; R5è CF3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; 20 composto A33: R1è H; R2è COOH; R3è CF3; R4è H; R5è H; R6è COOH; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; composto A38: R1è H; R2è COOH; R3è CH3; R4è H; R5è COOC2H5; R6è Cl; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; composto A40: R1è H; R2è COOH; R3è CF3; R4è H; 25 R5è COOCH3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; composto A43: R1è H; R2è COOH; R3è CH3; R4è F; R5è H; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; composto A45: R1è COOH; R2è H; R3è CH3; R4è H; R5è CF3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; 30 oppure composto A46: R1è COOH; R2è H; R3è CH3; R4è H; R5è COOCH3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H. FIN/136560 Barzanò & Zanardo - 41 -
- 3. Composizioni farmaceutiche comprendenti i composti secondo la rivendicazione 1 o 2, per l’uso nella inibizione dell’interazione Lbc-RhoA.
- 4. Composti di formula generale (III) e/o loro 5 sali e/o loro derivati per l’uso nel trattamento del cancro: <R>2 R1 R7 N N R10<O>R3 O R6 R5R4 R9<R>8 (III) dove: 10 R1viene scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH e -SO2NH2; preferibilmente R1è -H quando R2è -COOH oppure R1è -COOH quando R2è -H; R2viene scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH e -SO2NH2; preferibilmente R2è -H quando R1è -COOH 15 oppure R2è -COOH quando R1è -H; R3viene scelto nel gruppo costituito da C1-C4alchile, C1-C4alchile alogenato, C2-C4alchilammidi (preferibilmente alchilammidi primarie), C3-C4alchilammine (preferibilmente alchilammine primarie) e 20 C2-C3alchilguanidine; preferibilmente R3è C1-C4alchile oppure C1-C4alchile alogenato e, più preferibilmente, R3è -CH3oppure -CF3; R4è scelto nel gruppo costituito da -H, C1-C4alchile, C1-C4alchile alogenato, alogeno e -NO2; FIN/136560 Barzanò & Zanardo - 42 - preferibilmente R4è -H oppure -F; R5è scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH, -SO2NH2, alogeno, -CF3e -COOR, dove R è -CH3, -C2H5oppure C1-C4alchile; preferibilmente R5è -H, -COOCH3, 5 -COOC2H5oppure -CF3; R6è scelto nel gruppo costituito da -H, -COOH, alogeno, C1-C4alchile, C1-C4alchil etere, -SO2NH2e -COOR, dove R è -CH3, -C2H5oppure C1-C4alchile; preferibilmente R6è -H, -COOH oppure Cl; 10 R7è H, -COOH oppure -SO2NH2, preferibilmente, R7è H quando R1o R2è -COOH oppure R7è -COOH quando R1e R2sono entrambi H; R8e R9possono essere H oppure -(CH2)n-COOH, dove n varia da 1 a 3, preferibilmente R8e R9non sono 15 simultaneamente sostituenti che contengono un carbossilato; R10è -COOH oppure -CH2-COOH.
- 5. Composti per l’uso secondo la rivendicazione 4 aventi una delle seguenti strutture: 20 composto A13: R1è H; R2è COOH; R3è CH3; R4è H; R5è CF3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; composto A33: R1è H; R2è COOH; R3è CF3; R4è H; R5è H; R6è COOH; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; composto A38: R1è H; R2è COOH; R3è CH3; R4è H; 25 R5è COOC2H5; R6è Cl; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; composto A40: R1è H; R2è COOH; R3è CF3; R4è H; R5è COOCH3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; composto A43: R1è H; R2è COOH; R3è CH3; R4è F; R5è H; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; 30 composto A45: R1è COOH; R2è H; R3è CH3; R4è H; R5è CF3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H; oppure FIN/136560 Barzanò & Zanardo - 43 - composto A46: R1è COOH; R2è H; R3è CH3; R4è H; R5è COOCH3; R6è H; ciascuno di R7, R8, R9e R10è H.
- 6. Composizioni farmaceutiche comprendenti i composti secondo la rivendicazione 4 o 5, per l’uso nel 5 trattamento del cancro.
- 7. Composti di formula generale (IV) e/o loro sali e/o loro derivati per l’uso nella inibizione dell’interazione Lbc-RhoA: O N N R1O OH O 10 (IV) dove R1viene scelto nel gruppo costituito da –COOH e acido C1-C4alchil carbossilico.
- 8. Composti per l’uso secondo la rivendicazione 7 15 aventi una delle seguenti strutture: composto A21, dove R1è –COOH; oppure un suo stretto analogo.
- 9. Composizioni farmaceutiche comprendenti i composti secondo la rivendicazione 7 o 8, per l’uso 20 nella inibizione dell’interazione Lbc-RhoA.
- 10. Composti di formula generale (IV) e/o loro sali e/o loro derivati per l’uso nel trattamento del cancro: FIN/136560 Barzanò & Zanardo - 44 - O N N R1O OH O (IV) dove R1viene scelto nel gruppo costituito da –COOH e 5 acido C1-C4alchil carbossilico.
- 11. Composti per l’uso secondo la rivendicazione 10 aventi una delle seguenti strutture: composto A21, dove R1è –COOH; oppure un suo stretto analogo. 10
- 12. Composizioni farmaceutiche comprendenti i composti secondo la rivendicazione 10 o 11, per l’uso nel trattamento del cancro. 15 20 25 Barzanò & Zanardo Milano S.p.A. FIN/136560
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