ITGE20110066A1 - METHOD FOR DEVELOPMENT IN MICROCOLTURE AND / OR MACROCULTURE OF ALGALI UNICELLULAR AUTOTROPHIC ORGANISMS - Google Patents
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Description
"Metodo per lo sviluppo in microcolture e/o macrocolture di organismi autotrofi unicellulari algali" "Method for the development in microcultures and / or macrocultures of algal unicellular autotrophic organisms"
TESTO DELLA DESCRIZIONE TEXT OF THE DESCRIPTION
La presente invenzione ha per oggetto un metodo per lo sviluppo in micro e macrocolture di organismi autotrofi unicellulari algali. . Oggetto della presente invenzione à ̈ anche l'uso di alghe. The present invention relates to a method for the development of algal unicellular autotrophic organisms in micro and macrocultures. . The subject of the present invention is also the use of algae.
E' noto che i microrganismi autotrofi, in particolare le alghe unicellulari, la cui crescita in opportune condizioni può essere più rapida di quella delle piante terrestri, possono essere utilizzati per la produzione di molecole di interesse commerciale (astaxantina, pro-vitamina A, vitamina B12, acidi grassi poiinsaturi, ficocianine, ecc), per la produzione di biomasse per l'uso in acquariologia, per la produzione di biomasse per l'uso veterinario, per l'alimentazione di animali superiori ed inferiori, acquatici o terrestri, per la produzione di biocombustibili (biodiesel e idrogeno) . In particolare dalle alghe unicellulari si possono ottenere prodotti di interesse farmaceutico, cosmetico o alimentare limano, quali omega 3, nutraceutici, cosmetici, coloranti, farmaci, reagenti. It is known that autotrophic microorganisms, in particular unicellular algae, whose growth under suitable conditions can be faster than that of terrestrial plants, can be used for the production of molecules of commercial interest (astaxanthin, pro-vitamin A, vitamin B12, polyunsaturated fatty acids, phycocyanins, etc.), for the production of biomass for use in aquariology, for the production of biomass for veterinary use, for the feeding of upper and lower animals, aquatic or terrestrial, for the production of biofuels (biodiesel and hydrogen). In particular, from unicellular algae it is possible to obtain products of pharmaceutical, cosmetic or alimentary interest, such as omega 3, nutraceuticals, cosmetics, dyes, drugs, reagents.
E' noto che la crescita delle microalghe nelle coltivazioni su larga scala, avviene in due fasi principali, seguite da una fase di raccolta: It is known that the growth of microalgae in large-scale crops occurs in two main phases, followed by a harvest phase:
- una fase esponenziale il cui tasso di crescita à ̈ sempre positivo nel tempo ed à ̈ proporzionale ai nutrienti, alla temperatura ed all'illuminazione forniti, - an exponential phase whose growth rate is always positive over time and is proportional to the nutrients, temperature and lighting supplied,
- una fase lineare o stazionaria in cui il tasso di crescita à ̈ rallentato o azzerato e la coltura, raggiunta la concentrazione desiderata, viene mantenuta in vita con piccole aggiunte di nutrienti e con l'eliminazione dei cataboliti. - a linear or stationary phase in which the growth rate is slowed down or zeroed and the crop, once the desired concentration is reached, is kept alive with small additions of nutrients and with the elimination of catabolites.
L' eventuale fase decrescente, in cui le cellule tendono a morire per l'inadeguatezza dei mezzi di sostentamento, à ̈ evitata, nelle coltivazioni industriali, grazie alla fase di raccolta, che à ̈ effettuata filtrando il mezzo di coltura quando la concentrazione delle alghe ha raggiunto un valore massimo di concentrazione possibile. The eventual decreasing phase, in which the cells tend to die due to the inadequacy of the means of sustenance, is avoided, in industrial crops, thanks to the harvesting phase, which is carried out by filtering the culture medium when the concentration of algae has reached a maximum possible concentration value.
Sono noti terreni di coltura per alghe, utili sia in coltivazioni di piccole dimensioni, in laboratorio, sia per colture su larga scala. Ambedue le colture prevedono l'utilizzo di terreni di coltura liquidi o solidi contenenti nutrienti e altre sostanze che promuovono la crescita cellulare. Algae culture media are known, useful both in small-scale crops, in the laboratory, and for large-scale cultures. Both cultures involve the use of liquid or solid culture media containing nutrients and other substances that promote cell growth.
La coltivazione su larga scala avviene in bacini, vasche, fotobioreattori con tecniche differenti a seconda della specie e dell'applicazione. Nonostante la possibilità di coltivazione in fotobioreattori di notevoli dimensioni, ad oggi la limitata diffusione di colture algali à ̈ dovuta alla difficoltà di produrre, in modo veloce ed economico, quantitativi industriali di alghe e dei loro metaboliti. Large-scale cultivation takes place in basins, tanks, photobioreactors with different techniques depending on the species and application. Despite the possibility of cultivation in large photobioreactors, to date the limited diffusion of algal cultures is due to the difficulty of producing industrial quantities of algae and their metabolites quickly and economically.
Le coltivazioni monospecifiche all'aperto, a circuito aperto o chiuso, sono portate avanti con alcuni ceppi prescelti in alcune zone geografiche particolari . Monospecific outdoor crops, in open or closed circuit, are carried out with some selected strains in some particular geographical areas.
Nelle condizioni di coltura su larga scala sono necessarie strategie di contenimento delle contaminazioni batteriche, virali, animali o di altri vegetali per evitare la morte della coltura stessa. In large-scale culture conditions, strategies to contain bacterial, viral, animal or other plant contamination are necessary to avoid the death of the crop itself.
Per ovviare a questo inconveniente si utilizzano impianti di coltivazione a circuito chiuso che presentano l'inconveniente di far aumentare i costi di produzione, oppure si utilizzano sostanze farmaceutiche, ad esempio sostanze antifungine che limitano le contaminazioni da parte di funghi, o altre sostanze limitanti contro batteri virus o altri vegetali. To overcome this drawback, closed-circuit cultivation systems are used which have the drawback of increasing production costs, or pharmaceutical substances are used, for example antifungal substances that limit contamination by fungi, or other limiting substances against bacteria, viruses or other plants.
E' altresì noto che i licheni sono costituiti da associazioni mutualistiche/simbiontiche tra un fungo ed un fotobionte, come un alga unicellulare od un cianobatterio. Il fungo forma un intreccio di ife intorno alle cellule algali, rifornendole di acqua e sostanze minerali oltre a proteggerle dalle eccessive radiazioni solari. L'alga od il cianobatterio fornisce al fungo carbonio atmosferico organicato e, nel caso dei cianobatteri, azoto atmosferico organicato. It is also known that lichens consist of mutualistic / symbiotic associations between a fungus and a photobiont, such as a unicellular alga or a cyanobacterium. The fungus forms an intertwining of hyphae around the algal cells, supplying them with water and minerals as well as protecting them from excessive solar radiation. The alga or cyanobacterium supplies the fungus with atmospheric organic carbon and, in the case of cyanobacteria, atmospheric organic nitrogen.
Il genere Trebouxia comprende alghe unicellulari subaeree o alghe che vivono in simbiosi con licheni, con cellule di 10-15 Î1⁄4m in diametro. The genus Trebouxia includes subaerial unicellular algae or algae living in symbiosis with lichens, with cells 10-15 Î1⁄4m in diameter.
Il brevetto GB 2145733 à ̈ relativo ad un terreno solido di coltura su agar per licheni, funghi e/o alghe il quale terreno comprende zuccheri, amminoacidi, estratti naturali, presenti in determinate concentrazioni. Secondo detto brevetto al terreno possono essere aggiunti ormoni e/o antibiotici. Queste sostanze presenti nel terreno solido di coltura accelerano, pur rimanendo nell'ordine dei milligrammi , la crescita delle cellule simbionti del lichene, rispetto alla velocità di crescita ottenuta con terreni di coltura convenzionali, come quelli utilizzati per la coltivazione di funghi. The patent GB 2145733 relates to a solid culture medium on agar for lichens, fungi and / or algae which medium includes sugars, amino acids, natural extracts, present in certain concentrations. According to said patent, hormones and / or antibiotics can be added to the medium. These substances present in the solid culture medium accelerate, while remaining in the order of milligrams, the growth of the symbiont cells of the lichen, compared to the growth rate obtained with conventional culture media, such as those used for the cultivation of mushrooms.
Oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo per lo sviluppo, il mantenimento e l'accrescimento in microcolture e/o macrocolture di almeno un microrganismo unicellulare aigaie autotrofo. The object of the present invention is a method for the development, maintenance and growth in microcultures and / or macrocultures of at least one single-celled autotrophic microorganism.
Detto metodo prevede almeno una fase di avviamento e sviluppo di almeno una coltura aigaie, essendo detta coltura aigaie costituita a partire da alghe unicellulari appartenenti al genere Trebouxia sp.. Said method provides at least a start-up and development phase of at least one aigaie culture, being said aigaie culture consisting of unicellular algae belonging to the genus Trebouxia sp.
L'alga à ̈ ottenuta da licheni ma à ̈ possibile lo sviluppo, il mantenimento e l'accrescimento a partire da un microorganismo unicellulare aigaie autotrofo che vive libero nell'ambiente naturale od in simbiosi con altri organismi. The alga is obtained from lichens but it is possible to develop, maintain and grow from a single-celled autotrophic aigaie microorganism that lives free in the natural environment or in symbiosis with other organisms.
Tale metodo prevede almeno un passo di avviamento e almeno un passo di sviluppo di almeno una coltura aigaie ottenuto da alghe di origine naturale, che vivono in natura in forma libera od in simbiosi con altri microrganismi. This method provides at least one start-up step and at least one development step of at least one aigaie culture obtained from algae of natural origin, which live in nature in free form or in symbiosis with other microorganisms.
I passi di avviamento e sviluppo possono essere seguiti da almeno un passo di mantenimento e/o eventualmente, per ottenere produzioni su larga scala di tipo industriale, da una fase di crescita esponenziale della biomassa aigaie, a partire da detta almeno una coltura aigaie iniziale o da una frazione della stessa, la quale fase di crescita esponenziale può avvenire in sistemi aperti o chiusi. The start-up and development steps can be followed by at least one maintenance step and / or possibly, to obtain large-scale industrial productions, by an exponential growth phase of the aigaie biomass, starting from said at least one initial aigaie crop or from a fraction thereof, which phase of exponential growth can occur in open or closed systems.
La fase di avviamento e sviluppo del metodo oggetto della presente invenzione prevede quindi almeno uno dei seguenti passi: The start-up and development phase of the method object of the present invention therefore provides for at least one of the following steps:
avviamento della coltura con isolamento di almeno un tipo di alga dal suo ambiente naturale od estrazione di almeno un tipo di alga dall'organismo simbionte, start-up of the culture with isolation of at least one type of alga from its natural environment or extraction of at least one type of alga from the symbiotic organism,
- sviluppo di almeno una coltura aigaie in un mezzo liquido appropriato, - development of at least one aigaie culture in an appropriate liquid medium,
- mantenimento in vita ed accrescimento della detta almeno una coltura aigaie, con ottenimento di almeno una coltura aigaie primaria. - maintenance in life and growth of said at least one aigaie crop, with the obtaining of at least one primary aigaie crop.
La fase di avviamento e sviluppo viene eseguita in laboratorio ossia à ̈ una microcoltura avviata e sviluppata in un microsistema. The start-up and development phase is performed in the laboratory, that is, it is a microculture started and developed in a microsystem.
In particolare grazie al presente metodo di coltura si ottiene, in laboratorio, una crescita di decine di grammi al mese in contenitori da 500 mi. In particular, thanks to the present culture method, a growth of tens of grams per month in 500 ml containers is obtained in the laboratory.
L'estrazione dell'alga dal lichene prevede almeno uno dei seguenti passi: The extraction of the alga from the lichen involves at least one of the following steps:
- sminuzzamento del lichene, - shredding of lichen,
- posizionamento dei frammenti in un opportuno mezzo acquoso - positioning of the fragments in a suitable aqueous medium
filtrazione e/o centrifugazione della soluzione acquosa contenente i frammenti per ottenere sole cellule algali da sospendere in un opportuno mezzo liquido. filtration and / or centrifugation of the aqueous solution containing the fragments to obtain only algal cells to be suspended in a suitable liquid medium.
Le cellule algali, isolate o estratte, vegono quindi sospese in un mezzo di coltura liquido arricchito, ottenuto dalla miscelazione di acqua fontis con oligoelementi e/o vitamine e/o sali. The algal cells, isolated or extracted, are then suspended in an enriched liquid culture medium, obtained by mixing aqua fontis with trace elements and / or vitamins and / or salts.
Il passo di avviamento della coltura prevede il mantenimento delle cellule algali in condizione di immobilità ossia senza agitazione del mezzo liquido di coltura. The starting step of the culture foresees the maintenance of the algal cells in a condition of immobility, ie without agitation of the liquid culture medium.
Il passo di avviamento prevede l'utilizzo di almeno un contenitore di avviamento avente pareti ricurve, in particolare un contenitore di forma sferica , all'interno dei quale sono presenti le cellule algali, adese alle pareti, ed il terreno liquido di coltura. The start-up step involves the use of at least one starter container having curved walls, in particular a spherical-shaped container, inside which the algal cells, adhered to the walls, and the liquid culture medium are present.
Il passo di sviluppo prevede la raccolta dal contenitore di avviamento di almeno una frazione della coltura aigaie e il posizionamento di detta frazione in almeno un contenitore di sviluppo contenente un opportuno mezzo di coltura liquido, essendo detto mezzo di coltura liquido messo in agitazione ed areato, ad esempio tramite l'insufflazione di aria, con un gorgogliatone, all'interno del liquido di coltura, ed essendo detto mezzo liquido aggiunto all'interno di ciascun contenitore di sviluppo progressivamente nel tempo, fino a raggiungere un volume massimo, proporzionale agli oligoelementi, vitamine e/o sali forniti. The development step provides for the collection from the starter container of at least a fraction of the aigaie culture and the positioning of said fraction in at least one development container containing a suitable liquid culture medium, said liquid culture medium being stirred and aerated, for example through the insufflation of air, with a gurgle, inside the culture liquid, and being said liquid medium added inside each development container progressively over time, until reaching a maximum volume, proportional to the trace elements, vitamins and / or salts provided.
Il mezzo liquido può essere aggiunto in maniera continua o discontinua, ad intervalli di tempo. The liquid medium can be added continuously or discontinuously, at time intervals.
Il passo di mantenimento prevede la riduzione, in particolare il dimezzamento, dei volumi del mezzo liquido di coltura in cui si sono sviluppate le alghe, contenuto nei contenitori di sviluppo, e l'aggiunta di mezzo di coltura liquido fresco, essendo detto mezzo di coltura mantenuto in condizioni di agitazione e aerazione. The maintenance step involves the reduction, in particular the halving, of the volumes of the liquid culture medium in which the algae have developed, contained in the development containers, and the addition of fresh liquid culture medium, being said culture medium kept under conditions of agitation and aeration.
Aerazione e agitazione possono essere ottenute insufflando aria nel mezzo liquido di coltura. Aeration and agitation can be achieved by blowing air into the liquid culture medium.
Come verrà descritto con maggiori dettagli di seguito il mezzo liquido di coltura utilizzato durante il passo di sviluppo e/o mantenimento à ̈ costituito da acqua fontis o acqua di mare arricchite con oligoelementi e/o vitamine e/o sali. As will be described in more detail below, the liquid culture medium used during the development and / or maintenance step consists of aqua fontis or sea water enriched with trace elements and / or vitamins and / or salts.
Il presente metodo, per la coltivazione di alghe libere, ossia sospese in un mezzo di coltura in assenza di relazione simbiontiche con funghi, risulta essere semplice e poco costoso, e non prevede l'aggiunta di nutrienti, quali ad esempio amminoacidi, carboidrati, lipidi, nel mezzo di coltura: la crescita cellulare à ̈ dovuta solo alla fotosintesi clorofilliana. This method, for the cultivation of free algae, i.e. suspended in a culture medium in the absence of symbiotic relationship with fungi, is simple and inexpensive, and does not require the addition of nutrients, such as amino acids, carbohydrates, lipids , in the culture medium: cell growth is due only to chlorophyll photosynthesis.
Oggetto dell'invenzione à ̈ quindi un metodo per l'avviamento e lo sviluppo di una coltura di almeno un'alga estratta da licheni, per il suo mantenimento e la sua crescita esponenziale. The object of the invention is therefore a method for starting and developing a culture of at least an alga extracted from lichens, for its maintenance and its exponential growth.
Detto metodo prevede che la coltura aigaie sia costituita da alghe unicellulari appartenenti al genere Trebouxia sp. ottenute da licheni. This method provides that the aigaie culture consists of unicellular algae belonging to the genus Trebouxia sp. obtained from lichens.
Ovviamente à ̈ possibile prevede che la coltura sia ottenuta da alghe differenti da quelle appartenenti al genere Trebouxia. Obviously it is possible to foresee that the culture is obtained from algae different from those belonging to the genus Trebouxia.
E' anche possibile prevedere che il metodo oggetto della presente invenzione consenta l'avviamento, lo sviluppo, il mantenimento e l'accrescimento di più colture algali contemporaneamente,anche all'interno dello stesso liquido di coltura, a partire da due o più tipi di alghe (ad esempio di alghe appartenenti a generi o specie diverse tra loro) che vivono libere in natura od in simbiosi con organismi. It is also possible to foresee that the method object of the present invention allows the start-up, development, maintenance and growth of several algal cultures at the same time, even within the same culture liquid, starting from two or more types of algae (for example of algae belonging to different genera or species) that live free in nature or in symbiosis with organisms.
La peculiarità del presente metodo à ̈ che consente di evitare lo sviluppo di contaminanti patogeni, senza l'utilizzo di sostanze chimiche antibatteriche, antifungine, antivirali o simili. The peculiarity of this method is that it allows to avoid the development of pathogenic contaminants, without the use of antibacterial, antifungal, antiviral or similar chemicals.
Ciò à ̈ dovuto al fatto che l'alga Trebouxia se coltivata secondo il presente metodo ha sufficienti capacità difensive di tipo immunitario per non infettarsi . This is due to the fact that the Trebouxia alga, if cultivated according to this method, has sufficient defensive capabilities of the immune type to avoid becoming infected.
La coltura primaria ottenuta con il presente metodo, nella fase di mantenimento, può essere utilizzata come inoculo per culture massive che consentiranno di avere un'ottimale produzione qualitativa e quantitativa, con costi limitati. The primary culture obtained with this method, in the maintenance phase, can be used as an inoculum for massive cultures which will allow to have an optimal qualitative and quantitative production, with limited costs.
Il metodo può comprendere, dopo la fase di avviamento e sviluppo, anche una fase di sviluppo della o delle colture algali in macrosistemi, al di fuori del laboratorio, per l'ottenimento a partire da almeno una frazione della coltura ottenuta durante la fase di avviamento e sviluppo, di una coltura massiva, per consentire lo sfruttamento commerciale ed industriale delle alghe e dei prodotti del loro metabolismo. The method may include, after the start-up and development phase, also a development phase of the algal culture or cultures in macrosystems, outside the laboratory, to obtain starting from at least a fraction of the culture obtained during the start-up phase and development, of a massive crop, to allow the commercial and industrial exploitation of algae and the products of their metabolism.
In una forma esecutiva del presente metodo à ̈ possibile prevedere che al termine del passo di sviluppo nel microsistema (laboratorio) si passi direttamente alla fase di sviluppo in macrosistemi, senza l'esecuzione del passo di mantenimento. In an embodiment of the present method, it is possible to foresee that at the end of the development step in the microsystem (laboratory), one passes directly to the development phase in macrosystems, without carrying out the maintenance step.
Mutando le condizioni di coltivazione à ̈ possibile arrivare a colture massive di tipo industriale partendo dalla coltura primaria ottenuta al termine della fase di avviamento e sviluppo: dalla coltura primaria (in bottiglie da 0,5-1 litri provviste di gorgogliatore), che servono da "inoculum" per colture in piccoli contenitori intermedi da pochi litri (3-10 litri), si passa a volumi di maggiori (25-30 litri) fino ad avere veri e propri bacini di crescita, a circuito chiuso o aperto. By changing the cultivation conditions, it is possible to reach massive industrial-type crops starting from the primary crop obtained at the end of the start-up and development phase: from the primary crop (in 0.5-1 liter bottles equipped with a bubbler), which serve as "inoculum" for cultures in small intermediate containers of a few liters (3-10 liters), we pass to larger volumes (25-30 liters) until we have real growth basins, in closed or open circuit.
Questa tecnica permette di avere la coltura sempre nella fase di crescita esponenziale. This technique allows to have the crop always in the exponential growth phase.
Il vantaggio del presente metodo à ̈ di poter sviluppare colture intensive per l'industria chimica,farmaceutica, cosmetica o alimentare.il metodo rende quindi possibile lo sfruttamento industriale dei fotobionti lichenici in condizioni non simbiontiche. The advantage of this method is to be able to develop intensive cultures for the chemical, pharmaceutical, cosmetic or food industry. The method therefore makes it possible to industrial exploit lichen photobionts in non-symbiontic conditions.
Queste ed altre caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno più chiaramente dalla seguente descrizione di alcuni esempi esecutivi illustrati nei disegni allegati in cui: These and other characteristics and advantages of the present invention will become clearer from the following description of some executive examples illustrated in the attached drawings in which:
la fig. la illustra schematicamente il passo di avviamento della coltura aigaie a partire da licheni, la fig. lb illustra schematicamente 11 passo di sviluppo della coltura aigaie, fig. la schematically illustrates the starting step of the aigaie culture starting from lichens, fig. 1b schematically illustrates the development step of the aigaie crop,
la fig. le illustra schematicamente il passo di mantenimento della coltura aigaie, fig. schematically illustrates the maintenance step of the aigaie crop,
la fig. 2 illustra schematicamente la fase di sviluppo in macrosistemi, fig. 2 schematically illustrates the development phase in macrosystems,
la fig.3 illustra la distribuzione spettrale della tonalità di luce di un esempio di lampada utilizzata in laboratorio nella fase di avviamento e sviluppo. Fig. 3 illustrates the spectral distribution of the light tone of an example of a lamp used in the laboratory in the start-up and development phase.
Il metodo oggetto della presente invenzione prevede almeno una fase di avviamento e sviluppo, in laboratorio, di almeno una coltura o ceppo aigaie la quale fase prevede almeno uno dei seguenti passi: The method object of the present invention provides for at least a start-up and development phase, in the laboratory, of at least one aigaie culture or strain, which phase involves at least one of the following steps:
avviamento della coltura con isolamento di almeno un tipo di alga dal suo ambiente naturale od estrazione di almeno un tipo di alga da lichene con soluzione acquosa appropriata, start-up of the culture with isolation of at least one type of alga from its natural environment or extraction of at least one type of alga from lichen with an appropriate aqueous solution,
preparazione del mezzo liquido di coltura adatto, preparation of the suitable liquid culture medium,
preparazione delle condizioni di coltura adatte, preparation of suitable culture conditions,
sviluppo di almeno una coltura aigaie nel mezzo liquido appropriato, development of at least one aigaie culture in the appropriate liquid medium,
- mantenimento in vita ed accrescimento della detta almeno una coltura aigaie, con ottenimento di almeno una coltura aigaie primaria. - maintenance in life and growth of said at least one aigaie crop, with the obtaining of at least one primary aigaie crop.
Detti passi possono essere eseguiti in un microsistema, ossia sono eseguibili usando strumenti e mezzi di laboratorio. These steps can be performed in a microsystem, i.e. they can be performed using laboratory tools and means.
Il metodo oggetto della presente invenzione può comprendere anche una fase di sviluppo della coltura primaria in macrosistemi la quale fase permette di ottenere biomassa aigaie, in condizioni non simbiotiche, da sfruttare commercialmente ed industrialmente . The method object of the present invention can also comprise a phase of development of the primary culture in macrosystems which phase allows to obtain aigaie biomass, in non-symbiotic conditions, to be exploited commercially and industrially.
Nella presente invenzione per "coltura aigaie" nella fase di avviamento e sviluppo si intende l'utilizzo/trattamento/preparazione di pochi grammi di materiale biologico, mentre per "biomassa aigaie" nella fase di sviluppo in macrosistemi si intende l'utilizzo/trattamento/preparazione di almeno alcuni etti di materiale biologico. In the present invention, "aigaie culture" in the start-up and development phase means the use / treatment / preparation of a few grams of biological material, while "aigaie biomass" in the development phase in macrosystems means the use / treatment / preparation of at least a few hectograms of biological material.
Secondo la presente invenzione l'alga à ̈ un'alga verde in particolare del genere Trebouxia sp. o del genere affine Pseudotrebouxia sp.. According to the present invention the alga is a green alga in particular of the genus Trebouxia sp. or of the related genus Pseudotrebouxia sp ..
Secondo la presente invenzione l'alga à ̈ stata estratta dal lichene Pseudevernia furfuracea. According to the present invention, the alga was extracted from the lichen Pseudevernia furfuracea.
Detto lichene à ̈ presente nel Parco Nazionale del Gran Paradiso (Aosta). This lichen is present in the Gran Paradiso National Park (Aosta).
L'alga Trebouxia sp. può essere trovata come simbionte in diversi tipi di licheni, ad esempio Parmelia sulcata. Trebouxia sp. it can be found as a symbiont in different types of lichens, for example Parmelia sulcata.
Ovviamente à ̈ possibile prevedere l'estrazione anche da licheni diversi da Pseudevernia furfuracea. Obviously it is also possible to foresee the extraction from lichens other than Pseudevernia furfuracea.
Ad esempio l'alga Trebouxia può vivere nelle comunità simbiontiche che costituiscono i biofilm aerei ossia ecosistemi microbici che colonizzano la superficie nuda delle rocce esposte all'atmosfera e che ospitano un insieme di associazione di funghi, batteri e alghe. For example, the Trebouxia algae can live in the symbiotic communities that constitute the aerial biofilms, that is microbial ecosystems that colonize the bare surface of the rocks exposed to the atmosphere and that host an association of fungi, bacteria and algae.
L'alga può essere ottenuta anche da animali mediante endozoocoria, come descritto nel documento "Lichen endozoochory by snails", Steffen Boch, Daniel Prati, Silke Werth, Jòrg Ruetschi, Markus Fischer, PLOS ONE, Aprile 2011, Volume 6, Issue4, pag.l-5.Ovviamente à ̈ possibile prevedere che lo sviluppo della coltura si ottenga da alghe che vivono libere in natura. The alga can also be obtained from animals by endozoocoria, as described in the document "Lichen endozoochory by snails", Steffen Boch, Daniel Prati, Silke Werth, Jòrg Ruetschi, Markus Fischer, PLOS ONE, April 2011, Volume 6, Issue4, pag .l-5. Obviously it is possible to foresee that the development of the crop is obtained from algae that live free in nature.
Nel caso in cui l'alga viva in simbiosi con il fungo, l'alga viene estratta mediante sminuzzamento del lichene in piccoli frammenti che verranno poi posti in una opportuna soluzione acquosa per un determinato tempo. In the event that the algae lives in symbiosis with the fungus, the alga is extracted by crushing the lichen into small fragments which will then be placed in a suitable aqueous solution for a certain time.
Secondo una forma preferita, per l'avviamento della coltura, che si presenterà preferibilmente come una coltura pura composta esclusivamente da alghe del genere Trebouxia, o generi affini, il lichene 1 viene tagliato, con bisturi o mezzi simili, in frammenti da 1-2 mm (1-3 g di peso) e posti in un mezzo o una soluzione acquosa appropriata. According to a preferred form, for the start of the culture, which will preferably appear as a pure culture composed exclusively of algae of the genus Trebouxia, or similar genera, the lichen 1 is cut, with a scalpel or similar means, into fragments of 1-2 mm (1-3 g weight) and placed in an appropriate medium or aqueous solution.
I frammenti vengono lasciati nel liquido, all'interno di un contenitore di ridotte dimensioni (ad esempio provetta falcon 2) anche per qualche giorno. The fragments are left in the liquid, inside a small container (for example falcon 2 test tube) even for a few days.
Detto mezzo acquoso à ̈ costituito preferibilmente da cosiddetta "acqua fontis", acqua comunemente usata in istologia, ossia acqua sorgiva, batteriologicamente pura, in particolare acqua priva di cloro, con uno specifico pH e contenente i normali elettroliti ambientali. Said aqueous medium is preferably constituted by so-called "acqua fontis", water commonly used in histology, ie spring water, bacteriologically pure, in particular water without chlorine, with a specific pH and containing normal environmental electrolytes.
Caratteristiche chimico fisiche (medie) dell'acqua fontis utilizzata sono: Physico-chemical characteristics (average) of the fontis water used are:
- batteriologicamente pura, - bacteriologically pure,
- pH da 5,6 a 7,5 - pH from 5.6 to 7.5
- residuo fisso a 180°C maggiore di 700 mg/1 - anidride carbonica tra 1000 e 2000 mg/1 - fixed residue at 180 ° C greater than 700 mg / 1 - carbon dioxide between 1000 and 2000 mg / 1
- calcio tra 150 e 300 mg/1 - calcium between 150 and 300 mg / 1
- magnesio tra 10 e 40 mg/1 - magnesium between 10 and 40 mg / 1
- sodio tra 40 e 80 mg/1 - sodium between 40 and 80 mg / 1
- potassio tra 7 e 40 mg/1 - potassium between 7 and 40 mg / 1
- ione bicarbonato tra 500 e 1000 mg/1 - bicarbonate ion between 500 and 1000 mg / 1
- ione solfato tra 0 e 100 mg/1 - sulphate ion between 0 and 100 mg / 1
- ione cloruro tra 10 e 80 mg/1 - chloride ion between 10 and 80 mg / 1
- ione nitrato tra 0 e 7 mg/1 - nitrate ion between 0 and 7 mg / 1
- ione fluoruro tra 0 e 2 mg/1 - fluoride ion between 0 and 2 mg / 1
- silice tra 10 e 50 mg/1 - silica between 10 and 50 mg / 1
Il materiale frammentato sospeso in acqua fontis può essere mantenuto in condizioni costanti di temperatura, pH, illuminazione, anche per una settimana, dopo di che il materiale viene: The fragmented material suspended in fontis water can be kept in constant conditions of temperature, pH, lighting, even for a week, after which the material is:
- prefiltrato (esempio attraverso una garza o colino) per la rimozione dalla soluzione di frammenti più grossi di lichene 1, posto in un contenitore di maggiori dimensioni 3, dell'ordine di qualche mi (ad esempio provetta da 15 mi) e successivamente viene: - prefiltered (for example through a gauze or strainer) for the removal from the solution of larger fragments of lichen 1, placed in a larger container 3, of the order of a few ml (for example a 15 ml tube) and subsequently it is:
centrifugato (per la separazione liquido/cellule algali) e fatto passare attraverso almeno un filtro con fori di diametro tra 150-300 Î1⁄4m preferibilmente 200 pm (con eliminazione del sopranatante). centrifuged (for liquid / algal cell separation) and passed through at least one filter with holes of diameter between 150-300 Î1⁄4m preferably 200 µm (with elimination of the supernatant).
Questo consente di ottenere sole cellule algali 5, ossia materiale biologico privo di cellule fungine, da sospendere in un opportuno mezzo liquido. This allows to obtain only algal cells 5, ie biological material devoid of fungal cells, to be suspended in a suitable liquid medium.
La coltura 5, preferibilmente monospecifica, Ã ̈ quindi avviata in un microsistema ossia in piccoli volumi (qualche centinaio di millilitri) in condizioni ambientali controllate in un mezzo liquido appropriato . The culture 5, preferably monospecific, is then started in a microsystem that is in small volumes (a few hundred milliliters) under controlled environmental conditions in an appropriate liquid medium.
Secondo una forma esecutiva il filtrato 5 (1-2 mg di alghe) viene posto in un contenitore di sviluppo 4 trasparente alla luce, ad esempio in vetro, in particolare un pallone di vetro da 250 mi, in specifiche condizioni, in particolare in condizione di immobilità ossia senza agitazione del mezzo liquido di coltura costituito da acqua fontis arricchita con piccole quantità di soluzione di Guillard F/2. According to one embodiment, the filtrate 5 (1-2 mg of algae) is placed in a developing container 4 transparent to light, for example made of glass, in particular a 250 ml glass flask, under specific conditions, in particular under conditions of immobility, ie without agitation of the liquid culture medium consisting of aqua fontis enriched with small quantities of Guillard F / 2 solution.
Preferibilmente secondo la presente invenzione per piccole quantità si intende l'aggiunta di 1 mi di soluzione di Guillard f/2 per litro di acqua fontis. Preferably, according to the present invention, small quantities mean the addition of 1 ml of Guillard f / 2 solution per liter of fontis water.
Questa acqua fontis può quindi essere arricchita di altri oligoelementi e/o vitamine e/o sali, ottenuti con l'utilizzo di una soluzione di Guillard f/2, preparata secondo le tecniche note. This acqua fontis can therefore be enriched with other trace elements and / or vitamins and / or salts, obtained with the use of a solution of Guillard f / 2, prepared according to known techniques.
Un esempio di preparazione à ̈ disponibile sul sito "South Carolina algal Ecology Lab". An example of preparation is available on the "South Carolina algal Ecology Lab" website.
Come à ̈ noto il medium (terreno/mezzo) liquido f/2 (Guillard & Ryther 1962, Guillard 1975), ottenuto dalla miscelazione di tre soluzioni, soluzione con sali principali, soluzione con metalli in tracce e soluzione vitaminica, ha la seguente composizione: As is known, the medium (soil / medium) liquid f / 2 (Guillard & Ryther 1962, Guillard 1975), obtained by mixing three solutions, solution with main salts, solution with trace metals and vitamin solution, has the following composition :
Composizione di azoto, fosforo ed eventualmente silicio nel terreno f/2: Composition of nitrogen, phosphorus and possibly silicon in the soil f / 2:
Componenti Soluzione Quantità Concentrazione stock (g l<'1>) usata (l<-1>) finale nel terreno (M) NaN0375 1 mi 8,82 ·10<'4>NaH2P04·Î—20 5 1 mi 3,62 ·10<"5>N&2S103·9H20 30 1 mi 1,06 ·10<~4>Components Solution Quantity Concentration stock (g l <'1>) used (l <-1>) final in the soil (M) NaN0375 1 ml 8.82 10 <' 4> NaH2P04 Î — 20 5 1 ml 3.62 10 <"5> N & 2S103 9H20 30 1 mi 1.06 10 <~ 4>
O OR
f/2 Vedere 1 mi H f / 2 See 1 mi H
•soluzione tabella O â € ¢ solution table O
M<M <
con metalli sottostante with underlying metals
in traccia in trace
f/2 Vedere 0,5 mi f / 2 See 0.5 mi
soluzione tabella solution table
con vitamine sottostante with underlying vitamins
Composizione dei metalli in traccia nel terreno f/2: Composition of trace metals in soil f / 2:
Componenti Soluzione Soluzione Concentrazione stock stock di finale nel primaria lavoro terreno (M) (g 100 mi<'1>)<(>ì·<1)>Components Solution Solution Final stock concentration in primary soil work (M) (g 100 mi <'1>) <(> ì · <1)>
FeCl3·6H2O - 1/3 g 1,17 •10<'b>Na2EDTA·2H20 - 8,7 g 1,17 «lO<'h>MnCl2«4H20 18 1 mi 9,10 ·10<'Î1⁄2>ZnS04·7H20 2,20 1 mi 7,65·10<"8>COC12·6H20 1 1 mi FeCl3 6H2O - 1/3 g 1.17 â € ¢ 10 <'b> Na2EDTA · 2H20 - 8.7 g 1.17 «lO <' h> MnCl2« 4H20 18 1 mi 9.10 10 <'Î1 ⁄2> ZnS04 7H20 2.20 1 mi 7.65 10 <"8> COC12 6H20 1 1 mi
CUS04*5H20 0,98 1 mi 3,93·10<"8>Î &2^Î ̧Î ̧4·2H2O 0,63 1 mi 2,60·10<"8>CUS04 * 5H20 0.98 1 ml 3.93 10 <"8> Î & 2 ^ Î ̧Î ̧4 2H2O 0.63 1 ml 2.60 10 <" 8>
Composizione delle vitamine nel terreno f/2: Composition of vitamins in soil f / 2:
Componenti Soluzione Soluzione Concentrazione stock stock di finale nel primaria lavoro terreno (M) (g 1<-1>> (l<'1>) Components Solution Solution Final stock concentration in primary soil work (M) (g 1 <-1>> (l <'1>)
Tiamina - 200 mg 2,96 ·10<'7>Biotina 1/0 1 mi 2,05 ·10<'9>Vitamina B12 1,0 1 mi 3,69 ·10<'10>Vantaggiosamente vengono utilizzati palloni di forma sferica le cui pareti favoriscono l'adesione della alghe Trebouxia. Thiamine - 200 mg 2,96 10 <'7> Biotin 1/0 1 ml 2,05 10 <' 9> Vitamin B12 1,0 1 ml 3,69 10 <'10> spherical whose walls favor the adhesion of the Trebouxia algae.
Come illustrato in figura la per il passo di avviamento della coltura, che avviene in condizioni statiche, ossia senza l'agitazione del mezzo liquido di coltura, si utilizza come contenitore 4 un pallone in vetro, in una forma esecutiva preferita da 250 mi, sulle cui pareti interne aderisce, grazie alle loro molecole di adesione, un tappeto verde di alghe. Dette molecole di adesione delle alghe si sviluppano in condizioni di coltura statiche. As illustrated in figure la, for the starting step of the culture, which takes place in static conditions, i.e. without stirring the liquid culture medium, a glass flask 4 is used as container 4, in a preferred embodiment of 250 ml, on the whose internal walls adhere, thanks to their adhesion molecules, a green carpet of algae. Said algae adhesion molecules develop under static culture conditions.
Le pareti del contenitore 2 simulano un ambiente simbiotico con un substrato solido. The walls of the container 2 simulate a symbiotic environment with a solid substrate.
In una forma esecutiva preferita nel contenitore 4 da 250 mi sono contenuti circa 200 mi di acqua fontis, in cui à ̈ posto qualche milligrammo di cellule algali 5 (1-2 mg),e 200 Î1⁄4Î di soluzione di Guillard f/2. In a preferred embodiment, the 250 ml container 4 contains about 200 ml of fontis water, in which a few milligrams of algal cells 5 (1-2 mg) are placed, and 200 Î1⁄4Î of Guillard's solution f / 2 .
Il contenitore 4 Ã ̈ chiudibile mediante un tappo od una pellicola provvista di fori per consentire gli scambi gassosi tra l'interno del contenitore 4 e 1'ambiente. The container 4 can be closed by means of a cap or a film provided with holes to allow gaseous exchanges between the interior of the container 4 and the environment.
In particolare nella fase di avviamento A, la coltura à ̈ mantenuta in condizioni statiche ossia di immobilità per circa 2 mesi. In particular, in the start-up phase A, the crop is kept in static conditions, ie in immobility for about 2 months.
Questa staticità favorisce l'adesione delle alghe sulle pareti interne del contenitore di sviluppo 4. This stillness favors the adhesion of the algae on the internal walls of the developing container 4.
Non essendo necessaria in questa fase una crescita rapida non à ̈ necessario insufflare aria e/o anidride carbonica. Since rapid growth is not necessary in this phase, it is not necessary to blow air and / or carbon dioxide.
In questa prima fase lo scopo à ̈ quello di ottenere colture di qualità che verranno utilizzate per inoculi in volumi più grandi. In this first phase, the aim is to obtain quality crops that will be used for inoculations in larger volumes.
In tutte le fasi ed i passi del metodo oggetto della presente invenzione non à ̈ previsto l'utilizzo di antibiotici o altre sostanze o particolari accorgimenti di ostacolo alla contaminazione batterica, virale o fungina in quanto le alghe Trebouxia hanno mostrato meccanismi di autodifesa con produzione di sostanze batteriostatiche, battericide, antivirali, antifungine. In all the phases and steps of the method object of the present invention, the use of antibiotics or other substances or particular precautions to hinder bacterial, viral or fungal contamination is not envisaged as the Trebouxia algae have shown self-defense mechanisms with the production of bacteriostatic, bactericidal, antiviral, antifungal substances.
Nelle fasi e nei passi che costituiscono il metodo oggetto della presente invenzione, in particolare nella fase di avviamento e sviluppo, in cui sono previsti i passi di avviamento, sviluppo e mantenimento, la popolazione microalgale viene mantenuta preferibilmente a temperature costanti e in determinate condizioni di illuminazione. In the phases and steps that constitute the method object of the present invention, in particular in the start-up and development phase, in which the start-up, development and maintenance steps are envisaged, the microalgae population is preferably maintained at constant temperatures and under certain conditions of lighting.
Come fonte di luce per le alghe, durante la fase di avviamento e sviluppo, può essere utilizzata sia luce naturale che luce artificiale con lunghezze d'onda tipiche della luce solare. Both natural and artificial light with wavelengths typical of sunlight can be used as a light source for algae during the start-up and development phase.
Preferibilmente sono previsti cicli di luce/buio di 12 ore, ossia 12 ore di luce intervallate da 12 ore di buio ma à ̈ possibile prevedere cicli differenti. E' possibile ad esempio impostare un fotoperiodo di da 6 a 18 ore fino ad arrivare ad un massimo di 24 ore di luce. Preferably, light / dark cycles of 12 hours are provided, i.e. 12 hours of light interspersed with 12 hours of darkness but it is possible to foresee different cycles. For example, it is possible to set a photoperiod of from 6 to 18 hours up to a maximum of 24 hours of light.
La luce artificiale può essere ottenuta tramite uso di lampade a fluorescenza, ad incandescenza a mercurio o altre lampade note. Artificial light can be obtained through the use of fluorescent, mercury incandescent or other known lamps.
Un esempio di lampada utilizzabile à ̈ la lampada FLUORA<®>della ditta OSRAM adatta a simulare la luce naturale per favorire la fotosintesi e per stimolare la crescita degli organismi autotrofi grazie all'accentuazione nel blu e nel rosso dello spettro. An example of a usable lamp is the FLUORA <®> lamp by OSRAM suitable for simulating natural light to promote photosynthesis and to stimulate the growth of autotrophic organisms thanks to the accentuation in the blue and red of the spectrum.
Nella figura 3 à ̈ riportata la distribuzione spettrale della tonalità di luce. Figure 3 shows the spectral distribution of the light tone.
Di seguito riportiamo i dati tecnici della lampada FLUORA<®>come indicati sul sito della ditta OSRAM. Below we report the technical data of the FLUORA <®> lamp as indicated on the OSRAM company website.
TIPO L15 W/77 L18 W/77 L30 W/77 L36 W/77 L58 W/77 POTENZA 15W 18W 30W 36W 58W FLUSSO 400 550 1.000 1.400 2.250 LUMINOSO LUNGHEZZA 438 590 895 1.200 1.500 L MAX DIAMETRO 26 26 26 26 26 TYPE L15 W / 77 L18 W / 77 L30 W / 77 L36 W / 77 L58 W / 77 POWER 15W 18W 30W 36W 58W FLUX 400 550 1.000 1.400 2.250 BRIGHT LENGTH 438 590 895 1.200 1.500 L MAX DIAMETER 26 26 26 26 26
D MAX D MAX
Una tipica illuminazione, ad esempio, può essere fatta su contenitori 4 di vetro contenenti le alghe 5, posti ad una decina di centimetri da lampade a fluorescenza e con intensità di irraggiamento superiore ai 700 lux, preferibilmente dai 1000 ai 5000 lux e spettro luminoso da 400 a 6500 °K. A typical lighting, for example, can be done on glass containers 4 containing algae 5, placed at about ten centimeters from fluorescent lamps and with irradiation intensity higher than 700 lux, preferably from 1000 to 5000 lux and a light spectrum from 400 to 6500 ° K.
E' possibile utilizzare anche lampade a incandescenza, le quali vanno poste ad una distanza maggiore dai contenitori 4 per evitare che il calore possa nuocere alla coltura. It is also possible to use incandescent lamps, which must be placed at a greater distance from the containers 4 to prevent the heat from damaging the crop.
Tutti i passi operativi della fase di avviamento e sviluppo sono condotti ad una temperatura compresa tra 0 e 50°C, preferibilmente da 20 a 22 °C. All the operating steps of the start-up and development phase are carried out at a temperature ranging from 0 to 50 ° C, preferably from 20 to 22 ° C.
Ovviamente temperatura ed illuminazioni sono i fattori principali che regolano la crescita aigaie. Obviously, temperature and lighting are the main factors that regulate aigaie growth.
Condizioni ottimali di crescita sono temperature costanti tra 20 e 22 °C e cicli di luce/buio di 12 ore. Optimal growing conditions are constant temperatures between 20 and 22 ° C and 12 hour light / dark cycles.
Il pH dei mezzi acquosi utilizzati nei vari passi della fase di avviamento e sviluppo à ̈ sempre nel range 2-9, preferibilmente il ph à ̈ mantenuto tra 6 e 9. Eccessivi aumenti di pH vengono controllati eliminando una porzione del mezzo liquido di coltura ed aggiungendo acqua. The pH of the aqueous media used in the various steps of the start-up and development phase is always in the range 2-9, preferably the pH is maintained between 6 and 9. Excessive pH increases are controlled by eliminating a portion of the liquid culture medium and adding water.
L'avviamento (passo A) della coltura quindi avviene in condizioni di irraggiamento/temperatura ed in condizioni di immobilità del mezzo di coltura e può avere una durata di circa 2 mesi. The start-up (step A) of the culture therefore takes place in conditions of irradiation / temperature and in conditions of immobility of the culture medium and can last for about 2 months.
Secondo la presente invenzione non à ̈ necessario che i contenitori e gli strumenti usati durante i passi operativi del metodo, in qualsiasi passo o fase, siano sterili. Questa condizione di non sterilità permette di creare un equilibrio simbiotico tra i batteri e l'alga che permette all'alga Trebouxia di ricavare dai batteri ambientali le sostanze nutritive (ad esempio vitamine) necessarie alla sua crescita. According to the present invention it is not necessary that the containers and instruments used during the operative steps of the method, in any step or phase, are sterile. This non-sterile condition allows to create a symbiotic balance between the bacteria and the algae which allows the Trebouxia alga to obtain the nutrients (for example vitamins) necessary for its growth from the environmental bacteria.
Questa simbiosi alghe/batteri consente di evitare l'aggiunta di nutrienti dall'esterno durante la fase di avviamento e sviluppo. This algae / bacteria symbiosis avoids the addition of nutrients from the outside during the start-up and development phase.
E' anche stato notato che l'aggiunta di nutrienti nel mezzo di coltura risulta essere svantaggioso in quanto favorisce lo sviluppo batterico a discapito dello sviluppo aigaie. It has also been noted that the addition of nutrients in the culture medium is disadvantageous as it favors bacterial development at the expense of aigaie development.
Come illustrato in figura lb il successivo passo B di sviluppo della coltura prevede che almeno parte della coltura aigaie 5 prelevata dal contenitore di avviamento 4, ossia dal pallone in vetro da 250 mi, venga posta in sospensione, in un appropriato mezzo liquido di coltura. As illustrated in Figure 1b, the subsequent step B of developing the culture provides for at least part of the aigaie culture 5 taken from the starter container 4, ie from the 250 ml glass flask, to be suspended in an appropriate liquid culture medium.
Preferibilmente almeno una frazione della coltura aigaie viene posta in un liquido di coltura, all'interno di almeno un secondo contenitore trasparente 6, preferibilmente in vetro, avente volume maggiore rispetto al contenitore di avviamento 4. Preferably at least a fraction of the aigaie culture is placed in a culture liquid, inside at least a second transparent container 6, preferably made of glass, having a larger volume than the starter container 4.
Lo sviluppo della coltura avviene in specifiche condizioni di agitazione del mezzo liquido, di insufflazione di aria atmosferica e/o di irraggiamento . The development of the culture takes place in specific conditions of agitation of the liquid medium, of insufflation of atmospheric air and / or of irradiation.
Schematicamente il passo di sviluppo B prevede: - raccolta dal contenitore di avviamento 4 di una frazione della coltura aigaie 5, Schematically, the development step B provides: - collection from the starter container 4 of a fraction of the aigaie culture 5,
posizionamento delle alghe in contenitori contenenti un opportuno mezzo di coltura liquido, - agitazione della terreno di coltura liquido e aerazione continua tramite gorgogliatore, positioning of the algae in containers containing a suitable liquid culture medium, - agitation of the liquid culture medium and continuous aeration by means of a bubbler,
- irraggiamento. - irradiation.
Il contenitore di sviluppo 6 può essere costituito da un contenitore tipo bottiglia in vetro trasparente da 500 mi. The developing container 6 may consist of a 500 ml clear glass bottle type container.
La coltura o le colture algali, in base allo sviluppo raggiunto, vengono replicati per evitare che le colture superino la fase lineare di crescita e quindi decadano. The algal culture or cultures, depending on the development reached, are replicated to prevent the cultures from passing the linear phase of growth and therefore decaying.
Le repliche sono effettuate inoculando piccoli quantitativi della coltura precedente in una o più contenitori di sviluppo (bottiglie 6). Replicas are performed by inoculating small quantities of the previous culture into one or more developing containers (6 bottles).
Preferibilmente all'interno di ciascun contenitore di sviluppo 6 viene progressivamente aggiunto il mezzo liquido di coltura fino ad arrivare ad un volume massimo, proporzionale agli oligoelmenti e/o vitamine e/o Sali forniti preferibilmente tramite l'aggiunta di soluzione di Guillard f/2. Preferably, the liquid culture medium is progressively added inside each development container 6 until reaching a maximum volume, proportional to the trace elements and / or vitamins and / or salts preferably supplied by adding Guillard f / 2 solution. .
Le aggiunte possono essere fatte utilizzando volumi di liquido di coltura via via maggiori. Additions can be made by using increasingly larger volumes of culture liquid.
A differenza del passo A di avviamento, nei successivi passi di sviluppo e mantenimento B e C, il mezzo di coltura liquido à ̈ mantenuto in agitazione. Unlike the start-up step A, in the subsequent development and maintenance steps B and C, the liquid culture medium is kept stirred.
I passi di sviluppo e mantenimento della fase di avviamento e sviluppo possono utilizzare, come mezzo di coltura liquido, acqua fontis (come sopra descritto per la fase di avviamento) o acqua salata, arricchite con piccole quantità di soluzione di Guillard f/2. The development and maintenance steps of the start-up and development phase can use, as liquid culture medium, aqua fontis (as described above for the start-up phase) or salt water, enriched with small amounts of Guillard f / 2 solution.
E' stata dimostrata una crescita ottimale delle alghe Trebouxia in acqua salata. Optimal growth of Trebouxia algae in salt water has been demonstrated.
Preferibilmente secondo la presente invenzione per piccole quantità si intende l'aggiunta di 1 mi di soluzione di Guillard f/2 per litro di acqua fontis o acqua di mare. Preferably, according to the present invention, small quantities mean the addition of 1 ml of Guillard f / 2 solution per liter of fontis water or sea water.
La crescita in acqua marina, grazie ad un adattamento dei sistemi biochimici dell'alga Trebouxia, Ã ̈ maggiore di quella ottenuta in acqua fontis. The growth in sea water, thanks to an adaptation of the biochemical systems of the Trebouxia alga, is greater than that obtained in aqua fontis.
L'acqua di mare può essere ottenuta da acqua di mare autoclavata o bollita, di varie densità marine, mediamente comprese tra 1,008 e 1,030 g/cm<3>, essendo possibile comprendere anche acqua di mare con densità più estrema quale acqua di mare del Mar Morto dove la concentrazione di sali disciolti à ̈ estremamente elevata, e la densità à ̈ 1240 kg/m<3>. Sea water can be obtained from autoclaved or boiled sea water, of various marine densities, on average between 1.008 and 1.030 g / cm <3>, being also possible to include sea water with a more extreme density such as sea water of the Dead Sea where the concentration of dissolved salts is extremely high, and the density is 1240 kg / m <3>.
In alternativa l'acqua marina può essere ottenuta dalla miscelazione in acqua distillata o demineralizzata, autoclavata o bollita, di componenti salini tipici marini, aggiunti con una appropriata concentrazione . Alternatively, sea water can be obtained by mixing in distilled or demineralized water, autoclaved or boiled, of typical marine saline components, added with an appropriate concentration.
E' possibile ad esempio preparare acqua di mare sintetica solubilizzando in acqua ultrapura (bi For example, it is possible to prepare synthetic sea water by solubilizing in ultrapure water (bi
O OR
distillata e/o deionizzata le seguente composizione: distilled and / or deionized the following composition:
H H.
Sale Concentrazione (g/L) Salt Concentration (g / L)
NaCl 22 NaCl 22
MgCl26H20 9,7 MgCl26H20 9.7
Na2S04(anidro) 3,7 Na2S04 (anhydrous) 3.7
CaCl2(anidro) CaCl2 (anhydrous)
KC1 0,65 KC1 0.65
NaHC030,20 NaHC030.20
0,023 0.023
Preferibilmente all'acqua di mare viene aggiunta la soluzione di Guillard F/2 in quantità di un millilitro per litro di acqua di mare. The Guillard F / 2 solution is preferably added to seawater in a quantity of one milliliter per liter of seawater.
Le condizioni operative, di pH, illuminazione e temperatura fase del passo di sviluppo B e mantenimento C, come sopra descritto, in cui à ̈ mantenuta la coltura sono identiche a quelle fase del passo di avviamento A: The operating conditions, pH, lighting and temperature phase of the development step B and maintenance C, as described above, in which the culture is maintained are identical to those of the starting step A:
- temperatura compresa tra 0 e 50°C, in particolare da 20 a 22 °C. - temperature between 0 and 50 ° C, in particular from 20 to 22 ° C.
- pH à ̈ compreso nel range 2-9, preferibilmente il ph à ̈ mantenuto tra 6 e 7,5. - pH is included in the range 2-9, preferably the pH is kept between 6 and 7.5.
come fonte di luce per le alghe può essere utilizzata sia luce naturale che luce artificiale che mima le lunghezze d'onda della luce solare. both natural light and artificial light that mimics the wavelengths of sunlight can be used as a light source for algae.
Preferibilmente sono previsti cicli di luce/buio di 12 ore, ossia 12 ore di luce intervallate da 12 ore di buio ma à ̈ possibile prevedere cicli differenti. E' possibile ad esempio impostare un fotoperiodo da 6 a 18 ore fino ad arrivare ad un massimo di 24 ore di luce. Preferably, light / dark cycles of 12 hours are provided, i.e. 12 hours of light interspersed with 12 hours of darkness but it is possible to foresee different cycles. For example, it is possible to set a photoperiod from 6 to 18 hours up to a maximum of 24 hours of light.
La luce artificiale può essere ottenuta tramite uso di lampade a fluorescenza, ad incandescenza a mercurio o altre lampade note. Artificial light can be obtained through the use of fluorescent, mercury incandescent or other known lamps.
Un esempio di lampada utilizzabile à ̈ la lampada FLUORA<®>della ditta OSRAM, come sopra descritto. An example of a usable lamp is the FLUORA <®> lamp by OSRAM, as described above.
I passi di sviluppo e mantenimento prevedono preferibilmente l'agitazione del mezzo di coltura, la quale agitazione può avvenire meccanicamente e/o tramite l'insufflazione di aria nella soluzione acquosa contenuta nei contenitori di raccolta della coltura . The development and maintenance steps preferably provide for agitation of the culture medium, which agitation can take place mechanically and / or through the insufflation of air into the aqueous solution contained in the culture collection containers.
L'aerazione permette all'acqua di coltura di assorbire il biossido di carbonio contenuto nell'aria e necessario alla fotosintesi. Aeration allows the culture water to absorb the carbon dioxide contained in the air and necessary for photosynthesis.
In assenza di aerazione il consumo di biossido di carbonio porta all'interruzione della crescita. In the absence of aeration, the consumption of carbon dioxide leads to the interruption of growth.
L'aerazione del mezzo liquido di coltura di uno o più contenitori avviene tramite un gorgogliatore che insuffla aria quindi aria con una concentrazione di anidride carbonica pari o superiore a quella atmosferica ossia aria arricchita in C02. The aeration of the liquid culture medium of one or more containers takes place by means of a bubbler which blows in air and then air with a concentration of carbon dioxide equal to or greater than the atmospheric one, that is air enriched in C02.
Preferibilmente viene insufflata aria con una concentrazione di C02compresa tra 0,5 e 2% in volume (V/V), ma à ̈ possibile prevedere concentrazioni da 0,1 a 5% (V/V) o superiori. Preferably, air is blown with a concentration of C02 between 0.5 and 2% by volume (V / V), but it is possible to foresee concentrations from 0.1 to 5% (V / V) or higher.
Come fonte di carbonio, in alternativa od in combinazione all'insufflazione di aria à ̈ possibile prevedere oli o altre sostanze a lunga catena di carbonio (paraffine, idrocarburi e suoi derivati) poste nel terreno di coltura liquido. As a carbon source, alternatively or in combination with the insufflation of air, it is possible to provide oils or other substances with a long carbon chain (paraffins, hydrocarbons and their derivatives) placed in the liquid culture medium.
Secondo la presente invenzione quindi, quando all'acqua fontis o acqua salata, arricchita con soluzione Guillard, viene aggiunta una piccola porzione di coltura aigaie, si avvia un processo di crescita aigaie, grazie alle condizioni di luce ed aerazione, che porta ad avere una coltura di dimensioni maggiori. According to the present invention, therefore, when a small portion of aigaie culture is added to fontis or salt water, enriched with Guillard solution, a process of aigaie growth starts, thanks to the light and aeration conditions, which leads to a larger crop.
Utilizzando come "starter" per la crescita in acqua fontis o salata, una piccola porzione della coltura o ceppo iniziale, si garantisce che il processo di crescita possa continuare all'infinito. By using a small portion of the initial crop or strain as a "starter" for growth in fontis or salt water, it is ensured that the growth process can continue indefinitely.
Periodici conteggi tramite camere di conta al microscopio o tramite letture da spettrofotometri tarati con letture di densità cellulare al microscopio ottico, forniscono indicazioni sulla concentrazione delle colture algali. Periodic counts through counting chambers under the microscope or through readings from spectrophotometers calibrated with cell density readings under an optical microscope, provide information on the concentration of algal cultures.
Come illustrato in figura lb una porzione della coltura cellulare, ad esempio 5 mi, sviluppata nel contenitore di avviamento 4 contenente acqua fontis arricchita di soluzione f/2, Ã ̈ posta in un contenitore di sviluppo 6 contenente circa 100 mi di acqua fontis o acqua di mare arricchita con 100 Î1⁄4Î di soluzione di Guillard f/2. As shown in Figure 1b, a portion of the cell culture, for example 5 ml, developed in the starter container 4 containing aqua fontis enriched with solution f / 2, is placed in a developing container 6 containing about 100 ml of aqua fontis or water of sea enriched with 100 Î1⁄4Î of Guillard's solution f / 2.
Lo sviluppo della coltura prosegue quindi o in acqua di mare o in acqua fontis, arricchite con soluzione f/2. The development of the crop then continues either in sea water or in acqua fontis, enriched with f / 2 solution.
Il contenitore 6 à ̈ posto sotto irraggiamento, come sopra descritto ed il mezzo liquido di coltura à ̈ posto sotto agitazione, preferibilmente tramite l'insufflazione di aria al suo interno. The container 6 is placed under irradiation, as described above and the liquid culture medium is placed under agitation, preferably by blowing air into it.
Ad intervalli di tempo viene aggiunto nel contenitore 6 un determinato quantitativo di liquido di coltura. At intervals of time a certain quantity of culture liquid is added to the container 6.
Come contenitore di sviluppo 6 Ã ̈ possibile usare una bottiglia da 500 ml. A 500ml bottle can be used as developer container 6.
Nel contenitore à ̈ aggiunto, dopo un determinato periodo di tempo, ulteriore liquido di coltura, in particolare 150 mi di acqua fontis o acqua di mare arricchita con soluzione f/2 (preferibilmente 150 Î1⁄4Î ) e successivamente 250 mi di acqua fontis o acqua di mare arricchita con soluzione f/2(preferibilmente 250 Î1⁄4Î ), fino ad arrivare ad occupare tutto il volume disponibile del contenitore. After a certain period of time, further culture liquid is added to the container, in particular 150 ml of acqua fontis or sea water enriched with solution f / 2 (preferably 150 Î1⁄4Î) and subsequently 250 ml of acqua fontis or sea water enriched with solution f / 2 (preferably 250 Î1⁄4Î), until it occupies the entire available volume of the container.
L'aggiunta del mezzo liquido di coltura può avvenire ogni 5 giorni circa. The addition of the liquid culture medium can occur approximately every 5 days.
Ovviamente à ̈ possibile prevedere che il liquido di coltura venga aggiunto in quantità e con tempi diversi da quelli sopra descritti. Obviously it is possible to foresee that the culture liquid is added in quantities and at different times from those described above.
Il passo di sviluppo B può proseguire con il passo di mantenimento C. Development step B can continue with maintenance step C.
Come illustrato in figura le il mantenimento prevede il dimezzamento dei volumi del mezzo liquido di coltura in cui si sono sviluppate le alghe, contenuto nei contenitori di sviluppo 6, e l'aggiunta di mezzo di coltura fresco. As illustrated in figure 1, maintenance involves halving the volumes of the liquid culture medium in which the algae have grown, contained in the development containers 6, and the addition of fresh culture medium.
Il liquido di coltura fresco, come sopra descritto, comprende acqua fontis o acqua di mare arricchita con piccole quantità di soluzione di Guillard f/2. The fresh culture liquid, as described above, includes aqua fontis or sea water enriched with small amounts of Guillard's solution f / 2.
Il liquido di coltura contenente cellule algali asportato dal contenitore 6 può essere utilizzato per avviare una coltura massiva oppure può essere utilizzato per mantenere viva la coltura aigaie in laboratorio. The culture liquid containing algal cells removed from the container 6 can be used to start a massive culture or it can be used to keep the aigaie culture alive in the laboratory.
La coltura à ̈ quindi mantenuta in crescita continua. The crop is therefore kept in continuous growth.
In condizioni ottimali la concentrazione aigaie raddoppia in circa 10 giorni (20 giorni circa se la crescita à ̈ lenta): il dimezzamento del volume e l'aggiunta di nuovo mezzo liquido può avvenire quindi ogni 10 giorni. Under optimal conditions the aigaie concentration doubles in about 10 days (about 20 days if growth is slow): the volume is halved and a new liquid medium can be added every 10 days.
Come illustrato in figura, in una forma esecutiva, dai contenitori 6 da 500 mi viene asportato 250 mi di liquido di coltura (con alghe in sospensione), il liquido asportato viene posto in un nuovo contenitore 6, ed in ciascun contenitore (contenente quindi 250 mi di liquido di coltura con alghe) viene aggiunto liquido di coltura fresco (250 mi di acqua fontis o acqua di mare arricchita con 250 Î1⁄4Î di soluzione f/2). As illustrated in the figure, in one embodiment, 250 ml of culture liquid (with algae in suspension) is removed from the 500 ml containers 6, the removed liquid is placed in a new container 6, and in each container (therefore containing 250 ml of culture liquid with algae) is added fresh culture liquid (250 ml of fontis water or sea water enriched with 250 Î1⁄4Î of solution f / 2).
Preferibilmente per le aggiunte di liquido coltura che vengono fatte durante lo sviluppo e/o il mantenimento della coltura si utilizza o acqua fontis oppure acqua salata a seconda del tipo di acqua utilizzata all'inizio del passo di sviluppo: di conseguenza se lo sviluppo della coltura à ̈ avvenuto in acqua fontis arricchita, si utilizzerà acqua fontis arricchita per tutti i successivi passi che prevedono 1'aggiunta di liquido di coltura. Viceversa se lo sviluppo dell'alga, dopo il passo di avviamento, à ̈ avvenuto in acqua di mare arricchita si proseguirà la coltura aggiungendo, quando previsto, acqua di mare arricchita. Preferably, for the additions of culture liquid that are made during the development and / or maintenance of the culture, either fontis water or salt water is used depending on the type of water used at the beginning of the development step: consequently if the development of the culture It took place in enriched water fontis, enriched water fontis will be used for all the subsequent steps that require the addition of culture liquid. Conversely, if the development of the alga, after the start-up step, took place in enriched sea water, the cultivation will continue by adding, when foreseen, enriched sea water.
La procedura sopra descritta può proseguire per un tempo indeterminato. The procedure described above can continue for an indefinite period.
Come sopra descritto durante il mantenimento, il liquido à ̈ mantenuto in agitazione, preferibilmente insufflando aria con un gorgogliatore. As described above during holding, the liquid is kept stirred, preferably by blowing air with a bubbler.
In ogni momento, durante il passo di mantenimento C, le alghe possono essere estratte dal mezzo di coltura e congelate, ad esempio per poter essere più facilmente trasportate o per avviare un nuovo passo di sviluppo in tempi successivi. At any time, during the maintenance step C, the algae can be extracted from the culture medium and frozen, for example to be more easily transported or to start a new development step at a later time.
La coltura aigaie può essere congelata, ad esempio a -20°C o - 180 °C in azoto liquido, con riduzione di volume, ad esempio tramite centrifugazione e/o sedimentazione. The aigaie culture can be frozen, for example at -20 ° C or - 180 ° C in liquid nitrogen, with volume reduction, for example by centrifugation and / or sedimentation.
La coltura aigaie congelata può essere utilizzata per avviare una nuova fase di sviluppo B. The frozen aigaie culture can be used to start a new development phase B.
Le colture di mantenimento C costituiscono la base per la produzione massiva di microalghe e quindi la fase di passaggio tra la coltura aigaie in microsistemi (microcoltura) e la coltura intensiva in grandi volumi (macrocoltura). The maintenance cultures C form the basis for the massive production of microalgae and therefore the transition phase between the aigaie culture in microsystems (microculture) and the intensive culture in large volumes (macroculture).
E' possibile prevedere di passare alla fase di sviluppo in macrosistemi (coltura intensiva) direttamente al termine del passo di sviluppo B. It is possible to plan to pass to the development phase in macrosystems (intensive culture) directly at the end of the development step B.
Il mezzo di coltura utilizzato e le condizioni di temperatura, pH, concentrazione di elementi per la crescita, di aerazione consentono lo sviluppo (passo B) ed il mantenimento (passo C) della coltura per almeno un anno senza la necessità di avviare (passo A) una nuova coltura. The culture medium used and the conditions of temperature, pH, concentration of elements for growth, aeration allow the development (step B) and maintenance (step C) of the culture for at least one year without the need to start (step A ) a new crop.
Al termine del passo di mantenimento C à ̈ stato eseguito un test generico di tossicità sull'alga Trebouxia utilizzando rotiferi marini Brachionus plicatilis . At the end of maintenance step C a generic toxicity test was performed on the Trebouxia alga using marine rotifers Brachionus plicatilis.
Nell'arco di 48 ore l'alga messa a disposizione come nutrimento à ̈ stata completamente mangiata e digerita dai rotiferi. Within 48 hours the algae made available as nourishment was completely eaten and digested by the rotifers.
Come indice di vitalità sono state contate le uova prodotte da ogni singolo organismo: sono state rilevate 3 uova/individuo. È già considerata ottimale la produzione di 2 uova/individuo . The eggs produced by each individual organism were counted as an index of vitality: 3 eggs / individual were detected. The production of 2 eggs / individual is already considered optimal.
Il metodo oggetto della presente invenzione consente quindi di avere una coltura a ciclo continuo ossia una coltura in fase di crescita esponenziale. The method object of the present invention therefore allows to have a continuous cycle culture, ie a culture in an exponential growth phase.
Nella fase di sviluppo in macrosistemi, alla coltura massiva à ̈ possibile addizionare una certa quantità di liquido di coltura fresco e sottrarre una quantità equivalente di prodotto aigaie ossia liquidi di coltura con cellule. In questo modo le sostanze nutrienti ed i metabolici rimangono costanti così come il livello di crescita. During the development phase in macrosystems, it is possible to add a certain quantity of fresh culture liquid to the massive culture and subtract an equivalent quantity of aigaie product, ie culture liquids with cells. In this way the nutrients and metabolic substances remain constant as well as the level of growth.
Il mezzo di coltura liquido per il mantenimento e la crescita esponenziale della coltura massiva à ̈ costituito da acqua naturale e/o sintetica e/o acqua di mare, che può essere anche sterilizzata chimicamente (ipoclorito e tiosolfato di sodio) o fisicamente (autoclave) arricchita, ossia acqua di mare a cui vengono aggiunti oligoelementi, e/o vitamine e/o sali. The liquid culture medium for the maintenance and exponential growth of the massive culture consists of natural and / or synthetic water and / or sea water, which can also be chemically sterilized (sodium hypochlorite and thiosulfate) or physically (autoclave) enriched, i.e. sea water to which trace elements, and / or vitamins and / or salts are added.
Non sono aggiunti ulteriori sostanze quali zuccheri, ormoni, amminoacidi che possono favorire lo sviluppo cellulare. No further substances are added such as sugars, hormones, amino acids that can favor cell development.
Un volta raggiunti volumi sufficienti, le biomasse possono essere utilizzate per ottenere colture intensive mantenute in modo semi-continuo, continuo o discontinuo. Once sufficient volumes have been reached, the biomasses can be used to obtain intensive crops maintained in a semi-continuous, continuous or discontinuous way.
Come à ̈ noto il modo continuo o semi-continuo delle colture in grandi volumi, consiste nel mantenere attiva la coltura per lunghi periodi di tempo, prelevando parte della massa cellulare e riportando a volume con nuovo mezzo liquido di coltura ad intervalli od in maniera continua. As is known, the continuous or semi-continuous mode of cultures in large volumes consists in keeping the culture active for long periods of time, taking part of the cell mass and bringing it back to volume with new liquid culture medium at intervals or continuously .
Il modo discontinuo consiste nel portare la coltura alla massima concentrazione possibile e nell'utilizzo completo della biomassa ottenuta. The discontinuous way consists in bringing the crop to the maximum possible concentration and in the complete use of the biomass obtained.
Oggetto della presente invenzione à ̈ anche un mezzo di coltura liquido, ossia acqua fontiso o acqua marina arricchita come sopra descritto da utilizzare nella fase di avviamento e sviluppo in microsistemi di almeno una coltura aigaie e/o un mezzo di coltura liquido come sopra descritto da utilizzare nella fase di sviluppo della biomassa in macrosistemi a partire da una frazione di detta coltura. The object of the present invention is also a liquid culture medium, i.e. spring water or enriched sea water as described above to be used in the start-up and development phase in microsystems of at least one aigaie culture and / or a liquid culture medium as described above by use in the development phase of biomass in macrosystems starting from a fraction of said crop.
Oggetto della presente invenzione à ̈ anche una coltura costituita da almeno un microrganismo unicellulare aigaie autotrofo in particolare alga del genere Trebouxia sp. ottenuta tramite un metodo sopra descritto. The object of the present invention is also a culture consisting of at least one autotrophic aigaie unicellular microorganism in particular alga of the genus Trebouxia sp. obtained by means of a method described above.
Il metodo di sviluppo della coltura aigaie può essere adattato ad impianto per la produzione di microrganismi autotrofi algali, in particolare alghe del genere Trebouxia sp., su larga scala. The development method of the aigaie culture can be adapted to a plant for the production of algal autotrophic microorganisms, in particular algae of the genus Trebouxia sp., On a large scale.
L'impianto può essere costituito da uno o più contenitori, celle o vasche, previste separate o collegate tra di loro, adatte a contenere la soluzione acquosa di coltura che viene mantenuta in condizioni ambientali controllate in circuiti chiusi oppure all'aperto. The plant can consist of one or more containers, cells or tanks, provided separate or connected to each other, suitable for containing the aqueous culture solution which is kept in controlled environmental conditions in closed circuits or outdoors.
La o le celle sono quindi provviste di un impianto per l'illuminazione a luce solare o artificiale, di termoregolazione, e di una rete di distribuzione del mezzo di coltura liquido, di aria e/o di anidride carbonica. The cell or cells are therefore equipped with a system for solar or artificial light lighting, thermoregulation, and a distribution network for the liquid culture medium, air and / or carbon dioxide.
L'impianto à ̈ provvisto di: The plant is equipped with:
mezzi di controllo dei parametri chimicofisici, in particolare pH, temperatura, conduttività , densità , spettrocolorazione, del mezzo liquido di coltura, means for controlling the chemical-physical parameters, in particular pH, temperature, conductivity, density, spectro-coloring, of the liquid culture medium,
- mezzi di controllo della concentrazione di nutrienti e/o dei metaboliti, - means of controlling the concentration of nutrients and / or metabolites,
- mezzi di controllo della concentrazione delle alghe, - means of controlling the concentration of algae,
mezzi per l'aerazione e l'insufflazione di aria, quale un gorgogliatore. means for aerating and blowing air, such as a bubbler.
L'illuminazione dei contenitori/vasche che costituiscono l'impianto può essere ottenuta sfruttando l'energia solare o tramite illuminazione artificiale. The lighting of the containers / tanks that make up the system can be obtained by exploiting solar energy or by artificial lighting.
Poiché l'irraggiamento solare varia durante la giornata e durante l'anno à ̈ necessario prevedere sistemi di ombreggimento mobili e/o sistemi di raffreddamento/riscaldamento, per evitare il surriscaldamento o il reffreddamento del mezzo liquido di coltura. Since the solar radiation varies during the day and during the year it is necessary to provide for mobile shading systems and / or cooling / heating systems, to avoid overheating or cooling of the liquid culture medium.
Secondo una forma esecutiva, per ottenere una coltura in continuo à ̈ possibile prevedere mezzi per convogliare un flusso controllato di un opportuno mezzo liquido nei contenitori, previsti separati o collegati tra di loro, per la crescita delle cellule algali, i quali mezzi consentono di mantenere costante il livello del mezzo di coltura e la concentrazione delle sostanze che consentono la fotosintesi e la crescita aigaie. According to one embodiment, in order to obtain a continuous culture, it is possible to provide means for conveying a controlled flow of a suitable liquid medium into the containers, provided separate or connected to each other, for the growth of algal cells, which means allow to maintain the level of the culture medium and the concentration of substances that allow photosynthesis and aigaie growth are constant.
Possono inoltre essere previsti mezzi per la raccolta del mezzo di coltura e della massa cellulare, in modo tale da avere sempre una concentrazione cellulare nel mezzo liquido tale da consentire una crescita continua. Means can also be provided for collecting the culture medium and the cell mass, so as to always have a cell concentration in the liquid medium such as to allow continuous growth.
La frazione di mezzo di coltura estratta dal o dai contenitori, celle o vasche, può essere inviata ad un centro o stazione di filtraggio per ottenere la separazione dell'alga prodotta dal mezzo di coltura. Il mezzo di coltura può essere riciclato mentre il residuo solido di filtraggio, ossia l'alga, può essere sottoposta ai processi che ne consentono lo sfruttamento. Ovviamente à ̈ possibile prevedere impianti che sfruttino direttamente l'alga o i prodotti, metaboliti secondari dell'alga, contenuti nell'alga stessa e/o nel mezzo di coltura. The fraction of culture medium extracted from the container (s), cells or tanks, can be sent to a filtering center or station to obtain the separation of the alga produced from the culture medium. The culture medium can be recycled while the solid filtering residue, ie the algae, can be subjected to the processes that allow its exploitation. Obviously it is possible to foresee plants that directly exploit the algae or the products, secondary metabolites of the alga, contained in the alga itself and / or in the culture medium.
Il presente metodo, in particolare la fase di sviluppo in macrosistemi, può essere applicata per la coltura di alghe in fotobioreattori, ossia circuiti generalmente tubolari in cui viene inoculata la popolazione microalgale proveniente da volumi inferiori, i quali fotobiorettori, pur essendo più complessi dei sistemi di coltura all'aperto consentono un maggiore controllo dei parametri chimico-fisico-biologici ed una maggiore resa produttiva. This method, in particular the development phase in macrosystems, can be applied for the cultivation of algae in photobioreactors, that is generally tubular circuits in which the microalgae population coming from lower volumes is inoculated, which photobiorectors, although more complex than the systems outdoor cultivation allow greater control of chemical-physical-biological parameters and greater production yield.
Il metodo e l'impianto sopra descritto possono essere utilizzati per lo sviluppo e la crescita di colture algali a parte da alghe differenti dal genere Trebouxia o differenti da generi affini a Trebouxia. The method and plant described above can be used for the development and growth of algal cultures apart from algae different from the genus Trebouxia or different from related genera to Trebouxia.
Il metodo oggetto della presente invenzione consente: The method object of the present invention allows:
- un accrescimento continuo di alghe in maniera semplice e poco costosa, - a continuous growth of algae in a simple and inexpensive way,
una crescita della coltura paragonabile o superiore a quella nota dell'alga Nannochloropsis, l'esclusione dell'utilizzo di nutrimenti di origine proteica, lipidica o glucidica, o l'utilizzo di sostanze antibiotiche, antivirali o antimicotiche, un accrescimento aigaie tramite lo sfruttamento del processo naturale della fotosintesi. a growth of the crop comparable or superior to that known of the Nannochloropsis alga, the exclusion of the use of nutrients of protein, lipid or carbohydrate origin, or the use of antibiotic, antiviral or antifungal substances, an aigaie growth through the exploitation of natural process of photosynthesis.
Il metodo può essere applicato anche a coltivazioni industriali di alghe ossia in impianti in grado di fornire un ambiente adeguato alla crescita di organismi biologici. The method can also be applied to industrial algae cultivation, that is to say in plants capable of providing an environment suitable for the growth of biological organisms.
Il metodo rende possibile lo sfruttamento industriale di fotobionti lichenici in condizioni non simbiontiche. The method makes possible the industrial exploitation of lichen photobionts in non-symbiotic conditions.
La coltura aigaie ottenuta mediante il metodo oggetto della presente invenzione consente di: The aigaie culture obtained by the method object of the present invention allows to:
ottenere dalle alghe sostanze di Interesse chimico- farmaceutico, cosmetico, alimentare o simili mediante i metodi noti, quali frantumazione, cottura, trattamenti al microonde, essiccamento, obtain from algae substances of chemical-pharmaceutical, cosmetic, food or similar interest by means of known methods, such as crushing, cooking, microwave treatments, drying,
utilizzare le alghe o parti di esse direttamente o dopo un trattamento ad esempio di essicazione, liofilizzazione, bollitura, cottura, incenerimento o simili. use the algae or parts of them directly or after a treatment such as drying, freeze-drying, boiling, cooking, incineration or the like.
Dette alghe o i prodotti del loro metabolismo possono essere utilizzati per la produzione di composti da utilizzare in campo alimentare, chimicofarmaceutico e/o cosmetico. Said algae or the products of their metabolism can be used for the production of compounds to be used in the food, chemical-pharmaceutical and / or cosmetic fields.
Di particolare interesse sono le sostanze batteriostatiche o battericide prodotte dall'alga, in particolare Trebouxia sp. da utilizzare direttamente o per la produzione di composti ad uso farmaceutico e/o cosmetico. Of particular interest are the bacteriostatic or bactericidal substances produced by the alga, in particular Trebouxia sp. to be used directly or for the production of compounds for pharmaceutical and / or cosmetic use.
Come sopra descritto il metodo oggetto della presente invenzione non prevede l'utilizzo di sostanze antibatteriche, antivirali o antifungine, nel mezzo di coltura. As described above, the method object of the present invention does not provide for the use of antibacterial, antiviral or antifungal substances in the culture medium.
Nonostante l'assenza di queste sostante le colture non soffrono di nessuna forma di infezione. Questo à ̈ dovuto a meccanismi di autodifesa delle alghe stesse che producono sostanze, batteriostatiche, battericide, antivirali e/o antifungine. Despite the absence of these substances, the crops do not suffer from any form of infection. This is due to the self-defense mechanisms of the algae themselves that produce bacteriostatic, bactericidal, antiviral and / or antifungal substances.
Durante tutto il periodo di crescita, che dura diversi mesi,l'alga, in particolare Trebouxia sp., non subisce processi di putrefazione e/o fermentazione, né si sviluppa la componente fungina del lichene. During the whole period of growth, which lasts several months, the alga, in particular Trebouxia sp., Does not undergo rot and / or fermentation processes, nor does the fungal component of the lichen develop.
Il metodo oggetto della presente invenzione non prevede l'utilizzo di specifici nutrienti per favorire la crescita aigaie, la quale invece à ̈ prodotta dalla fotosintesi e dall'utilizzo di oligoelementi, vitamine e sali, contenuti in modeste quantità nei mezzi di coltura. The method object of the present invention does not provide for the use of specific nutrients to promote aigaie growth, which is instead produced by photosynthesis and by the use of trace elements, vitamins and salts, contained in modest quantities in the culture media.
In particolare à ̈ stato dimostrato che l'alga Trebouxia ha instaurato una sorta di simbiosi con flora batterica ambientale non patogena che fornisce all'alga elementi vitaminici e nutritivi. In particular, it has been shown that the Trebouxia alga has established a sort of symbiosis with non-pathogenic environmental bacterial flora that provides the alga with vitamin and nutritional elements.
Oggetto della presente invenzione à ̈ anche l'uso dell'alga Trebouxia sp. o di prodotti del suo metabolismo . The subject of the present invention is also the use of the Trebouxia sp. or products of its metabolism.
Le alghe Trebouxia sp., ottenute ad esempio mediante il metodo oggetto della presente invenzione, parti di essa o prodotti del suo metabolismo, possono inoltre essere utilizzate come: Trebouxia sp. Algae, obtained for example by the method object of the present invention, parts of it or products of its metabolism, can also be used as:
ossigenatori ambientali e/o per l'abbattimento dell'anidride carbonica o per la preparazione di composti da utilizzare come ossigenatori ambientali o per abbattere l'anidride carbonica, in ambito di risanamento ambientale, environmental oxygenators and / or for the abatement of carbon dioxide or for the preparation of compounds to be used as environmental oxygenators or to abate carbon dioxide, in the field of environmental remediation,
agenti disinquinanti e/o decontaminanti dell'ambiente da sostanze disperse quali idrocarburi, matalli pesanti, radionuclidi, o per la preparazione di composti da utilizzare come detti agenti, in ambito di risanamento ambientale, depolluting and / or decontaminating agents of the environment from dispersed substances such as hydrocarbons, heavy metals, radionuclides, or for the preparation of compounds to be used as said agents, in the field of environmental remediation,
- agenti per il trattamento di acque reflue o per la preparazione di composti da utilizzare come agenti per il trattamento di acque reflue, in ambito di risanamento ambientale - agents for the treatment of waste water or for the preparation of compounds to be used as agents for the treatment of waste water, in the field of environmental remediation
- fertilizzanti o per la preparazione di composti da utilizzare come fertilizzanti, - fertilizers or for the preparation of compounds for use as fertilizers,
- acceleratori per la crescita dei licheni o per la preparazione di composti da utilizzare come acceleratori per la crescita dei licheni, - accelerators for the growth of lichens or for the preparation of compounds to be used as accelerators for the growth of lichens,
- materia prima per la produzione di biodiesel, produttori di idrogeno (nella fase oscura del ciclo) - raw material for biodiesel production, hydrogen producers (in the dark phase of the cycle)
- nutrimento per organismi autotrofi od eterotrofi, acquatici o terrestri, o per la produzione di composti da utilizzare come nutrimento di detti organismi, - nourishment for autotrophic or heterotrophic organisms, aquatic or terrestrial, or for the production of compounds to be used as nourishment for these organisms,
agenti metabolizzanti o per la preparazione di composti da utilizzare come agenti metabolizzanti. metabolizing agents or for the preparation of compounds for use as metabolizing agents.
In ambito chimico-farmaceutico e/o cosmetico l'alga del genere Trebouxia sp. o i prodotti del suo metabolismo, possono essere usati come agenti batteristatici o battericidi o per la produzione di composti da utilizzare come agenti batteristatici o battericidi. In the chemical-pharmaceutical and / or cosmetic field, the algae of the genus Trebouxia sp. or the products of its metabolism, can be used as bacteristatic or bactericidal agents or for the production of compounds to be used as bacteristatic or bactericidal agents.
In campo immunoematologico à ̈ stato dimostrato che Trebouxia à ̈ in grado di difendersi autonomamente da aggressioni di patogeni: Trebouxia sp. può quindi essere utilizzata per l'estrazione di molecole di adesione, ossia molecole di natura glico-proteica che costituiscono recettori trasmembrana coinvolte in importanti fenomeni biologici come l'immunità e l'adesione tra cellule. In the immunohematological field it has been shown that Trebouxia is able to defend itself autonomously from attack by pathogens: Trebouxia sp. it can therefore be used for the extraction of adhesion molecules, ie molecules of a glyco-protein nature which constitute transmembrane receptors involved in important biological phenomena such as immunity and adhesion between cells.
Oggetto della presente invenzione à ̈ anche l'uso dell'alga del genere Trebouxia sp. in campo immunologie© per legare, tramite le sue molecole di adesione di superficie, molecole di interesse. The subject of the present invention is also the use of the seaweed of the genus Trebouxia sp. in the field of immunology © to bind, through its surface adhesion molecules, molecules of interest.
La coltura cellulare ottenuta tramite il metodo oggetto della presente invenzione può quindi essere utilizzata come mezzo di avviamento sia per colture massive con crescita in regime stazionario per un tempo prefissato, dopo il quale avviene la raccolta dell'alga, sia per colture massive a ciclo continuo o discontinuo in cui la raccolta dell'alga avviene in modo tale da mantenere la concentrazione dei microrganismi nel liquido di coltura a valori di concentrazione ottimali che consentono la massima velocità di moltiplicazione dei microrganismi. The cell culture obtained through the method object of the present invention can therefore be used as a starting medium both for massive crops with steady state growth for a predetermined time, after which the seaweed harvest takes place, and for massive continuous cycle crops. or discontinuous in which the collection of the alga takes place in such a way as to maintain the concentration of microorganisms in the culture liquid at optimal concentration values that allow the maximum speed of multiplication of the microorganisms.
Le cellule algali, in particolare Trebouxia sp., e/o i prodotti del loro metabolismo possono essere usati in campo chimico, farmaceutico, immunologico, veterinario, alimentare, botanico, agrario, ambientale e per la produzione di biocombustibili. Algal cells, in particular Trebouxia sp., And / or the products of their metabolism can be used in the chemical, pharmaceutical, immunological, veterinary, food, botanical, agricultural, environmental fields and for the production of biofuels.
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