ITMI20101069A1 - "VITAMIN B12 MANUFACTURERS OF PROBIOTIC BATTERIES" - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE dell'invenzione avente per titolo: DESCRIPTION of the invention having as title:
Ceppi di batteri probiotici produttori di Vitamina B12 Vitamin B12 producing probiotic bacteria strains
La presente invenzione si riferisce a una composizione comprendente almeno un ceppo di batteri probiotico appartenente alla specie Lactobacillus reuteri come produttore di vitamina B12. In particolare, la presente invenzione si riferisce a selezionati ceppi di batteri appartenenti alla specie Lactobacillus reuteri come produttori di Vitamina B12 . Infine, la presente invenzione si riferisce a una composizione alimentare o un integratore o una composizione farmaceutica comprendente un ceppo di batteri appartenente alla specie Lactobacillus reuteri. The present invention relates to a composition comprising at least one probiotic bacteria strain belonging to the Lactobacillus reuteri species as producer of vitamin B12. In particular, the present invention refers to selected strains of bacteria belonging to the Lactobacillus reuteri species as producers of Vitamin B12. Finally, the present invention relates to a food composition or a supplement or a pharmaceutical composition comprising a strain of bacteria belonging to the Lactobacillus reuteri species.
E'noto che la Cobalamina (vitamina B12) svolge un ruolo importante nella produzione dei globuli rossi ed à ̈ essenziale per un buon funzionamento del sistema nervoso . Cobalamin (vitamin B12) is known to play an important role in the production of red blood cells and is essential for the proper functioning of the nervous system.
Inoltre, à ̈ noto che alla Cobalamina (vitamina B12) possono fare riferimento quattro forme chimiche in funzione del tipo di gruppo chimico (R) che si lega allo ione cobalto nella sua formula di struttura. Il gruppo (R) può' essere: Furthermore, it is known that four chemical forms can refer to Cobalamine (vitamin B12) depending on the type of chemical group (R) that binds to the cobalt ion in its structural formula. The group (R) can be:
- cianidrico, -CN (cianocobalamina) - hydrocyanic, -CN (cyanocobalamin)
- ossidrilico, -OH (idrossicobalamina) - hydroxyl, -OH (hydroxocobalamin)
- metilico, -CH3 (metilcobalamina) - methyl, -CH3 (methylcobalamin)
- 5-deossiadenosile (5'-deossiadenosilcobalamina) . - 5-deoxyadenosyl (5'-deoxyadenosylcobalamin).
Le forme metabolicamente attive sono la metil- e la 5'-deossiadenosilcobalamina . The metabolically active forms are methyl- and 5'-deoxyadenosylcobalamin.
L'idrossicobalamina à ̈ la forma naturale con cui la vitamina B12 viene di solito assunta nella dieta. Hydroxocobalamin is the natural form in which vitamin B12 is usually taken in the diet.
Tuttavia, per l'impiego a uso alimentare e farmaceutico di tale vitamina, si deve ricorrere alla forma più stabile che à ̈ rappresentata dalla cianocobalamina la quale viene sintetizzata per via chimica. La Cianocobalamina non esiste in natura salvo in rari casi. However, for the use of this vitamin for food and pharmaceutical use, it is necessary to resort to the more stable form which is represented by cyanocobalamin which is synthesized chemically. Cyanocobalamin does not exist in nature except in rare cases.
Pertanto, la cianocobalamina prodotta per via sintetica e' un artefatto che si forma durante i processi industriali di estrazione in quanto si utilizza la papaia, una proteasi che viene attivata dall'aggiunta di CN- . In pratica, durante i processi industriali di sintesi si opera la trasformazione dell'idrossicobalamina in cianocobalamina perche' quest'ultima forma della vitamina B12 Ã ̈ piu' stabile all'aria e piu' facilmente cristallizzabile favorendo cosi' le rese di produzione. Per questa ragione, la maggioranza dei prodotti alimentari, integratori alimentari e prodotti farmaceutici contengono la cianocobalamina . Therefore, cyanocobalamin produced synthetically is an artifact that is formed during industrial extraction processes as papaya is used, a protease that is activated by the addition of CN-. In practice, during the industrial synthesis processes the transformation of hydroxocobalamin into cyanocobalamin is carried out because the latter form of vitamin B12 is more stable in the air and more easily crystallized, thus favoring production yields. For this reason, the majority of food products, nutritional supplements and pharmaceuticals contain cyanocobalamin.
Pertanto, la possibilità ' di produrre la vitamina B12 per via naturale, sottoforma di idrossicobalamina, in alternativa alla vitamina B12 prodotta per via sintetica, sottoforma di cianocobalamina, e' vista con molto interesse e risponde a una esigenza molto sentita da parte degli operatori del settore. Therefore, the possibility of producing vitamin B12 naturally, in the form of hydroxocobalamin, as an alternative to vitamin B12 produced synthetically, in the form of cyanocobalamin, is viewed with great interest and responds to a very felt need by the operators of the sector.
Pertanto, rimane la necessita' di poter disporre di un metodo per la produzione, per via naturale, di vitamina B12 . Therefore, there remains the need to have a method for the natural production of vitamin B12.
In particolare, rimane la necessita' di poter disporre di un metodo per la produzione, per via naturale, di idrossicobalamina . In particular, there remains the need to have a method for the natural production of hydroxocobalamin.
Infine, Ã ̈ noto che la carne contiene vitamina B12. Finally, meat is known to contain vitamin B12.
Tuttavia, per le persone che non consumano i prodotti a base di carne, come ad esempio i vegetariani, può risultare difficile approvigionarsi di una quantità giornaliera di vitamina B12 sufficiente al fabbisogno giornaliero . However, for people who do not consume meat products, such as vegetarians, it can be difficult to get enough daily vitamin B12 for their daily needs.
Pertanto, poter disporre di prodotti alimentari, non a base di carne, ricchi in vitamina B12 consentirebbe ai vegetariani di poter assumere, in maniera più facile, una dose giornaliera di vitamina B12 sufficiente al fabbisogno giornaliero. Therefore, having access to food products, not based on meat, rich in vitamin B12 would allow vegetarians to be able to take, in an easier way, a daily dose of vitamin B12 sufficient for their daily needs.
Forma un oggetto della presente invenzione un ceppo di batteri probiotico appartenente alla specie Lactobacillus reuteri, come riportato nella unita rivendicazione . An object of the present invention is a strain of probiotic bacteria belonging to the Lactobacillus reuteri species, as reported in the attached claim.
Forma un altro oggetto della presente invenzione un selezionato ceppo di batteri probiotico appartenente alla specie Lactobacillus reuteri, come riportato nella unita rivendicazione. Another object of the present invention is a selected strain of probiotic bacteria belonging to the Lactobacillus reuteri species, as reported in the accompanying claim.
Forma un altro oggetto della presente invenzione una composizione alimentare o un integratore o una composizione farmaceutica, come riportato nella unita rivendicazione . Another object of the present invention is a food composition or a supplement or a pharmaceutical composition, as reported in the accompanying claim.
Forma un altro oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da una patologia o uno stato di malessere dovuti a una carenza o deficit di vitamina B12, come riportato nella unita rivendicazione . Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for use in the preventive and / or curative treatment of subjects suffering from a pathology or a state of malaise due to a deficiency or deficiency of vitamin B12, as reported in the accompanying claim.
Forma un altro oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da anemia perniciosa, come riportato nella unita rivendicazione. Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for use in the preventive and / or curative treatment of subjects suffering from pernicious anemia, as reported in the attached claim.
Forma un altro oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica per uso nel trattamento di soggetti che assumono vitamina C, come riportato nella unita rivendicazione. Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for use in the treatment of subjects who take vitamin C, as reported in the accompanying claim.
Ulteriori realizzazioni preferite della presente invenzione saranno di seguito riportate e illustrate senza voler limitare in alcun modo la portata della presente invenzione. Further preferred embodiments of the present invention will be reported and illustrated below without wishing to limit in any way the scope of the present invention.
La Tabella 1 mostra i valori di concentrazione (valore medio su più prove) di vitamina B12 (espressi in Î1⁄4g/litro) misurati a OD600. Table 1 shows the concentration values (average value over several tests) of vitamin B12 (expressed in Î1⁄4g / liter) measured at OD600.
La Richiedente dopo un'intensa attività di ricerca ha selezionato, tra i ceppi di batteri probiotici scelti dal gruppo comprendente i ceppi di batteri appartenenti alla specie Lactobacillus reuteri, solo quelli che erano in grado di produrre la vitamina B12. The Applicant, after an intense research activity, has selected, among the strains of probiotic bacteria chosen from the group including the strains of bacteria belonging to the Lactobacillus reuteri species, only those that were capable of producing vitamin B12.
In una realizzazione preferita, il ceppo à ̈ scelto dal gruppo comprendente: In a preferred embodiment, the strain is selected from the group comprising:
- Lactobacillus reuteri ATCC 55730, - Lactobacillus reuteri ATCC 55730,
- Lactobacillus reuteri DSM 17938, e - Lactobacillus reuteri DSM 17938, e
- Lactobacillus reuteri DSM 16143. - Lactobacillus reuteri DSM 16143.
In una realizzazione preferita, la composizione alimentare o un integratore o una composizione farmaceutica comprende almeno un ceppo di batteri, scelti tra quelli sopra citati. In a preferred embodiment, the food composition or a supplement or a pharmaceutical composition comprises at least one strain of bacteria, selected from those mentioned above.
Preferibilmente, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può comprendere due ceppi o tre ceppi, scelti tra quelli sopra citati. Preferably, the food composition or the supplement or the pharmaceutical composition can comprise two strains or three strains, selected from those mentioned above.
Vantaggiosamente, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica comprende i due ceppi Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938 o, alternativamente, i tre ceppi Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938 e Lactobacillus reuteri DSM 16143. Advantageously, the food composition or the supplement or the pharmaceutical composition comprises the two strains Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938 or, alternatively, the three strains Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938 and Lactobacillus reuteri.
Le suddette specie di batteri sono presenti in una quantità compresa da 0,1 a 75% in peso, preferibilmente da 0,5 al 15% in peso; ancora più preferibilmente da 1 a 10% in peso, rispetto al peso totale della composizione o integratore. Tuttavia, detta percentuale rispetto al peso totale della composizione, dipende dalla tipologia merceologica della composizione o integratore. Ad esempio, in una capsula la quantità di dette specie di batteri à ̈ preferibilmente superiore al 40%. The aforesaid species of bacteria are present in an amount ranging from 0.1 to 75% by weight, preferably from 0.5 to 15% by weight; even more preferably from 1 to 10% by weight, with respect to the total weight of the composition or supplement. However, said percentage with respect to the total weight of the composition depends on the product type of the composition or supplement. For example, in a capsule the quantity of said species of bacteria is preferably greater than 40%.
In una realizzazione preferita, la composizione contiene batteri in una concentrazione compresa da 1x10<6>a 1x10<11>CFU/g di miscela, preferibilmente da 1x10<8>a 1x10<10>CFU/g di miscela. In a preferred embodiment, the composition contains bacteria in a concentration ranging from 1x10 <6> to 1x10 <11> CFU / g of mixture, preferably from 1x10 <8> to 1x10 <10> CFU / g of mixture.
In una realizzazione preferita, la composizione contiene batteri in una concentrazione compresa da 1x10<6>a 1x10<11>UFC/dose, preferibilmente da 1x10<8>a 1x10<10>UFC/dose. In a preferred embodiment, the composition contains bacteria in a concentration ranging from 1x10 <6> to 1x10 <11> CFU / dose, preferably from 1x10 <8> to 1x10 <10> CFU / dose.
La dose può essere compresa da 0,2 a 10 g, ad esempio e"di 0,25 g, 1 g, 3 g, 5 g o 7 g. The dose can range from 0.2 to 10 g, for example e "of 0.25 g, 1 g, 3 g, 5 g or 7 g.
I batteri probìotici utilizzati nella presente invenzione possono essere in forma solida, in particolare sotto forma di polvere, polvere disidratata, sprayzzata o liofilizzata. The probòotic bacteria used in the present invention can be in solid form, in particular in the form of powder, dehydrated, sprayed or lyophilized powder.
In una realizzazione preferita dell'invenzione, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può inoltre comprendere anche fibre prebiotiche e carboidrati ad azione bifidogena quali ad esempio inulina, frutto-oligosaccaridi (FOS), gaiatto e trans-galatto-oligosaccaridi (GOS e TOS), gluco-oligosaccaridi (GOSα), xilo-oligosaccaridi, (XOS), chitosan-oligosaccaridi (COS), soia-oligosaccaridi (SOS), isomalto-oligosaccaridi (IMOS), amido resistente, pectine, psyllium, arabino-galattani , gluco -mannani, galatto-mannani , xilani, lattosaccarosio, lattulosio, lattitolo e vari altri tipi di gomme, fibra di acacia, di carruba, di avena, di bamboo, fibre di agrumi e, in generale, fibre contenenti una porzione solubile ed una insolubile, in rapporto variabile tra di loro. In a preferred embodiment of the invention, the food composition or the supplement or the pharmaceutical composition can furthermore also comprise prebiotic fibers and carbohydrates with bifidogenic action such as for example inulin, fructo-oligosaccharides (FOS), gaiatto and trans-galacto-oligosaccharides ( GOS and TOS), gluco-oligosaccharides (GOSÎ ±), xylo-oligosaccharides, (XOS), chitosan-oligosaccharides (COS), soy-oligosaccharides (SOS), isomalt-oligosaccharides (IMOS), resistant starch, pectins, psyllium, arabino -galactans, gluco-mannans, galacto-mannans, xylans, lactosaccharose, lactulose, lactitol and various other types of gums, acacia, carob, oat, bamboo fiber, citrus fiber and, in general, fiber containing a portion soluble and one insoluble, in variable ratio between them.
Vantaggiosamente, detta fibra à ̈ scelta dal gruppo comprendente FOS, inulina e fibre di agrumi, preferibilmente in un rapporto in peso da 1:3 a 3:1. Advantageously, said fiber is selected from the group comprising FOS, inulin and citrus fibers, preferably in a weight ratio from 1: 3 to 3: 1.
La quantità delle fibre prebiotiche e/o dei carboidrati ad azione bifidogena, se presenti, risulta compresa in peso dallo 0,5 al 75%, preferibilmente dall'1% al 40% ed ancora più preferibilmente dal 2 al 20% rispetto al peso totale della composizione. In questo caso si ha un integratore ad attività " simbiotica. The quantity of prebiotic fibers and / or carbohydrates with bifidogenic action, if present, is included in weight from 0.5 to 75%, preferably from 1% to 40% and even more preferably from 2 to 20% with respect to the total weight of the composition. In this case we have a supplement with a symbiotic activity.
In una realizzazione preferita, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può inoltre comprendere uno o più additivi o eccipienti fisiologicamnte accettabili. In a preferred embodiment, the food composition or supplement or pharmaceutical composition may further comprise one or more physiologically acceptable additives or excipients.
In una realizzazione preferita dell'invenzione, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può inoltre comprendere anche altri ingredienti e/o componenti attivi quali vitamine, minerali, peptidi bioattivi, sostanze ad attività antiossidante, ipocolesterolemizzante , ipoglicemizzante, antiinf iammatoria, edulcoranti in una quantità in peso generalmente compresa da 0,001% al 10% in peso, preferibilmente da 0,5 al 5% in peso, comunque dipendente dal tipo di componente attivo e dalla sua eventuale dose giornaliera consigliata, rispetto al peso totale della composizione. In a preferred embodiment of the invention, the food composition or the supplement or the pharmaceutical composition can also comprise other ingredients and / or active components such as vitamins, minerals, bioactive peptides, substances with antioxidant, hypocholesterolemic, hypoglycemic, anti-inflammatory activity, sweeteners in an amount by weight generally ranging from 0.001% to 10% by weight, preferably from 0.5 to 5% by weight, in any case depending on the type of active component and its possible recommended daily dose, with respect to the total weight of the composition.
La composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica della presente invenzione sono preparate mediante le tecniche già ' note e alla portata del tecnico del settore che e' in grado di utilizzare i macchinari e le apparecchiature note e la metodica piu' idonea . The food composition or the supplement or the pharmaceutical composition of the present invention are prepared by the techniques already known and within the reach of the person skilled in the art who is able to use the known machinery and equipment and the most suitable method.
In una realizzazione preferita la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica possono contenere elementi o sostanze ad attività antiossidante di cui sopra in una quantità in peso compresa da 0,0001% a 30% rispetto al peso della composizione finale, in funzione della concentrazione delle sostanze ad attività antiossidante e/o della dose giornaliera raccomandata (RDA), ove definita. In a preferred embodiment, the food composition or the supplement or the pharmaceutical composition can contain elements or substances with antioxidant activity mentioned above in an amount by weight ranging from 0.0001% to 30% with respect to the weight of the final composition, depending on the concentration of substances with antioxidant activity and / or the recommended daily allowance (RDA), where defined.
Il selenio può essere presente in forma di sodio seleniato, L-seleniometionina, sodio selenito, selenito acido di sodio, acido selenioso, nonché in forma di microrganismi, ad esempio lieviti, arricchiti in selenio, in una quantità in peso compresa da 0,0005% a 0,005% rispetto al peso della composizione finale, in ogni caso sufficiente ad apportare un quantitativo di selenio preferibilmente compreso da 10 pg a 150 pg. Selenium can be present in the form of sodium selenate, L-selenomethionine, sodium selenite, sodium acid selenite, selenious acid, as well as in the form of microorganisms, for example yeasts, enriched in selenium, in an amount by weight ranging from 0, 0005% to 0.005% with respect to the weight of the final composition, in any case sufficient to provide a quantity of selenium preferably comprised from 10 pg to 150 pg.
Vantaggiosamente, trovano applicazione i ceppi depositati dalla Società BIOMAN S.r.l., Via Alfieri 18, 10100 Torino, Italia, quali: Advantageously, the strains deposited by the Company BIOMAN S.r.l., Via Alfieri 18, 10100 Turin, Italy, apply, such as:
- Lactobacillus buchneri LB26BM, depositato in data 05/04/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16341, e/o - Lactobacillus buchneri LB26BM, filed on 05/04/2004 at the DSMZ and having filing number DSM 16341, and / or
- Lactobacillus ferintoshensis LB6BM, depositato in data 17/01/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16144, e/o - Lactobacillus ferintoshensis LB6BM, filed on 17/01/2004 with the DSMZ and having filing number DSM 16144, and / or
- Lactobacillus reuteri LB2BM, depositato in data 17/01/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16143, e/o - Lactobacillus reuteri LB2BM, filed on 17/01/2004 at the DSMZ and having filing number DSM 16143, and / or
in associazione con i ceppi produttori di vitamina B12 della presente invenzione. in association with the vitamin B12 producing strains of the present invention.
Detti ceppi, infatti, sono in grado di accumulare all'interno della cellula elevati quantitativi di selenio, soprattutto in forma organica, se cresciuti in presenza di un'opportuna fonte di selenio nel terreno di coltura . These strains, in fact, are able to accumulate high quantities of selenium inside the cell, especially in organic form, if grown in the presence of an appropriate source of selenium in the culture medium.
In un'altra realizzazione preferita, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica possono contenere il glutatione. In particolare, il glutatione nella forma antiossidante si riferisce al glutatione ridotto (o GSH) . In una realizzazione preferita, la composizione comprende il glutatione in forma ridotta e il selenio in una quantità ' in peso compresa da 0,5% al 25%, rispetto al peso della composizione finale, in associazione con i ceppi produttori di vitamina B12 della presente invenzione . In another preferred embodiment, the food composition or supplement or pharmaceutical composition may contain glutathione. Specifically, glutathione in the antioxidant form refers to reduced glutathione (or GSH). In a preferred embodiment, the composition comprises glutathione in reduced form and selenium in an amount by weight ranging from 0.5% to 25%, with respect to the weight of the final composition, in association with the vitamin B12 producing strains of the present invention.
Vantaggiosamente, poiché il glutatione può essere parzialmente inattivato se assunto per via orale, la composizione può comprendere l'amminoacido solforato cisteina e/o N-acetilcisteina e/o loro miscele. Advantageously, since glutathione can be partially inactivated if taken orally, the composition can include the sulfur amino acid cysteine and / or N-acetylcysteine and / or their mixtures.
In una realizzazione della presente invenzione, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può contenere i batteri probiotici sopra citati della presente invenzione, in forma microincapsulata, cioà ̈ rivestiti con una composizione contenente almeno un lipide (composizione lipidica), preferibilmente di origine vegetale. In an embodiment of the present invention, the food composition or the supplement or the pharmaceutical composition may contain the aforementioned probiotic bacteria of the present invention, in microencapsulated form, i.e. coated with a composition containing at least one lipid (lipid composition), preferably of vegetable origin.
Alternativamente, la composizione alimentare o l'integratore o la composizione farmaceutica può' comprendere i batteri probiotici sopra citati della presente invenzione come batteri microincapsulati e batteri non micro incapsulati. Alternatively, the food composition or supplement or pharmaceutical composition may comprise the aforementioned probiotic bacteria of the present invention such as microencapsulated bacteria and non-microencapsulated bacteria.
Detta composizione lipidica comprende almeno un lipide, e detto almeno un lipide e' di origine vegetale. Said lipid composition comprises at least one lipid, and said at least one lipid is of vegetable origin.
Vantaggiosamente, detto lipide di origine vegetale à ̈ scelto dal gruppo comprendente grassi saturi. Advantageously, said lipid of vegetable origin is selected from the group comprising saturated fats.
Vantaggiosamente, vengono utilizzati i grassi saturi aventi un punto di fusione inferiore a 75°C, preferibilmente compreso da 45 a 65°C. Advantageously, saturated fats having a melting point lower than 75 ° C, preferably between 45 and 65 ° C, are used.
In una realizzazione preferita, detti grassi saturi sono scelti dal gruppo comprendente mono- e di-gliceridi di acidi grassi saturi, i poligliceroli esterificati con acidi grassi saturi e gli acidi grassi saturi liberi. In a preferred embodiment, said saturated fats are selected from the group comprising mono- and di-glycerides of saturated fatty acids, polyglycerols esterified with saturated fatty acids and free saturated fatty acids.
Preferibilmente, detti grassi saturi sono scelti tra il poligliceril distearato, il gliceril palmitostearato o i grassi vegetali idrogenati di origine non laurica. Preferably, said saturated fats are selected from polyglyceryl distearate, glyceryl palmitostearate or hydrogenated vegetable fats of non-lauric origin.
In una prima realizzazione, i batteri probiotici sopra citati della presente invenzione sono mono rivestiti. In pratica, viene realizzato un singolo rivestimento con uno stesso lipide. Vantaggiosamente, il singolo rivestimento e' base di poligliceril di stearato (nome commerciale Plurol Stearique WL 1009). In a first embodiment, the aforementioned probiotic bacteria of the present invention are mono-coated. In practice, a single coating is made with the same lipid. Advantageously, the single coating is based on polyglyceryl stearate (trade name Plurol Stearique WL 1009).
I batteri probiotici sopra citati della presente invenzione mono rivestiti vengono messi nella composizione alimentare o nell" integratore o nella composizione farmaceutica della presente invenzione. The aforementioned mono-coated probiotic bacteria of the present invention are put into the food composition or the supplement or pharmaceutical composition of the present invention.
In una seconda realizzazione, i batteri probiotici sopra citati della presente invenzione sono doppiamente rivestiti. In pratica, viene realizzato, in successione, un doppio rivestimento con due lipidi diversi tra loro. In a second embodiment, the aforementioned probiotic bacteria of the present invention are doubly coated. In practice, a double coating with two different lipids is carried out in succession.
Vantaggiosamente, i due lipidi sono scelti tra un grasso di palma idrogenato (Tf=60°C) e un dipalmito-stearato di glicerolo (Tf=57-60°C) vengono sprayzzati sul liofilizzato in successione, cioà ̈ sul liofilizzato viene applicata una doppia ricopertura: la prima con il grasso di palma idrogenato (ad esempio con Revel C) e la seconda con il dipalmito- stearato di glicerolo (ad esempio Precirol Ato 5) in un rapporto in peso 3:1 tra loro, vantaggiosamente 2:1, ad esempio 2/3 in peso del primo e 1/3 in peso del secondo. Advantageously, the two lipids are selected from a hydrogenated palm fat (Tf = 60 ° C) and a glycerol dipalmito-stearate (Tf = 57-60 ° C) are sprayed on the lyophilisate in succession, i.e. a double coating: the first with hydrogenated palm fat (for example with Revel C) and the second with glycerol dipalmito-stearate (for example Precirol Ato 5) in a weight ratio of 3: 1, advantageously 2: 1 , for example 2/3 by weight of the first and 1/3 by weight of the second.
In una realizzazione preferita, la composizione farmaceutica à ̈ indicata per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da una patologia o da uno stato di malessere dovuti a stati carenziali o deficit di vitamina B12. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition is indicated for use in the preventive and / or curative treatment of subjects suffering from a pathology or a state of malaise due to deficiency states or vitamin B12 deficiency.
In un'altra realizzazione preferita, la composizione farmaceutica à ̈ indicata per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da anemia perniciosa . In another preferred embodiment, the pharmaceutical composition is indicated for use in the preventive and / or curative treatment of subjects suffering from pernicious anemia.
L'anemia perniciosa à ̈ una malattia provocata da una carenza o deficit di vitamina B12, come ad esempio la cobalamina. Questa malattia à ̈ caratterizzata da anemia megaloblastica e disturbi del sistema nervoso. Pernicious anemia is a disease caused by a deficiency or deficiency of vitamin B12, such as cobalamin. This disease is characterized by megaloblastic anemia and nervous system disorders.
In questi casi à ̈ importante valutare anche la concentrazione di vitamina B12 e acido folico in quanto anche la carenza di quest'ultimo provoca un quadro di anemia megaloblastica senza, però, interessare il sistema nervoso. In these cases it is also important to evaluate the concentration of vitamin B12 and folic acid as even the deficiency of the latter causes a picture of megaloblastic anemia without, however, affecting the nervous system.
Pertanto, nel caso di anemia perniciosa risulta essere molto importante migliorare il quadro anemico somministrando una composizione farmaceutica comprendente almeno un ceppo produttore di vitamina B12 della presente invenzione scelto dal gruppo comprendente: Lactobacillus reuteri ATCC 53609, Lactobacillus reuteri DSM 20016, Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938, Lactobacillus reuteri DSM 16143 e Lactobacillus reuteri NCIMB 701359, in associazione con almeno un ceppo di batteri produttore di acido folico scelto dal gruppo comprendente : Therefore, in the case of pernicious anemia it is very important to improve the anemic picture by administering a pharmaceutical composition comprising at least one vitamin B12 producing strain of the present invention selected from the group comprising: Lactobacillus reuteri ATCC 53609, Lactobacillus reuteri DSM 20016, Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938, Lactobacillus reuteri DSM 16143 and Lactobacillus reuteri NCIMB 701359, in association with at least one strain of folic acid producing bacteria selected from the group comprising:
- un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium adolescentis , preferibilmente il Bifidobacterium adolescentis depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16595; - un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum, preferibilmente il Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18350; - un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium animalis subsp . lactis, preferibilmente il Bìfidobacterium animalis subsp. lactis depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18352; - a strain of bacteria belonging to the Bifidobacterium adolescentis species, preferably Bifidobacterium adolescentis registered with DSMZ on 21.07.2004 and having access number DSM 16595; - a strain of bacteria belonging to the Bifidobacterium catenulatum / pseudocatenulatum species, preferably Bifidobacterium catenulatum / pseudocatenulatum filed with DSMZ on 15.06.2006 and having access number DSM 18350; - a strain of bacteria belonging to the species Bifidobacterium animalis subsp. lactis, preferably Bìfidobacterium animalis subsp. lactis filed with DSMZ on 15.06.2006 and having access number DSM 18352;
- un ceppo di batteri appartenente alla specie Bìfidobacterium breve, preferibilmente il Bìfidobacterium breve depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16596; - un ceppo di batteri appartenente alla specie Bìfidobacterium pseudocatenulatum, preferibilmente il Bìfidobacterium pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16597, Bìfidobacterium pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16598 e Bìfidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18353. - a strain of bacteria belonging to the species Bìfidobacterium breve, preferably the Bìfidobacterium breve, registered with the DSMZ on 21.07.2004 and having access number DSM 16596; - a strain of bacteria belonging to the Bìfidobacterium pseudocatenulatum species, preferably Bìfidobacterium pseudocatenulatum filed with DSMZ on 21.07.2004 and having access number DSM 16597, Bìfidobacterium pseudocatenulatum registered at DSM access number 21.07. DSM 16598 and Bìfidobacterium catenulatum / pseudocatenulatum filed with DSMZ on 15.06.2006 and having access number DSM 18353.
I ceppi di cui sopra sono stati depositati dalla Società " Anidral Srl (adesso Probiotical SpA Via Mattei 3, Novara 28100 Italia) in data 21.07.2004 e 15.06.2006 presso il DSMZ in Germania. The above mentioned strains were deposited by the Company "Anidral Srl (now Probiotical SpA Via Mattei 3, Novara 28100 Italy) on 21.07.2004 and 15.06.2006 at the DSMZ in Germany.
In un'altra realizzazione preferita, la composizione farmaceutica à ̈ indicata per uso nel trattamento di soggetti che assumono vitamina C in quanto l'assunzione di alte quantità di vitamina C (maggiore di 1 g) possono, col tempo, generare stati carenziali di cobalamina. Questo à ̈ dovuto al fatto che la vitamina C, in presenza di ferro, si può comportare da ossidante e formare radicali liberi che danneggiano la cobalamina ed il fattore intrinseco. In another preferred embodiment, the pharmaceutical composition is indicated for use in the treatment of subjects who take vitamin C since the intake of high quantities of vitamin C (greater than 1 g) can, over time, generate cobalamin deficiency states. . This is due to the fact that vitamin C, in the presence of iron, can act as an oxidant and form free radicals that damage cobalamin and intrinsic factor.
Pertanto una composizione alimentare o un integratore o una composizione farmaceutica della presente invenzione trova valida applicazione per quelle persone che assumono giornalmente dosi di vitamina C. Therefore, a food composition or a supplement or a pharmaceutical composition of the present invention finds valid application for those people who take daily doses of vitamin C.
Quindi, l'impiego di ceppi di batteri probiotici e produttori di vitamina B12 (sotto forma di idrossicobalamina che à ̈ la forma naturale che viene maggiormente assunta con la dieta), à ̈ una alternativa vantaggiosa rispetto all'impiego di alimenti o integratori o farmaci che contengono la vitamina B12 sotto forma di cianocobalamina. Therefore, the use of probiotic and vitamin B12 producing strains of bacteria (in the form of hydroxocobalamin which is the natural form that is mostly taken with the diet), is an advantageous alternative to the use of foods or supplements or drugs. which contain vitamin B12 in the form of cyanocobalamin.
Tutte le composizioni sopra citate o integratori della presente invenzione, possono essere formulati in forma solida, liofilizzata o essiccata, ad esempio in polvere o granuli. All the aforementioned compositions or supplements of the present invention can be formulated in solid, lyophilized or dried form, for example in powder or granules.
Inoltre, una forma farmaceutica d'interesse à ̈ la compressa o capsule rigide o molli. Also, a pharmaceutical form of interest is the hard or soft tablet or capsule.
Per quanto concerne la compressa, questa può comprendere una parte interna comprendente i ceppi di batteri e una parte esterna di rivestimento. Il rivestimento può comprendere polimeri solubili in acqua e/o polimeri in grado di resistere alle variazioni del pH dello stomaco e consentire il passaggio nel tratto intestinale . As far as the tablet is concerned, this may comprise an internal part comprising the strains of bacteria and an external part of the coating. The lining may comprise water-soluble polymers and / or polymers capable of resisting changes in stomach pH and allowing passage into the intestinal tract.
In una realizzazione preferita, il ceppo di batteri probiotico e'scelto dal gruppo comprendente i ceppi di batteri appartenenti alla specie Lactobacillus reuteri, come produttore di vitamina B12. In a preferred embodiment, the probiotic strain of bacteria is selected from the group comprising strains of bacteria belonging to the Lactobacillus reuteri species, as a producer of vitamin B12.
In un'altra realizzazione preferita, il ceppo produttore di vitamina B12 e' scelto dal gruppo comprendente: Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938 e Lactobacillus reuteri DSM 16143. In another preferred embodiment, the vitamin B12 producing strain is selected from the group comprising: Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938 and Lactobacillus reuteri DSM 16143.
In un'altra realizzazione preferita, una composizione alimentare o un integratore o una composizione farmaceutica comprende almeno un ceppo di batteri produttore di vitamina B12, preferibilmente e' inoltre presente almeno un ulteriore ceppo di batteri in grado di accumulare all'interno delle cellule batteriche il selenio, preferibilmente detto ceppo di batteri e' scelto dal gruppo comprendente: Lactobacillus buchneri LB26BM, depositato in data 05/04/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16341, Lactobacillus ferintoshensis LB6BM, depositato in data 17/01/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16144, e Lactobacillus reuteri LB2BM, depositato in data 17/01/2004 presso la DSMZ e avente numero di deposito DSM 16143. In another preferred embodiment, a food composition or a supplement or a pharmaceutical composition comprises at least one strain of bacteria producing vitamin B12, preferably there is also at least one further strain of bacteria capable of accumulating the bacterial cells inside the selenium, preferably said strain of bacteria is selected from the group comprising: Lactobacillus buchneri LB26BM, filed on 05/04/2004 at DSMZ and having filing number DSM 16341, Lactobacillus ferintoshensis LB6BM, filed on 17/01/2004 at the DSMZ and having filing number DSM 16144, and Lactobacillus reuteri LB2BM, filed on 17/01/2004 at the DSMZ and having filing number DSM 16143.
In un'altra realizzazione preferita, detta composizione inoltre comprende glutatione in forma ridotta. In another preferred embodiment, said composition further comprises glutathione in reduced form.
In un'altra realizzazione detta composizione inoltre comprende un ulteriore ceppo di batteri in grado di produrre acido folico, preferibilmente detto ceppo e' scelto dal gruppo comprendente: un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium adolescentis , preferibilmente il Bifidobacterium adolescentis depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16595; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum, preferibilmente il Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18350; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium animalis subsp . lactis, preferibilmente il Bifidobacterium animalis subsp. lactis depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18352; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium breve, preferibilmente il Bifidobacterium breve depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16596; un ceppo di batteri appartenente alla specie Bifidobacterium pseudocatenulatum, preferibilmente il Bifidobacterium pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16597, Bifidobacterium pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 21.07.2004 e avente numero di accesso DSM 16598 e Bifidobacterium catenulatum/pseudocatenulatum depositato al DSMZ il 15.06.2006 e avente numero di accesso DSM 18353. In another embodiment, said composition also comprises a further strain of bacteria capable of producing folic acid, preferably said strain is selected from the group comprising: a strain of bacteria belonging to the Bifidobacterium adolescentis species, preferably Bifidobacterium adolescentis deposited at DSMZ on 21.07 .2004 and having access number DSM 16595; a strain of bacteria belonging to the species Bifidobacterium catenulatum / pseudocatenulatum, preferably Bifidobacterium catenulatum / pseudocatenulatum filed with DSMZ on 15.06.2006 and having access number DSM 18350; a strain of bacteria belonging to the species Bifidobacterium animalis subsp. lactis, preferably Bifidobacterium animalis subsp. lactis filed with DSMZ on 15.06.2006 and having access number DSM 18352; a strain of bacteria belonging to the species Bifidobacterium brevis, preferably Bifidobacterium brevis deposited at DSMZ on 21.07.2004 and having access number DSM 16596; a strain of bacteria belonging to the species Bifidobacterium pseudocatenulatum, preferably the Bifidobacterium pseudocatenulatum filed with the DSMZ on 21.07.2004 and having access number DSM 16597, Bifidobacterium pseudocatenulatum filed at DSMZ catum acterium pseudocatenulatum on 21.07.2004 and access number 165 filed with DSMZ on 15.06.2006 and having access number DSM 18353.
In un'altra realizzazione preferita, detta composizione farmaceutica e' indicata per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da una patologia o da uno stato di malessere dovuti a stati carenziali o deficit di vitamina B12. In another preferred embodiment, said pharmaceutical composition is indicated for use in the preventive and / or curative treatment of subjects suffering from a pathology or a state of malaise due to deficiency states or vitamin B12 deficiency.
In un'altra realizzazione preferita, detta composizione farmaceutica e' indicata per uso nel trattamento preventivo e/o curativo di soggetti affetti da anemia perniciosa . In another preferred embodiment, said pharmaceutical composition is indicated for use in the preventive and / or curative treatment of subjects affected by pernicious anemia.
In un'altra realizzazione preferita, detta composizione farmaceutica e' indicata per uso nel trattamento di soggetti che assumono vitamina C. In another preferred embodiment, said pharmaceutical composition is indicated for use in the treatment of subjects who take vitamin C.
In un'altra realizzazione preferita, detta composizione o integratore può comprendere detti ceppi di batteri produttori di vitamina B12 e/o detti ceppi di batteri in grado di accumulare i selenio e/o detti ceppi di batteri produttori di acido folico rivestiti con una composizione contenente almeno un lipide, preferibilmente di origine vegetale, detto lipide essendo scelto dal gruppo comprendente grassi saturi aventi un punto di fusione inferiore a 75°C, preferibilmente compreso da 45 a 65°C. In another preferred embodiment, said composition or supplement may comprise said strains of bacteria producing vitamin B12 and / or said strains of bacteria capable of accumulating selenium and / or said strains of folic acid producing bacteria coated with a composition containing at least one lipid, preferably of vegetable origin, said lipid being selected from the group comprising saturated fats having a melting point lower than 75 ° C, preferably comprised between 45 and 65 ° C.
Parte sperimentale - Metodo microbiologico Experimental part - Microbiological method
Il presente metodo microbiologico viene utilizzato per determinare la quantità di vitamina B12 prodotta dalle cellule batteriche dei ceppi della presente invenzione. Il metodo si basa sull'impiego del ceppo Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355 auxotrofo per la vitamina B12 che cresce quindi proporzionalmente alla quantità di vitamina B12 presente nel mezzo colturale. Tale crescita viene determinata con la lettura spettrofotometrica della coltura alla lunghezza d'onda di 600 nm. La retta di taratura calcolata dalla crescita del Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii) in terreni contenenti quantità scalari e note di vitamina B12 viene impiegata quindi per la determinazione della cobalamina prodotta dai ceppi batteri della presente invenzione che sono stati oggetto dell'analisi. The present microbiological method is used to determine the amount of vitamin B12 produced by the bacterial cells of the strains of the present invention. The method is based on the use of the Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355 auxotroph for vitamin B12 which therefore grows in proportion to the quantity of vitamin B12 present in the culture medium. This growth is determined with the spectrophotometric reading of the culture at the wavelength of 600 nm. The calibration line calculated from the growth of Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii) in media containing scalar and known quantities of vitamin B12 is therefore used for the determination of the cobalamin produced by the bacterial strains of the present invention which have been the object of the analysis.
Metodo microbiologico Microbiological method
1 .1 Preparazione del ceppo auxotrofo per il calcolo della retta di taratura e delle concentrazioni di vitamina B12 prodotte. 1 .1 Preparation of the auxotrophic strain for the calculation of the calibration line and the concentrations of vitamin B12 produced.
1.1.1 II ceppo auxotrofo Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii ) ATCC 7830-DSMZ 20355 viene inoculato all'1% in 15 mi di MRS brodo (MRS Difco 55,00 g e 1000 mi di acqua distillata) e addizionato all'1% con Cisteina cloroidrato (Merck cod. 1.02735.0100 50,00 g e 1000 ml di acqua distillata; sol. al 5%). 1.1.1 The auxotrophic strain Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355 is inoculated at 1% in 15 ml of MRS broth (MRS Difco 55.00 g and 1000 ml of distilled water) and added at 1% with Cysteine hydrochloride (Merck code 1.02735 .0100 50.00 g and 1000 ml of distilled water; 5% sol.).
1.1.2 Successivamante si mette in un agitatore Vortex a vortexare . 1.1.2 Subsequently it is placed in a Vortex mixer to vortex.
1.1.3 II tappo a ghiera viene avvitato avendo cura di non stringerlo completamente onde permettere l'instaurarsi di un ambiente anossico. Il ceppo viene incubato in Gas-Pack provvisto di sistema per anaerobiosi Anaerocult A per 18-24 ore a 37 °C. 1.1.3 The screw cap is screwed on taking care not to tighten it completely in order to allow the establishment of an anoxic environment. The strain is incubated in Gas-Pack equipped with Anaerocult A anaerobiosis system for 18-24 hours at 37 ° C.
1.1.4 Successivamente, si procedere con il trapianto della coltura ottenuta per due volte consecutive utilizzando sempre lo stesso terreno e la medesima percentuale di inoculo. 1.1.4 Subsequently, proceed with the transplantation of the culture obtained twice in a row, always using the same medium and the same percentage of inoculum.
1.1.5 Al termine del periodo di incubazione centrifugare la coltura di Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii ) ATCC 7830-DSMZ 20355 a 6000 giri per 15 minuti . 1.1.5 At the end of the incubation period, centrifuge the culture of Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355 at 6000 rpm for 15 minutes.
1.1.6 Al termine della centrifugazione si elimina il surnatante e si lava il pellet per tre volte consecutive con 10 ml di soluzione fisiologica 0,85% NaCl. 1.1.6 At the end of the centrifugation the supernatant is removed and the pellet is washed three consecutive times with 10 ml of 0.85% NaCl saline solution.
1.1.7 Si risospende il pellet in 10 mi di soluzione fisiologica 0,85% NaCl. 1.1.7 The pellet is resuspended in 10 ml of 0.85% NaCl saline solution.
1.1.8 Poi si diluisce 1:100 con soluzione fisiologica 0,85% NaCl ottenendo così l'inoculo necessario all'allestimento dei tubi, a concentrazioni note di vitamina B12, necessari per il calcolo della retta di taratura e l'allestimento dei tubi da cui viene determinata la quantità di vitamina B12 prodotta. 1.1.8 Then it is diluted 1: 100 with a saline solution 0.85% NaCl thus obtaining the inoculum necessary for the preparation of the tubes, at known concentrations of vitamin B12, necessary for the calculation of the calibration line and the preparation of the tubes from which the quantity of vitamin B12 produced is determined.
1.2 Prepararazione dei tubi necessari al calcolo della retta di taratura. 1.2 Preparation of the pipes necessary for the calculation of the calibration line.
1.2.1 Si scioglie 7,6 g di vitamina B12 Assay Medium (Difco cod. 60179) in 100 ml di acqua ultrapura. 1.2.1 7.6 g of vitamin B12 Assay Medium (Difco code 60179) is dissolved in 100 ml of ultrapure water.
1.2.2 Si riscalda e si agita contemporaneamente facendo bollire per circa 2-3 minuti per dissolvere completamente tutta la polvere. 1.2.2 It is heated and stirred at the same time by boiling for about 2-3 minutes to completely dissolve all the powder.
1.2.3 Si distribuisce 5 ml di vitamina B12 Assay Medium in sette provette di vetro precedentemente lavate con acqua ultrapura e messe in stufa a 100 °C per una notte. 1.2.3 5 ml of Vitamin B12 Assay Medium is distributed in seven glass tubes previously washed with ultrapure water and placed in an oven at 100 ° C for one night.
1.2.4 Si aggiunge alle provette la soluzione stock di cianocobalamina (preparata come sotto riportato) e si porta al volume finale di 10 mi con acqua ultrapura, come sotto riportato: 1.2.4 The cyanocobalamin stock solution (prepared as described below) is added to the test tubes and brought to the final volume of 10 ml with ultrapure water, as reported below:
- mi di soluzione stock per tubo: - ml of stock solution per tube:
0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5
- mi di acqua ultrapura per tubo: - ml of ultrapure water per tube:
5, 4.5, 4, 3, 2, 1, 0 5, 4.5, 4, 3, 2, 1, 0
- Concentrazione di vitamina B12 per tubo (ng/ml): - Vitamin B12 concentration per tube (ng / ml):
0.0 0.025 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.0 0.025 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
La soluzione stock di cianocobalamina e" cosi" preparata : The stock solution of cyanocobalamin is prepared as follows:
i) Sciogliere 10 mg di Standard di cianocobalamina (Sigma cod. C3607) in un matraccio da 100 mi portando a volume con una soluzione di etanolo al 25% in acqua ultrapura (concentrazione finale 0,1 mg/ml). i) Dissolve 10 mg of Cyanocobalamin Standard (Sigma code C3607) in a 100 ml flask making up to volume with a 25% ethanol solution in ultrapure water (final concentration 0.1 mg / ml).
ii) Aggiungere 1 ml della soluzione ottenuta al punto (i) a 99 mi di acqua ultrapura (concentrazione finale 1 pg/ml) . ii) Add 1 ml of the solution obtained in point (i) to 99 ml of ultrapure water (final concentration 1 pg / ml).
iii) Aggiungere 1 ml della soluzione ottenuta al punto (ii) a 99 mi di acqua ultrapura (concentrazione finale 10 ng/ml) iii) Add 1 ml of the solution obtained in point (ii) to 99 ml of ultrapure water (final concentration 10 ng / ml)
iv) Aggiungere 1 ml della soluzione ottenuta al punto (iii) a 199 ml di acqua ultrapura (concentrazione finale 0 .05 ng/ml). iv) Add 1 ml of the solution obtained in point (iii) to 199 ml of ultrapure water (final concentration 0 .05 ng / ml).
1.2.5 I tubi si mettono in autoclave a 121°C per 15 minuti . 1.2.5 The tubes are placed in an autoclave at 121 ° C for 15 minutes.
1.2.6 Al termine del trattamento termico, aggiungere 100 Î1⁄4l della sospensione del Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355, ottenuta come sopra 1.1.8, in ogni provetta. 1.2.6 At the end of the heat treatment, add 100 Î1⁄4l of the suspension of Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355, obtained as above 1.1.8, in each tube.
1.2.7 Successivamante si mette in un agitatore Vortex a vortexare . 1.2.7 Subsequently it is placed in a Vortex mixer to vortex.
1.2.8 II tappo a ghiera viene avvitato avendo cura di non stringerlo completamente onde permettere l'instaurarsi di un ambiente anossico. Il ceppo viene incubato in Gas-Pack provvisto di un sistema per anaerobiosi Anaerocult A per 18-24 ore a 37°C. 1.2.8 The screw cap is screwed on taking care not to tighten it completely in order to allow the establishment of an anoxic environment. The strain is incubated in a Gas-Pack equipped with an Anaerocult A anaerobiosis system for 18-24 hours at 37 ° C.
1.2.9 Al termine del periodo di incubazione, raffreddare le provette a 4 °C per 15-20 minuti per bloccare la crescita batterica. 1.2.9 At the end of the incubation period, cool the tubes to 4 ° C for 15-20 minutes to stop bacterial growth.
1.3 Calcolo della retta di taratura. 1.3 Calculation of the calibration line.
1.3.1 Si procede con l'azzeramento dello spettrofotometro a 660 nm contro 1 ml dì vitamina B12 Assay medium (diluizione con 0 ng/ml di cianocobalamina) ottenuto come sopra. 1.3.1 The spectrophotometer is zeroed at 660 nm against 1 ml of vitamin B12 Assay medium (dilution with 0 ng / ml of cyanocobalamin) obtained as above.
1.3.2 Aggiungere 1 mi di coltura ottenuta come al punto 1.2.9 in cuvette di plastica da 1,5 mi secondo l'ordine crescente della concentrazione di cianocobalamina presente . 1.3.2 Add 1 ml of culture obtained as in point 1.2.9 into 1.5 ml plastic cuvettes according to the increasing order of the concentration of cyanocobalamin present.
1.3.3 Si procede con la lettura dei valori di assorbanza alla lunghezza d'onda di 660 nm. 1.3.3 We proceed with the reading of the absorbance values at the wavelength of 660 nm.
1.3.4 I valori di assorbanza ottenuti sono stati utilizzati per la determinazione della retta di taratura, la cui equazione servirà per l'estrapolazione dei dati relativi ai quantitativi incogniti di vitamina B12 presenti nelle colture ottenute al punto 1.4.18. 1.3.4 The absorbance values obtained were used to determine the calibration line, the equation of which will be used to extrapolate the data relating to the unknown quantities of vitamin B12 present in the cultures obtained in point 1.4.18.
1.4 Preparazione dei campioni per la determinazione della vitamina B12 prodotta. 1.4 Preparation of samples for the determination of the produced vitamin B12.
1.4.1 Si scioglie 7,6 g di Vitamin B12 Assay Medium in 100 mi di acqua ultrapura. 1.4.1 7.6 g of Vitamin B12 Assay Medium is dissolved in 100 ml of ultrapure water.
1.4.2 Si riscalda e si agita contemporaneamente facendo bollire per circa 2-3 minuti per dissolvere completamente tutta la polvere. 1.4.2 It is heated and stirred at the same time by boiling for about 2-3 minutes to completely dissolve all the powder.
1.4.3 Si distribuiscono 5 ml di vitamina B12 Assay Medium in "n" provette di vetro (n = numero di campioni da attivare x numero sub colture di attivazione) precedentemente lavate con acqua ultrapura e messe in stufa a 100 °C. 1.4.3 5 ml of vitamin B12 Assay Medium are distributed in "n" glass test tubes (n = number of samples to be activated x number of activation sub-cultures) previously washed with ultrapure water and placed in an oven at 100 ° C.
1.4.4 Si distribuiscono 5 ml di vitamina B12 Assay Medium in "n" provette di vetro (n = numero di campioni da analizzare x 5) precedentemente lavate con acqua ultrapura e messe in stufa a 100 °C per una notte. 1.4.4 5 ml of vitamin B12 Assay Medium are distributed in "n" glass tubes (n = number of samples to be analyzed x 5) previously washed with ultrapure water and placed in an oven at 100 ° C for one night.
1.4.5 Si distribuiscono 25 mi di vitamina B12 Assay medium in "n" bibbi (bottiglia di vetro Pirex, generalmente da 100 o 250 mi, idonea alla sterilizzazione in autoclave di terreni colturali) da 100 ml (n = numero di campioni da analizzare) precedentemente lavati con acqua ultrapura e messi in stufa a 100 °C. 1.4.5 25 ml of vitamin B12 Assay medium are distributed in "n" bibbi (Pyrex glass bottle, generally of 100 or 250 ml, suitable for autoclaving of culture media) of 100 ml (n = number of samples to be analyzed ) previously washed with ultrapure water and placed in an oven at 100 ° C.
1.4.6 Si portano le provette di cui al punto 1.4.3 al volume di 10 mi con l'aggiunta di acqua ultrapura. 1.4.6 The test tubes referred to in point 1.4.3 are brought to a volume of 10 ml with the addition of ultrapure water.
1.4.7 Si portano i bibbi di cui al punto 1.4.5 al volume di 50 mi con l'aggiunta di acqua ultrapura. 1.4.7 The bibs referred to in point 1.4.5 are brought to a volume of 50 ml with the addition of ultrapure water.
1.4.8 Si mette in autoclave a 121 °C per 15 minuti. 1.4.8 It is placed in an autoclave at 121 ° C for 15 minutes.
1.4.9 Si inocula all'1% i ceppi batterci da analizzare nelle provette appartenenti al gruppo descritto di cui al punto 1.4.3. 1.4.9 The bacterial strains to be analyzed are inoculated at 1% in the test tubes belonging to the group described in point 1.4.3.
1.4.10 Successivamante si mette in un agitatore Vortex a vortexare . 1.4.10 Subsequently it is placed in a Vortex mixer to vortex.
1.4.11 Il tappo a ghiera viene avvitato saldamente e si procede a incubare in bagnetto termostatato per 18-24 ore a 37 °C. 1.4.11 The screw cap is screwed on tightly and incubated in a thermostated bath for 18-24 hours at 37 ° C.
1.4.12 Si trapianta la coltura ottenuta per tre volte consecutive utilizzando sempre lo stesso terreno e la medesima percentuale di inoculo. 1.4.12 The culture obtained is transplanted three consecutive times, always using the same medium and the same percentage of inoculum.
1.4.13 Si inocula all'1% i ceppi batterici nei bibbi appartenenti al gruppo di cui al punto 1.4.5. 1.4.13 The bacterial strains in bibbi belonging to the group referred to in point 1.4.5 are inoculated at 1%.
1.4.14 Successivamante si mette in un agitatore Vortex a vortexare . 1.4.14 Subsequently it is placed in a Vortex mixer to vortex.
1.4.15 Il tappo a ghiera viene avvitato saldamente e si procede a incubare in bagnetto termostatato per 18-24 ore a 37 °C. 1.4.15 The screw cap is screwed on tightly and incubated in a thermostated bath for 18-24 hours at 37 ° C.
1.4.16 Al termine del periodo di incubazione, centrifugare a 6000 giri per 15 minuti. 1.4.16 At the end of the incubation period, centrifuge at 6000 rpm for 15 minutes.
1.4.17 Al termine della centrifugazione, si rimuove il surnatante e si lava il pellet tre volte consecutive con 10 ml di tampone Sodio fosfato 0,1 M pH 7. 1.4.17 At the end of the centrifugation, the supernatant is removed and the pellet is washed three consecutive times with 10 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.
1.4.18 Si risospende il pellet in 1 mi di tampone di estrazione Sodio fosfato 0,1 M pH 4,5 [Ac. Citrico], 0,005% KCN. 1.4.18 The pellet is resuspended in 1 ml of 0.1 M sodium phosphate extraction buffer pH 4.5 [Ac. Citric], 0.005% KCN.
11 tampone di estrazione viene preparato come segue: al) Portare a pH 4,5 100 mi di soluzione tampone Sodio fosfato 0,1 M pH 7 traminte l'aggiunta di acido citrico. The extraction buffer is prepared as follows: a) Bring 100 ml of 0.1 M pH 7 sodium phosphate buffer solution to pH 4.5 by adding citric acid.
a2) Aggiungere KCN in ragione dello 0,005% della soluzione ottenuta al punto a1). a2) Add KCN in the ratio of 0.005% of the solution obtained in point a1).
a3) Mettere in agitazione per 10 minuti. a3) Stir for 10 minutes.
1.4.19 Si mette in agitazione a 4°C con 1 g di glass beads per tre cicli da 5 minuti. 1.4.19 It is stirred at 4 ° C with 1 g of glass beads for three cycles of 5 minutes.
1.4.20 Al termine del periodo di agitazione, si bolle l'estratto a 100°C per 5 minuti per permettere la denaturazione delle proteine e la formazione della cianocobalamina . 1.4.20 At the end of the stirring period, the extract is boiled at 100 ° C for 5 minutes to allow the denaturation of the proteins and the formation of cyanocobalamin.
1.4.21 Al termine del termo-trattamento , si diluisce l'estratto con acqua ultrapura secondo le proporzioni sotto riportate: 1.4.21 At the end of the heat treatment, the extract is diluted with ultrapure water according to the proportions given below:
- diluizione: 1:2 1:5 1:101:100 1:1000 - dilution: 1: 2 1: 5 1: 101: 100 1: 1000
- Î1⁄4l estratto: 500200 100 10 1 - Î1⁄4l extract: 500 200 100 10 1
- Î1⁄4l ddH20: 500800 900 990 999 - Î1⁄4l ddH20: 500 800 900 990 999
1.4.22 Si aggiunge ogni diluizione ai tubi di cui al punto 1.4.4. 1.4.22 Any dilution is added to the tubes referred to in point 1.4.4.
1.4.23 Si porta ogni tubo al volume di 10 mi con acqua ultrapura . 1.4.23 Each tube is brought to a volume of 10 ml with ultrapure water.
1.4.24 Si aggiungono 100 Î1⁄4l della sospensione del Lactobacillus delbrueckii subs . lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355 di cui al punto 1.4.8. 1.4.24 Add 100 Î1⁄4l of the suspension of Lactobacillus delbrueckii subs. lactis (L. leichmannii) ATCC 7830-DSMZ 20355 referred to in point 1.4.8.
1.4.25 Successivamante si mette in un agitatore Vortex a vortexare . 1.4.25 Subsequently it is placed in a Vortex mixer to vortex.
1.4.26 Il tappo a ghiera viene avvitato avendo cura di non stringerlo completamente onde permettere l'instaurarsi di un ambiente anossico. Il ceppo viene incubato in Gas-Pack provvisto di un sistema per anaerobiosi Anaerocult A per 18-24 ore a 37 °C. 1.4.26 The screw cap is screwed on taking care not to tighten it completely in order to allow the establishment of an anoxic environment. The strain is incubated in a Gas-Pack equipped with an Anaerocult A anaerobiosis system for 18-24 hours at 37 ° C.
1.4.27 Al termine del periodo di incubazione, si raffredda le provette a 4 °C per 15-20 minuti per bloccare la crescita batterica. 1.4.27 At the end of the incubation period, the tubes are cooled to 4 ° C for 15-20 minutes to stop bacterial growth.
1.5 Determinazione della vitamina B12 prodotta. 1.5 Determination of the vitamin B12 produced.
1.5.1 Si azzera lo spettrofotometro a 660 nm contro 1 mi di vitamina B12 Assay medium (diluizione con 0 ng/ml di cianocobalamina) come sopra ottenuta. 1.5.1 The spectrophotometer is zeroed at 660 nm against 1 ml of vitamin B12 Assay medium (dilution with 0 ng / ml of cyanocobalamin) as obtained above.
1.5.2 Si aggiunge 1 mi di coltura come ottenuta al punto 1.2.9 in cuvette di plastica da 1,5 ml secondo l'ordine crescente delle diluizioni dell'estratto come riportato al punto 1.4.21. 1.5.2 1 ml of culture as obtained in point 1.2.9 is added in 1.5 ml plastic cuvettes according to the increasing order of the dilutions of the extract as reported in point 1.4.21.
1.5.3 Si leggono i valori di assorbanza alla lunghezza d'onda di 660 nm. 1.5.3 Read the absorbance values at the wavelength of 660 nm.
1.5.4 I valori di assorbanza ottenuti sono stati utilizzati nell'equazione della retta sopra calcolata al punto 1.3.4 per il calcolo della concentrazione di vitamina B12 prodotta dai ceppi in esame. I risultati sono espressi in ng/l. 1.5.4 The absorbance values obtained were used in the equation of the straight line calculated above in point 1.3.4 for the calculation of the concentration of vitamin B12 produced by the strains under examination. The results are expressed in ng / l.
Parte sperimentale - Metodo analitico (HPLC) Experimental part - Analytical method (HPLC)
Il presente metodo analitico viene utilizzato per determinare la quantità di vitamina B12 prodotta dalle cellule batteriche dei ceppi della presente invenzione. La determinazione analitica della vitamina B12, prodotta dalle colture batteriche dei ceppi della presente invenzione che sono oggetto della presente analisi, viene effettuata con metodica HPLC in fase inversa (colonna C18) utilizzando un detector UV/VIS. The present analytical method is used to determine the quantity of vitamin B12 produced by the bacterial cells of the strains of the present invention. The analytical determination of vitamin B12, produced by the bacterial cultures of the strains of the present invention which are the object of the present analysis, is carried out with the reverse phase HPLC method (column C18) using a UV / VIS detector.
Metodo analitico (HPLC) Analytical method (HPLC)
2 .1 Prepararazione di soluzioni standard per il calcolo della retta di taratura. 2 .1 Preparation of standard solutions for the calculation of the calibration line.
2.1.1 Si pesano 10 mg di Cianocobalamina Standard (Sigma cod. C3607) ed effettuare le seguenti diluizioni seriali : 2.1.1 Weigh 10 mg of Standard Cyanocobalamin (Sigma code C3607) and carry out the following serial dilutions:
2.1.1.1 Soluzione 1 mg/ml: pesare 10 mg di Cianocobalamina Standard (Sigma cod. C3607) in un matraccio da 10 mi e portare a volume con acqua MilliQ e 25% Etanolo (l'etanolo serve ad aumentare la solubilità della cianocobalamina). 2.1.1.1 1 mg / ml solution: weigh 10 mg of Cyanocobalamin Standard (Sigma code C3607) into a 10 ml flask and make up to volume with MilliQ water and 25% Ethanol (ethanol serves to increase the solubility of cyanocobalamin) .
2.1.1.2 Soluzione 0,1 mg/ml: prelevare 1 mi della soluzione al punto 2.2.1.1 e portarla a volume in un matraccio da 10 mi e portare a volume con acqua MilliQ. 2.1.1.2 0.1 mg / ml solution: take 1 ml of the solution in point 2.2.1.1 and make up to volume in a 10 ml flask and make up to volume with MilliQ water.
2.1.1.3 Soluzione 0,01 mg/ml: prelevare 1 mi della soluzione al punto 2.2.1.2 e portarla a volume in un matraccio da 10 mi e portare a volume con acqua MilliQ. 2.1.1.3 0.01 mg / ml solution: take 1 ml of the solution in point 2.2.1.2 and make it up to the mark in a 10 ml flask and make up to the mark with MilliQ water.
2.1.1.4 Soluzione madre (1000 ng/ml): prelevare 5 mi della soluzione al punto 2.2.1.3 e portarla a volume in un matraccio da 50 mi e portare a volume con acqua MilliQ. 2.1.1.4 Stock solution (1000 ng / ml): take 5 ml of the solution in point 2.2.1.3 and make up to volume in a 50 ml flask and make up to volume with MilliQ water.
2.1.2 Dalla soluzione madre descritta al punto 2.2.1.4 si preparano le diluizioni standard per la creazione della retta di taratura nel seguente modo: 2.1.2.1 Soluzione 1000 ng/ml o soluzione madre tal quale . 2.1.2 From the stock solution described in point 2.2.1.4, the standard dilutions are prepared for the creation of the calibration line as follows: 2.1.2.1 1000 ng / ml solution or stock solution as is.
2.1.2.2 Soluzione 800 ng/ml: prelevare 4 mi di soluzione madre e portare a volume in un matraccio di 5 mi con acqua MilliQ. 2.1.2.2 800 ng / ml solution: take 4 ml of stock solution and make up to volume in a 5 ml flask with MilliQ water.
2.1.2. 3 Soluzione 500 ng/ml: prelevare 5 mi di soluzione madre e portare a volume in un matraccio da 10 mi con acqua MilliQ. 2.1.2. 3 500 ng / ml solution: take 5 ml of stock solution and make up to volume in a 10 ml flask with MilliQ water.
2.1.2.4 Soluzione 200 ng/ml: prelevare 1 mi di soluzione madre e portare a volume in un matraccio di 5 mi con acqua MilliQ. 2.1.2.4 200 ng / ml solution: take 1 ml of stock solution and make up to volume in a 5 ml flask with MilliQ water.
2.1.2. 5 Soluzione 100 ng/ml: prelevare 1 mi di soluzione madre e portare a volume in un matraccio di 10 mi con acqua MilliQ. 2.1.2. 5 100 ng / ml solution: take 1 ml of stock solution and make up to volume in a 10 ml flask with MilliQ water.
2.1.2. 6 Soluzione 50 ng/ml: prelevare 1 mi di soluzione 500 ng/ml (vd. punto 2.2.23) e portare a volume in un matraccio da 10 mi con acqua MilliQ. 2.1.2. 6 50 ng / ml solution: take 1 ml of 500 ng / ml solution (see point 2.2.23) and make up to volume in a 10 ml flask with MilliQ water.
2.1.2. 7 Soluzione 25 ng/ml: prelevare 5 ml di soluzione 50 ng/ml (cd. punto 7.2.2.6) e portare a volume in un matraccio da 10 mi con acqua MilliQ. 2.1.2. 7 25 ng / ml solution: take 5 ml of 50 ng / ml solution (so-called point 7.2.2.6) and make up to volume in a 10 ml flask with MilliQ water.
2 .2 Principali parametri di impostazione per la metodica HPLC. 2 .2 Main setting parameters for the HPLC method.
Per il corretto utilizzo dell'HPLC Waters 625 LC System, del software di acquisizione dati TotalChrom (Perkin Elmer) e del detector UV/VIS 785 A (Perkin Elmer) si devono seguire attentamente le indicazioni presenti sulle procedure di utilizzo. Di seguito sono indicati i parametri fondamentali dell'analisi per determinare la quantità di Vitamina B12 prodotta dai ceppi batterici oggetto dell'analisi: For the correct use of the HPLC Waters 625 LC System, the TotalChrom data acquisition software (Perkin Elmer) and the UV / VIS 785 A detector (Perkin Elmer), the instructions on the use procedures must be carefully followed. The following are the fundamental parameters of the analysis to determine the quantity of Vitamin B12 produced by the bacterial strains under analysis:
2.2.1 Parametri relativi all'HPLC: 2.2.1 Parameters related to HPLC:
Tipo di colonna cromatografica: Type of chromatography column:
Colonna Spherisorb ODS 2 (Waters) C18 250x4.6 mm, diametro 5Î1⁄4m. Spherisorb ODS 2 (Waters) C18 column 250x4.6 mm, diameter 5Î1⁄4m.
Fase mobile: Acqua MilliQ e Acetonitrile in gradiente di eluizione (come indicato nella tabella sottostante) . Mobile phase: MilliQ water and Acetonitrile in elution gradient (as indicated in the table below).
Gradiente di eluizione: Impostare il gradiente di eluizione, tramite tastiera presente sul controller centrale dell'HPLC Waters 625 LC System, come sotto mostrato : Elution gradient: Set the elution gradient, using the keyboard on the central controller of the HPLC Waters 625 LC System, as shown below:
Tempo % Acqua MilliQ % Acetonitrile Time% Water MilliQ% Acetonitrile
0 95 5 0 95 5
14 85 15 14 85 15
19 70 30 19 70 30
20 95 5 20 95 5
35 95 5 35 95 5
Flusso di eluizione: Impostare sul controller centrale dell'HPLC Waters 625 LC System un flusso costante di 1.0 ml/min. Elution Flow: Set a constant flow of 1.0 mL / min on the central controller of the Waters 625 LC System HPLC.
Temperatura colonna: Impostare sul controller centrale dell'HPLC Waters 625 LC System una temperatura di 25 °C per il fornetto di termostatazione della colonna . Column temperature: Set a temperature of 25 ° C for the column thermostating oven on the central controller of the Waters 625 LC System HPLC.
Volume iniezione: 20 Î1⁄4Î di standard e campione. Injection volume: 20 Î1⁄4Î of standard and sample.
2.2.2 Parametri relativi al detector UV/VIS. La lunghezza d'onda e' pari a 360 nm. 2.2.2 Parameters related to the UV / VIS detector. The wavelength is equal to 360 nm.
2.3 Retta di taratura. 2.3 Calibration line.
2.3.1 Iniettare una dopo l'altra tutte le soluzioni standard preparate come descritto nel punto 2.2. 2.3.1 Inject one after the other all standard solutions prepared as described in point 2.2.
2.3.2 Acquisire tramite software TotalChrom i relativi cromato grammi. 2.3.2 Acquire the relative chromatograms using the TotalChrom software.
2.3.3 Il software procede automaticamente all'integrazione dei picchi presenti su ogni cromatogramma. E' fondamentale però controllare che l'integrazione automatica effettuata dal software sia corretta. Il tempo di ritenzione della cianocobalamina à ̈ di circa 19 minuti. 2.3.3 The software automatically proceeds to integrate the peaks present on each chromatogram. However, it is essential to check that the automatic integration carried out by the software is correct. The retention time of cyanocobalamin is approximately 19 minutes.
2.3.4 Le aree di ogni singolo picco relativo alla vitamina B12 vengono annotate. In base al valore delle aree dei picchi in relazione alle concentrazioni di partenza si crea un grafico a dispersione. 2.3.4 The areas of each individual vitamin B12 peak are noted. Based on the value of the areas of the peaks in relation to the starting concentrations, a scatter plot is created.
2.3.5 La retta di taratura generata deve avere valore di R2 > 0.99. 2.3.5 The calibration line generated must have a value of R2> 0.99.
2.3.6 Per interpolazione sulla retta di taratura verrà calcolata la vitamina B12 presente nei campioni oggetto dell'analisi. 2.3.6 The vitamin B12 present in the samples under analysis will be calculated by interpolation on the calibration line.
2.4 Preparazione dei campioni per la determinazione della vitamina B12 prodotta. 2.4 Preparation of samples for the determination of the vitamin B12 produced.
I campioni sono preparati seguendo la stessa metodica riportata ai punti da 1.4.1 a 1.4.20. The samples are prepared following the same method described in points 1.4.1 to 1.4.20.
2.5 Determinazione della vitamina B12 prodotta. 2.5 Determination of the vitamin B12 produced.
2.5.1 20 Î1⁄4l dell'estratto preparato al punto 1.4.20 vengono iniettati in HPLC. 2.5.1 20 Î1⁄4l of the extract prepared in point 1.4.20 are injected into HPLC.
2.5.2 II valore dell'area del picco relativo al campione analizzato viene interpolato sulla retta di taratura preparata come al punto 1.4. 2.5.2 The value of the peak area relative to the analyzed sample is interpolated on the calibration line prepared as in point 1.4.
2.5.3 Calcolare il valore finale di vitamina B12 di ogni singolo campione in base alla quantità di campione iniettata (20 Î1⁄4l). I risultati sono espressi in ng/1. 2.5.3 Calculate the final vitamin B12 value of each individual sample based on the amount of sample injected (20 Î1⁄4l). The results are expressed in ng / 1.
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