ITMI20102224A1 - Metodo per la diagnosi e/o il monitoraggio della mucormicosi - Google Patents

Description

DESCRIZIONE d

La presente invenzione si riferisce ad un metodo per la diagnosi e/o il monitoraggio dell’infezione attiva o pregressa da Mucor che consiste nell'identificazione di cellule T Mucorales-specifiche in campioni da fluidi biologici prelevato dal paziente e messi in contatto con un antigene di Mucor. La rilevazione di tali risposte immuni specifiche può essere ottenuta mediante l’esecuzione di saggi immunoenzimatici (ELISPOT, Quantiferon) (Lalvani, Chest, 131: 1898-1906, 2007) o di saggi immunocitofluorimetrici [Cytokine Secretion Assay (CSA) (Goodyear et al., Blood, 112: 3362-3372, 2008)], Intracellular Cytokine Staining (ICS) (Jaimes et al., J. Immunol. Method, 1-15, 2010)] in vitro, qui incorporati per riferimento. Più in dettaglio, il metodo in questione prevede la verifica della presenza di cellule T specifiche produttrici di IFN-γ, di cellule T specifiche produttrici di IL-10 e/o di cellule T specifiche produttrici di IL-4.

STATO DELL’ARTE

Le infezioni fungine invasive (IFI) rappresentano una rilevante causa di morbidità e mortalità nei pazienti affetti da emopatie maligne, non soltanto sottoposti a trapianto di midollo allogenico, ma anche sottoposti a chemioterapia standard. Il rischio di morte dei pazienti affetti da IFI raggiunge anche percentuali del 90%.

L’agente eziologico maggiormente responsabile delle IFI à ̈ rappresentato da funghi della specie Aspergillus, che tiene conto di poco più del 50% di tutte le infezioni fungine invasive. Tuttavia negli ultimi anni, funghi dell'ordine Mucorales [Nota degli inventori: Una recente riclassificazione ha abolito l'ordine degli Zigomiceti e ha incluso i funghi dell'ordine Mucorales al subphylum provvisorio Mucormycotina, e i funghi dell'ordine Entomophtorales a quello degli Entomophtormycotina. In attesa di una definitiva riclassificaione e di una reintroduzione dell'ordine degli Zigomiceti, considerato che gli Entomophtorales causano infezioni di grado lieve e croniche, quasi mai invasive e mai in soggetti con emopatie maligne, tratteremo in questo testo le infezioni invasive da Mucorales come sinonimo delle infezioni precedentemente denominate Zigomicosi invasive] sono divenuti il secondo più comune agente responsabile di infezioni fungine invasive, con percentuali variabili dal 3% al 15% a seconda delle casistiche. Le infezioni invasive da Mucorales (IM), sono gravate da elevatissime percentuali di mortalità, dal 70% al 90% dei pazienti affetti. Le cause di una mortalità così elevata risiedono nella mancanza di metodiche diagnostiche che permettano una diagnosi certa e tempestiva di mucormicosi. E' stato stimato come, in caso di IM, un ritardo nell'inizio di un'efficace terapia antifungina di sei giorni dall'insorgenza dei primi sintomi di IM, si associ ad un incremento della mortalità di due volte e della riduzione della sopravvivenza a 12 settimane a meno del 20% dei pazienti (Chamilos et al., Clin. Infect. Dis.; 47: 503-509, 2008).

Le metodiche diagnostiche attualmente in uso per la diagnosi di IM sono rappresentate pressoché esclusivamente dall’esame istologico e dall'esame colturale. Tuttavia entrambe sono fortemente limitate da: a. invasività e difficoltà nell'ottenimento del campione bioptico a causa delle condizioni cliniche dei pazienti affetti; b. bassa sensibilità (l'esame colturale risulta positivo in una percentuale di circa il 10-20 % dei casi) (Lass-Florl, Clin. Microbiol. Infect.; 15: 60-65, 2009); c. contaminazione del campione da parte di funghi ambientali (in uno studio, solo 7.6% dei campioni colturali sui cui sono stati rilevati Mucorales, derivava da pazienti realmente affetti da IM) (Torres-Narbona et al., J. Clin. Microbiol.; 2051-2053, 2007); d. fattori influenzanti negativamente la crescita di questi funghi in coltura, quali freddo e inibitori proteici; e. difficoltà nell'isolare Mucorales da esami colturali di sangue periferico (Chayakuleeree M, Eur. J. Microbiol. Infect. Dis.; 25: 215-229, 2006).

Inoltre, i segni radiologici, riscontrati più frequentemente in caso di IM alla tomografia assiale computerizzata (CT), non sono in grado di differenziare una IM da una aspergillosi invasiva, considerato che entrambi i patogeni sono angioinvasivi e presentano spesso le stesse caratteristiche radiologiche (Roden et al., Clin. Infect. Dis. 41: 634-653, 2005).

Infine, la reazione polimerasica a catena (PCR) per l'amplificazione e il riscontro su materiali biologici di acidi nucleici di Mucorales manca di standardizzazione, ed à ̈ pressoché esclusivamente utilizzata come test di conferma su materiale bioptico e non come test di screening sul plasma, quindi con gli stessi limiti di accesso dell'esame bioptico (Bialek et al., J. Clin. Pathol., 58: 1180-1184, 2005; Kasai et al., J. Clin. Microbiol., Vol.46, n. 11, 3690-3702, 2008; Hata et al., J. Clin. Microbiol., Vol.46, n. 7, 2353-2358, 2008).

La diagnosi di IM à ̈ così basata su gradi più o meno elevati di probabilità e molto raramente, e spesso tardivamente rispetto al decorso dell'infezione, di certezza.

Studi recenti, dapprima in ambito murino, poi anche nell’uomo, hanno dimostrato che l’immunità adattiva, ovvero quella rappresentata dalle cellule T, svolge un ruolo preponderante nelle difese dell’ospite contro i funghi. In particolare, un’immunità cellulo-mediata polarizzata a cellule T helper di tipo 1 (TH1), produttrice di interferone gamma (IFN-g) risulta protettiva nei confronti di infezioni fungine, specialmente aspergillosi invasiva; mentre un’immunità cellulo-mediata polarizzata a cellule T helper di tipo 2 (TH2), produttrice di interleuchina 10 (IL-10) risulta permissiva nei confronti di IA (Cenci et al., Infection and Immunity, Vol.

65, n. 2, 564-570, 1997; Hebart et al., Blood, Vol. 100, n. 13, 4521-4528, 2002; Romani, Nature Reviews, Vol.4, 1-13, 2004).

La metodica ELISPOT (Enzyme-linked ImmunoSpot Assay) si à ̈ dimostrata uno strumento sensibile e specifico nella diagnosi di infezione da micobatterio della tubercolosi o in infezioni di origine virale sia in soggetti immunocompetenti che in soggetti immunodepressi, mediante la ricerca di cellule T specifiche per il micobatterio (Lalvani, Am. J. Respir. Crit. Care Med., Vol. 166, 789-790, 2002), o per l’isolamento di cellule T specifiche per il virus di Epstein-Barr in pazienti sottoposti a trapianto di rene (Comoli et al., Blood, 99: 2592-2598, 2002).

ELISPOT à ̈ un saggio basato sulla risposta immunologica cellulare verso uno specifico antigene. Tale metodica viene eseguita generalmente su piastre a 96 pozzetti coattati da anticorpi monoclonali specifici, nei quali le cellule e l’antigene specifico vengono incubati per 6-48 ore.

Durante tale periodo, avviene la risposta cellulare e vengono prodotte le citochine specifiche a seconda del tipo di anticorpo/antigene utilizzato che generano macchie (spot) rilevate e contate attraverso comuni software di analisi dell’immagine.

La metodica ELISPOT per una generica valutazione dell’attività cellulare del sangue à ̈ descritta nella domanda di brevetto europeo EP0957359 (Volkmar et al.), qui incorporato per riferimento.

La metodica ELISPOT applicata ai linfociti T per la diagnosi o il monitoraggio di malattie come l’epatite B, l’epatite C, la tubercolosi, la malaria, l’HIV o l’influenza à ̈ descritta nella domanda di brevetto internazionale WO98/23960 (Lalvani et al.), qui incorporato per riferimento.

La metodica ELISPOT applicata ai linfociti T reattivi agli antigeni derivanti dalla proteina ESAT-6, espressa dal Mycobacterium Tubercolosis, per la diagnosi della tubercolosi o anche solo al contatto dell’ospite con il patogeno (malattia latente) à ̈ descritta nella domanda di brevetto internazionale WO00/26248 (Lalvani et al.), qui incorporato per riferimento.

Ulteriore metodica ELISPOT applicata ai linfociti T reattivi non solo agli antigeni derivanti dalla ESAT-6 ma anche dalla proteina CFP-10 Ã ̈ descritta nella domanda di brevetto internazionale WO2004/005925 (Lalvani et al.), qui incorporato per riferimento.

La metodica ELISPOT applicata ai linfociti T reattivi agli antigeni di ife e conidi di Aspergillus fumigatus per la diagnosi di Aspergillosi Invasiva à ̈ descritta nella domanda di brevetto europeo WO2008/075395 (Università di Modena e Reggio Emilia), qui incorporato per riferimento.

La metodica ELISPOT Ã ̈ stata fino ad oggi pertanto utilizzata per malattie di origine virale e per infezioni batteriche, in particolare per infezioni da Mycobacterium Tubercolosis, mentre per le infezioni fungine, unicamente per la forma invasiva delle infezioni da Aspergillus fumigatus.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

E' noto che saggi immunoenzimatici, in particolare ELISPOT, e immunocitofluorimetrici possono essere vantaggiosamente utilizzati per la diagnosi, in particolare una diagnosi precoce e/o il monitoraggio anche di infezioni fungine, in particolare in caso di Mucormicosi Invasiva (IM). Lo scopo dell’invenzione à ̈ quello di utilizzare tali saggi, e in particolare il saggio ELISPOT, per l’identificazione e la conta di cellule T specifiche per Mucorales, in modo tale che la semplice rilevazione di cellule produttrici di IFN-g, di cellule produttrici di IL-10 e/o di cellule produttrici di IL-4, possano essere utilizzati per la definizione del rischio di infezione, per la diagnosi di IM, per il monitoraggio dell’infezione attiva o pregressa e per migliorare la gestione clinica dei pazienti a rischio e/o affetti da tale patologia.

Oggetto della presente invenzione à ̈ pertanto un metodo per la diagnosi e/o il monitoraggio della IM che comprende l’esecuzione di un saggio immunoenzimatico o immunocitofluorimetrico in vitro su piastre di microtitolazione, come ad esempio del tipo a 96 pozzetti, caratterizzato dal fatto di porre a contatto il fluido biologico, prelevato dal paziente, con un antigene di funghi della classe Mucorales, in particolare un antigene estrattivo di Mucorales.

Secondo un aspetto della presente invenzione, detto metodo consente l’identificazione e la conta di cellule T specifiche per Mucorales, al fine di verificare la presenza e/o definire un rapporto tra quelle produttrici di IFN-g, quelle produttrici di IL-10 e/o quelle produttrici di IL-4.

Secondo la presente invenzione, detto saggio immunoenzimatico à ̈ ELISPOT (Enzyme-linked ImmunoSpot Assay) e detto antigene, preferibilmente antigene estrattivo, può essere ottenuto da conidi di Mucorales o da ife di Mucorales.

I conidi (o conidiospore) sono le strutture riproduttive, prevalentemente unicellulari, del fungo che si formano all’apice delle ife che, a loro volta, sono i filamenti unicellulari o pluricellulari di forma cilindrica che, disposti uno sull’altro, formano il micelio ovvero il corpo vegetativo dei funghi. In particolare, secondo una realizzazione della presente invenzione, detto antigene à ̈ ottenuto da conidi di Mucorales che vengono raccolti dopo duequattro giorni di coltura, preferibilmente tre giorni di coltura, preferibilmente su terreno agar saboraud, filtrati attraverso una garza sterile. Dopo filtrazione, i conidi vengono posti in terreno saboraud liquido e tenuti in agitazione per circa 6-18 ore, preferibilmente 12 ore, per ottenere la germinazione che consente l’esposizione dei determinanti antigenici. I conidi germinati vengono lavati in soluzione salina (PBS), inattivati al calore, preferibilmente per circa 1 ora a 100°C, e contati. Successivamente, detto antigene viene trattato mediante sonicazione, utilizzando preferibilmente un omogeneizzatore ad ultrasuoni che raggiunge i 400W di potenza massima e lavora ad una frequenza di 24KhZ. I conidi vengono sottoposti a 4 cicli di sonicazione della durata di circa 10 secondi, ciascuno a circa il 70% di potenza massima. Infine, i conidi germinati e sonicati vengono storati in PBS o medium di coltura tra circa -30 e -10°C, preferibilmente a -20°C.

Secondo un’ulteriore realizzazione della presente invenzione detto antigene, preferibilmente antigene estrattivo, à ̈ ottenuto da ife di Mucorales che vengono omogenate, ad esempio utilizzando un mortaio con biglie di un materiale inerte, preferibilmente biglie di vetro in tampone, preferibilmente tampone 50 mM Tris-Hcl con un pH di circa 7.5. L’estratto proteico così ottenuto à ̈ recuperato dopo centrifugazione tra 10 e 14000 rpm per circa 10 minuti e conservato ad una temperatura tra circa -30 e -10°C, preferibilmente –20°C.

Ai fini della presente invenzione con l’espressione “antigene di Mucorales†si intende quindi un costituente della struttura del fungo trattato in maniera tale che sia capace di stimolare una risposta di cellule T specifiche.

Il fluido biologico utilizzato secondo il metodo della presente invenzione può essere sangue, liquido da lavaggio bronchioalveolare (BAL) o liquido pleurico da pazienti a rischio di Mucormicosi invasiva o già infetti.

In particolare, tale fluido può essere ottenuto da prelievo endovenoso citratato, preferibilmente di circa 20 ml, da prelievo di liquido pleurico citratato, preferibilmente di circa 20 ml, o da prelievo di liquido da BAL citratato, preferibilmente di circa 30 ml.

Secondo il metodo della presente invenzione, dal prelievo di sangue endovenoso possono essere utilizzate le cellule mononucleate o i soli linfociti T isolati.

Secondo la presente invenzione, il campione di sangue, di liquido pleurico o di liquido di lavaggio bronchioloalveolare viene diluito con circa un ugual volume di terreno di coltura, ad esempio RPMI 1640, e quindi sottoposto a centrifugazione su gradiente di densità (Ficoll, Lymphoprep) per separare la popolazione delle cellule mononucleate (PBMCs). Dopo 2 lavaggi, ad esempio in RPMI 1640, le cellule sono congelate, preferibilmente in azoto liquido, ancora più preferibilmente in presenza di 20% DMSO e 50% di siero fetale bovino (FBS) per gli esperimenti ELISPOT.

I campioni cellulari vengono poi scongelati lentamente in bagno termostato a 35-40°C, preferibilmente a circa 37°C. Viene aggiunta DNAse alla concentrazione finale di circa 10mg/ml e lasciata agire a temperatura ambiente per circa 20 minuti. Le cellule vengono trasferite in una provetta e risospese delicatamente con circa 10 ml di terreno RPMI 1640 addizionato di circa 5% di FBS che viene aggiunto goccia a goccia. Dopo una prima centrifugazione a circa 1000 rpm per circa 10’, il pellet cellulare ottenuto viene nuovamente risospeso in terreno di coltura R10 (RPMI 1640; 10% FBS; 1% sodio piruvato; 1% ampicillina ; 0.5% gentamicina; 18 UI/ml IL-2) e quindi le cellule vengono contate in camera di BÃ1⁄4rker.

Per la separazione delle cellule T CD3+ à ̈ stato utilizzato il “Pan T cell Isolation Kit human†distribuito da Miltenyi Biotech S.r.l. (Calderara di Reno, Bologna, Italia). La separazione delle cellule T CD3+ avviene per deplezione delle cellule non-T (selezione negativa). Le cellule non-T marcate con un cocktail di anticorpi monoclonali biotina-coniugati (CD14, 16, 19, 36, 56, 123 e Glicoforina A ), sono fatte reagire con anticorpi monoclonali anti-biotina coniugati a MicroBiglie magnetiche. Il passaggio delle cellule marcate (cellule non-T) e non-marcate (cellule T CD3+) attraverso una colonna MACS-MS (Miltenyi) in presenza di un campo magnetico determina il passaggio delle cellule T CD3+ e il blocco delle cellule non-T. La procedura di separazione à ̈ stata eseguita su campioni cellulari dopo scongelamento, seguendo le indicazioni descritte da Miltenyi.

Secondo una ulteriore realizzazione della presente invenzione detto antigene può essere ottenuto da conidi di Mucorales che sono raccolti dopo 2-4 giorni di coltura (ad esempio su terreno agar saboraud) mediante lavaggio dello strato superficiale della coltura fungina con acqua sterile. Il liquido di lavaggio ottenuto viene filtrato attraverso una garza sterile e sottoposto a centrifugazione tra 10000 e 15000 rpm, preferibilmente a circa 12000 rpm per 5-15 minuti, preferibilmente 10 minuti. Il surnatante viene eliminato e il pellet di conidi così ottenuto viene risospeso in saboraud liquido e tenuto in agitazione per 6-18 ore, preferibilmente per circa 12 ore, per ottenere la germinazione. I conidi germinati vengono lavati in soluzione salina (PBS), inattivati al calore, preferibilmente per circa 1 ora a 100°C, e contati. Successivamente, detto antigene (2-4 milioni di conidi germinati) viene trattato mediante sonicazione, preferibilmente utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni che raggiunge i 400W di potenza massima e lavora ad una frequenza di 24KhZ. I conidi vengono sottoposti a 4 cicli di sonicazione della durata di circa 10 secondi ciascuno, preferibilmente al 70% di potenza massima. Infine, i conidi germinati e sonicati vengono risospesi in PBS o medium di coltura (1ml) e utilizzati subito o storati a circa -20°C ed utilizzati in seguito.

I conidi così ottenuti vengono utilizzati nell’esperimento Elispot alla concentrazione finale di circa 100.000-200.000 conidi/ml e nell'esperimento CSA alla concentrazione 200.000-400.000 conidi/ml. Secondo una ulteriore realizzazione della presente invenzione, detto antigene estrattivo può essere ottenuto da ife di Mucorales che vengono raccolte per raschiamento di più piastre di coltura con una lama di bisturi e risospese in acqua sterile. Dopo aver vortexato si procede alla filtrazione attraverso una garza sterile per eliminare l’eventuale agar. Il micete così ottenuto viene sottoposto a centrifugazione a circa 15000 rpm per circa 10 minuti, quindi, eliminato il surnatante, viene congelato in azoto liquido per circa 12 ore. In seguito, il micete scongelato, viene omogeneizzato in un mortaio in presenza di un volume di biglie di materiale inerte, preferibilmente biglie di vetro, pari a quello del micete, in tampone, preferibilmente tampone 50 mM Tris-Hcl, ad un pH di circa 7.5. L’estratto proteico così ottenuto à ̈ recuperato dopo centrifugazione a circa 14000 rpm per circa 20’. Dopo valutazione del contenuto proteico, l’estratto da ife, viene utilizzato nell’esperimento Elispot alla concentrazione finale di circa 6-10 microgrammi/ml e nell'esperimento CSA alla concentrazione finale di 10 microgrammi/ml.

L’antigene ottenuto può essere utilizzato subito o può essere storato mediante congelamento a circa -20°C e utilizzato in seguito.

Per gli scopi della presente invenzione, la soglia di positività, ovvero il numero minimo di cellule T specifiche produttrici di IFN-γ, cellule T specifiche produttrici di IL-10 e/o cellule T specifiche produttrici di IL-4 considerato indicativo della presenza di mucormicosi invasiva à ̈ compreso tra 2 e 10 SFCs, preferibilmente di 5 SFCs.

PARTE SPERIMENTALE

Metodo ELISPOT per cellule T produttrici di IFN-gamma Mucoralesspecifiche

Per tutti gli esperimenti ELISPOT sono state utilizzate piastre di microtitolazione da 96 pozzetti (Multiscreen HTS IP Sterile Plate) distribuite da Millipore (Bedford, MA, USA) incluse nel kit ELISPOT IFN-gamma distribuito da Mabtech (Nacka Strand, Svezia). Il fondo dei pozzetti della piastra, costituito da nitrocellulosa à ̈ coattato con un anticorpo monoclonale specifico per IFN-g. Le piastre vengono rimosse dall’imballaggio e lavate 4 volte con PBS 1X (200 ml/pozzetto). Le piastre vengono fissate con R10 (200 ml/pozzetto), e incubate a temperatura ambiente per ³30’.

Il mezzo di fissaggio viene rimosso e 100.000-200.000 cellule in terreno R10 vengono dispensate nei singoli pozzetti (volume finale di 100-150 ml/pozzetto) e quindi stimolate con conidi germinati sonicati inattivati al calore (1-2x105 conidi/ml) o con estratto proteico (6-10 mg/ml) durante una incubazione a 37°C in presenza di CO2 (5%) per circa 20 ore.

I controlli positivi sono costituiti dalle medesime cellule incubate con fitoemagglutinina (PHA) (25 mg/ml) o con un anticorpo anti CD3 umano (Mabtech) utilizzato alla diluizione di 1:1000; il controllo negativo à ̈ costituito dalle sole cellule, senza alcuna stimolazione. Tutti gli esperimenti vengono condotti in triplicato.

Dopo incubazione, la piastra viene svuotata e sottoposta a 5 lavaggi successivi con PBS 200µl per pozzetto. I complessi citochina-anticorpo vengono colorati mediante reazione enzimatica e aggiunta di un substrato cromogenico: in ogni singolo pozzetto vengono distribuiti 100ml di anticorpo secondario coniugato con fosfatasi alcalina, distribuito da Mabtech, diluito 1:200 in PBS 1x e 0.5% di siero bovino fetale (FBS) e dopo 120’ di incubazione a temperatura ambiente viene aggiunto il substrato 100ml (BCIP/NTB-plus), anch’esso distribuito da Mabtech. La reazione con il substrato viene arrestata dopo 10-15’ lavando la piastra con acqua corrente. La membrana di nitrocellulosa, viene fatta seccare all’aria per almeno 4 h. Ogni singola macchia (spot) che compare sul fondo del pozzetto corrisponde alla secrezione della citochina di una singola cellula (spot forming cell: SFC). Gli spots vengono quindi contati automaticamente mediante uno strumento per l’analisi di immagine (AID ELISPOT Reader System, Amplimedical) gestito da un software in grado di fornire una valutazione facile e veloce degli spots in base alla loro taglia e intensità. Metodo ELISPOT per cellule T produttrici di IL-10 Mucorales-specifiche Per tutti gli esperimenti ELISPOT sono state utilizzate piastre di microtitolazione da 96 pozzetti (Multiscreen HTS IP Sterile Plate) distribuite da Millipore (Bedford, MA, USA) incluse nel kit ELISPOT IL-10 distribuito da Mabtech (Nacka Strand, Svezia). Il fondo dei pozzetti della piastra, costituito da nitrocellulosa à ̈ coattato con un anticorpo monoclonale specifico per IL-10. Le piastre vengono rimosse dall’imballaggio e lavate 4 volte con PBS 1X (200 ml/pozzetto). Le piastre vengono fissate con R10 (200 ml/pozzetto), e incubate a temperatura ambiente per ³30’.

Il mezzo di fissaggio viene rimosso e 30.000-100.000 cellule in R10 vengono dispensate nei singoli pozzetti (volume finale di 100-150 ml/pozzetto) e quindi stimolate con conidi germinati sonicati inattivati al calore (1-2x105 conidi/ml) o con estratto proteico (6-10 mg/ml) durante una incubazione a 37°C in presenza di CO2 (5%) per circa 40 ore. I controlli positivi sono costituiti dalle medesime cellule incubate con fitoemagglutinina (PHA) (25 mg/ml) o con un anticorpo anti CD3 umano (Mabtech) utilizzato alla diluizione di 1:1000; il controllo negativo à ̈ costituito dalle sole cellule, senza alcuna stimolazione. Tutti gli esperimenti vengono condotti in triplicato.

Dopo incubazione, la piastra viene svuotata e sottoposta a 5 lavaggi successivi con PBS 200µl per pozzetto. I complessi citochina-anticorpo vengono colorati mediante reazione enzimatica e aggiunta di un substrato cromogenico: in ogni singolo pozzetto vengono distribuiti 100ml di anticorpo secondario coniugato con fosfatasi alcalina, distribuito da Mabtech, diluito 1:200 in PBS 1x e 0.5% di siero bovino fetale (FBS) e dopo 120’ di incubazione a temperatura ambiente viene aggiunto il substrato 100ml (BCIP/NTB-plus), anch’esso distribuito da Mabtech. La reazione con il substrato viene arrestata dopo 30-40’ lavando la piastra con acqua corrente. La membrana di nitrocellulosa, viene fatta seccare all’aria per almeno 4 h. Ogni singola macchia (spot) che compare sul fondo del pozzetto corrisponde alla secrezione della citochina di una singola cellula (spot forming cell: SFC). Gli spots vengono quindi contati automaticamente mediante uno strumento per l’analisi di immagine (AID ELISPOT Reader System, Amplimedical) gestito da un software in grado di fornire una valutazione facile e veloce degli spots in base alla loro taglia e intensità.

Metodo ELISPOT per cellule T produttrici di IL-4 Mucorales-specifiche Per tutti gli esperimenti ELISPOT sono state utilizzate piastre di microtitolazione da 96 pozzetti (Multiscreen HTS IP Sterile Plate) distribuite da Millipore (Bedford, MA, USA) incluse nel kit ELISPOT IL-10 distribuito da Mabtech (Nacka Strand, Svezia). Il fondo dei pozzetti della piastra, costituito da nitrocellulosa à ̈ coattato con un anticorpo monoclonale specifico per IL-4. Le piastre vengono rimosse dall’imballaggio e lavate 4 volte con PBS 1X (200 ml/pozzetto). Le piastre vengono fissate con R10 (200 ml/pozzetto), e incubate a temperatura ambiente per ³30’.

Il mezzo di fissaggio viene rimosso e 100.000-250.000 cellule in R10 vengono dispensate nei singoli pozzetti (volume finale di 100-150 ml/pozzetto) e quindi stimolate con conidi germinati sonicati inattivati al calore (1-2x105 conidi/ml) o con estratto proteico (6-10 mg/ml) durante una incubazione a 37°C in presenza di CO2 (5%) per circa 40 ore. I controlli positivi sono costituiti dalle medesime cellule incubate con fitoemagglutinina (PHA) (25 mg/ml) o con un anticorpo anti CD3 umano (Mabtech) utilizzato alla diluizione di 1:1000; il controllo negativo à ̈ costituito dalle sole cellule, senza alcuna stimolazione. Tutti gli esperimenti vengono condotti in triplicato.

Dopo incubazione, la piastra viene svuotata e sottoposta a 5 lavaggi successivi con PBS 200µl per pozzetto. I complessi citochina-anticorpo vengono colorati mediante reazione enzimatica e aggiunta di un substrato cromogenico: in ogni singolo pozzetto vengono distribuiti 100ml di anticorpo secondario coniugato con fosfatasi alcalina, distribuito da Mabtech, diluito 1:300 in PBS 1x e 0.5% di siero bovino fetale (FBS) e dopo 120’ di incubazione a temperatura ambiente viene aggiunto il substrato 100ml (BCIP/NTB-plus), anch’esso distribuito da Mabtech. La reazione con il substrato viene arrestata dopo 30-40’ lavando la piastra con acqua corrente. La membrana di nitrocellulosa, viene fatta seccare all’aria per almeno 4 h. Ogni singola macchia (spot) che compare sul fondo del pozzetto corrisponde alla secrezione della citochina di una singola cellula (spot forming cell: SFC). Gli spots vengono quindi contati automaticamente mediante uno strumento per l’analisi di immagine (AID ELISPOT Reader System, Amplimedical) gestito da un software in grado di fornire una valutazione facile e veloce degli spots in base alla loro taglia e intensità. Preparazione dell’antigene da conidi di Mucorales

Dopo tre giorni di coltura di Mucorales su terreno agar saboraud i conidi vengono raccolti mediante lavaggio dello strato superficiale della coltura con 30 ml di acqua sterile.

Il liquido di lavaggio viene filtrato attraverso una garza sterile e successivamente sottoposto a centrifugazione a 12000 rpm per 10 minuti. Il surnatante viene eliminato e il pellet di conidi così ottenuto viene risospeso in saboraud liquido e tenuto in agitazione per 12h per ottenere la germinazione. I conidi germinati vengono lavati in soluzione salina (PBS), inattivati al calore per 1 ora a 100°C e contati. Successivamente, detto antigene (2-4 milioni di conidi germinati) viene trattato mediante sonicazione utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni che raggiunge i 400W di potenza massima e lavora ad una frequenza di 24KhZ. I conidi vengono sottoposti a 4 cicli di sonicazione della durata di 10 secondi ciascuno al 70% di potenza massima. Infine, i conidi germinati e sonicati vengono risospesi in PBS o medium di coltura (1ml) e utilizzati subito o storati a -20°C ed utilizzati in seguito .

I conidi così ottenuti vengono utilizzati nell’esperimento Elispot alla concentrazione finale di circa 100.000-200.000 conidi/ml e nell'esperimento CSA alla concentrazione 200.000-400.000 conidi/ml. Preparazione dell’antigene da ife di Mucorales

Da coltura di Mucorales su terreno agar saboraud si procede al raschiamento di più piastre di coltura e sospensione in 30 ml di acqua sterile del prodotto raschiato.

La sospensione ottenuta viene agitata su vortex, filtrata attraverso una garza sterile e centrifugata a 15000 per 10 minuti.

Il surnatante viene quindi eliminato e si procede al congelamento del pellet di micete per 12 ore in azoto liquido.

Il pellet di micete viene poi scongelato e si procede con l’omogenizzazione in mortaio con pari volume fungo/biglie in tampone 50mM di Tris-HCl ad un pH di circa 7.5.

L’omogenato ottenuto viene centrifugato a 14000 per 20 minuti e viene valutato il contenuto proteico.

Le ife ottenute possono infine essere direttamente utilizzate nell’esperimento ELISPOT secondo la presente invenzione ad una concentrazione di 6-10 mg/ml. In alternativa, le ife vengono congelate a – 20°C fino al momento dell’utilizzo secondo la presente invenzione.

STUDIO CLINICO

Per valutare se la determinazione e la conta delle cellule T producenti IFNγ-TH1, IL-10 (IL-10-TH2) e IL-4 (IL-4-TH2) Mucorales specifiche attraverso I saggi immunospot enzimatico (ELISPOT) e di immunofluorimetrico (CSA) potessero migliorare la diagnosi e il monitoraggio clinico della IZ, sono stati eseguiti test clinici su una serie di 13 pazienti ematologici con neutropenia e infezioni, radiologicamente e clinicamente documenate, e cinque donatori sani. Tre dei pazienti ematologici con infezione erano affetti da Zigomicosi invasiva provata. Cellule mononucleate di sangue periferico (PBMCs) sono state separate da ciascun paziente o soggetto sano attraverso centrifugazione a gradiente Ficoll-Hypaque (Linaris Bettingen an Main, Germany) e poi messe in coltura, in parte, in piastra a 96 pozzetti polivinilidene di fluoruro con anticorpi monoclonali anti-IFN gamma, anti-IL-10 e anti-IL-4 (Mabtech, Nacka Strand, Sweden), in parte stimolate con gli antigeni di cui di seguito, per poi essere analizzati al citofluorimetro. Le cellule sono state stimolate con conidi germinati inattivati al calore e sonicati, preparati da Mucorales isolato da paziente, e/o con un estratto cellulare idro-solubile di Mucorales, con PHA e con antiCD3. 1x10<5>cellule/pozzetto vengono messe in coltura in saggio IFN gamma per sedici ore, mentre 3x10<4>cellule/pozzetto e 2x10<5>cellule/pozzetto, vengono messe in coltura per 40 ore in saggio IL-10 e IL-4, rispettivamente.

Tutte le condizioni del test sono eseguite in triplicato e i risultati vengono considerati positivi se: 1. il numero delle cellule formanti macchie (SFC)/10^6 cellule in pozzetti antigene-Mucorales stimolati à ̈ doppiamente maggiore che nei pozzetti di controllo (cellule in pozzetti non antigene-Mucorales stimolati) e vi sono almeno 20 macchie (spot) e/o 2. la differenza di SFC tra negativo e stimolato e maggiore o uguale a 5.

Il primo paziente à ̈ un uomo di 54 anni, che, al giorno 16 del ciclo chemioterapico di induzione per leucemia mieloide acuta (LAM), durante la fase neutropenica, ha sviluppato febbre e una lesione polmonare destra . E' stata intrapresa una terapia antibiotica empirica con glicopetidi e carbapenemi e terapia con L-amB al dosaggio di 3 mg/kg/die. Gli esami colturali e molecolari di sangue, urine, feci e del liquido di lavaggio bronchioloalveolare (BALf) sono risultati ripetutamente negativi per la presenza di batteri, funghi o virus. Al giorno 22, vi à ̈ stato il riscontro di ingrandimento volumetrico della lesione polmonare destra. Al giorno 36, si à ̈ osservato ulteriore ingrandimento dell'area di consolidamento nodulare. Al giorno 47, à ̈ stata eseguita una resezione chirurgica della lesione polmonare. Al giorno 52, il referto istologico della biopsia polmonare à ̈ risultato compatibile con Mucormicosi invasiva. Al giorno 58, l'esame colturale sulla biopsia polmonare e l'esame moelcolare hanno caratterizzato un micete della specie Rizhopus pusillus. Il paziente ha ottenuto la remissione completa dell’emopatia, e intrapreso profilassi antimicotica secondaria con posaconazolo per poi essere sottoposto a ciclo di chemioterapia di consolidamento.

Il secondo paziente à ̈ una donna di 68 anni, affetta da anemia aplastica severa (SAA), che, al giorno 26 del trattamento immunosoppressivo ha presentato febbre e un voluminoso conglomerato linfonodale para-tracheale alla tomografia computerizzata ad alta risoluzione (HRCT) del torace. Gli esami colturali e molecolari di sangue, urine, feci sono risultati ripetutamente negativi per la presenza di batteri, funghi o virus. Al giorno 28 del trattamento immunosoppressivo, la broncoscopia evidenziava infiltrazione della trachea con completo sovvertimento della struttura cartilaginea. Venivano eseguite multiple biopsie. Al giorno 33, l'esame istologico della biopsia tracheale evidenziava ife fungine compatibili con infezione da fungo filamentoso, più probabilmente aspergillo. La terapia con L-amB à ̈ stata intrapresa al dosaggio di 5 mg/kg/die. Al giorno 35, l'esame colturale su liquido di BAL, risultava positivo per Mucor spp. Al giorno 36 veniva posizionato stent tracheale ad Y. Al giorno 41, anche l'esame colturale eseguito sulla biopsia tracheale risultava positivo per Mucor spp. Una HRCT del torace di controllo ha dimostrato invariata la compressione tracheale. Al giorno 49, vi à ̈ stato il riscontro di ulcera esofagea da infiltrazione ab-estrinseco. Al giorno 55, riscontro di fistola esofago-tracheale. Al giorno 64, alla L-amB à ̈ stato associato posaconazolo. Al giorno 77, à ̈ stata registrata occlusione da reazione granulomatosa del ramo sinistro dello stent tracheale. Al giorno 84, à ̈ stata eseguita una nuova broncoscopia con l'impossibilità di rimuovere lo stent e di render pervio il bronco sinistro. La dispnea della paziente à ̈ progressivamente peggiorata sino a portare a morte la paziente al giorno 88 dall'inizio della terapia immunospressiva.

Il terzo paziente à ̈ un uomo di 36 anni affetto da leucemia acuta promielocitica (LAP), che al giorno 35 del trattamento di induzione con antracicline e acido alltransretinoico (ATRA) ha sviluppato diplopia e cefalea. Una Tc encefalo à ̈ risultata negativa. Gli esami morfologico e colturali su liquor cefalorachidiano sono risulati negativi per la presenza di batteri, funghi o virus o per localizzazione di APL. Al giorno 42, per la comparsa di ptosi palpebrale sx, à ̈ stata eseguita una RMN encefalo con riscontro di tessuto neoformato a livello del seno cavernoso sx. Al giorno 50 si à ̈ osservata comparsa di dolore in occhio sx e vi à ̈ stato riscontro alla Tc encefalo di rarefazione ossea del seno sfenoidale sx. Al giorno 60 à ̈ stat eseguita una biopsia transfenoidale della mucosa del seno sfenoidale sx e del tessuto neoformato del seno cavernoso. Al giorno 69, l'esame istologico della biopsia transcranica ha evidenziato tessuto infiammatorio con ife fungine non settate. Il paziente à ̈ stato sottoposto a terapia antifungina con L-amB al dosaggio di 5 mg/kg/die. Al giorno 75, l'esame colturale e quello molecolare, eseguito anche mediante micromanipolazione sulla singola cellula fungina, hanno caratterizzato una Mucormicosi invasiva da Rizhopus spp. Alla terapia in corso à ̈ stato associato posaconazolo al dosaggio di 800 mg/die. Al giorno 82, il paziente, che aveva ottenuto la remissione completa dell'emopatia, à ̈ stato dimesso con la sola terapia orale con posaconazolo. Attualmente il paziente à ̈ ancora in remissione molecolare di LAP, dopo aver completato 4 cicli di mantenimento con arsenico triossido e ATRA. Il trattamento con posaconazolo à ̈ attualmente ancora in corso. Ad un ultimo recente controllo con RMN, il tessuto infiammatorio/infettivo del seno sfenoidale sx si à ̈ ridotto di dimensioni e la sintomatologia, inclusa la diplopia, à ̈ in via di completa risoluzione.

Nel paziente 1, la metodica ELISPOT secondo la presente invenzione à ̈ stata eseguito al tempo dell'inizio della chemioterapia (giorno 1), tra la seconda e la terza HRCT (giorno 27), e 2 giorni prima della terza HRCT del torace (giorno 34), successivamente al giorno 51 e 64 e al giorno 238. L’ELISPOT à ̈ risultato negativo per la presenza di cellule T Mucoralesspecifiche, nella prima e nell'ultima determinazione , in assenza e alla risoluzione della patologia infettiva, mentre à ̈ risultato positivo nelle determinazioni eseguite in concomitanza con l'infezione polmonare da Mucorales. In particolare la metodica ELISPOT secondo la presente invenzione ha mostrato : 1. la presenza di cellule T Mucorales-specifiche, polarizzata verso un'immunità di tipo TH2 e produttrice di IL-10 al giorno 27 e 64; 2. la presenza di cellule T Mucorales-specifiche polarizzate verso un'immunità di tipo TH1 e produttrici di IFN-γ alle determinazioni dei giorni 27, 34 e 51; 3. un rapporto decrescente tra il numero delle cellule produttrici di IL-10 e quello delle cellule produttrici di IFN-γ alle determinazioni dei giorni 27, 34 e 51(Fig.1A).

Nel paziente 2, la metodica ELISPOT secondo la presente invenzione à ̈ stata eseguita su campioni di sangue periferico raccolti nei giorni 36, 55, 68, 75 e 82 dall'inizio della terapia immunosoppressiva, rispettivamente. L’ELISPOT à ̈ risultato positivo per la presenza di cellule T Mucoralesspecifiche, unicamente produttrici di interleuchina 10, alla prima determinazione (36) e positivo nelle successive determinazioni (55, 68, 75, 82) per la presenza di cellule T Mucorales-pecifiche produttrici sia di IL4 sia di IL10, quindi indicative di una risposta di tipo TH2. Nelle tre determinazioni (55, 68, 72), L’ELISPOT à ̈ risultato positivo per la presenza di cellule T Mucorales-pecifiche, produttrici di interferone-gamma (IFN-γ), indicative di una risposta di tipo TH1 (Fig.1B).

Nel paziente 3, la metodica ELISPOT à ̈ stata eseguita al giorno 75 e al giorno 95 della terapia di induzione, e al giorno 48 (137 dall'inizio del trattamento), al giorno 55 (143 dall'inizio del trattamento) della terapia di mantenimento e al giorno 217 dall'inizio del trattamento. L’ELISPOT à ̈ risultato positivo unicamente per una risposta di cellule T Mucoralesspecifiche, produttrici di IL-10 nella prima e nella seconda determinazione, e per una risposta di cellule T Mucorales-specifiche, produttrici di IFN-γ, quindi TH1, e produttrici di IL-4, nella terza e nella quarta determinazione . L'ELISPOT à ̈ risultato negativo per cellule T Mucorales-specifiche nell'ultima determinazione, in concomitanza con la quasi completa risoluzione dell'episodio infettivo (Fig.1C).

RISULTATI CLINICI

La metodica secondo la presente invenzione ha pertanto fornito la prova della Mucormicosi in tutti e tre i pazienti. In particolare, la positività dell’ELISPOT secondo la presente invenzione à ̈ l’unica prova dell’infezione nel paziente 1, già al giorno 27. In questo paziente la diagnosi era stata raggiunta, un mese dopo, unicamente con l’intervento chirurgico, solo al giorno 52 essendo tutte le altre metodiche risultate negative. Nel paziente 2 e nel paziente 3 ELISPOT ha fornito un valido supporto alla diagnosi istologica e colturale, rappresentando l'unica metodica non-colturale e non-invasiva risultata positiva.

La Fig.2 rappresenta i risultati di ELISPOT in pazienti affetti da polmonite ad eziologia non fungina utilizzati come controlli negativi.

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1 Metodo per la diagnosi e/o il monitoraggio della mucormicosi comprendente l’esecuzione di un saggio in vitro in cui il fluido biologico prelevato dal paziente à ̈ messo in contatto con un antigene di Mucorales e la successiva verifica della presenza di cellule T specifiche produttrici di IFN-γ, di cellule T specifiche produttrici di IL-10 e/o di cellule T specifiche produttrici di IL-4.
2. 2 Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta mucormicosi à ̈ mucormicosi invasiva.
3. 3 Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto saggio à ̈ un saggio immunoenzimatico.
4. 4 Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto saggio immunoenzimatico à ̈ il saggio ELISPOT.
5. 5 Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto saggio immunoenzimatico à ̈ il saggio Quantiferon.
6. 6 Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto saggio à ̈ un saggio immunocitofluorimetrico.
7. 7 Metodo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto saggio immunocitofluorimetrico à ̈ selezionato tra saggio CSA e saggio ICS.
8. 8 Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto antigene di Mucorales à ̈ un antigene estrattivo.
9. 9 Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto antigene estrattivo à ̈ ottenuto da conidi e/o da ife di Mucorales.
10. 10 Metodo secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal comprendere i seguenti passaggi: - incubazione dei conidi per 2-4 giorni, - successiva raccolta dei conidi mediante lavaggio della coltura fungina con acqua sterile, - successiva filtrazione e centrifugazione del liquido di lavaggio, - successiva eliminazione del surnatante, - successiva sospensione in saboraud liquido e germinazione in agitazione, preferibilmente per 6-18 ore, - successiva lavaggio in soluzione salina, - successiva bollitura e centrifugazione, - successiva sonicazione dei conidi germinati inattivati al calore, - successiva sospensione in soluzione salina o terreno di coltura, - successivo eventuale congelamento.
11. 11 Metodo secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal comprendere i seguenti passaggi: - raccolta di ife da piastre di coltura, preferibilmente attraverso raschiamento, - successiva sospensione in acqua sterile, - successiva filtrazione e centrifugazione, - successiva eliminazione del surnatante, - successiva congelamento e scongelamento del pellet di micete, - successiva omogeneizzazione del micete in presenza di un volume di biglie di materiale inerte, preferibilmente vetro, pari circa a quello del micete, - successiva centrifugazione, - successivo eventuale congelamento.
12. 12 Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto fluido biologico à ̈ scelto tra sangue, liquido di lavaggio bronchioalveolare e/o liquido pleurico.
13. 13 Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la soglia di positività per dette cellule T specifiche produttrici di IFN-γ, dette cellule T specifiche produttrici di IL-10 e/o dette cellule T specifiche produttrici di IL-4 à ̈ compreso tra 2 e 10 SFCs, preferibilmente di 5 SFCs.
14. 14 Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto antigene à ̈ una proteina ricombinante di Mucorales e/o almeno un peptide di Mucorales.