ITFI20120257A1 - Anticorpo ricombinante umano e suo uso per l¿identificazione di syndecano-1 (cd-138) per scopi diagnostici e terapeutici. - Google Patents
Anticorpo ricombinante umano e suo uso per l¿identificazione di syndecano-1 (cd-138) per scopi diagnostici e terapeutici. Download PDFInfo
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Description
DOMANDA DI BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO:
Anticorpo ricombinante umano e suo uso per l'identificazione di syndecano-1 (CD-138) per scopi diagnostici e terapeutici
Campo dell'invenzione
La presente invenzione si riferisce al campo degli anticorpi ricombinanti in particolare anticorpi ricombinanti umani e loro coniugati, capaci di identificazioni altamente specifiche e al loro uso in terapia e diagnostica.
Stato dell'arte
Se rivelato precocemente, il melanoma primario può essere curato per asportazione chirurgica del tessuto maligno, mentre per il melanoma metastatico la prognosi è infausta e non esiste nessuna terapia efficace. Infatti, nonostante le nuove terapie la sopravvivenza media di pazienti con melanoma metastatico è di soli pochi mesi per cui nuovi mezzi terapeutici contro il melanoma rappresentano una necessità prioritaria. Osservazioni analoghe possono essere fatte anche per il carcinoma ovarico.
L’uso terapeutico di anticorpi murini ha dei limiti dovuti alla risposta HAMA (Human Anti-Mouse Antibodies), che possono essere superati dall’ utilizzo di anticorpi totalmente umani. L’uso di anticorpi ricombinanti umani o frammenti di anticorpi come mezzi per il trasporto di citochine prò- e antiinfiammatorie promette di aumentare notevolmente l’indice terapeutico di questi agenti.
Molti anticorpi esercitano il loro effetto terapeutico interferendo direttamente nelle comunicazioni fra recettori cellulari di superficie e ligandi da essi riconosciuti, bloccando o attivando i segnali recettoriali. Anticorpi bloccanti con affinità subnanomolare per Γ antigene sono stati isolati direttamente da librerie fagiche anticorpali. Inoltre con metodi in vitro è possibile ottenere anticorpi umani specifici per epitopi conformazionali o per sequenze altamente conservate. Sarebbe estremamente difficile, se non impossibile, ottenere anticorpi con tale specificità tramite immunizzazione di animali. L’angiogenesi, la formazione di nuovi capillari da vasi preesistenti, è nota essere un complesso processo nella crescita dei tumori solidi come il melanoma e carcinoma ovarico, e coinvolge una gran varietà di tipi cellulari, molti segnali, inclusi quelli fra matrice extracellulare (ECM) e segnali intracellulari attraverso integrine. Esistono altri meccanismi, come quello definito “mimesi vascolare/vascular mimicry”, in cui cellule tumorali formano una microcircolazione vascolare alternativa e indipendente dall’ angiogenesi derivante dalle cellule endoteliali.
Syndecano-1 (CD138) è una proteina della membrana cellulare che, dopo il taglio del suo dominio extracellulare da parte di enzimi, detti eparanasi, è accumulato nella ECM di alcuni tumori, mieloma e carcinoma polmonare, dove modula diversi processi chiave di genesi tumorale come la proliferazione e apoptosi delle cellule cancerose, l' angiogenesi e i processi di metastatizzazione.
Alla luce di quanto sopra, è chiara la necessità di disporre di anticorpi umani capaci di riconoscere nuovi bersagli tumorali come il sindecano-1 , coinvolto nel processo di maturazione dei vasi tumorali e di inibizione della crescita tumorale.
Questi anticorpi ricombinanti umani sono inoltre un ulteriore mezzo utile per nuove terapie o diagnosi.
Breve descrizione delle figure
Figura 1 - Mostra l’espressione di Syndecan-1 in linee cellulari e tessuti di melanoma e carcinoma ovarico usando l' anticorpo ricombinante secondo l'invenzione.
Figura 2 - Mostra la reattività dell’anticorpo secondo l'invenzione con il dominio extracellulare del sindecano-1 ricombinante umano.
Figura 3 - Mostra il coinvolgimento del Syndecano-1 nella crescita del melanoma e l’efficacia terapeutica dell’anticorpo secondo l’invenzione in esperimenti pre-clinici.
Sommario dell’invenzione
L’invenzione si riferisce ad anticorpi interamente umani e specifici per la porzione extracellulare del Sindecano-1 per l’uso come agenti terapeutici e diagnostici.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
E’ stato ora sorprendentemente trovato che anticorpi interamente umani e specifici per la porzione extracellulare del Sindecano-1 possono essere utilizzati per inibire la maturazione dei vasi tumorali e la crescita del melanoma e del carcinoma ovarico e sono quindi utili come mezzi terapeutici e diagnostici nel trattamento di dette malattie.
Secondo una particolare sua realizzazione la presente invenzione si riferisce ad un nuovo anticorpo, qui di seguito denominato OC-46F2, interamente umano e specifico per la porzione extracellulare del Sindecano-1 espresso dalla seguente sequenza nucleotidica delle sue catene pesante VFI (SEQ ID 1 ):
5’ GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGC TATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGAC TC C GT G AAG G G C C G GTT C AC C AT CTC C AG AG AC AATT C C AAG AAC AC GCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCGTAT ATTACTGTGCGAAAGTTGTTCATAAGAAGTTTGACTACTGGGGCCAG GGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT - 3’
e leggera VL (SEQ ID 3)
5’ TCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGAC AGTCAGGATCACGTGCCAAGGAGACAGTCTCAGAAGCTATTATGCAA GCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTAT GGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTC CAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCG GAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCTCTCCCGCGCGGCGATG GCCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGC - 3’
o loro omologhe per almeno il 92%, preferibilmente 93%, più preferibilmente il 98%.
A dette sequenze corrispondono rispettivamente le sequenze di amminoacidi SEQ ID 2 e SEQ ID 4
Si è infatti dimostrato che l’anticorpo come sopra definito dalla sua sequenza, rappresenta un nuovo agente terapeutico (anticorpo umano in formato scFv, OC-46F2) in grado di inibire la maturazione dei vasi tumorali, come dimostrato nel melanoma, e la crescita del melanoma dimostrandone la sua efficacia in studi preclinici. Abbiamo confermato l' efficacia terapeutica di questo anticorpo in un modello sperimentale di carcinoma ovarico. Inoltre abbiamo osservato che il sindecano-1 e il VEGFR-2 codistribuiscono con il CD144 noto essere un marker di “mimesi vascolare/vascular mimicry”, delineando per il sindecano-1 un nuovo
ruolo in questo processo.
Parte Sperimentale
Linee cellulari
Culture di cellule di melanoma umano primario MeCoP, MePA, MeOV,
MeMO, MeTA (Pietra G. et al. Int Immunol 2009) e tutte le linee cellulari
usate per la caratterizzazione dell’anticorpo secondo l’invenzione e
elencate nella Tabella 1 qui di seguito riportata sono state usate entro sei
mesi dalla resurrezione:
Linee cellulari OC-46F2
Melanoma umano
MeCoP
MePA
MeOV
MeMO (-)
MeTA
SKMEL28
FO-1
MV3
Melanoma murino
B16-F1 (-)
Gliobtastoma umano
U87MG
Carcinoma ovarico umano
A2780
IGROV-1
SKOV-3
Osteosarcoma umano
SAOS-2
HOS
Carcinoma polmonare umano
A549
Adenocarcinoma umano della cervice uterina
HeLa
Linea cellulare umana embrionale renale
HEK-293
Cellule endoteliali ombelicali umane
HUVEC -(+)
Linfoblasti T umani
JURKAT
Linea cellulare naturai killer umana
NK-92
Mieloma murino
SP2/0
Linea cellulare ovarica di criceto cinese
CHO-K1
Linea di fibroblasti trasf. da rene di scimmia
COS7
, positivo; {-), pos debole,; -, negativo; -(+) neg. con celi pos
Selezione dei fagi anticorpali:
I fagi anticorpali sono stati selezionati da una libreria fagica anticorpale umana (ΕΤΗ-2-Gold) (Silacci M. et al. Proteomics 2005 and Giovannoni L. et al. Nucleic Acids Res 2001). Per ottenere l' anticorpo scFv 46, cellule di melanoma umano (MeCoP) sono state risospese con 0.5M EDTA ed incubate con 2 mi di ΕΤΗ-2-Gold library. Il sovranatante contenente fagi leganti le cellule è stato usato per infettare cellule di E.coli HB2151 in crescita logaritmica. Per ottenere il scFv 68, la stessa libreria è stata selezionata 4 volte su NK-92, procedendo poi come precedentemente descritto per scFv 46.
Clonazione ed espressione di scFvs ricombinanti e del dominio extracelluare del sindecano-1 umano in cellule di mammiferi:
II cDNA codificante per scFv 46 o scFv 68 contenente la sequenza Myctag all’estremità 3’ è stata amplificata per PCR con i primers: 5’-ctcgtgtgcactcggaggtgcagctgttggagtctggg-3’ (fw; ApaL\ sito di restrizione) (SEQ ID 5) e 5’-ctcgaattcttactaatggtgatggtgatgat gtgcggccccattgagatcctcttctga-3’ (rev; EcoRI sito di restrizione) (SEQ ID 6) per scFv 46; 5’-ctcgtgtgcactcggaggtgcagc tgttggagtctggg-3’ (fw; ApaU sito di restrizione) (SEQ ID 7) e 5’-ctcggatccttacta atggtgatggtgatgatgtgcggccccattgagatcc tcttctga-3’ (rev; BamH \ sito di restrizione) (SEQ ID 8) sono stati usati per scFv 68.
I prodotti di amplificazione per scFvs 68 e 46 e, per il dominio extracellulare di sindecano-1 e la sequenza genomica del segnale leader di secrezione, precedentemente descritto (Carnemolla B. et al. Blood 2002), sono stati clonati nel vettore pcDNA3.1.
I costrutti di scFvs 68 e 46 e del dominio extracellulare di sindecano-1 sono stati usati per transfettare la linea cellulare CFIO. I differenti cloni selezionati sono stati selezionati in citofluorimetria di flusso secondo Pietra et al. 2009 su linee cellulari di melanoma o su NK-92 per la loro capacità di secernere i frammenti anticorpali. I nuovi scFv 46 o scFv 68 espressi in cellule di mammifero sono stati denominati rispettivamente OC-46F2 e 68-2 (anticorpo ricombinante di controllo). Il vettore vuoto pcDNA3.1 e i costrutti scFv OC-46F2 e scFvs 68 sono stati usati per transfettare cellule di melanoma SKMEL28 e la linea murina, B16-F1 e sono state processate come detto sopra.
Purificazione di anticorpi ricombinanti e del dominio extracellulare di sindecanol :
Il OC-46F2 e 68-2 scFvs da cellule di mammifero è stato purificato su una colonna ProteinA/Sepharose. Il dominio extracellulare del sindecano-1 è stato purificato dal terreno di coltura delle cellule CFIO transfettate utilizzando una colonna di Ceramic Flydroxyapatite Tipo I seguita da colonna Ni-NTA sfruttando il tag di 6 His presenti nel C-terminus della proteina ricombinante.
Identificazione per spettrometria di massa della proteina di membrana riconosciuta da scFv OC-46F2:
L’isolamento della proteina di membrana riconosciuta da scFv OC-46F2 è stato eseguito per immuno affinità da lisato di cellule di melanoma MeCoP. Le proteine sono state eluite e separate in elettroforesi. Per l’analisi spettrometrica la banda positiva con scFv OC-46F2 analizzata per “Western blot” è stata sottoposta a digestione con tripsina come descritto in Candiano G. et al. Electrophoresis 2004.
Esperimenti di proliferazione cellulare in vitro :
Per misurare la crescita di cellule di SKMEL28/pcDNA3.1 e SKMEL28/OC-46F2 in vitro, le cellule sono state marcate con blu tripan e sono state contate soltanto le cellule vive.
Test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay):
Il test ELISA è stato eseguito come già descritto in Orecchia P. et al. Eur. J Cancer 2011.
Immunoistochimica e immunofluorescenza:
Tessuti di melanoma umano metastatico e di ovaio umano normale sono stati ottenuti previe procedure di consenso informato approvate dal Comitato Etico interno dell’Istituto Nazionale del Cancro (IRCCS S. Martino-IST, Genova Italia).
Le procedure sono state descritte Orecchia P. et al. Eur. J Cancer 2011. Modelli sperimentali animali e analisi statistica:
Femmine di topo NOD-SCID di otto settimane sono state fornite dal Jackson Laboratory (Bar Harbour, MA). La stabulazione e il sacrificio degli animali ha seguito quanto previsto dalle norme legislative nazionali per la protezione di animali usati per scopi scientifici (Legge Italiana n. 116 del 27 Gennaio 1992).
Campioni di melanoma umano SKMEL28 e di carcinoma ovarico umano SKOV-3 e A2780 sono stati ottenuti per iniezione sottocutanea di 10<7>cellule topo in topi NOD-SCID.
Per gli esperimenti in vivo gruppi di 8 topi NOD-SCID sono stati inoculati per via sottocutanea con le linee cellulari usate. La terapia in vivo con OC-46F2 purificato è stata effettuata quando i tumori avevano raggiunto un volume di circa 0,1 cm<3>: 70pg scFv OC-46F2 sono stati iniettati ogni giorno nella vena caudale o nel peritoneo di ogni animale a giorni alterni fino al giorno 17 o 12. Gruppi simili di animali sono stati iniettati con ranticorpo ricombinante di controllo per lo stesso numero di giorni. Per determinare la localizzazione di OC-46F2 nel tumore e la sua assenza negli organi, 280.pg di scFv OC-46F2 sono stati iniettati in due giorni consecutivi nel peritoneo di 3 topi NOD-SCID quando il volume del tumore raggiungeva i 0.5 cm<3>. La significatività statistica dei risultati è stata determinata utilizzando il test non parametrico di Mann-Whitney.
RISULTATI
Generazione e caratterizzazione di un anticorpo ricombinante umano antisindecano-1 :
E’ stato generato un pannello di anticorpi ricombinanti umani (scFvs) verso proteine di membrana di cellule di melanoma umano. L’anticorpo scFv-46 è stato scelto per la sua buona reattività con le proteine di membrana delle cellule di melanoma (MeCoP) usate per la selezione delle libreria e per la sua negatività con le linee cellulari NK-92 e Jurkat (Fig. 1A). Per migliorare la conformazione deiranticorpo e la sua stabilità il scFv-46 è stato prodotto in cellule di mammifero (CHO), sequenziato e rinominato OC-46F2. La proteina di membrana riconosciuta dal OC-46-F2 è stata identificata tramite spettrometria di massa. Il peptide sequenziato RNQSPVDQGATGASQGLLDRK, (SEQ. ID 9) apparteneva alla porzione extracellulare della proteina di membrana umana sindecano-1 (CD138).
Per convalidare questo risultato sono stati utilizzati due diversi approcci: a) il OC-46F2 scFv ha reagito con una linea cellulare di melanoma murino (B16-F1) transfettato con il cDNA “ORF” codificante per il sindecano-1 umano (Figura 2A); b) usando un test ELISA, abbiamo dimostrato la positività di OC-46F2 scFv con la porzione extracellulare ricombinante umana purificata di sindecano-1 (Figura 2B).
Espressione di sindecano-1
E’ stata esaminata l’espressione in membrana cellulare di sindecano-1 in varie linee cellulari utilizzando l’anticorpo ricombinante OC-46F2 come riportato nella Tabella 1. Inoltre, come mostrato con Western blot, OC-46F2 riconosce la forma solubile del sindecano-1 (Figura 1B). La figura 1C (a-e) mostra la reattività di OC-46F2 con i tessuti. In tutti questi tumori una forte positività era presente nei vasi e nel ECM attorno alle cellule tumorali mentre non è stata trovata positività nei tessuti umani ovarici normali (Figura 1C e) contenenti un gran numero di vasi positivi anti CD31 (Figura 1C f). Abbiamo dimostrato che OC-46F2 nel melanoma umano, indotto in modelli murini, e in tessuti di melanoma metastatico, riconosceva sia i vasi precoci positivi con anti desmina, sia vasi maturi positivi con anti SMA (actina di muscolo liscio).
L’anticorpo ricombinante anti-sindecano-1 OC-46F2 inibisce la maturazione vascolare e la crescita del tumore.
Come mostrato nelle figura 3A, OC-46F2 rilasciato nel mezzo di coltura di cellule transfettate (SKMel28/OC-46F2) è in grado di inibire del 55% e 65% la crescita delle cellule rispettivamente alle 48 e 72 ore, rispetto alla linea cellulare di controllo (SKMel28/pcDNA3). L’effetto in vivo di OC-46F2 è stato testato in un modello murino di melanoma umano (SKMel28). La crescita tumorale in topi iniettati per via sottocutanea con cellule SKMel28/scFv OC-46F2 è ridotta del 47% rispetto ai topi di controllo. Questo risultato è altamente significativo: p 0.0087 (Figura 3B). La Figura 3C mostra che l’anticorpo rilasciato in vivo dalle cellule di melanoma si localizzava nelle strutture in cui, secondo i nostri esperimenti, è particolarmente espresso il sindecano-1 (vasi e ECM). Infatti, un anticorpo specifico per la sequenza myc, localizzata nel C-term inale di OC-46F2, colorava sezioni di tessuto tumorale proveniente da topi iniettati per via sotto cutanea con cellule SKMel28/ OC-46F2 (Fig. 3 C, a-b), ma non sezioni derivanti dai topi di controllo (Fig. 3 C, c.) Le minori dimensioni dei tumori derivati da cellule SKMel28/OC-46F2 erano in accordo con il minor numero di cellule proliferanti positive con Ki67 riscontrate in questi tumori rispetto ai controlli (Fig. 3D, E). Il valore di p nei due gruppi era < 0,0001, considerato estremamente significativo. Nei tumori derivati da topi iniettati sottocute con SKMel28/OC-46F2 la positività con anti-CD31 era limitata a singole cellule non organizzate in strutture vascolari: queste erano completamente negative con anti-SMA, un marcatore di vasi maturi, e positive con anticorpo anti-desmina, che marca i vasi precoci. Al contrario i tumori di controllo presentavano un reticolo vascolare ben organizzato composto da vasi maturi (SMA positivi) e precoci (Desmina positivi).
Uso deiranticorpo ricombinante umano OC-46F2 come farmaco biologico in esperimenti pre-clinici.
OC-46F2 ha un effetto terapeutico sulla crescita del tumore quando somministrato a topi con melanoma (figura 3F) e carcinoma ovarico (figura 3G) con una riduzione del 76% della crescita del melanoma e del 77% del tumore ovarico nei topi trattati rispetto ai topi di controllo. Abbiamo dimostrato che OC-46F2 era localizzato nei tumori di topi trattati con alte dosi di anticorpo, mentre nessuna positività airanticorpo è stata rivelata negli organi (polmoni, milza, fegato e reni) nei topi analizzati. Inoltre, nei tumori da animali che avevano ricevuto OC-46F2 come farmaco, non è stata determinata alcuna positività con anticorpi anti-SMA il che conferma la capacità di OC-46F2 di inibire la maturazione di vasi intratumorali. Inoltre i tumori prelevati da topi che avevano ricevuto la terapia con OC-46F2 erano negativi con anti-VEGFR-2, mentre i tumori dei topi di controllo mostravano una marcata espressione di VEGFR-2 in molte aree del tumore. Da questo risultato possiamo dedurre che ranticorpo, ricevuto dagli animali con la terapia, legandosi in maniera specifica e selettiva al sindecano-1, non consente Γ interazione di quest’ ultimo con il VEGFR-2 impedendo Γ attivazione delle vie di segnale che conducono alla formazione di nuovi vasi nelle quali entrambe le proteine sono coinvolte. Inoltre abbiamo osservato che il sindecano-1 e il VEGFR-2 codistribuiscono con il CD144 noto essere un marker di “mimesi vascolare/vascular mimicry”, delineando per il sindecano-1 un nuovo ruolo in questo processo.
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. Anticorpi interamente umani e loro frammenti, specifici per la porzione extracellulare del Sindecano-1 , per l’uso come agenti terapeutici e diagnostici.
- 2. Anticorpi secondo la rivendicazione 1 per la diagnosi o il trattamento terapeutico del melanoma e del carcinoma ovarico.
- 3. Anticorpo secondo la rivendicazione 1 interamente umano e specifico per la porzione extracellulare del Sindecano-1 espresso dalla seguente sequenza nucleotidica delle sue catene pesante VH (SEQ ID 1 ): 5’ GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGG GGT CCCT G AG ACT CT CCT GTGCAGCCT CTGG ATT CACCTTT AGCAGC TATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGAC TCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACAC GCT GT ATCTGCAAATG AACAGCCT G AG AGCCGAAG ACACGGCCGT AT ATTACTGTGCGAAAGTTGTTCATAAGAAGTTTGACTACTGGGGCCAG GGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT - 3’ e leggera VL (SEQ ID 3) 5’ TCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGAC AGTCAGGATCACGTGCCAAGGAGACAGTCTCAGAAGCTATTATGCAA GCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTAT GGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTC CAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCG GAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCTCTCCCGCGCGGCGATG GCCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGC - 3’ a cui corrispondono rispettivamente le sequenze di amminoacidi SEQ ID 2 e SEQ ID 4, o loro omologhe per almeno il 92%, preferibilmente 93%, più preferibilmente il 98%.
- 4. Coniugati di anticorpo secondo la rivendicazione 1 e 3 e molecole capaci di agire come agenti diagnostici, scelti fra isotopi radioattivi e sostanze fluorescenti, e agenti terapeutici scelti fra isotopi radioattivi, citochine e sostanze chemioterapiche.
- 5. Uso di un anticorpo secondo la rivendicazione 1 , 3 e 4 per inibire la maturazione dei vasi tumorali e la crescita del melanoma.
- 6. Uso di un anticorpo secondo la rivendicazione 1 , 3 e 4 per inibire la maturazione dei vasi tumorali e la crescita e del carcinoma ovarico.
- 7. Uso di un anticorpo secondo la rivendicazione 1 , 3 e 4 come mezzo diagnostico del melanoma.
- 8. Uso di un anticorpo secondo la rivendicazione 1 , 3 e 4 come mezzo diagnostico del carcinoma ovarico.
- 9. Uso di un anticorpo secondo la rivendicazione 1 , 3 e 4 come mezzo terapeutico per patologie in cui sono coinvolti i processi di angiogenesi e “Mimesi vascolare/Vascular Mimicry”.
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