ITFI20120026A1 - Proteina apo-sod sua preparzione ed uso. - Google Patents
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Description
DOMANDA DI BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO:
Proteina apo-SOD sua preparazione ed uso
Campo dell'invenzione
La presente domanda si riferisce al campo delle proteine e al loro uso farmaceutico e cosmetico.
Stato deN’arte
L'enzima superossido dismutasi (SOD) è noto essere un importante antiossidante in quasi tutte le cellule in cui si ha presenza di radicali ossigeno (O2 ).
NeN'uomo si conoscono tre forme di questo enzima presenti rispettivamente nel citoplasma (SODI) e che contiene come cofattore metallico il Rame e lo Zinco, nel mitocondri (SOD2) che contiene come cofattore metallico il Manganese e nel liquido extracellulare (SOD3), il cui cofattore metallico è costituito dal Ferro.
La quantità di metallo in una SOD è imprescindibile per qualificarne l'efficacia enzimatica. La SOD2 è un tetramero costituito da quattro sub-unità, ciascuna avente nel suo centro di azione uno ione manganese nello stato di ossidazione II o III.
Vista l'importanza del ruolo svolto da questo enzima, di cui nella letteratura internazionale ne sottolinea chiaramente l’importanza come molecola assolutamente essenziale per la tutela degli organismi che vivono in atmosfera ricca di ossigeno, i cui scarti sono costituiti dai radicali liberi , esso è stato notevolmente studiato per poterne sfruttare le proprietà antiossidative.
E' ovvio quindi l'interesse a identificare nuove forme di proteina aventi migliore capacità antiossidativa rispetto alla proteina naturale (wild type).
Descrizione dettagliata dell'invenzione
E' stato ora sorprendentemente trovato che una proteina del tipo SOD (ma priva di Manganese) e qui di seguito nominata apo-MnSOD presenta una particolare efficienza antiossidativa che la rende un prodotto estremamente interessante per applicazione farmacologica e cosmetica.
Nella proteina apo-SOD secondo l’invenzione, nella sua forma estrattiva, il manganese risulta assente, e la proteina presenta la sequenza qui di seguito riportata (SEQ ID N 1):
MLSRAVCGTS RQLAPALGYL GSRQKHSLPDLPYD YGALEPHINA QIMQLHHSKH HAAYVNNLNV TEEKYQEAL A KGDVTAQIAL QPALKFNGGG HINHSIFWTN LSPNGGGEP K GELLEAIKR DFGSFDKFKE KLTAASVGVQ GSGWGWLGFN KERGHLQIAA CPNQDPLQGT TGLIPLLGID VWEHAYYLQY KNVRPDYLKA IWNVINWENV TERYMACKNK NSC
(ove la sequenza sottolineata di 24 aminoacidi rappresenta il peptide leader).
Detta proteina è stata isolata da cellule LSA isolate con il seguente processo (che è anch’esso oggetto della presente invenzione.
Processo di ottenimento di apo-MnSOD umana a basso contenuto di Manganese
10<9>cellule (LSA), queste sono state lavate due volte nella piastra con soluzione sterile di PBS e trattate con Tripsina-EDTA.
Una volta staccatesi dalla piastra le cellule sono state raccolte sterilmente, miscelate con 50 mi di mezzo di coltura FI2,serum-free e centrifugate a 1000 g per 10 min.
Alla fine della centrifugazione, dopo aver allontanato la tripsina residuata dal trattamento, le cellule sono state ulteriormente lavate ancora due volte con PBS sterile, per allontanare ogni residuo di mezzo di coltura o di tripsina.
Dopo questo trattamento le cellule sono state sottoposte a shock ionico mediante aggiunta al pellet cellulare di una 10 mi di soluzione ipotonica sterile per 20 minuti (RIPA Buffer Cat.n° 9806-Cell Signaling-Thechnology).
Dopo tale periodo di incubazione a R.T., mediante centrifugazione per 25 min a 5 x g, è stato prelevato il supernatante costituito dalle proteine prodotte e contenute nel citoplasma delle cellule LSA.
Dopo aver sottoposto questo campione a corsa elettroforetica di gel preparativi di Acrilamide al 15% e dopo colorazione con blu di Comassie sono state rimosse dal gel, mediante taglio con il bisturi, le bande di proteine comprese tra i 25 e 35 KDa.
Tra le proteine che sono state sottoposte ad esame della sequenza amminoacidica con la Spettrometria di Massa è stata identificata una MnSOD il cui peso molecolare è di 30 Kda ed avente la sequenza suddetta.
Da un cDNA derivato dall’ mRNA ricavato dalle cellule LSA, è stata ottenuta successivamente la forma ricombinante, facendola esprimere in E. coli, denominata hrMnSOD.
Questa proteina è stata sottoposta ad analisi chimico-fisica ed è stata inoltre analizzata l'intera sequenza amminoacidica.
Dalle analisi risulta che la hrMnSOD come sopra definita è attiva enzimaticamente e presenta un potenziale antiossidante superiore a quello della Vit. C.
La proteina, come si vede dalla sequenza amminoacidica, presenta il peptide leader di sequenza composto da 24 aa. ancora legati alla porzione N-terminale.
Per facilitare la purificazione mediante cromatografia per immunoaffinità, secondo una particolare realizzazione l'invenzione, alla sequenza della proteina come sopra definita (SEQ ID N° 1) è stata aggiunta, nella molecola ricombinante, una molecola Tag composta da 15 aa. ed avente sequenza (SEQ ID N° 2):
ASMTGGQQMGRGSEF
In questo caso la proteina avrà quindi sequenza (SEQ ID N° 3):
ASMTGGQQMGRGSEF MLSRAVCGTS RQLAPALGYL GSRQKHSLPDLPYD YGALEPHINA QIMQLHHSKH HAAYVNNLNV TEEKYQEAL A KGDVTAQIAL QPALKFNGGG HINHSIFWTN LSPNGGGEP K GELLEAIKR DFGSFDKFKE KLTAASVGVQ GSGWGWLGFN KERGHLQIAA CPNQDPLQGT TGLIPLLGID VWEHAYYLQY KNVRPDYLKA IWNVINWENV TERYMACKN KNSC
Sia nella molecola estrattiva che in quella ricombinante manca il cofattore metallico, costituito dal Manganese, mentre nella molecola wild type essa è presente in quantità normale in tutta la molecola. Infatti, per ogni monomero di proteina vi è presente uno ione manganese.
La assenza del Mn rappresenta perciò un aspetto essenziale della proteina naturale.
Secondo l'invenzione è infatti noto che la presenza del cofattore metallico in una SOD favorisce il giusto refolding della proteina, ciò che poi genera la sua attività enzimatica, tuttavia benché il Manganese sia assente nella molecola estrattiva ed in quella ricombinante, entrambe sono tuttavia dotate di una notevole attività antiossidante, addirittura maggiore di quella espressa dalla Vit-C.
La proteina infatti, non essendo foldata e contenendo il peptide leader che la abilita ad entrare in tutte le cellule, ed avendo la necessità di legare il Mn, per poter divenire attiva, trova il Manganese che le necessita proprio nelle cellule in cui penetra dove quindi agisce da antiossidante.
La proteina è facilmente iniettabile in vitro ed in vivo ed è capace di penetrare nelle cellule dove trasforma i radicali liberi in perossido di idrogeno che viene poi convertito in ossigeno molecolare ed acqua dalle catalasi.
Per la sua attività antiossidante ed anti-radicalica, la proteina è stata utilizzata per il trattamento terapeutico di numerose malattie ovvero per la loro prevenzione.
Infatti, è stato dimostrato che:
-la hrMnSOD secondo l'invenzione, iniettata in ratti portatori di cirrosi epatica, determina la riduzione della Ipertensione Portale per il 90 %. La neutralizzazione della quantità di radicali liberi in tutto il parenchima epatico consente alle cellule endoteliali dei sinusoidi epatici la possibilità di disporre nuovamente dell’NO che abilita queste cellule a rispondere nuovamente agli stimoli vasodilatatori o vasocostrittori, impedendo che si generi ascite. -la hrMnSOD somministrata a ratti che erano stati trattati con ciclosporina-A (Cs-A), consente al rene di recuperare la quota del filtrato glomerulare per il 90 %, impedendo quindi l’instaurarsi di una condizione di Insufficienza Renale Acuta (IRA), irreversibilmente mortale, che si è normalmente osservata negli animali trattati con la Cs-A in assenza della hrMnSOD.
-la hrMnSOd aggiunta a soluzioni plegiche commerciali (Custodiol) consente la conservazione degli organi destinati al trapianto per un periodo superiore alle dodici ore, senza che l'organo subisca danni strutturali ed o ultrastrutturali, suggerendo che tale condizione possa anche proteggere l’organo durante la successiva fase di riperfusione, quando cioè l’organo verrà reimpiantato nel paziente ricevente.
Negli organi conservati in questa soluzione , dopo dodici ore di permanenza a 4°C, la quantità di radicali liberi è risultata notevolmente inferiore alla quantità di radicali presenti negli organi appena espiantati o in quelli conservati in assenza della hrMnSOD.
Inoltre la hrMnSOD, aggiunta al sangue di pazienti che erano stati sottoposti a dialisi, a causa della insufficienza renale cronica, prima che questo venisse reintrodotto nell’organismo, ha determinato un abbattimento della quota di radicali liberi, quasi annullandoli completamente. In considerazione del fatto che sono proprio questi radicali a determinare il peggioramento delle condizioni vascolari del paziente uremico, che spesso causano morti improvvise, l’utilizzo preventivo della hrMnSOD servirebbe a ridurre significativamente questi danni.
La hrMnSOD riesce poi a riparare i danni cutanei da ischemia, dovuti a cause chimiche, fisiche o biologiche, sempre con lo stesso meccanismo di azione, cioè quello della rimozione della eccessiva quantità di radicali liberi e loro dismutazione in ossigeno molecolare ed è inoltre capace di impedire l’instaurarsi di insufficienza acuta renale (IRA) nei ratti che hanno ricevuto una iniezione da mezzi di contrasto, necessari per effettuare analisi per immagini (TAC o PET)
Sorprendentemente la rhMnSOD secondo l'invenzione esercita una notevole attività antiaging ed è quindi potenzialmente un nuovo cosmetico capace di impedire che la cute venga sottoposta a danni che ne determinano una perdita di struttura e perciò di funzione. La hrMnSOD è quindi una molecola che impedisce invecchiamento cutaneo.
La proteina si presta quindi ad essere utilizzata per curare o prevenire tutti gli stati ossidativi in cui un eccesso di radicali liberi può determinare l’instaurarsi di una condizione ischemica
In considerazione che circa il 90 % delle malattie sono dovute ad una condizione ischemica, ipotizziamo che un tale prodotto, con le sue caratteristiche possa avere anche un notevole impatto di mercato
Fra le composizioni antiaging secondo l'invenzione un esempio è costituto da una composizione per uso in formulazioni per applicazione topica in cui la proteina secondo l'invenzione è sciolta in glicerina ed acqua eventualmente in presenza degli usuali conservanti antibatterici, complessanti ecc.
Un esempio di formulazione secondo l'invenzione è costituto da:
rMnSOD - 1mg
Glicerina 20g
Metilcloroisotiazolinone Metilisotiazolinone sol. 1,5% 0,05g
EDTA bisodico 0, 1 g
Imidazolidinilurea 0,3g
Acqua Depurata F.U. qb a 100ml
Detta formulazione garantisce una concentrazione di proteina di 50 pg /100g.
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1 . Proteina apo-MnSOD umana ricavata da cellule LSA, di 30 Kda avente sequenza MLSRAVCGTS RQLAPALGYL GSRQKHSLPDLPYD YGALEPHINA QIMQLHHSKH HAAYVNNLNV TEEKYQEAL A KGDVTAQIAL QPALKFNGGG HINHSIFWTN LSPNGGGEP K GELLEAIKR DFGSFDKFKE KLTAASVGVQ GSGWGWLGFN KERGHLQIAA CPNQDPLQGT TGLIPLLGID VWEHAYYLQY KNVRPDYLKA IWNVINWENV TERYMACKNK NSC (SEQ ID N°1 ) ed avente un contenuto nullo di manganese.
- 2. Processo per l'ottenimento di una proteina secondo la rivendicazione 1 in cui: - cellule (LSA), lavate due volte nella piastra con soluzione sterile di PBS e trattate con Tripsina-EDTA, sono raccolte sterilmente, miscelate con mezzo di coltura F12,serum-free e centrifugate; - alla fine della centrifugazione, dopo aver allontanato la tripsina residuata dal trattamento, le cellule sono ulteriormente lavate ancora due volte con PBS sterile, per allontanare ogni residuo di mezzo di coltura o di tripsina; - le cellule sono sottoposte a shock ionico e quindi, per centrifugazione, si preleva il supernatante costituito dalle proteine prodotte e contenute nel citoplasma delle cellule LSA. - il sovranatante raccolto è sottoposto a corsa elettroforetica di gel preparativi di Acrilamide al 15% si è quindi isolata la banda corrispondente a 30 Kda.
- 3. Proteina secondo la rivendicazione 1 espressa in E. coli.
- 4. Proteina secondo la rivendicazione 3 avente sequenza: ASMTGGQQMGRGSEF MLSRAVCGTS RQLAPALGYL GSRQKHSLPDLPYD YGALEPHINA QIMQLHHSKH HAAYVNNLNV TEEKYQEAL A KGDVTAQIAL QPALKFNGGG HINHSIFWTN LSPNGGGEP K GELLEAIKR DFGSFDKFKE KLTAASVGVQ GSGWGWLGFN KERGHLQIAA CPNQDPLQGT TGLIPLLGID VWEHAYYLQY KNVRPDYLKA IWNVINWENV TERYMACKN KNSC
- 5. Uso di una proteina secondo le rivendicazioni 1 - 4 come agente antiossidante.
- 6. Uso secondo la rivendicazione 5 in cui la proteina è utilizzata come agente antiaging.
- 7. Composizione comprendente la proteina secondo le rivendicazioni 1 - 4, glicerina, acqua ed eventuali conservanti antibatterici e complessanti.
- 8. Composizione secondo la rivendicazione 7 contenente una concentrazione di proteina di 50 pg /1 OOg
- 9. Composizione secondo la rivendicazione 8 costituita da: rMnSOD secondo le rivendicazioni 1 - 3 1 mg - Glicerina 20g - Metilcloroisotiazolinone Metilisotiazolinone sol. 1 ,5% 0,05g - EDTA bisodico 0,1 Og - Imidazolidinilurea 0,30g - Acqua Depurata F.U. qb a l OOml
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|---|---|---|---|---|
| WO2003072768A2 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Istituto Nazionale Per Lo Studio E La Cura Dei Tumori Fondazione Giovanni Pascale | Modified human manganese superoxide dismutase and uses thereof |
-
2012
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2003072768A2 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Istituto Nazionale Per Lo Studio E La Cura Dei Tumori Fondazione Giovanni Pascale | Modified human manganese superoxide dismutase and uses thereof |
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