ITMI20111009A1 - Idrogeli di gelatina reticolata - Google Patents

Description

“IDROGELI DI GELATINA RETICOLATAâ€

Campo dell’invenzione

La presente invenzione si colloca nell’ambito della medicina rigenerativa e in particolare riguarda la rigenerazione dei tessuti molli. Più precisamente l’invenzione si riferisce a matrici del tipo idrogelo e alle loro applicazioni biomediche come sistemi per il rilascio controllato di farmaci o per la coltura, la veicolazione e l’impianto di cellule.

Sfondo dell’invenzione

Gli idrogeli rappresentano materiali polimerici idonei all’utilizzo come substrati per la rigenerazione dei tessuti molli grazie alle loro non elevate caratteristiche meccaniche e alla loro elevata idrofilicità. Si tratta di reti macromolecolari tridimensionali di natura polimerica, capaci di assorbire una grande quantità di soluzioni acquose o fluidi biologici, senza essere soggette a fenomeni di solubilizzazione.

Tra gli svariati tipi di idrogeli, quelli contenenti gelatina si sono rivelati materiali molto promettenti nel settore biomedico. La gelatina, infatti, à ̈ un prodotto di origine naturale, derivato dal collagene, che favorisce l’adesione cellulare ma non manifesta immunogenicità in condizioni fisiologiche, à ̈ altamente biocompatibile, completamente riassorbibile in vivo, poco costosa e facilmente reperibile. Il principale svantaggio associato alla gelatina à ̈ dovuto alle sue scarse proprietà meccaniche, che limitano i suoi possibili utilizzi come biomateriale allo stato non reticolato.

Infatti, nonostante la gelatina sia in grado di formare spontaneamente un gel in soluzione acquosa a bassa temperatura (< 5-10°C), essa manifesta un comportamento termoreversibile, ovvero ritorna liquida a temperature superiori ai 30°C. Quindi, per un utilizzo come biomateriale in campo biomedico, à ̈ necessario incrementarne la stabilità e le proprietà meccaniche in condizioni fisiologiche. La formazione di legami covalenti inter- e intra-molecolari (reticolazione) diventa, quindi, importante per migliorare alcune proprietà, come la densità e la solubilità, per facilitare il controllo della degradazione e dell’eventuale rilascio di sostanze in vivo ed in generale per migliorare la stabilità termica, meccanica e chimica in ambiente biologico.

Nella letteratura scientifica sono descritti differenti metodologie per reticolare la gelatina ricorrendo a due diversi metodi di reticolazione, fisico e chimico.

La reticolazione di tipo fisico, tramite irraggiamento UV o trattamento termico, se da un lato presenta il vantaggio di non introdurre agenti chimici esterni, potenzialmente tossici per l’organismo, dall’altro risulta poco efficace e rende difficile il controllo della stabilità e della densità di reticolazione nella matrice finale.

La reticolazione di tipo chimico include l’impiego di agenti chimici a loro volta divisi in due classi: non-zero length (ad esempio, aldeidi, epossidi, isocianati) e zero length (ad esempio, acilazidi, carbodiimmidi), e comporta la formazione di legami covalenti attraverso una reazione di condensazione, come descritto da Kuijpers A.J., et Al., Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 11 (3) 225-243, 2000.

In letteratura sono descritti prodotti a base di gelatina reticolata, l’utilizzo in generale del meccanismo di addizione tipo Michael per la sintesi di polimeri o di idrogeli e l’utilizzo di metilene-bis-acrilammide (MBA) come reticolante. Si veda, ad esempio, A.J. Kuijpers et Al, J Biomater Sci Polymer Edn, 2000, 11(3):225–24; P. Dubruel et Al, Biomacromolecules 2007, 8:338-344; S. Van Vlierberghe et al, Biomacromolecules 2007, 8:331-337. Tuttavia, non à ̈ mai stata riportata la reazione tra gelatina e MBA.

WO 2010/060104 A2 descrive matrici semisolide impiantabili comprendenti un idrogelo, utili per la veicolazione di liposomi contenenti materiali bioattivi a siti o tessuti di interesse. La matrice può essere costituita da vari materiali biodegradabili, tra i quali viene menzionata la gelatina, e può inoltre contenere un agente di reticolazione, in grado di formare una matrice semisolida con l’idrogelo. Tra i vari agenti di reticolazione citati viene menzionato anche la N,N’-metilene-bisacrilammide (MBA). Il documento, tuttavia, non descrive un idrogelo di gelatina reticolata con N,N’-metilene-bisacrilammide.

WO 2008/121422 A2 descrive matrici semisolide impiantabili contenenti cellule monocitiche e comprendenti un materiale avente le caratteristiche di un idrogelo. Tra vari possibili idrogeli viene citata la gelatina. La matrice può contenere anche un agente di reticolazione, scelto in un elenco che comprende anche MBA. Anche in questo caso il documento non descrive un idrogelo di gelatina reticolata con N,N’-metilene-bisacrilammide.

Descrizione dell’invenzione

Si à ̈ ora sorprendentemente trovato che idrogeli di gelatina reticolata con bisacrilammidi ottenute per funzionalizzazione di ammine primarie o secondarie possiedono vantaggiose proprietà meccaniche e di stabilità in ambiente fisiologico rispetto ad altri idrogeli, inclusi quelli a base di gelatina; tali proprietà ne rendono particolarmente vantaggioso l’impiego per la coltura, crescita e proliferazione di cellule, nonché per il rilascio controllato di molecole bioattive e per favorire la rigenerazione dei tessuti.

Oggetto della presente invenzione sono pertanto idrogeli di gelatina reticolata con bisacrilammidi di ammine primarie o secondarie preferibilmente scelte tra N,N’-metilene-bisacrilammide (MBA), N,N’-etilene-bisacrilammide, bis-acriloilpiperazina e bis-acriloilcistamina (CH2=CH- (C=O)-NH-S-S-NH-(C=O)-CH=CH2) (agenti reticolanti). Oltre a queste, possono essere utilizzate bisacrilammidi solubili in acqua e ottenibili per funzionalizzazione di oligomeri omobifunzionali quale poliossialchilendiammina attraverso la reazione di Schotten-Bauman (N,N’-poliossialchilen bisacrilammide). È maggiormente preferito l’agente reticolante N,N’-metilene-bisacrilammide (MBA).

Gli idrogeli dell’invenzione sono ottenuti per reazione in condizioni blande tra gelatina e bisacrilammide. Più precisamente, gli idrogeli dell’invenzione vengono ottenuti mediante addizione di tipo Michael tra i gruppi amminici primari presenti nella gelatina (gruppi laterali della lisina oltre ai pochi gruppi amminici terminali di catena) e i gruppi acrilammide.

La gelatina utilizzata per la preparazione degli idrogeli dell’invenzione può essere di origine bovina o porcina. Si utilizza preferibilmente gelatina porcina di tipo A.

La reazione viene condotta in presenza di un composto amminico terziario a basso peso molecolare o di una base inorganica in modo da ottenere un pH adatto alla deprotonazione dei gruppi amminici primari della gelatina, e quindi la loro attivazione in presenza dell’agente reticolante.

La reazione viene eseguita in soluzione acquosa impiegando concentrazioni di gelatina variabili dal 5 al 40% p/v, con un rapporto molare tra gruppi amminici equivalenti presenti nella gelatina (mM (NH2) lisina) e equivalenti gruppi acrilammide presenti nell’agente reticolante compreso tra 0,5 e 2,5. Si opera ad una temperatura compresa tra 30 e 70°C, preferibilmente tra 40 e 50°C, in presenza di trietilammina (0,1 - 0,3 ml/g gelatina), oppure di un analogo composto amminico terziario a basso peso molecolare quali trietanolammina, trietilendiammina e N,N,N',N'-tetraetilendiammina (TEMED), o di una base inorganica, ad esempio NaOH o LiOH, preferibilmente LiOH monoidrato. L’agente reticolante viene aggiunto per ultimo alla miscela di reazione, sotto agitazione. La miscela di reazione viene quindi trasferita in stufa termostatata a una temperatura compresa tra 30 e 70°C, preferibilmente tra 40 e 50°C, e lasciata reagire per un tempo compreso tra 4 e 24 ore, preferibilmente per 12 ore.

Gli idrogeli così ottenuti vengono sottoposti ad una procedura di lavaggio appositamente messa a punto per eliminare l’eventuale eccesso di agente reticolante e altri componenti non reagiti, consistente in lavaggi successivi con etanolo puro, con una soluzione HCl 0,1M, ed infine con acqua distillata.

Gli idrogeli dell’invenzione possono essere conservati fino al momento dell’utilizzo in ambiente acquoso, o più preferibilmente, in condizioni anidre, dopo essiccamento in stufa a peso costante o liofilizzazione.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ pertanto una composizione contenente, in un mezzo acquoso o in forma essiccata, un idrogelo di gelatina reticolata con una bisacrilammide come sopra definita.

Gli idrogeli dell’invenzione sono ottenuti in condizioni blande, evitando così temperature elevate, solventi organici, oppure l’impiego di reazioni chimiche complesse o di composti che possono rilasciare residui potenzialmente tossici. La reazione di addizione di tipo Michael utilizzata per la preparazione degli idrogeli dell’invenzione à ̈ particolarmente vantaggiosa perché può essere condotta a temperatura ambiente o di poco superiore, in tempi brevi e in soluzione acquosa.

Nessuno dei meccanismi di reticolazione della gelatina precedentemente riportati in letteratura avviene con le favorevoli modalità dell’addizione di tipo Michael descritta nella presente invenzione.

Gli idrogeli dell’invenzione sono di origine sintetico-naturale, insolubili in solventi acquosi, capaci di aumentare di volume e di peso fino a 3 ordini di grandezza. La loro caratterizzazione à ̈ stata condotta attraverso prove di stabilità in soluzioni acquose e in ambiente fisiologico a 37°C (rigonfiamento e perdita in peso), e tramite caratterizzazione dinamico-meccanica.

I risultati delle prove dinamico-meccaniche mostrano che gli idrogeli a base di gelatina della presente invenzione hanno migliori proprietà rispetto a materiali di confronto che non contengono gelatina.

La metodologia di sintesi impiegata per la preparazione degli idrogeli dell’invenzione permette di ottenere matrici bio- ed emo-compatibili a base di gelatina dotate di stabilità sensibilmente più elevata in ambiente fisiologico (tempi superiori ai 35 giorni) rispetto ad analoghi già presenti sul mercato o in sperimentazione.

Gli idrogeli dell’invenzione hanno caratteristiche vantaggiose in termini di citotossicità e citocompatibilità in vitro che li rendono idonei all’impiego come supporti per la coltura, la crescita e la proliferazione di cellule. In particolare, gli idrogeli dell’invenzione garantiscono un micro-ambiente adeguato per l’adesione cellulare e il successivo mantenimento delle condizioni ottimali per la coltura di cellule, incluse le cellule staminali adulte isolate da tessuto adiposo.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ pertanto l’uso di un idrogelo di gelatina reticolata come qui definito o di una composizione contenente lo stesso per la coltura, crescita o proliferazione cellulare.

Gli idrogeli e le composizioni oggetto dell’invenzione possono essere utilizzati come substrati per favorire la rigenerazione in vivo od in vitro di tessuti molli, come ad esempio il tessuto adiposo, il tessuto vascolare, la pelle. Sono anche utili nel campo del rilascio controllato di farmaci, in particolare polipeptidi e biomolecole attive, quali i fattori di crescita. Si prestano inoltre all’utilizzo come carrier di cellule.

Ulteriori oggetti dell’invenzione sono pertanto un idrogelo di gelatina reticolata come qui definito contenente una sostanza biologicamente attiva o cellule e l’uso di un idrogelo di gelatina reticolata come qui definito o di una composizione contenente lo stesso, per la rigenerazione in vitro di tessuti molli, per il rilascio controllato di farmaci, polipeptidi e biomolecole attive, e come carrier di cellule.

Un ulteriore aspetto dell’invenzione riguarda un impianto o innesto di tessuti o cellule, in particolare cellule staminali adulte isolate da tessuto adiposo, in cui dette cellule sono contenute in un idrogelo come qui definito.

L’invenzione viene ora illustrata in maggior dettaglio attraverso i seguenti esempi.

Esempio 1 - Procedura sperimentale per la sintesi ed esempi di prodotti

Tutti i reagenti utilizzati sono stati ottenuti da Sigma Aldrich: MBA, cod.146072, gelatina porcina di tipo A, cod G2500-100G, esametilendiammina, cod. H11696, trietilammina, cod.T0886. Il solvente di reazione à ̈ rappresentato da acqua distillata (Idrochimica Srl, Milano).

Come materiale di confronto à ̈ stato utilizzato un materiale sintetizzato sostituendo la gelatina con una diammina alifatica, la esametilendiammina (HEX); tale materiale viene indicato con la sigla MBA/HEX.

Sono stati sintetizzati differenti idrogeli variando le quantità dei reagenti. A titolo di esempio, in Tabella 1 vengono riportate tre diverse sintesi. Il prodotto di confronto, non contenente gelatina, à ̈ indicato con la sigla MBA/HEX.

La procedura sperimentale à ̈ stata la seguente:

In una capsula di Petri (à ̧=5 cm), scelta come recipiente di reazione, à ̈ stata versata una soluzione 15% (15MBA47, 15MBA23) o al 25% (25MBA47) p/v di gelatina A in acqua distillata, portata a 50°C su piastra termostatata; a questa, sotto agitazione, sono stati aggiunti 0,1 ml di trietilammina. Dopo 30 minuti à ̈ stata aggiunta, sempre sotto agitazione a 50°C, MBA nelle quantità riportate in Tabella 1. Dopo qualche minuto di agitazione, la miscela di sintesi à ̈ stata trasferita in una stufa termostatata a 50°C dove à ̈ stata lasciata per una notte. Al termine, il prodotto di reazione à ̈ stato sottoposto a tre successivi lavaggi: immersione in etanolo puro per 12 ore, ricambiando con etanolo fresco ogni due ore; immersione in HCl 0,1M per un’ora; immersione in acqua distillata per 12 ore, con ricambio ogni due ore, seguito da immersione in acqua distillata per una notte.

Terminata la procedura di lavaggio, Ã ̈ stata usata una fustella manuale del diametro opportuno per ricavare provini di dimensioni adeguate alle successive prove di caratterizzazione.

Tabella 1: Sigle e quantità dei reagenti utilizzati per la sintesi dei diversi campioni di idrogeli

GELATINA di tipo A MBA HEX TEA<idrogelo>mg mM (NH2 lisina) mg mM mg mM mlMBA/HEX - - 1000 6,490 367,52 3,24 0,1 15MBA47 1000 0,31 47,8 0,310 - - 0,1 25MBA47 1000 0,31 47,8 0,310 - - 0,1 15MBA23 1000 0,31 23,9 0,155 - - 0,1 La stima dei gruppi amminici presenti nella gelatina à ̈ stata determinata sperimentalmente tramite titolazione, secondo la metodica descritta da Cayot P. et al, Analytical Biochemistry 249, 184-200, 1997.

Esempio 2 - Prove di rigonfiamento e di perdita di peso

Le prove sono state condotte su provini di dimensioni iniziali à ̧=12 mm e h=5 mm, essiccati in stufa a 30°C fino a peso costante. Sono stati utilizzati tre provini per ogni tipologia di idrogelo sintetizzato. Prima di iniziare la prova, si à ̈ misurato il peso a secco di ognuno di essi. Ogni provino à ̈ stato immerso in acqua distillata e posto in stufa termostatata a 37°C per tutta la durata della prova. I time point considerati sono compresi tra 5 e 840 ore (35 giorni). Ad ogni time point, i provini vengono pesati ed i valori di peso a secco e allo stato rigonfiato sono utilizzati per calcolare la variazione ponderale secondo la seguente formula:

dove Ptime pointà ̈ il peso rigonfiato al time point considerato e Pseccoà ̈ il peso a secco.

La variazione ponderale di ciascun tipo di idrogelo analizzato à ̈ stata espressa come valore medio e deviazione standard dei valori ottenuti per i tre provini della stessa tipologia.

La procedura di rigonfiamento à ̈ avvenuta sia in acqua distillata che in soluzione fisiologica tamponata (Phosphate Buffered Saline, PBS, pH=7,4, Sigma, P4417), per verificare anche la stabilità a pH fisiologico.

In Figura 1 vengono riportati i valori di variazione ponderale misurati in PBS. Si nota che tutti gli idrogeli a base di gelatina/MBA sono risultati stabili in ambiente fisiologico in vitro fino a 35 giorni, mostrando una cinetica di rigonfiamento rapida nelle prime ore di prova, raggiungendo il plateau a tempi compresi tra 50 e 100 ore di immersione, senza mostrare diminuzioni di peso fino a 35 giorni. Il valore di rigonfiamento a plateau risulta massimo (circa 800%) per gli idrogeli sintetizzati in condizioni di maggior diluizione, mentre nel caso della sintesi avvenuta a concentrazione maggiore il valore massimo di rigonfiamento si mantiene intorno al 550%. Non si notano invece differenze tra idrogeli sintetizzati con diversa quantità di MBA, a parità di concentrazione della miscela di reazione. Per contro, il materiale di confronto (MBA-HEX) si rivela stabile ai tempi di prova considerati, ma mostra valori di rigonfiamento molto ridotti (non superiori al 50%).

Esempio 3 - Caratterizzazione spettroscopica

La caratterizzazione spettroscopica degli idrogeli gelatina/MBA à ̈ stata eseguita mediante spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR), utilizzando lo spettrometro Nicolet 6700 (Thermo Electron Corporation). L’analisi à ̈ stata fatta utilizzando l’accessorio Single Bounce-ATR (Attenuated Total Reflectance), che permette di studiare superfici di piccole dimensioni. I campioni analizzati mediante FTIR sono stati precedentemente essiccati in stufa a vuoto a 37°C per 72 ore, in modo tale da eliminare dallo spettro il contributo dell’acqua presente nei provini. Le analisi FTIR sono state condotte impiegando i seguenti parametri sperimentali: finestra spettrale = 4000-600 cm ̄¹, numero scansioni = 64, cristallo = ZnSe.

La spettroscopia IR ha permesso di verificare la presenza delle bande relative ai gruppi funzionali caratteristici dell’avvenuta formazione del legame ammido-amminico (stiramento del legame N-C delle ammine secondarie a 1220- 1047 cm<-1>e terziarie a 1111-1087 cm<-1>; stiramento del C=O del legame ammidico a 1548 cm<-1>; deformazione d’angolo del legame N-H ammidico a 1642 cm<-1>). Gli spettri IR degli idrogeli ottenuti nell’Esempio 1 sono riportati in Figura 2.

Esempio 4 - Proprietà meccaniche

Lo studio delle proprietà meccaniche degli idrogeli gelatina/MBA à ̈ stato svolto mediante analizzatore dinamico-meccanico (DMA mod. 2980, TA Instruments), mediante prove meccaniche a compressione in rampa di frequenza e prove di rilassamento dello sforzo e successivo recupero della deformazione. Tutte le prove meccaniche sono state effettuate su provini cilindrici (à ̧ = 5 mm, h = 3 mm) precedentemente portati a plateau di rigonfiamento in acqua distillata. Sono stati caratterizzati 3 provini per ciascuna formulazione degli idrogeli di gelatina e MBA e per la formulazione MBA/HEX utilizzata come confronto.

Prove meccaniche a compressione

Sono state svolte prove a compressione in rampa di frequenza (f = 0.5 ÷ 10 Hz, T = 37°C, n = 10 cicli) e temperatura costante (37°C), per ottenere l’andamento del modulo complesso al variare della frequenza. In particolare si possono ottenere informazioni riguardanti la componente reale del modulo complesso, detta modulo conservativo (E’), che rappresenta l’energia accumulata nel materiale e quindi correlata al comportamento elastico, e la componente immaginaria, chiamata modulo dissipativo (E†), che rappresenta invece l’energia dissipata e perciò legata alla componente viscosa del materiale. Il rapporto E†/E’, chiamato tan delta, permette di valutare il contributo delle due componenti al variare dei parametri di prova.

Nelle prove dinamico-meccaniche a compressione gli idrogeli dell’invenzione hanno mostrato valori di modulo conservativo e dissipativo variabili a seconda della composizione chimica. Come riportato in Tabella 2, il modulo conservativo (E’) à ̈ risultato essere compreso tra 4 e 21 kPa.

Tabella 2 - Valori di modulo conservativo (E’) per gli idrogeli a base di gelatina dell’invenzione e per il materiale di controllo (MBA-HEX)

f cycle #1 cycle #5 cycle #10 f cycle #1 cycle #5 cycle #10 [Hz] [Hz]

MBA-HEX 0.5 9.97±7.41 9.33±7.50 9.10±7.42 15MBA47 0.5 13.68±3.49 13.32±3.53 13.09±3.52

1 10.17±7.50 9.47±7.63 9.23±7.56 1 14.24±3.60 13.77±3.63 13.56±3.58 2 10.40±7.64 9.67±7.75 9.44±7.67 2 14.76±3.64 14.36±3.70 14.02±3.76 3 10.80±7.75 9.96±7.88 9.73±7.83 3 15.12±3.82 14.72±3.83 14.42±3.91 4 11.19±8.02 10.31±8.17 10.08±8.05 4 15.46±3.93 15.01±3.98 14.71±3.99 5 11.59±8.27 10.72±8.43 10.38±8.35 5 15.78±4.17 15.32±4.15 15.01±4.19 6 12.09±8.50 11.09±8.64 10.80±8.53 6 16.17±4.10 15.65±4.18 15.23±4.24 7 12.56±8.82 11.43±9.02 10.98±9.05 7 16.23±4.27 15.57±4.48 15.47±4.38 8 13.03±8.99 11.73±9.38 11.60±9.20 8 16.44±4.33 15.93±4.41 15.70±4.41 9 12.94±8.51 12.20±9.41 12.01±9.54 9 16.84±4.45 16.21±4.64 15.86±4.50 10 13.70±9.44 12.45±9.48 12.33±9.34 10 16.87±4.23 16.14±4.23 15.96±4.62 15MBA23 0.5 17.91±0.66 17.91±0.33 17.91±0.12 25MBA47 0.5 4.65±0.09 4.33±0.08 4.00±0.20

1 18.18±0.83 18.11±0.54 18.11±0.18 1 4.83±0.13 4.54±0.04 4.18±0.15 2 18.45±0.76 18.45±0.51 18.42±0.27 2 4.99±0.17 4.67±0.03 4.33±0.14 3 18.75±1.06 18.72±0.79 18.72±0.50 3 5.13±0.28 4.78±0.05 4.45±0.08 4 19.09±1.14 19.04±0.79 19.10±0.58 4 5.11±0.29 4.90±0.10 4.49±0.12 5 19.34±1.23 19.28±0.94 19.34±0.71 5 5.25±0.37 4.99±0.13 4.65±0.13 6 19.44±1.07 19.40±0.98 19.49±0.58 6 5.45±0.21 5.04±0.22 4.72±0.13 7 19.54±1.26 19.48±0.92 19.62±0.68 7 5.50±0.28 5.15±0.15 4.76±0.06 8 19.84±1.25 19.70±1.00 19.87±0.48 8 5.37±0.60 5.31±0.30 4.85±0.04 9 20.09±1.34 19.69±1.16 20.21±0.59 9 5.72±0.05 5.79±0.60 5.26±0.35 10 20.08±1.41 20.53±0.40 20.45±0.64 10 5.75±0.67 5.71±0.23 5.10±0.42 Per tutti gli idrogeli a base di gelatina dell’invenzione si à ̈ osservata una prevalenza della componente elastica al crescere della frequenza di sollecitazione e del numero di cicli di prova, mentre per il materiale di controllo si à ̈ osservato un maggior contributo della componente viscosa al crescere della frequenza. Questo comportamento à ̈ ben visibile nei grafici di Figura 3, dove viene riportato l’andamento di tan delta a tre diversi cicli di prova, al variare della frequenza di sollecitazione per il materiale di confronto (MBA-HEX) e per l’idrogelo 15MBA23.

Prove di rilassamento dello sforzo e di recupero della deformazione Sono state condotte prove di rilassamento dello sforzo seguite dal recupero della deformazione in compressione a 37°C. Ai campioni à ̈ stata applicata una deformazione costante (pari al 5%) e si à ̈ studiato l’andamento nel tempo dello sforzo necessario a mantenere il valore di deformazione imposto; una volta rimossa la deformazione imposta, si à ̈ studiata la capacità di recuperare le dimensioni originali. Sono stati eseguiti 5 cicli di rilassamento dello sforzo ciascuno seguito dal recupero della deformazione, ottenendo, rispettivamente, l’andamento dello sforzo e della deformazione nel tempo.

Per tutti gli idrogeli a base di gelatina dell’invenzione si à ̈ potuto osservare un leggero rilassamento dello sforzo, che rimane costante per i 5 cicli di prova; inoltre, mentre dopo il primo ciclo rimaneva una deformazione residua, questa veniva completamente azzerata nei cicli successivi. Questo comportamento indica una prevalenza della componente elastica in condizioni di sollecitazione ciclica o ripetuta. Per contro, il materiale di confronto non mostra una componente viscosa ma appare decisamente più debole. A titolo di esempio, la Figura 4 mostra l’andamento di stress relaxation in compressione per il materiale di confronto (MBA-HEX) e per l’idrogelo 15MBA23.

Dai risultati delle prove dinamico-meccaniche si evince che gli idrogeli a base di gelatina mostrano globalmente migliori proprietà rispetto al materiale di confronto, che non contiene gelatina. E’ anche possibile selezionare condizioni di sintesi tali per cui gli idrogeli a base di gelatina prodotti presentino un comportamento in cui prevale la componente elastica su quella viscosa.

Esempio 5 - Prove di citocompatibilità indiretta con la linea cellulare L929

Sono state eseguite prove di citotossicità in vitro per verificare l’assenza di rilascio di prodotti a basso peso molecolare e/o residui di reazione. Questi prodotti, se presenti, possono essere rilasciati nell’ambiente di crescita cellulare e possono influenzare l’attività cellulare, causandone anche la morte.

È stata valutata, mediante il saggio colorimetrico MTT (M5655, Sigma), la vitalità di fibroblasti murini della linea L929 coltivati per 24 ore a contatto con terreno di coltura in cui gli idrogeli sono stati immersi per diversi tempi (eluati a 4-168h).

Gli idrogeli si sono dimostrati non citotossici; infatti, le cellule coltivate in presenza degli eluati ottenuti fino a 7 giorni di immersione hanno mostrato livelli di vitalità non significativamente diversi da quelli ottenuti per le cellule coltivate in mezzo di coltura pulito (controllo), come mostrato in Figura 5.

Esempio 6 - Prove di interazione con cellule staminali da tessuto adiposo (ASC)

Sono state eseguite prove di interazione in vitro con cellule staminali isolate da tessuto adiposo prelevato mediante lipoaspirazione da pazienti sottoposte ad intervento di mastectomia. L’isolamento della cellule ASC à ̈ stato svolto seguendo il protocollo descritto da Rigotti et al, Clinical treatment of radiotherapy tissue damage by lipoaspirate transplant: a healing process mediated by adipose derived adult stem cells, Plast Reconstr Surg. 2007; 119(5):1409-1422, mediante la digestione enzimatica del tessuto grasso e cicli di centrifugazione. Le cellule sono state coltivate sugli idrogeli inducendo il differenziamento tramite Adipogenic Induction Medium (AIM) in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM (Ham’s F12 1% Human Serum Albumin) e successivamente coltivando le cellule in Adipogenic Differentiation Medium (ADM) in DMEM (Ham’s F12 1% Human Serum Albumin). L’avvenuto differenziamento in adipociti à ̈ stato studiato valutando la presenza delle gocce lipidiche prodotte ed evidenziate mediante la colorazione Oil Red O (Sigma-Aldrich).

A 7 giorni dalla semina la colorazione Oil Red O ha confermato il differenziamento con la formazione di adipociti, come mostrato dalla Figura 6.

Alla luce di evidenze di letteratura (Tanzi MC et al, Adipose tissue engineering: state of the art, recent advances and innovative approaches. Expert Rev Med Devices. 2009; 6(5):533-51) questo risultato à ̈ da considerarsi molto positivo.

Esempio 7 - Prove di interazione con cellule endoteliali da vena ombelicale umana (HUVEC)

Scopo di queste prove di interazione cellulare à ̈ quello di verificare l’idoneità degli idrogeli oggetto della presente invenzione alla rigenerazione di vasi ematici e, in generale, ad applicazioni a contatto con il sistema cardiovascolare.

Sono stati preparati due diversi idrogeli gelatina/MBA: 25MBA47 e 15MBA23.

Dopo procedura di purificazione effettuata sotto cappa a flusso laminare, i campioni (n = 3) sono stati essiccati a peso costante e successivamente fatti rigonfiare in una soluzione acquosa contenente lo 0,02% p/v di una elastina ricombinante (HELP) con sequenza simile a quella dell’elastina umana (Bandiera A, et Al., Biotechnol Appl Biochem. 2005; 42(Pt 3): 247-56), ottenendo così reticoli interpenetrati gelatina/HELP.

Questi idrogeli sono stati successivamente seminati con cellule HUVEC (human umbelical vein endothelial cells) coltivate in Endothelial Cell growth Medium MV2(basal medium; Promocell, Hidelberg, Germany). A 48 ore dalla semina, le colture sono state fissate con formalina al 4% v/v e colorate con blu di toluidina.

Anche in questo caso i risultati sono stati molto positivi: per tutti i campioni analizzati si à ̈ osservata la formazione di un monostrato confluente omogeneo (Figura 7), indicando l’idoneità di queste matrici per applicazioni di ricostruzione e cura del tessuto vascolare.

Descrizione delle Figure

Figura 1 - Grado di rigonfiamento in ambiente fisiologico a 37°C degli idrogeli gelatina/metilene-bisacrilammide ottenuti con varie formulazioni e del materiale di confronto MBA-HEX.

Figura 2 - Spettri FT-IR di tre idrogeli gelatina/MBA ottenuti con diverse formulazioni.

Figura 3 - Andamento del parametro tan delta a tre diversi cicli di prova, al variare della frequenza di sollecitazione, per il materiale di confronto (MBA-HEX) e dell’idrogelo 15MBA23.

Figura 4 – Curve rappresentative dell’andamento di stress relaxation in compressione (deformazione costante pari al 5%) per il materiale di confronto (MBA-HEX) e l’idrogelo 15MBA23.

Figura 5 - Risultati del saggio di vitalità MTT effettuato sulle cellule L929 a contatto con gli eluati ottenuti a diversi tempi di incubazione con le differenti tipologie di idrogeli. In bianco i dati relativi al solo mezzo di coltura.

Figura 6 - Colorazione con Oil Red O di ASC differenziate in adipociti su a) 15MBA23, b) 15MBA47. Ingrandimento: 500X.

Figura 7 - Colture di HUVEC su gel (A) 25MBA47 e (B) 15MBA23 condizionati con 0.02% p/v HELP a 24 ore dalla semina. Colorazione: blu di toluidina. Ingrandimento: 100X.

Claims (17)

1. RIVENDICAZIONI 1. Idrogelo di gelatina reticolata con bisacrilammidi di ammine primarie o secondarie, in qualità di agenti reticolanti, dette bisacrilammidi essendo preferibilmente scelte tra N,N’-metilene-bisacrilammide (MBA), N,N’-etilene-bisacrilamide, bis-acriloilpiperazina, bis-acriloilcistamina e N,N’-poliossialchilen-bisacrilammide.
2. 2. Idrogelo secondo la rivendicazione 1, dove detto agente reticolante à ̈ N,N’-metilene-bisacrilammide (MBA).
3. 3. Idrogelo secondo le rivendicazioni 1-2, ottenibile mediante un procedimento comprendente i seguenti passaggi: (a) reazione in ambiente acquoso tra gelatina e bisacrilammide; (b) purificazione del prodotto ottenuto nel passaggio (a); (c) opzionale essiccamento o liofilizzazione.
4. 4. Idrogelo secondo la rivendicazione 3, in cui la reazione del passaggio (a) comprende: (a’) preparazione di una soluzione acquosa di gelatina ad una temperatura compresa tra i 30 e i 70°C, in presenza di un composto amminico terziario o di una base inorganica, impiegando concentrazioni di gelatina variabili dal 5 al 40% p/v; (b’) aggiunta di bisacrilammide alla soluzione ottenuta in (a’) in un quantitativo tale che il rapporto molare tra i gruppi amminici presenti nella gelatina (mM (NH2) lisina) e i gruppi acrilammide presenti nella bisacrilammide à ̈ compreso tra 0,5 e 2,5; (c’) riscaldamento della soluzione ottenuta in b) ad una temperatura compresa tra 30 e 70°C, per un tempo compreso tra 4 e 24 ore.
5. 5. Idrogelo secondo la rivendicazione 3, in cui la purificazione del passaggio (b) comprende successivi lavaggi con etanolo, con una soluzione di HCl 0,1 M ed infine con acqua.
6. 6. Idrogelo secondo le rivendicazioni 1-5, in cui la gelatina à ̈ gelatina bovina o porcina.
7. 7. Idrogelo secondo le rivendicazioni 3-5 in cui il composto amminico terziario à ̈ trietilammina in quantità variabile tra 0,1 e 0,3 ml per grammo di gelatina.
8. 8. Idrogelo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, contenente una sostanza biologicamente attiva o cellule.
9. 9. Composizione contenente un idrogelo secondo la rivendicazioni 1-8 in un mezzo acquoso o in forma essiccata.
10. 10. Idrogelo secondo le rivendicazioni 1-8 o composizione secondo la rivendicazione 9 per uso nel rilascio controllato di farmaci, polipeptidi o biomolecole attive.
11. 11. Idrogelo o composizione secondo la rivendicazione 10, in cui le biomolecole attive sono fattori di crescita.
12. 12. Uso di un idrogelo secondo le rivendicazioni 1-8 o di una composizione secondo la rivendicazione 9 per la coltura, crescita o proliferazione di cellule in vitro.
13. 13. Uso secondo la rivendicazione 12, in cui dette cellule sono cellule staminali adulte isolate da tessuto adiposo e cellule endoteliali di cordone ombelicale umano (HUVEC).
14. 14. Uso di un idrogelo secondo le rivendicazioni 1-8 o di una composizione secondo la rivendicazione 9 per favorire la rigenerazione in vitro di un tessuto molle.
15. 15. Uso secondo la rivendicazione 14, in cui il tessuto molle à ̈ scelto tra tessuto adiposo, tessuto vascolare o pelle.
16. 16. Uso di un idrogelo secondo le rivendicazioni 1-8 o di una composizione secondo la rivendicazione 9 come carrier di cellule.
17. 17. Impianto o innesto di un idrogelo contenente cellule secondo le rivendicazioni 8-9.