ITMI20070157A1 - ENZYMATIC ENRICHING PROCESS OF A MIXTURE CONTAINING OMEGA 3 - Google Patents
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale Description of the industrial invention
La presente invenzione ha per oggetto un procedimento di arricchimento enzimatico selettivo per la preparazione di omega-3 e/o loro esteri; il processo può essere effettuato a partire da miscele di olii naturali dove gli omega-3 sono già presenti sotto forma di esteri. The present invention relates to a selective enzymatic enrichment process for the preparation of omega-3s and / or their esters; the process can be carried out starting from blends of natural oils where the omega-3s are already present in the form of esters.
STATO DELL’ARTE STATE OF THE ART
Con il termine “acidi omega-3” o, più semplicemente “omega-3” si intendono gli acidi grassi poliinsaturi aventi un doppio legame in posizione ω-3; essi hanno normalmente da 18 a 22 atomi di carbonio e da 3 a 6 insaturazioni. Gli omega-3 più comuni sono l’acido α-linolenico (08:3), l’acido moroctico (08:4), l’acido eicosatetraenoico (C20:4), l’acido eicosapentaenoico (C20:5; comunemente detto EPA), l’acido eneicosapentaenoico (C21:5), l’acido clupanodonico (C22:5) e l’acido docosaesaenoico (C22:6; comunemente detto DHA). The term “omega-3 acids” or, more simply, “omega-3” refers to polyunsaturated fatty acids having a double bond in the ω-3 position; they normally have from 18 to 22 carbon atoms and from 3 to 6 unsaturations. The most common omega-3s are α-linolenic acid (08: 3), moroctic acid (08: 4), eicosatetraenoic acid (C20: 4), eicosapentaenoic acid (C20: 5; commonly called EPA), eneicosapentaenoic acid (C21: 5), clupanodonic acid (C22: 5) and docosahexaenoic acid (C22: 6; commonly called DHA).
Gli omega-3 ed i loro esteri, in particolare gli esteri etilici, sono normalmente impiegati nel’ industria alimentare ed in quella farmaceutica, in particolare nel trattamento e/o nella prevenzione di malattie e/o eventi cardiovascolari quali ad esempio l’infarto del miocardio. Omega-3 and their esters, in particular ethyl esters, are normally used in the food and pharmaceutical industries, in particular in the treatment and / or prevention of diseases and / or cardiovascular events such as heart attacks of myocardium.
La miscela comunemente impiegata a tali scopi è definita come esteri etilici di acidi omega-3 90 ed è caratterizzata da (European Pharmacopoeia 5.0): • un contenuto minimo di etil esteri di EPA e DHA dell’ 80%, con un minimo del 40% di etil esteri di EPA ed un minimo del 34% di etil esteri di DHA; The mixture commonly used for these purposes is defined as ethyl esters of omega-3 acids 90 and is characterized by (European Pharmacopoeia 5.0): • a minimum content of EPA and DHA ethyl esters of 80%, with a minimum of 40% EPA ethyl esters and a minimum of 34% DHA ethyl esters;
• un contenuto minimo di etil esteri di acidi omega-3 del 90%. • a minimum content of 90% of ethyl esters of omega-3 acids.
La preparazione di omega-3 e dei relativi esteri alchilici è descritta in diversi documenti brevettuali ed è nota in letteratura. Nella domanda di brevetto WO870389 si descrive per esempio un procedimento di purificazione da olio marino mediante frazionamento per cristallizzione in presenza di urea e successiva distillazione molecolare. Tale procedura consente di ottenere una miscela di acidi grassi con contenuto totale di EPA e DHA pari a circa Γ 80-90% in peso. Per questa tecnica il contenuto di EPA e DHA nella miscela di partenza costituisce un fattore importante, da controllare, che influisce sulla la resa e sulla qualità del processo . The preparation of omega-3 and related alkyl esters is described in various patent documents and is known in the literature. Patent application WO870389 describes, for example, a purification process from marine oil by means of fractionation by crystallization in the presence of urea and subsequent molecular distillation. This procedure makes it possible to obtain a mixture of fatty acids with a total content of EPA and DHA equal to approximately Γ 80-90% by weight. For this technique, the content of EPA and DHA in the starting mixture is an important factor, to be controlled, which affects the yield and quality of the process.
Nel corso degli anni sono stati descritti procedimenti di ottenimento di tali miscele mediante Γ ausilio di enzimi. Nella domanda di brevetto W09626287 si descrive un approccio chemoenzimatico che prevede una reazione di transesterificazione con Γ ausilio di lipasi specifiche e non specifiche che consente di ottenere una miscela di trigliceridi ricca per il 60% di acidi grassi poliinsaturi (PUFA) partendo da una miscela che ne contiene solo il 30%. Per Γ ottenimento di un buon grado purezza in PUFA sono però necessari passaggi di saponificazione e di cristallizzazione precedenti alla transesterificazione enzimatica. Over the years, processes have been described for obtaining such mixtures with the aid of enzymes. Patent application W09626287 describes a chemoenzymatic approach which involves a transesterification reaction with the aid of specific and non-specific lipases which allows to obtain a mixture of triglycerides rich in 60% polyunsaturated fatty acids (PUFA) starting from a mixture which it contains only 30%. To obtain a good degree of purity in PUFA, however, saponification and crystallization steps prior to enzymatic transesterification are necessary.
In W00073254 è descritto Γ utili zzo di una lipasi in grado di dare etanolisi e transesterificazione selettiva in presenza di alcossi alcool su oli di pesce naturale. Tale processo, che utilizza successivi passaggi di distillazione molecolare, consente di isolare miscele ricche di DHA oppure di EPA (pari a circa Γ80% in peso), sotto forma di esteri . W00073254 describes the usefulness of a lipase capable of giving ethanolysis and selective transesterification in the presence of alkoxy alcohols on natural fish oils. This process, which uses successive molecular distillation steps, makes it possible to isolate mixtures rich in DHA or EPA (equal to about Γ80% by weight), in the form of esters.
EP1300470 e W02004043894 descrivono l’utilizzo di lipasi in grado di dare reazioni di arricchimento delle miscele di acidi grassi PUFA. EP1300470 and W02004043894 describe the use of lipases capable of giving enrichment reactions of the mixtures of PUFA fatty acids.
Le rese ottenibili con i procedimenti sino ad ora descritti sono modeste e difficilmente riproducibili, anche a causa della varibilità della materia prima che induce all’ impiego di diversi passaggi di purificazione e di arricchimento. The yields obtainable with the procedures described up to now are modest and difficult to reproduce, also due to the variability of the raw material which leads to the use of different purification and enrichment steps.
Inoltre, questi procedimenti presentano lo svantaggio di utilizzare reagenti chimici, con formazioni di impurezze potenziali che possono essere dannose per l’organismo. Furthermore, these processes have the disadvantage of using chemical reagents, with the formation of potential impurities that can be harmful to the body.
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE Scopo della presente invenzione è quello di fornire un processo per la preparazione di miscele aventi un elevato contenuto di acidi omega-3 con una tecnica di arricchimento selettiva ottenuta attraverso idrolisi enzimatica che sia esente dagli inconvenienti dei processi della tecnica nota. DESCRIPTION OF THE INVENTION The purpose of the present invention is to provide a process for the preparation of mixtures having a high content of omega-3 acids with a selective enrichment technique obtained through enzymatic hydrolysis that is free from the drawbacks of the processes of the known art.
Con l’espressione “miscele aventi un elevato contenuto di acidi omega-3” si intendono miscele di acidi grassi e/o loro esteri, aventi un contenuto di esteri degli acidi omega-3, preferibilmente esteri etilici, superiore all’ 80% in peso; gli esteri sono preferibilmente esteri di alcool C1-C4, aventi da 1 a 3 gruppi idrossilici. In particolare, il processo secondo la presente invenzione è finalizzato alla preparazione di miscele conformi alla Farmacopea Europea, ovvero miscele aventi: The expression "mixtures having a high content of omega-3 acids" means mixtures of fatty acids and / or their esters, having a content of esters of omega-3 acids, preferably ethyl esters, higher than 80% by weight ; the esters are preferably C1-C4 alcohol esters, having from 1 to 3 hydroxyl groups. In particular, the process according to the present invention is aimed at the preparation of mixtures compliant with the European Pharmacopoeia, i.e. mixtures having:
• un contenuto minimo di etil esteri di EPA e DHA dell’ 80%, con un minimo del 40% di etil esteri di EPA ed un minimo del 34% di etil esteri di DHA; • a minimum content of EPA and DHA ethyl esters of 80%, with a minimum of 40% EPA ethyl esters and a minimum of 34% DHA ethyl esters;
• un contenuto minimo di etil esteri di acidi omega-3 del 90%. • a minimum content of 90% of ethyl esters of omega-3 acids.
E stato infatti sorprendentemente trovato che utilizzando enzimi specifici appartenenti alla classe delle lipasi, fino ad ora utilizzate per reazioni di transesterificazione, si è in grado di effettuare una reazione di idrolisi selettiva sui residui esterei di acidi grassi saturi oppure insaturi aventi una catena corta, ovvero inferore a 18 atomi di carbonio, mantenendo inalterati gli esteri degli acidi grassi a catena superiore, quali ad esempio gli omega 3, che sono poi isolati dal mezzo di reazione per semplice estrazione oppure per distillazione. It has in fact been surprisingly found that by using specific enzymes belonging to the class of lipases, up to now used for transesterification reactions, it is possible to carry out a selective hydrolysis reaction on the ester residues of saturated or unsaturated fatty acids having a short chain, i.e. lower than 18 carbon atoms, keeping the esters of the higher chain fatty acids unaltered, such as for example the omega 3, which are then isolated from the reaction medium by simple extraction or by distillation.
La miscela di partenza è preferibilmente composta da miscele naturali di trigliceridi, quali ad esempio olii naturali; possono anche essere utilizzate miscele di trigliceridi in cui gli omega-3, in particolare DHA ed EPA, sono già presenti come esteri etilici. Gli olii naturali possono essere scelti tra olii di pesce, di alghe, di funghi, di microorganismi e/o vegetali. In via preferenziale la reazione è condotta utilizzando miscele che contengono tra il 40 ed il 70% in peso di esteri di EPA ed DHA ed in cui il rapporto EPA/DHA è compreso tra 3 e 0.5, preferibilmente ra 1.5 e 0.9. The starting mixture is preferably composed of natural mixtures of triglycerides, such as for example natural oils; triglyceride mixtures can also be used in which the omega-3s, in particular DHA and EPA, are already present as ethyl esters. Natural oils can be chosen from fish, algae, fungus, microorganism and / or vegetable oils. Preferably, the reaction is carried out using mixtures containing between 40 and 70% by weight of EPA and DHA esters and in which the EPA / DHA ratio is between 3 and 0.5, preferably between 1.5 and 0.9.
La metodologia prevede l’utilizzo di enzimi appartenenti alla classe delle idrolasi, specificatamente alla classe delle lipasi provenienti da diverse fonti microbiche; tra le lipasi preferite vanno segnalate quella da Pseudomonas Fluorescens, Pseudomonas cepacea e Candida antartica. The methodology involves the use of enzymes belonging to the class of hydrolases, specifically to the class of lipases from different microbial sources; among the preferred lipases we should mention that from Pseudomonas Fluorescens, Pseudomonas cepacea and Candida antartica.
Gli enzimi sono preferibilmente utilizzati in forma purificata, sia liberi che immobilizzati su supporto solido o sotto forma di enzima cri stalli zato oppure possono essere usati in forma grezza, ad esempio contenuti in paste cellulari o in cellule intere. The enzymes are preferably used in purified form, both free and immobilized on solid support or in the form of crystallized enzyme or they can be used in crude form, for example contained in cell pastes or in whole cells.
Sono utilizzate in particolare immobilizzazioni su supporto solido realizzate mediante metodi ad adsorbimento oppure metodi ad interazione ionica oppure metodi ad interazione covalente. In via preferenziale sono utilizzate interazioni di tipo covalente mediante l’utilizzo di resine polimeriche fuzionalizzate con gruppi epossidici semplici e/o opportunamente derivatizzati e/o stabilizzati. In particular, fixed assets on solid support made by adsorption methods or ionic interaction methods or covalent interaction methods are used. Preferably, covalent-type interactions are used through the use of functionalized polymeric resins with simple and / or suitably derivatized and / or stabilized epoxy groups.
Secondo la metodologia della presente invenzione, la miscela contenente i trigliceridi, oppure gli esteri etilici degli acidi grassi, oppure la miscela dei due, è posta in ambiente acquoso; al mezzo è aggiunta la lipasi e la reazione è condotta fino a raggiungimento della concentrazione desiderata di omega-3 e, in particolare, di EPA e di DHA. Successivamente gli esteri degli acidi grassi di intercesse sono isolati dal mezzo di reazione mediante distillazione oppure separazione chimica oppure cromatografica. Nel caso di miscele di partenza a base di trigliceridi di omega-3, la successiva conversione in esteri etilici può essere effettuata per transesterificazione, secondo metodiche ben note nel’ arte. According to the methodology of the present invention, the mixture containing the triglycerides, or the ethyl esters of the fatty acids, or the mixture of the two, is placed in an aqueous environment; lipase is added to the medium and the reaction is carried out until the desired concentration of omega-3 and, in particular, of EPA and DHA is reached. Subsequently, the esters of the fatty acids of interest are isolated from the reaction medium by distillation or chemical or chromatographic separation. In the case of starting mixtures based on omega-3 triglycerides, the subsequent conversion into ethyl esters can be carried out by transesterification, according to methods well known in the art.
Il solvente di reazione è acqua, da sola o in miscela con solventi organici ad essa miscibili, in presenza o in assenza di un tampone, il pH essendo preferibilmente compreso tra circa 4 e circa 8 corretto mediante un sale alcalino e/o alcalino terroso. Il solvente è normalmente utilizzato in quantità compresa tra 1 e 50 volumi, preferibilmente tra 1 e 5 volumi, per volume di miscela da trattare. The reaction solvent is water, alone or in a mixture with organic solvents miscible thereto, in the presence or absence of a buffer, the pH being preferably between about 4 and about 8 corrected by means of an alkaline and / or alkaline earth salt. The solvent is normally used in quantities ranging from 1 to 50 volumes, preferably from 1 to 5 volumes, per volume of mixture to be treated.
La bioreazione è normalmente condotta ad una temperatura compresa tra 0 e 100° C e la sua durata è normalmente compresa tra 2 e 96 ore, in funzione della concentrazione di omega-3 che si vuole ottenere. Preferenzialmente è condotta a temperatura compresa tra i 20 e 35°C ed ha una durata compresa tra 5 e 15 ore. The bioreaction is normally carried out at a temperature between 0 and 100 ° C and its duration is normally between 2 and 96 hours, depending on the concentration of omega-3 to be obtained. It is preferably carried out at a temperature between 20 and 35 ° C and has a duration of between 5 and 15 hours.
La lipasi è normalmente utilizzata in quantità compresa tra 0.2 e 2.0 parti in peso rispetto alla miscela di esteri etilici di partenza, preferibilmente in quantità compresa tra 0.2 e 1 parti in peso. The lipase is normally used in a quantity comprised between 0.2 and 2.0 parts by weight with respect to the mixture of starting ethyl esters, preferably in a quantity comprised between 0.2 and 1 parts by weight.
Al fine di separare gli esteri dagli acidi idrolizzati, la miscela viene poi sottoposta a estrazione oppure distillazione. In alternativa il prodotto può essere purificato su resine o gel di silice o attraverso tecniche cromatografiche specifiche. La miscela così ottenuta può essere sottoposta a nuovi cicli di arricchimento, a seconda della concentrazione di omega-3 nella miscela di partenza e di quella che si vuole ottenere. In order to separate the esters from the hydrolyzed acids, the mixture is then subjected to extraction or distillation. Alternatively, the product can be purified on resins or silica gel or through specific chromatographic techniques. The mixture thus obtained can be subjected to new enrichment cycles, depending on the concentration of omega-3 in the starting mixture and the one to be obtained.
Questo procedimento è molto vantaggioso in quanto permette di aumentare selettivamente il contenuto di DHA e EPA e di ottenere miscele di acidi grassi e/o loro esteri ricche di omega-3, ovvero con un contenuto di omega-3 pari o superiore al 80% in peso della miscela e con un rapporto EPA/DHA compreso tra 0.9 e 1.5. This procedure is very advantageous as it allows to selectively increase the content of DHA and EPA and to obtain mixtures of fatty acids and / or their esters rich in omega-3, i.e. with an omega-3 content equal to or greater than 80% in weight of the mixture and with an EPA / DHA ratio between 0.9 and 1.5.
La tecnica prevede Γ utilizzo di un numero limitato di steps di purificazione, cosa che consente una miglioria di rese e qualità del processo. Inoltre utilizzando come solvente di reazione preferibilmente acqua, si migliora l’impatto ecologico e ambientale evitando in questo modo Γ utilizzo di solventi. The technique involves Γ the use of a limited number of purification steps, which allows for an improvement in yields and process quality. Furthermore, by using preferably water as the reaction solvent, the ecological and environmental impact is improved, thus avoiding the use of solvents.
Gli esempi che seguono hanno scopo puramente illustrativo e non limitativo dell’ invenzione. The following examples are purely illustrative and not limitative of the invention.
Esempio 1: Example 1:
In un reattore da 25 mi si carica 1 g di una miscela di esteri etilici di acidi grassi contenti EPA e DHA in rapporto 40/20 in peso disciolti in tampone fosfato 1 M pH 7. Si caricano 0.5 g di lipasi da Pseudomonas Fluorescens e si lascia sotto agitazione per 24 ore ad una temperatura di 25<0>C. Il pH è mantenuto costante per aggiunta di NaOH 0.1 N. 1 g of a mixture of ethyl esters of fatty acids containing EPA and DHA in a ratio of 40/20 by weight dissolved in 1 M phosphate buffer pH 7 is loaded into a 25 ml reactor. 0.5 g of lipase from Pseudomonas Fluorescens are loaded and leave under stirring for 24 hours at a temperature of 25 <0> C. The pH is kept constant by adding 0.1 N NaOH.
Si distilla sotto vuoto e si ottiene in miscela avente un rapporto EPA/DHA pari a 2.5 ed un contenuto di EPA+DHA pari al 74 % in peso. It is distilled under vacuum and obtained in a mixture having an EPA / DHA ratio equal to 2.5 and an EPA + DHA content equal to 74% by weight.
Esempio 2: Example 2:
In un reattore da 25 mi si carica 1 g di una miscela di esteri etilici di acidi grassi EPA e DHA in rapporto 40/20 disciolti in tampone fosfato 1 M pH 7. Si caricano 0.5 g di lipasi da Pseudomonas cepacea e si lascia sotto agitazione per 5 ore ad una temperatura di 25° C. Il pH è mantenuto costante per aggiunta di NaOH 0.1 N . 1 g of a mixture of ethyl esters of EPA and DHA fatty acids in a 40/20 ratio dissolved in 1 M phosphate buffer pH 7 is loaded into a 25 ml reactor. 0.5 g of lipase from Pseudomonas cepacea are loaded and left under stirring for 5 hours at a temperature of 25 ° C. The pH is kept constant by adding 0.1 N NaOH.
Si distilla sotto vuoto e si ottiene una miscela avente un rapporto EPA/DHA pari a 3.0 ed un contenuto di EPA+DHA pari al 77 % in peso. It is distilled under vacuum and a mixture is obtained having an EPA / DHA ratio equal to 3.0 and an EPA + DHA content equal to 77% by weight.
Esempio 3 : Example 3:
In un reattore da 25 mi si carica 1 g di una miscela di esteri etilici di acidi grassi EPA e DHA in rapporto 40/20 disciolti in tampone fosfato 1 M pH 7. Si caricano 0.5 g di lipasi da Candida antartica e si lascia sotto agitazione per 24 ore ad una temperatura di 25° C. Il pH è mantenuto costante per aggiunta di NaOH 0.1 N . 1 g of a mixture of ethyl esters of EPA and DHA fatty acids in a 40/20 ratio dissolved in 1 M phosphate buffer pH 7 is loaded into a 25 ml reactor. 0.5 g of antarctic Candida lipase is loaded and left under stirring for 24 hours at a temperature of 25 ° C. The pH is kept constant by adding 0.1 N NaOH.
Si distilla sotto vuoto e si ottiene una miscela avente un rapporto EPA/DHA pari a 1.8 ed un contento di EPA+DHA pari al 78 % in peso . It is distilled under vacuum and a mixture is obtained having an EPA / DHA ratio equal to 1.8 and an EPA + DHA content equal to 78% by weight.
Esempio 4: Example 4:
In un reattore da 25 mi si carica 1 g di una miscela di esteri etilici di acidi grassi EPA e DHA in rapporto 40/20 disciolti in tampone fosfato 1 M pH 7. Si carica 1 g di lipasi da Candida antartica immobilizzato su Eupergit C e si lascia sotto agitazione per 24 ore ad una temperatura di 25° C. Il pH è mantenuto costante per aggiunta di NaOH 0.1 N . 1 g of a mixture of ethyl esters of EPA and DHA fatty acids in a 40/20 ratio dissolved in 1 M phosphate buffer pH 7 is loaded into a 25 ml reactor. 1 g of lipase from Antarctic Candida immobilized on Eupergit C and it is left under stirring for 24 hours at a temperature of 25 ° C. The pH is kept constant by adding 0.1 N NaOH.
Si distilla sotto vuoto e si ottiene una miscela avente un rapporto EPA/DHA pari a 1.5 ed un contenuto di EPA+DHA pari all’ 82 % in peso. It is distilled under vacuum and a mixture is obtained having an EPA / DHA ratio of 1.5 and a content of EPA + DHA equal to 82% by weight.
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