ITFI20100171A1 - Preparazione di coniugati fra derivati dell'adenina e proteine allergeniche e loro uso in immunoterapia specifica per il trattamento delle malattie allergiche. - Google Patents

Description

PREPARAZIONE DI CONIUGATI FRA DERIVATI DELL’ADENINA E PROTEINE ALLERGENICHE E LORO USO IN IMMUNOTERAPIA SPECIFICA PER IL TRATTAMENTO DELLE MALATTIE ALLERGICHE CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione rientra nel campo della preparazione di vaccini per l’immunoterapia specifica.

STATO DELL’ARTE

Attualmente esistono sul mercato diversi prodotti per immunoterapia specifica (ITS) per il trattamento delle malattie allergiche. L’ITS, tuttavia, presenta numerose limitazioni riconducibili al profilo di efficacia e sicurezza. In primo luogo l’ITS à ̈ scarsamente utile a meno che non sia utilizzata in pazienti ultra-selezionati (per età, allergene responsabile della sensibilizzazione, entità della sensibilizzazione, etc). In secondo luogo, à ̈ possibile un’eccessiva liberazione di mediatori correlata alla stimolazione di cellule FCεRI+ da parte degli estratti allergenici somministrati, con la conseguenza, quindi, che l’ITS può essere gravata da eventi avversi anche gravi fino allo shock anafilattico. Ciò comporta anche che l’ITS non sia utilizzabile in quelle malattie allergiche più gravi (asma bronchiale, dermatite atopica, allergia alimentare) ove sarebbe ancor più auspicabile poter interferire con la risposta allergene-specifica.

La risposta immunitaria specifica nei confronti degli antigeni à ̈ mediata da due bracci effettori distinti funzionalmente. Mentre i linfociti T capaci di produrre Interferone (IFN-)-gamma (linfociti TH1) sono responsabili delle risposte protettive nei confronti di patogeni (batteri intracellulari, virus), le cellule T di tipo TH2, capaci di produrre IL-4, IL-5 ed IL-13, sono coinvolte nei meccanismi di difesa nei confronti dei parassiti. Una terza sottopopolazione linfocitaria, recentemente descritta come capace di produrre IL-17A (ed, eventualmente, IL-22 e/o IFN-gamma) (linfociti TH17) à ̈ responsabile della risposta nei confronti di alcuni patogeni extracellulari.

Le tre sottopopolazioni cellulari sono comunque anche responsabili di molti quadri patologici umani. In particolare, le malattie allergiche (rinite, asma, dermatite atopica, allergia alimentare, etc.) sono associate all’espansione di cellule TH2 specifiche per antigeni altrimenti innocui (gli allergeni) che si accumulano negli organi sede di flogosi (apparato respiratorio, apparato gastrointestinale, cute, etc.). Nonostante siano attualmente disponibili valide opzioni terapeutiche per il controllo delle malattie atopiche (steroidi, anti-istaminici, immunosoppressori), i farmaci hanno soltanto la capacità di inibire l’azione dei mediatori o, ancor più genericamente e aspecificamente, di regolare l’attivazione cellulare.

L’immunoterapia specifica (ITS), praticata da circa un secolo, si propone di modificare l’andamento della malattia allergica o di prevenire ulteriori sensibilizzazioni negli individui atopici ma nella pratica attuale risponde soltanto parzialmente a tali requisiti. La sua auspicabile modalità di azione dovrebbe, infatti, essere basata, da un lato, sulla riduzione della risposta TH2 ad attività patogenetica, insieme ad un redirezionamento della risposta cellulare allergenespecifica verso la produzione di IFN-gamma (cellule TH1), ovvero verso un fenotipo maggiormente protettivo. Tali attività possono essere rese possibili dall’uso di nuovi e più potenti adiuvanti vaccinali che inducono la produzione di citochine ad attività modulatoria quali IFN-alfa ed IL-12 attraverso l’interazione con particolari Toll-like receptors (TLRs). In effetti, alcune classi di composti a basso peso molecolare agiscono come immunomodulanti sia in vivo in modelli sperimentali animali, che su cellule umane coltivate in vitro.

In particolare, vi sono ben dimostrate evidenze che eterocicli sintetici chimicamente derivati dalla struttura dell’adenina sono in grado esercitare attività immunomodulanti sia in vivo che in vitro attraverso l’attivazione del TLR7 inducendo la produzione di citochine modulatorie (IFN-alfa, tra le altre) e regolatorie (IL-10), riducendo la produzione di citochine TH2, possedendo, al contempo, limitati effetti di stimolazione dei linfociti B e ridotta capacità di indurre la produzione di citochine dell’infiammazione. Infine, i derivati dell’adenina presentano notevole varietà strutturale correlata ad una diversa potenza dell’attività immunomodulante che si attua a concentrazioni comprese tra 1 e 10Î1⁄4M. Queste caratteristiche suggeriscono che questi composti potrebbero rappresentare degli adiuvanti efficaci e sicuri da utilizzare nei protocolli vaccinali per il trattamento delle malattie mediate da risposte TH2 o, comunque, anche in altri tipi di malattie in cui la risposta protettiva mediata da IFN-gamma à ̈ auspicabile.

Tuttavia, se à ̈ vero che gli adiuvanti ideali sono quelle molecole che aumentano la potenza vaccinale stimolando la risposta immunitaria specifica e possibilmente direzionandola verso il fenotipo funzionale desiderato, à ̈ anche altrettanto intuitivo che la semplice combinazione (ovvero, miscela) di una sostanza immunomodulante con proteine antigeniche (siano esse derivate da patogeni o con proprietà allergeniche) agirà su molti bersagli cellulari e, in particolare, su molte cellule presentanti l’antigene. Ciò comporta l’uso di maggiori quantità di adiuvante perché si ottenga un sensibile effetto stimolante con amplificazione degli effetti collaterali indesiderati e una riduzione della specificità della risposta immune.

Risulta pertanto non risolto allo stato dell’arte il problema di indirizzare contemporaneamente verso la stessa cellula presentante l’antigene sia l’adiuvante attivo che la proteina antigenica (od allergenica) in modo da consentire di a) impiegare minori quantità di adiuvante (con minori effetti tossici), b) agire esclusivamente sulla risposta specifica per l’antigene (riducendo la liberazione di mediatori della flogosi), c) modulare la quantità di adiuvante fino alla dose minima efficace per indirizzare la risposta immunitaria.

EP1035123 descrive l’acido 4-(6-amino-9-benzil-8-hydroxy-2-purinil)tiobutirrico ed il suo metil estere, questi due composti sono descritti insieme ad altri composti simili e sono rivendicati essere utili come agenti terapeutici per malattie immunologiche.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione risolve i problemi suddetti mediante composti coniugati stabili di formula (II), derivati dalla coniugazione tramite un legame covalente di un antigene proteico con adenine modificate, in cui detta formula (II) Ã ̈ NH2

N N O OH

P ( )nX N N

m

(II)

dove X=S; n à ̈ un numero intero compreso fra 0 e 18; P rappresenta un antigene proteico (sia altamente purificato, ricombinante o come estratto semipurificato) covalentemente legato alle adenine modificate, ad esempio ma non in modo esclusivo, per mezzo dei suoi residui di lisina, dove m à ̈ un numero intero che può variare da m = 1 fino a m = numero di lisine disponibili presenti sulla proteina P.

E’ stato trovato che i nuovi composti di formula (II) derivati dalla coniugazione di un antigene proteico con le adenine modificate sono capaci di modificare la risposta allergene-specifica indirizzandola verso un pattern con minore patogenicità e, al contempo, presentano una minore capacità di stimolare la liberazione di mediatori della flogosi allergica. Questa risposta à ̈ possibile in virtù della sinergia fra antigene e derivato dell’adenina che, coniugato tramite un legame covalente, à ̈ presente in quantità molto ridotte rispetto alla sua dose di efficacia da solo od in semplice miscela con l’antigene. Tale sorprendente sinergia à ̈ resa possibile dalla coniugazione tramite un legame covalente fra la proteina e l’adenina modificata. Tale risultato era inoltre inaspettato per la grande varietà di strutture di derivati dell’adenina che posseggono potenza immunomodulante diversa, perchà ̈ non tutte le strutture, specie quelle dotate di maggiore attività immunostimolante, sono adeguate alla formazione di legami covalenti con antigeni proteici e anche per la non banalità di riuscire a coniugare stabilmente tramite un legame covalente un’adenina modificata ad una proteina .

Pertanto oggetto della presente invenzione sono composti di formula (II), come sopra descritti, per l’uso come medicamenti (o come principi attivi in protocolli vaccinali) ed in particolare per l’uso in immunoterapia specifica, più specificamente per il trattamento delle malattie allergiche o, possibilmente, per la loro prevenzione.

Ulteriore oggetto della presente invenzione sono composizioni farmaceutiche comprendenti almeno un composto di formula (II) ed almeno un altro ingrediente farmaceuticamente accettabile. Per composizioni farmaceutiche s’intendono preferibilmente vaccini.

Ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ un processo per la preparazione di composti di formula (II), detto processo comprendente l’accoppiamento di una proteina P con un acido di formula (V),

NH2

O N N

OH

HO n<S>NN

Ph

(V)

od un corrispondente estere attivato, dove n à ̈ come sopra definito.

L’accoppiamento avviene vantaggiosamente con l’impiego di esteri attivati di derivati dell’adenina aventi struttura generale (I)

NH2

N

O N O OH N

O( )nX N<N>

O

Linker

(I)

in cui X = S ed n rappresenta il numero di unità metileniche CH2compreso da 0 a 18. La sottostruttura molecolare –CH2-(CH2)n-CO verrà definita linker.

I composti aventi struttura generale (I), come sopra descritti, sono altresì oggetto della presente invenzione. Essi si sono dimostrati essere capaci di reagire efficientemente ed in condizioni blande con proteine allergeniche per formare coniugati stabili aventi struttura generale (II).

Altresì à ̈ oggetto della presente invenzione un processo, a partire dal composto di formula (III), per preparare composti di formula (II) come sopra descritti.

NH2

N N OH H SNN

Ph

(III)

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

Nella struttura (II) l’antigene P può essere un qualsiasi antigene di natura sostanzialmente proteica fra cui ad esempio antigeni batterici, allergeni inalatori quali allergeni pollinici o derivati epidermici di animali, allergeni alimentari.

Per alcune forme di realizzazione l’antigene P à ̈ stato scelto fra i seguenti allergeni: estratto semipurificato dell’acaro della polvere Dermatophagoides pteronyssinus (DP), allergene purificato naturale Der p2 (allergene maggiore dell’acaro della polvere Dermatophagoides pteronyssinus) (nDer), allergene ricombinante Der p2 (rDer) oppure ovalbumina (OVA grade V). Nei composti di formula (II) preferibilmente n à ̈ compreso fra 2 e 10; più preferibilmente n=2, 3, 4.

I nuovi composti (II) derivati dalla coniugazione delle proteine allergeniche suddette con le adenine modificate sono risultati essere capaci di svolgere attività immunomodulatrice sia in un sistema in vitro che utilizza cellule umane di soggetti atopici sia in vivo in un modello murino di allergia.

I risultati ottenuti nei test biologici con i coniugati aventi struttura (II) in cui n=2 e P à ̈ una delle proteine suddette, ottenuti combinando proteine allergeniche (sia altamente purificate o ricombinanti o come estratti semipurificati) e l’estere attivo SA26-E (composto di formula (I) in cui n=2) sono di assoluta rilevanza e particolarmente significativi per le loro capacità immunomodulanti.

In particolare à ̈ stato infatti trovato che:

- i prodotti ottenuti dalla coniugazione dell’adenina modificata denominata SA-26E con l’estratto allergenico dell’acaro della polvere Dermatophagoides pteronyssinus (sia nella sua forma purificata naturale [nDer p2-conj] che nella forma semipurificata che contiene molte proteine allergeniche [DP-conj]) stimola la produzione di citochine modulatorie, regolatorie e pro-infiammatorie (IL-12p40, TNF-alfa, IL-6, IFN-alfa e IL-10) da parte di monociti purificati e di cellule dentritiche plasmacitoidi di sangue periferico di soggetti normali. L’effetto à ̈ analogo a quanto ottenuto con l’aggiunta di ligandi solubili di TLRs già noti (Lipopolisaccaride, CpG-ODN, R-848), mentre gli allergeni non coniugati (nDer p2 e DP) sono completamente inattivi. L’adenina SA-26E, aggiunta solubile alle stesse concentrazioni in cui à ̈ presente nel coniugato nDer p2-conj, à ̈ completamente inattiva.

- I prodotti di coniugazione nDer p2-conj e DP-conj inducono la traslocazione nucleare di NF-kB come dimostrato dall’aumento dell’ espressione nucleare di p50 in monociti purificati di sangue periferico di soggetti normali. Inoltre, nDer p2-conj e DP-conj attivano esclusivamente TLR7 in HEK293 transfettate con plasmidi che codificano per TLR umano o murino. Gli allergeni nDer p2 e DP non coniugati o l’adenina SA-26E solubile (alla concentrazione in cui à ̈ presente nel coniugato nDer p2-conj) sono completamente inattivi negli stessi sistemi sperimentali.

- I prodotti nDer p2-conj e DP-conj inducono l’espansione di cellule allergenespecifiche che producono una quantità significativamente ridotta di IL-4, IL-5 ed IL-13 con parallelo aumento dell’IFN-gamma (cellule TH0/TH1 anziché TH2). L’effetto à ̈ confermato anche a livello trascrizionale (riduzione di GATA-3 ed aumento di T-bet) e con esperimenti con cloni T. Infine, i prodotti di coniugazione sono anche capaci di modificare il potenziale funzionale di cellule memoria TH2 allergenespecifiche già stabilizzate (cellule CRTH2). Non à ̈ stata osservata alcuna espansione di cellule potenzialmente patogeniche a fenotipo TH17. L’adenina SA-26E solubile (alla concentrazione in cui à ̈ presente nel coniugato nDer p2-conj) à ̈ inattiva negli stessi sistemi sperimentali.

- I prodotti di coniugazione nDer p2-conj e DP-conj stimolano la proliferazione di blasti T specifici per gli allergeni non modificati, indicando che la coniugazione non altera l’integrità della molecola allergenica.

- I prodotti di coniugazione nDer p2-conj o DP-conj inducono una proliferazione di linfociti B altamente purificati (che esprimono alte quantità di TLR7) significativamente minore rispetto ad altri ligandi di TLR non coniugati (R-848, CpG-ODN) o alla stessa adenina modificata solubile non coniugata.

- I prodotti di coniugazione nDer p2-conj o DP-conj mostrano una capacità significativamente ridotta (rispetto alle molecole allergeniche non modificate) di attivare i granulociti basofili di sangue periferico di soggetti allergici indicando la minore capacità dei coniugati di indurre la liberazione di mediatori da parte di cellule FCεRI+. Inoltre, l’allergene coniugato DP-conj si lega in misura minore rispetto all’allergene non modificato alle IgE circolanti.

- topi BALB/C e C57BL/6 sensibilizzati con una proteina allergenica come OVA o nDer p2 coniugata con adenina modificata posseggono nel loro siero quantità significativamente inferiori di IgE totali e di IgE specifiche e significativamente maggiori di IgG2a rispetto agli animali sensibilizzati con le proteine OVA o nDer p2 native. Inoltre, gli animali sensibilizzati con OVA-conj (o nDer p2-conj) mostrano anche una broncoreattività delle vie aeree stimolata da metacolina significativamente minore rispetto agli animali di controllo.

- à ̈ possibile modulare l’attività dei prodotti coniugati in quanto variando la quantità di adenina legata alla molecola allergenica si ottiene una maggiore attività stimolatoria delle cellule dell’immunità innata e un più marcato effetto di redirezionamento delle cellule allergene-specifiche verso il fenotipo protettivo.

I suddetti risultati ottenuti con specifiche forme di realizzazione suggeriscono che, vista la generale applicabilità della procedura di coniugazione, risultati analoghi si possano attenere anche con altri antigeni proteici.

Secondo l’invenzione, i composti di formula (II) possono essere ottenuti facendo reagire un composto di formula (V), come sopra definito, in condizioni adeguate a promuovere la formazione di un legame ammidico fra la funzione carbossilica del linker ed uno o più residui di lisina dell’antigene P. A questo scopo si possono impiegare condizioni e catalizzatori noti per la formazione di legami ammidici, altresì si può trasformare il composto di formula (V) in un corrispondente estere attivato, fra tali esteri attivati i composti di formula (I) sono preferiti perché consentono un efficiente coniugazione in condizioni blande.

Preferibilmente la reazione di coniugazione fra un composto di formula (I) ed un antigene P, à ̈ condotta in soluzione tamponata ad un pH compreso fra 7 e 8; più preferibilmente ad un pH compreso fra 7.2 e 7.6. Preferibilmente la soluzione à ̈ tamponata con un tampone fosfato.

Preferibilmente viene impiegato un eccesso di estere attivo (I) rispetto alle moli di lisina calcolate essere presenti per la quantità di proteina usata; detto eccesso à ̈ preferibilmente pari a 1.5-8.0 eq.

Nel caso del coniugato in cui n=2, P=nDer p2 i risultati biologici migliori sono stati osservati per m=1, 2; gradi di sostituzione maggiori (ovvero valori di m maggiori di 2) hanno prodotto un eccessivo effetto citolitico sulle cellule.

Composti di formula (I) secondo l’invenzione in cui X=S possono essere ottenuti a partire dal derivato dell’adenina (III) noto dalla letteratura. Il derivato (III) può essere inizialmente (step a) funzionalizzato con un linker mediante trattamento con ROC(=O)-(CH2)n-Y dove Y à ̈ un gruppo uscente come Br, I, OTs o OMs, R à ̈ un C1-C4 alchile, n à ̈ compreso fra 0-18 (preferibilmente fra 2 e 10); per ottenere un composto di formula (IV)

NH2

O N N

OH

RO n<S>NN

Ph

(IV)

in cui n ed R sono come sopra definiti.

Preferibilmente Y Ã ̈ bromo e n=2, 3, 4.

Preferibilmente nello step a s’impiega circa 1 equiv. di ROC(=O)-(CH2)n-Y e preferibilmente la reazione à ̈ condotta in DMF anidra e in presenza di K2CO3come base.

L’estere (IV) così ottenuto viene idrolizzato, preferibilmente in ambiente alcalino con KOH in una miscela di metanolo-acqua in rapporto 3:1, portando alla formazione dell’acido (V).

L’estere attivo di formula (I) si prepara mediante trattamento dell’acido (V) con una carbodiimmide, preferibilmente dicicloesilcarbodiimmide (in leggero eccesso), seguita da N-idrossisuccinimmide secondo condizioni note.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

FIG. 1 mostra la produzione di p50 per attivazione dell’NF-kB da parte di cellule CD14+ purificate da parte di R-848 già noto come attivatore di TLR, le proteine allergeniche nDer p2 e estratto DP nativo ed il loro rispettivi coniugati nDer p2-conj (Conj-5) e DP-conj secondo quanto specificato nell’Esempio 4 (step a). Come controllo positivo à ̈ stato utilizzato l’estratto nucleare delle cellule della linea Jurkat secondo le indicazioni del produttore. I valori di p50 riscontrati (asse delle ordinate) sono espressi in Densità Ottiche. La figura mostra un caso rappresentativo.

FIG. 2 mostra l’aumento dell’attività luciferasica in cellule HEK293 cotransfettate mediante nucleofezione (Nucleofector®) con un plasmide che codifica per TLR7 umano (Fig.2A) o murino (Fig. 2B) insieme a un plasmide che codifica per luciferasi sotto il controllo del promotore ELAM-1. Le cellule transfettate sono state stimolate con un ligando noto di TLR7, R-848 (2 Î1⁄4g/ml), 6Î1⁄4M) utilizzato come controllo positivo, le proteine allergeniche native nDer p2 e estratto DP, od i loro rispettivi coniugati nDer p2-conj (Conj-5) o DP-conj in curva di dose (10-2-0.5 Î1⁄4g/ml) o solo terreno (controllo negativo) come specificato nell’Esempio 4 (step b). L’aumento dell’attività luciferasica (asse delle ordinate) à ̈ espressa come indice di incremento rispetto al controllo negativo. Sono mostrati due esperimenti rappresentativi.

Fig. 3 mostra l’espressione intracitoplasmatica di IL-4, ed IFN-gamma da parte di linee T-cellulari specifiche per l’estratto DP (colonne grigie) od il suo coniugato DP-conj (colonne nere) (entrambi a 10 Î1⁄4g/ml) dopo stimolazione policlonale con PMA e ionomicina come spiegato nell’Esempio 5 (step a). Le colonne rigate rappresentano i risultati di linee T-cellulari ottenute con l’uso dell’allergene DP miscelato con SA-26E solubile alla concentrazione 0.085 Î1⁄4g/10 Î1⁄4g allergene (quantità di SA-26E presente nel Conj-5). Nelle figure sono mostrate le percentuali (medie±ES) delle cellule CD3+CD4+ capaci di esprimere IL-4 da sola (cellule Th2), IFN-gamma da solo (cellule Th1) oppure entrambe le citochine (cellule Th0). Le significatività sono state valutate con t Student.

Fig. 4 mostra l’espressione intracitoplasmatica di IL-4, ed IFN-gamma da parte di linee T-cellulari specifiche per l’allergene purificato nDer p2 (colonne grigie) od il suo coniugato nDer p2-conj (Conj-5) (colonne nere) (entrambi a 10 Î1⁄4g/ml) dopo stimolazione policlonale con PMA e ionomicina come spiegato nell’Esempio 5 (step a). Nelle figure sono mostrate le percentuali (medie±ES) delle cellule CD3+CD4+ capaci di esprimere IL-4 da sola (cellule Th2), IFN-gamma da solo (cellule Th1) oppure entrambe le citochine (cellule Th0) (media di 14 donatori). Le significatività sono state valutate con t Student.

Fig. 5 mostra l’espressione di mRNA per citochine correlate con il fenotipo Th2 (IL-4, IL-5 ed IL-13) o Th1 (IFN-gamma) valutata mediante real time RT-PCR quantitativa di linfociti T di linee specifiche per l’estratto allergenico DP ed il suo coniugato DP-conj (pannello in alto) o l’allergene purificato nDer p2 ed il suo coniugato nDer p2-conj (Conj-5) (pannello in basso) secondo quanto specificato nell’Esempio 5 (step a). Sull’asse delle ordinate à ̈ espresso l’indice di aumento rispetto al gene della β-Actina utilizzato come riferimento. Nella Figura à ̈ mostrato un caso rappresentativo.

Fig. 6 mostra l’espressione di mRNA per fattori di trascrizione correlati con il fenotipo Th2 (GATA3), Th1 (T-bet), Th17 (ROR C) o al fenotipo regolatorio (Foxp3) mediante real time RT-PCR quantitativa in linfociti T di linee specifiche per l’estratto allergenico DP ed il suo coniugato DP-conj (pannello in alto) o l’allergene purificato nDer p2 ed il suo coniugato nDer p2-conj (Conj-5) (pannello in basso) secondo quanto specificato nell’Esempio 5 (step a). Sull’asse delle ordinate à ̈ espresso l’indice di aumento rispetto al gene della β-Actina utilizzato come riferimento. Nella Figura à ̈ mostrato un caso rappresentativo.

Fig. 7 mostra la produzione di IFN-gamma (asse delle ordinate) e di IL-4 (asse delle ascisse) (espresse in pg/ml) da parte di cloni specifici per l’allergene purificato nDer p2 (30 cloni) o per il suo coniugato nDer p2-conj (Conj-5) (37 cloni) dopo stimolazione policlonale con PMA ed anti-CD3 come specificato nell’Esempio 5 (step b). In rosso sono indicati le quantità di IFN-gamma e IL-4 prodotte dalle sole cellule feeder. Nel riquadro sono indicate le percentuali dei cloni capaci di produrre esclusivamente IFN-gamma (cellule Th1, in alto a sinistra), esclusivamente IL-4 (cellule Th2, in basso a destra), entrambe le citochine (cellule Th0, in alto a destra) o nessuna delle citochine (in basso a sinistra). I cloni rappresentati sono stati derivati dal donatore M.A.

Fig 8 mostra l’espressione delle citochine IL-4 (asse delle ordinate) ed IFN-gamma (asse delle ascisse) da parte di blasti T di linee specifiche per l’allergene purificato nDer p2 o il suo corrispettivo coniugato nDer p2-conj (Conj-5) ottenute da cellule CRTH2 dopo stimolazione con PMA ed ionomicina valutata mediante citofluorimetria secondo quanto specificato nell †̃esempio 5 (step c). Nel riquadro sono indicate le percentuali di cellule capaci di produrre esclusivamente IL-4 (cellule Th2, in alto a sinistra), esclusivamente IFN-gamma (cellule Th1, in basso a destra), entrambe le citochine (cellule Th0, in alto a destra). E’ mostrato un esperimento rappresentativo (donatore #3).

Fig 9 mostra la proliferazione di blasti T di linee specifiche per l’estratto allergenico DP di tre diversi donatori nei confronti di DP nativo o del suo rispettivo coniugato DP-conj in presenza di cellule mononucleate autologhe irradiate utilizzate come APC come specificato nell’Esempio 5 (step f). La proliferazione à ̈ valutata come indice di stimolazione rispetto al controllo negativo (blasti T coltivati in presenza delle sole cellule presentanti autologhe in assenza di allergene).

Fig 10 mostra la produzione di IgE specifiche per OVA in animali C57BL/6 (5 topi per gruppo) sensibilizzati con OVA (quadrato rosso), il suo rispettivo coniugato OVA-conj (triangoli rossi) o PBS (gruppo di controllo) (losanga blu) prima (pannello sinistro) e dopo (pannello destro) challenge intratracheale di OVA come specificato nell’ Esempio 7 (step b). I valori di IgE sono valutati in ELISA e sono espressi in Densità Ottiche (asse delle ordinate) a varie diluizioni di siero (asse delle ascisse, diluizione da 1:10 a 1:640).

Fig 11 mostra reattività bronchiale di topi C57BL/6 (5 topi per gruppo) sensibilizzati con OVA (linea blu) od il suo rispettivo coniugato OVA-conj (linea rossa) dopo inalazione di dosi progressivamente crescenti di metacolina (6.25-12.5-25 e 50 mg/ml) rispetto al valore base valutato mediante inalazione di PBS secondo quanto specificato nell’Esempio 7 (step a).

Fig. 12 mostra l’analisi di spettroscopia di massa mediante MALDI-TOF dei coniugati 2-5 e 6 tra nDer p2 e estere attivo SA-26E.

PARTE SPERIMENTALE

La presente invenzione potrà essere meglio compresa alla luce dei seguenti esempi realizzativi.

La sintesi degli esteri attivi di formula (II) à ̈ stata realizzata a partire da adenine modificate note in letteratura. Come esempio di preparazione di un estere attivo di formula (I) à ̈ riportata la procedura per l’estere attivo (SA26-E) in cui X = S ed n = 2. Tutti gli altri esteri attivi di formula generale (I) possono essere preparati con analoga metodologia.

Esempio 1 - Preparazione dell’estere attivo SA26-E

NH NH22

N N(a)N N

OH (b) OH

O

N N S N N HS

O

(III)(IVa)

NH2

NH2

N N N N O OH OH (c) O

N S N N HO S N N O O

O

<(Va)>(SA26-E)

Il derivato dell’adenina (III) noto dalla letteratura à ̈ stata inizialmente funzionalizzato con il linker mediante trattamento con etil 4-bromobutanoato (1 equiv.) in DMF anidra e in presenza di K2CO3come base. Il prodotto IVa viene così ottenuto con una resa del 54% dopo cromatografia. L’estere etilico (IVa) così ottenuto viene idrolizzato in ambiente alcalino con KOH in una miscela di metanolo-acqua in rapporto 3:1. Dopo 48 h, il metanolo viene evaporato e la soluzione residua portata a pH 3 con NaHSO410% portando alla precipitazione dell’acido (Va) (resa 70%). L’estere attivo SA26-E si prepara sciogliendo l’acido (Va) in DMF anidra a aggiungendo dicicloesilcarbodiimmide in leggero eccesso seguita da N-idrossisuccinimmide secondo condizioni standard. Dopo cromatografia del grezzo l’estere attivo si ottiene con una resa del 79%.

Step (a) - Procedura per la preparazione di Acido 4-(6-amino-9-benzil-8-idrossi-9H-purin-2-ilsulfanil)butirrico etil estere (IVa).

In un pallone a due colli da 100 mL viene sciolto il composto (III) (1.4 g, 5.12 mmoli) in 40 mL di DMF anidra sotto atmosfera di azoto. Si aggiungono setacci molecolari (4 Ã…) al fine di allontanare eventuale acqua presente nel composto (III) e si lascia sotto agitazione a 25 °C per 35 minuti. Si aggiunge quindi K2CO3(0.708 g, 5.12 mmoli) e la soluzione à ̈ lasciata sotto agitazione per un’ora. Si aggiunge quindi etil 4-bromo butanoato (0.703 mL, 5.12 mmoli) e si lascia a temperatura ambiente sotto agitazione per 20 ore. Il solvente à ̈ rimosso mediante distillazione a pressione ridotta con bagno a 36 °C e il residuo viene ripreso con H2O sterile (5 mL). Si forma un precipitato giallo e la sospensione si porta a pH 7 con KHSO410% in acqua sterile. Il precipitato che si ottiene viene filtrato su BÃ1⁄4chner e si ottiene un solido color giallo senape (1.6 g) che viene purificato per cromatografia su gel di silice (eluente diclorometano/metanolo 40:1, Rf= 0.16). Si ottengono 1.073 g (2.77 mmoli) di prodotto (IVa) come polvere di color giallo pallido (resa: 54%).

<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 25 °C) Î ́: 1.17 (t, J =7.0 Hz, 3 H), 1.84-1.91 (m, 2 H), 2.38 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 3.07 (t, J = 7.3 Hz, 2 H), 4.04 (q, J = 7.0 Hz, 2 H), 4.89 (s, 2 H), 6.63 (br s, 2 H), 7.24-7.32 (m, 5 H), 10.3 ( br s, 1 H).

<13>C NMR (100.4 MHz, DMSO, 25°C) Î ́: 15.0 (q), 25.8 (t), 30.3 (t), 32.5 (t), 43.4 (t), 60.7 (t), 101.3 (s), 128.3 (d), 128.5 (d, 2 C), 129.4 (d, 2 C), 138.1 (s), 147.9 (s), 148.9 (s), 152.7 (s), 162.0 (s), 173.3 (s).

MS (ESI-MS) m/z (%): C18H21N5O3S, 388 (M<+>+ 1, 24), 342 (100).

P. fus. =123-127 °C.

Step (b) - Procedura per la preparazione di Acido 4-(6-amino-9-benzil-8-idrossi-9H-purin-2-ilsulfanil)butirrico (Va)

In un pallone ad un collo da 50 mL viene parzialmente sciolto il composto (IVa) (0.421 g, 1.09 mmoli) in 23 mL di metanolo/acqua sterile 3:1. Si aggiunge KOH (0.184 g, 3.77 mmoli); dopo tale aggiunta il prodotto di partenza che non si era sciolto passa completamente in soluzione. La reazione viene lasciata sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente (25 °C) per 48 ore. La soluzione si presenta limpida e di color giallo scuro. Dopo aver allontanato il MeOH in vacuo, la soluzione acquosa rimanente viene portata a pH 3 con una soluzione di NaHSO410% in acqua sterile ottenendo un precipitato di colore giallo chiaro. Questo viene filtrato su BÃ1⁄4chner e lavato con una soluzione acquosa leggermente acida, poi con acqua ed infine con diclorometano. Il prodotto viene seccato in essiccatore sotto vuoto e si ottengono 274 mg (0.76 mmoli) di prodotto Va pari ad una resa del 70%.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO, 25 °C) Î ́: 1.85-1.92 (m, 2 H), 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 3.08 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 4.92 (s, 2 H), 6.54 (br s, 2 H), 7.28-7.36 (m, 5 H), 10.1 ( br s, 1 H), 12.1 (br s, 1 H).

<13>C NMR (100.4 MHz, DMSO, 25°C) Î ́: 25.7 (t), 30.4 (t), 33.6 (t), 43.5 (t), 101.3 (s), 128.4 (d), 128.6 (d, 2 C), 129.4 (d, 2 C), 138.0 (s), 147.8 (s), 148.9 (s), 152.7 (s), 162.1 (s), 174.9 (s).

MS (ESI-MS) m/z (%): C16H17N5O3S 360 (M<+>+ 1, 6), 342 (100), 274 (17).

P. fus. =.230 °C (dec)

Step (c) - Procedura per la preparazione di Acido 4-(6-amino-9-benzil-8-idrossi-9H-purin-2-ilsulfanil)butirrico 2,5-diossopirrolidin-1-il estere (SA26-E) In un pallone a due colli da 50 mL viene sciolto sotto atmosfera d’azoto l’acido (Va) (0.249 g, 0.69 mmoli) in 5.5 mL di DMF anidra in presenza di setacci molecolari da 4 Ã…. Si aggiunge quindi la DCC (dicicloesilcarbodiimmide) (157 mg, 0.76 mmoli) e quindi la N-idrossisuccinimmide (80 mg, 0.69 mmoli). La soluzione risultate viene lasciata sotto agitazione a temperatura ambiente per 23 ore. Trascorso tale periodo di tempo la soluzione si presenta torbida. Si filtra la soluzione e il solvente viene rimosso per distillazione sotto vuoto con bagno a 33 °C. Il residuo (490 mg) viene purificato mediante cromatografica su gel di silice (miscela eluente diclorometano/metanolo 40:1, Rf = 0.11). Si ottengono 247 mg (0.54 mmoli) di SA26-E come polvere di color giallo acceso (resa 78%).

<1>H (DMSO, 25°C) Î ́: 1.94-2.01 (m, 2 H), 2.77 (t, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.80 (s, 4 H), 3.10 (t, J = 6.6 Hz, 2 H), 4.88 (s, 2 H), 6.53 (s, 2 H), 7.24-7.34 (m, 5 H), 10.1 (s, 1 H).

<13>C NMR (100.4 MHz, DMSO, 25°C) Î ́: 24.4 (t), 25.4 (t, 2 C), 29.3 (t), 33.3 (t), 42.5 (t), 100.4 (s), 127.4 (d), 127.6 (d, 2 C), 128.5 (d, 2 C), 137.0 (s), 146.9 (s), 148.0 (s), 151.8 (s), 160.8 (s), 170.2 (s). MS (ESI-MS) m/z (%): C20H20N6O5S, 457 (M<+>+ 1, 6), 342 (100).

P. fus. = 161 °C (dec)

Esempio 2 - Procedura generale per la preparazione di un coniugato di formula (II) fra l’estere attivo SA-26 E e la proteina Der p2.

In un portacampione di vetro viene solubilizzato l’allergene nDer p2 (750 Î1⁄4g) in 0.5 mL di tampone fosfato 0.1 M a pH 7.4 L’estere attivo (vedi tabella), disciolto in DMSO (130 Î1⁄4L), viene diluito con 1 mL di tampone fosfato e trasferito nel portacampione in cui si trova l’allergene arrivando così ad un volume complessivo di 1.5 mL. La soluzione à ̈ lasciata sotto agitazione meccanica a 4 °C per 18 ore dopodichà ̈ viene sottoposta a dialisi.

La coniugazione con la proteina nDer p2 viene realizzata impiegando un eccesso di estere attivo rispetto alle moli di lisine calcolate per la quantità di proteina usata, come risulta dalla tabella. L’effettiva coniugazione à ̈ stata dimostrata mediante analisi MALDI-TOF del coniugato con la quale viene evidenziata la presenza della proteina non coniugata (14,098 KDa) e la formazione di coniugati a massa molecolare 14,439 e 14,781. Questi sono in percentuali variabili dipendendo dall’eccesso di estere attivo usato e corrispondono, rispettivamente, alla proteina legata ad uno e due frammenti di adenina modificata a peso molecolare 341 (vedi figura 12).

Estere attivo rapporto molare tra % coniugato % coniugato (Î1⁄4g) estere attivo e P 1 molecola P 2 molecole lisine

Conj 1 1100 7.5 nd nd Conj 2 1100 7.5 50 20 Conj 3 1100 7.5

Conj 4 1100 7.5

Conj 5 250 1.7 23 4 Conj 6 250 1.7

Conj 7 250 1.7

Conj 8 250 1.7

Come esempio di coniugazione con una proteina allergenica à ̈ stata descritta la procedura di accoppiamento con Der p2 naturale purificato e detossificato (nDer). La coniugazione con altre proteine allergeniche come Ovalbumina (OVA), DP o rDer viene realizzato seguendo la stessa procedura ma variando la quantità di estere attivo in funzione del numero di lisine presenti nelle proteine potenzialmente funzionalizzabili. Nel caso di nDer p2 (PM 14 kDa) sono sei le lisine presenti e viene impiegata una quantità di estere attivo tale da avere un rapporto pari a 1.7 o 7.5 tra le moli di estere attivo e quelle di lisina presenti sulla proteina (nelle tabelle successive nDer p2-conj si riferisce al coniugato ottenuto impiegando un rapporto tra le moli di estere attivo e quelle di lisina pari a 1.7, Conj 5). Un rapporto pari a 1.7 à ̈ stato impiegato anche nella coniugazione con le altre proteine allergeniche OVA, DP e rDer per ottenere i coniugati DP-conj, OVA-conj e rDer-conj. Quando il rapporto tra le moli di estere attivo e quelle di lisina à ̈ pari ad 1.7 e la proteina allergenica usata à ̈ nDer p2 (come nel Conj-5, Conj-6, Conj-7 e Conj-8), à ̈ stato calcolato che, in 10 Î1⁄4g di coniugato, la quantità di estere attivo effettivamente presente à ̈ pari a 0.085 Î1⁄4g. SA-26E solubile alla concentrazione di 0.085 Î1⁄4g/ml, da solo o miscelato con 10 Î1⁄4g/ml di nDer p2, à ̈ stato quindi usato come controllo in alcuni modelli sperimentali.

Esempio 3 - Valutazione della produzione di citochine e chemochine dell’immunità innata

Step (a) - Procedura per la stimolazione di cellule dell’immunità innata e per il dosaggio di citochine e chemochine da loro prodotte

Le cellule mononucleate (CMN) circolanti vengono isolate mediante gradiente di densità (Ficoll-Hypaque) usando buffy coats di 14 donatori normali (Servizio Immunotrasfusionale e terapie cellulari, Azienda Ospedaliera Universitaria Pediatrica A. Meyer, Firenze). Vengono separate 200 x 10<6>CMN utilizzando il kit del commercio (CD14 isolation kit, Miltenyi) aggiungendo 400 Î1⁄4l di anticorpo monoclonale anti-CD14 legato a microbiglie ferrose e passando su colonna (LS column) in campo magnetico. Vengono recuperati per selezione positiva 50 x 10<6>monociti che sono lavati estensivamente con una soluzione sterile di PBS senza calcio e magnesio e posti in coltura alla concentrazione di 1 x 10<6>/ml/pozzetto in terreno di coltura completo addizionato di siero bovino fetale al 10% in piastre a 24 pozzi a fondo piatto. Sono utilizzati come stimolanti i seguenti prodotti: allergeni non coniugati (DP o nDer) (10 Î1⁄4g/ml), loro rispettivi coniugati (DP-conj o nDer p2-conj) (0.6, 2.5 e10 Î1⁄4g/ml), R-848 (2 Î1⁄4g/ml, 6Î1⁄4M), SA-26 SA-26A o SA-26E (0.6, 2.5 e 10 Î1⁄4g/ml), LPS (100 ng/ml) e CpG-ODN 2006 (10 Î1⁄4g/ml, 1.3 Î1⁄4M). Le piastre sono incubate per 36 ore a 37° C in atmosfera umidificata al 5% di CO2e il supernatante raccolto dopo centrifugazione a 1200 rpm, aliquotato e infine conservato a -20° fino al dosaggio delle citochine.

La preparazione delle cellule BDCA4+ à ̈ stata ottenuta ugualmente da CMN di buffy coats di 14 soggetti normali. Dopo la separazione su gradiente di densità sono state ottenute 500 x 10<6>CMN che sono state separate utilizzando il kit del commercio (BDCA4 isolation kit, Miltenyi) aggiungendo 500 Î1⁄4l di anticorpo monoclonale anti-BDCA4 legato a microbiglie ferrose e passando su colonna (LS column) in campo magnetico. Vengono recuperate per selezione positiva 5 x 10<6>cellule dentritiche plasmacitoidi (PDCs) che sono lavate estensivamente con una soluzione sterile di PBS senza calcio e magnesio e poste in coltura alla concentrazione di 1x10<6>/ml/pozzetto in terreno di coltura completo addizionato di siero bovino fetale al 10% in piastre a 24 pozzi a fondo piatto. Sono utilizzati come stimolanti i seguenti prodotti: allergeni non coniugati (DP o nDer) (10 Î1⁄4g/ml), loro rispettivi coniugati (DP-conj o nDer p2-conj) (0.6, 2.5 e10 Î1⁄4g/ml), R-848 (2 Î1⁄4g/ml), SA-26, SA-26A o SA-26E (0.6, 2.5 e 10 Î1⁄4g/ml). Le piastre sono incubate per 36 ore a 37° C in atmosfera umidificata al 5% di CO2e il supernatante raccolto dopo centrifugazione a 1200 rpm, aliquotato e infine conservato a -20° fino al dosaggio delle citochine.

1x10<5>cellule sono destinate al controllo della purezza delle popolazioni ottenute e vengono incubate in ghiaccio che fonde con 20 Î1⁄4l di anticorpo monoclonale anti-CD14 od anti-BDCA4 coniugato a fluorocromo al buio. Una volta lavate con soluzione PBS e centrifugate, sono allungate con 500 Î1⁄4l di PBS e analizzate al citofluorimetro. Si ottiene una purezza superiore al 98%.

Per il dosaggio delle citochine e chemochine dell’immunità innata, à ̈ utilizzata una metodica ELISA del commercio: IL-12p40 (Cytoscreen, Biosource Int, Camarillo, CA), IFN-α (Cytoscreen), TNF-α (Cytoscreen), IL-10 (Pharmingen), IL-6 e CXCL10 (R&D System) sono disponibili commercialmente. 100 Î1⁄4l per pozzetto di ciascun supernatante à ̈ incubato nelle piastre secondo le modalità descritte da ciascun produttore ed al termine del dosaggio sono ottenute quantità espresse in pg/ml delle singole citochine sulla base di curve di riferimento costituite dalle singole citochine ricombinanti.

L’aggiunta di LPS su cellule CD14+ [Esempio 3 (step a)] stimola, come atteso, la produzione di rilevanti quantità di citochine modulatorie (IL-12) ed infiammatorie (TNF-α e IL-6) a livelli sostanzialmente analoghi a quelli ottenuti con l’aggiunta di SA-26. Viceversa, l’adenina SA-26A non à ̈ capace di attivare la produzione di citochine a nessuna dose mentre l’adenina modificata SA-26E solubile ha un effetto intermedio. L’aggiunta di SA-26E solubile alla concentrazione di 0.085 Î1⁄4g/ml (ovvero, come già detto, corrispondente alla quantità di estere attivo presente nei Conj-5, -6, -7 e -8) non stimola la produzione di alcuna citochina. Gli allergeni non coniugati (estratto DP e nDer p2) sono sostanzialmente incapaci di indurre la produzione di quantità apprezzabili delle stesse citochine da parte di cellule CD14+. Tuttavia, dopo la coniugazione delle molecole allergeniche con SA-26E (DP-conj o nDer p2-conj), le due molecole sono entrambe altamente attive nell’indurre la produzione di significative quantità di citochine sia modulatorie che regolatorie a livelli simili a quelli ottenuti con altri composti stimolatori, anche quando usate in piccole concentrazioni. Non si osserva la produzione di altre citochine come IL-27 o della molecola regolatoria IDO (dati non mostrati).

Analogamente, le cellule BDCA-4+ degli stessi donatori sono capaci di produrre elevate quantità di IFN-α, IL-10 e CXCL10 in risposta a R-848. L’adenina SA-26A à ̈ incapace di stimolare la produzione di queste citochine mentre SA-26E ha un effetto intermedio sulle cellule dendritiche plasmacitoidi, in dipendenza della dose utilizzata. Comunque, alla dose di 0.085 Î1⁄4g/ml, SA-26E à ̈ inattivo. Come atteso, gli allergeni non coniugati non stimolano la produzione di citochine, mentre gli allergeni coniugati (DP-conj e nDer p2-conj) stimolano la produzione di elevate quantità sia di IFN-α che di IL-10. Ne’ la produzione di IL-29 ne’ di CXCL10 sono significativamente modificate dall’aggiunta di nessuno degli stimoli utilizzati ad eccezione di R-848 (dati non mostrati).

Nella tabelle successive sono riportati i risultati (medie ± errori standard) dei dosaggi delle citochine prodotte da cellule CD14+ (Tabelle A e B) e BDCA4+ (Tabelle C e D) con le relative significatività.

Tabella A produzione di citochine da parte di cellule CD14+ purificate Donatore # 1

Condizione<Dose>Produzione delle citochine (pg/mL)(mcg/ml)

IL-12p40 TNF-alfa IL-6 IL-10 Medium 0 0 0 0

LPS 2725 5331 12905 8140 SA-26 10 3120 1635 1508 296

2.5 1949 817 1713 280

0.6 446 367 67 290

SA-26A 10 0 0 0 0

2.5 0 0 0 0

0.6 0 0 0 0

SA-26E 10 2500 2123 2930 609

2.5 863 597 11 618 0.6 569 345 0 124

0.085 0 0 0 0

Donatore # 2

Condizione<Dose>Produzione delle citochine (pg/mL)(mcg/ml)

IL-12p40 TNF-alfa IL-6 IL-10 Medium 0 0 0 0

LPS 6311 4619 3125 1155 SA-26 10 7678 2450 1713 258

2.5 5451 2353 1457 243 0.6 1187 597 248 209 SA-26A 10 0 0 0 0

2.5 0 0 0 0

0.6 0 0 0 0

SA-26E 10 4800 3730 163 584

2.5 2464 1267 4 243

0.6 785 466 0 0

0.085 0 0 0 0

Tabella B produzione di citochine da parte di cellule CD14+ purificate

Stimolo Dose Citochine prodotte (ng/ml) (medie ± ES)

(Î1⁄4g/ml)

IL-12p40 TNF-alfa IL-6 IL-10 Medium 0±0 0±0 0±0 0±0 LPS 1 3.8±1.7** 7.6±2.7** 17.5±4.9*** 7.9±1.9* R-848 2 16.9±6.3*** 16.3±4.9*** 45.8±15.2* 2.0±0.5***

* **

DP 10 0.05±0.07 0.06±0.05 0.1±0.2 0±0 DP-conj 10 6.4±1.3**** 5.5±1.1**** 24.4±8.8*** 1.0±0.2***

2.5 2.9±1.2** 1.8±0.6** 9.7±5.0* 0.4±0.1* 0.6 0.7±.01*** 0.5±0.2** 0.3±0.4 0.1±0.08 nDer p2 10 0±0 0.05±0.06 0±0 0.4±0.4 nDer p2-conj 10 0.8±0.15*** 0.9±0.2*** 2.1±1.4* 0.1±0.1 *

2.5 0.7±0.2* 0.5±0.2* 0.06±0.05 0.25±0 0.6 0.14±0.08 0.05±0.06 0±0 0±0

Valore di p : * <0.05, ** <0.005, *** <0.0005, **** <0.00005

Tabella C produzione di citochine da parte di cellule BDCA4+ Donatore # 1

Condizione<Dose>Produzione delle citochine (pg/mL)(mcg/ml)

IFN-alfa TNF-alfa IL-6 IL-10 Medium 254 0 0 0

R-848 3154 10368 746 1500 SA-26A 10 0 268 0 0

2.5 0 0 0 0

0.6 0 2 0 0

SA-26E 10 486 858 675 896

2.5 179 252 0 0

0.6 179 183 0 0

0.085 0 0 0

Donatore # 2

Condizione<Dose>Produzione delle citochine (pg/mL)(mcg/ml)

IFN-alfa TNF-alfa IL-6 IL-10 Medium 0 0 0 0

R-848 6187 20990 308 753 SA-26A 10 168 531 0 0

2.5 161 1 0 0

0.6 0 2 0 0

SA-26E 10 3589 3405 1439 750

2.5 2014 1157 760 209

0.6 669 520 0 0

0.085 0 0 0 0

Tabella D produzione di citochine da parte di cellule BDCA4+

Stimolo Dose Citochine prodotte (ng/ml) (medie ± ES)

(Î1⁄4g/ml)

IFN-alfa TNF-alfa IL-6 IL-10 Medium 0.1±0.1 0±0 0±0 0±0 R-848 2 5.6±2.5** 5.4±1.4**** 7.7±2.6*** 1.0±0.6* DP 10 0.1±0.1 0.01±0.01 0±0 0±0 DP-conj 10 6.5±2.2*** 3.9±1.3*** 9.8±4.8** 1.4±0.7*

2.5 11.8±1.6*** 1.6±0.5*** 5.1±2.6* 0.5±0.15**

*

0.6 9.0±1.6*** 0.6±0.1** 1.3±05 0.1±0.1 nDer p2 10 0.07±0.06 0.03±0.02 0±0 0±0 nDer p2-conj 10 2.2±1.9* 1.5±0.3*** 2.0±.7* 0.5±0.12** 2.5 1.05±0.25* 1.0±0.1*** 1.0±0.5 0.2±0.08 0.6 0.8±0.07*** 0.23±0.02** 0.1±0.1 0.04±0.04

Valore di p : * <0.05, ** <0.005, *** <0.0005, **** <0.00005

Per verificare che il processo di coniugazione della proteina allergenica con l’estere attivo SA-26E svolge attività modulatoria superiore rispetto alla semplice miscela della proteina stessa e di SA-26E solubile, cellule CD14+ e BDCA4+ altamente purificate di due donatori normali sono poste in coltura per 36 ore con la proteina allergenica nativa nDer p2 (10 Î1⁄4g/ml), il prodotto coniugato nDer p2-conj (Conj-5), LPS o R-848 (100 ng/ml e 2 Î1⁄4g/ml, rispettivamente) o con la miscela nDer p2 e SA-26E solubile (10 Î1⁄4g/ml e 0.085 Î1⁄4g/ml, rispettivamente) per stimolare la produzione di citochine modulatorie, regolatorie e pro-infiammatorie. Sia l’allergene non coniugato, come atteso, ma anche la miscela di allergene ed estere attivo solubile sono incapaci di stimolare la produzione di quantità significative di citochine da parte di monociti o di cellule dendritiche plasmacitoidi. Soltanto quando l’allergene à ̈ coniugato all’adenina modificata si ottengono quantità significative di citochine a livelli analoghi a quelli ottenuti con sostanze ad attività immunomodulante nota come LPS e R-848.

Le tabelle successive (E ed F) mostrano i risultati ottenuti in due donatori.

Tabella E. Produzione di citochine da parte delle cellule CD14+

Donatore #1

Stimolo Dose Produzione delle citochine (pg/ml)

(Î1⁄4g/ml)

IL-12p40 TNF-alfa IL-6 IL-10 Medium 0 0 0 0 LPS 0.1 5627 3136 27235 530 nDer p2 10 0 218 0 0 nDer p2-conj 10 2167 892 10784 706 (Conj-5)

nDer p2 10 371 15 22 0 SA-26E solubile 0.085

Donatore #2

Stimolo Dose Produzione delle citochine (pg/ml)

(Î1⁄4g/ml)

IL-12p40 TNF-alfa IL-6 IL-10 Medium 0 4 0 0 LPS 0.1 10522 14061 39499 3000 nDer p2 10 0 0 0 0 nDer p2-conj 10 9086 3421 17715 2144 (Conj-5)

nDer p2 10 466 299 10 0 SA-26E solubile 0.085

Tabella F. Produzione di citochine da parte delle cellule BDCA4+

Donatore #1

Stimolo Dose Produzione delle citochine (pg/ml) (Î1⁄4g/ml)

IFN-alfa TNF-alfa IL-6 IL-10 Medium 0 0 0 0

R-848 2 1131 4832 44302 1864

nDer p2 10 0 0 0 0

nDer p2-conj (Conj- 10 2233 2008 12152 6375 5)

nDer p2 10 0 0 0 0 SA-26E solubile 0.085

Donatore #2

Stimolo Dose Produzione delle citochine (pg/ml)

(Î1⁄4g/ml)

IFN-alfa TNF-alfa IL-6 IL-10

Medium 29 0 0 0

R-848 2 1605 6898 37603 1305

nDer p2 10 0 0 0 0

nDer p2-conj 10 1443 4550 17667 2429 (Conj-5)

nDer p2 10 326 0 0 0 SA-26E solubile 0.085

Esempio 4 - Valutazione del legame dei coniugati a recettori e stimolazione di secondi messaggeri

Step (a) procedura per la valutazione dell’attivazione di NF-kB

Le cellule CD14+ sono coltivate alla concentrazione di 5 x 10<6>in provette di polipropilene da 15 ml con fondo conico in terreno di coltura completo addizionato di siero bovino fetale al 10% in presenza dei seguenti prodotti come stimolanti: allergeni non coniugati (DP o nDer) (10 Î1⁄4g/ml), loro rispettivi coniugati (DP-conj o nDer p2-conj) (10 Î1⁄4g/ml), R-848 (2 Î1⁄4g/ml) o nDer p2 miscelato con SA-26E solubile (10 Î1⁄4g/ml e 0.085 Î1⁄4g/ml, rispettivamente). Le provette sono incubate per 2 ore a 37° C in atmosfera umidificata al 5% di CO2poi allungate con 10 ml di PBS e centrifugate a 1500 rpm ripetendo il trattamento per tre volte. Il deposito cellulare à ̈ portato a secco con micropipette e congelato a -80° fino all’uso. L’estratto nucleare della coltura cellulare à ̈ preparato aggiungendo alle singole provette una miscela di reattivi secondo le istruzioni del kit di estrazione nucleare (Active Motif) e il contenuto in proteine delle singole preparazioni à ̈ valutato con il metodo di Bradford. Due diverse quantità di proteine (0.5 e 2 Î1⁄4g) sono state incubate in piastre da 96 pozzetti nei quali à ̈ già immobilizzato un oligonucleotide che contiene il sito di consenso per l’ NF-κB attivato (5’-GGGACTTTCC-3’), ai quali à ̈ aggiunto un anticorpo che riconosce un epitopo della subunità p50 dell’ NF-κB. Ai singoli pozzetti à ̈ aggiunto un anticorpo secondario coniugato ad HRP e lo sviluppo del colore à ̈ monitorato con uno spettrofotometro. I valori sono riportati come Densità Ottiche.

Come controllo positivo à ̈ utilizzato l’estratto nucleare del commercio delle cellule Jurkat mentre la specificità del sistema à ̈ garantita dall’aggiunta di un oligonucleotide competitore del legame con NF-κB.

Step (b) procedura per il monitoraggio dell’attivazione del TLR7

Le cellule HEK293 sono staccate con trattamento con tripsina dalla superficie di plastica della bottiglia di coltura, lavate estensivamente con PBS senza calcio e magnesio, contate ed aggiustate alla concentrazione di 1 x 10<6>per ogni provetta di polipropilene con fondo a V. Dopo l’ultimo lavaggio, le cellule sono portate a secco e à ̈ aggiunto 100 Î1⁄4l di tampone di transfezione (Amaxa) e 5 Î1⁄4g di plasmide che codifica per TLR3, TLR7, TLR8 o TLR9 insieme a 5 Î1⁄4g di plasmide che codifica per luciferasi sotto il controllo del promotore ELAM-1. La miscela così ottenuta à ̈ trasferita in provette apposite e la transfezione à ̈ ottenuta con un particolare apparecchio elettroporatore che introduce direttamente nel nucleo il materiale genetico (Nucleofection®, Amaxa GmbH). Le cellule sono recuperate e poste in coltura alla concentrazione di 1x10<5>/ml in piastre a 48 pozzetti a fondo piatto in E-MEM contenente siero bovino fetale al 5% per 18 ore. Dopo à ̈ aggiunto medium (controllo negativo) o i seguenti stimolanti: DP, nDer p2 o I loro rispettivi coniugati DP-conj o nDer p2-conj (10 Î1⁄4g/ml), nDer p2 miscelato con SA-26E solubile (10 Î1⁄4g/ml e 0.085 Î1⁄4g/ml, rispettivamente) o ligandi noti di TLR quali Poly I;C (50 Î1⁄4g /ml), R-848 (2 Î1⁄4g /ml) or ODN 2006 (1.3 Î1⁄4mol). L’incubazione si conclude dopo ulteriori 18 ore e l’attività luciferasica à ̈ misurata nei lisati cellulari utilizzando un test del commercio (Promega).

Gli allergeni coniugati DP-conj e nDer p2-conj ma non gli allergeni non coniugati DP e nDer p2, che sono sostanzialmente inattivi, provocano un significativo aumento dell’espressione nucleare di p50 in cellule CD14+ purificate ottenute secondo quanto specificato [Esempio 4 (step a)] con effetti analoghi a quanto si ottiene con R-848, la cui aggiunta consente, come atteso, una rapida ed elevata attivazione di p50 che raggiunge livelli più elevati dello stesso controllo positivo (cellule Jurkat). L’effetto svolto dai prodotti coniugati indica che i prodotti coniugati attivano la via segnalatoria degli NF-κB.

Nella figura 1 Ã ̈ riportato un caso esemplificativo.

Sulle cellule HEK transfettate secondo la metodica indicata [Esempio 4 (step b)], abbiamo trovato che, come atteso, R-848 e ODN 2006 inducono l’espressione di NF-κB nelle cellule transfettate con TLR7/8- e TLR9-rispettivamente, il Poly I:C nelle cellule che esprimono TLR3 (dati non mostrati). I prodotti coniugati DP-conj e nDer p2-conj attivano soltanto cellule HEK transfettate con TLR7. Le proteine allergeniche DP e nDer p2 non coniugate sono prive di attività. Anche la miscela nDer p2 e SA-26E solubile (10 Î1⁄4g/ml e 0.085 Î1⁄4g/ml, rispettivamente) à ̈ inattiva (dati non mostrati). Analoghi effetti sono stati ottenuti quando le cellule HEK293 sono state transfettate con un plasmide che codifica per TLR7 murino insieme a 5 Î1⁄4g di plasmide che codifica per luciferasi sotto il controllo del promotore ELAM-1.

Nelle figure 2A e 2B sono riportati i dati ottenuti (un esperimento rappresentativo).

Esempio 5 -Valutazione dell’influenza sul fenotipo dei linfociti T

Step (a) procedura per il monitoraggio del fenotipo funzionale delle linee cellulari allergene-specifiche

Le cellule mononucleate di dieci pazienti allergici sensibili al Dermatophagoides pteronyssinus isolate su gradiente di densità Ficoll-Hypaque si pongono in coltura alla concentrazione di 1x10<6>in 2 ml di medium addizionato di 5% siero autologo in presenza degli allergeni DP oppure di nDer p2 o dei rispettivi coniugati (DP-Conj o nDer p2-Conj) (tutti alla concentrazione di 10 Î1⁄4g/ml) in piastre a fondo piatto da 24 pozzetti (Costar). Come controllo positivo, si approntano colture con DP oppure nDer p2 in presenza di R-848 solubile (2 Î1⁄4g/ml). Dopo 6 giorni di incubazione e aggiunta di rIL-2 (Proleukin) (25 UI/ml), i blasti T sono espansi con l’aggiunta di medium, siero fresco 5% e rIL-225 UI/ml ogni tre giorni. Al 15° giorno di coltura, i blasti T delle singole colture raccolti, lavati con PBS e contati, sono utilizzati per la specificità allergenica, l’analisi fenotipica e funzionale.

Per l’analisi della specificità delle TCL, 1 x 10<5>blasti T sono coltivati in piastre con fondo a U a 96 pozzetti in 0.2 ml con medium, 5% siero autologo, 1 x 10<5>cellule mononucleate autologhe (MNC) irradiate (9.000 R), DP o nDer p2 (10 Î1⁄4g/ml) e, dopo 3 giorni di incubazione, si addiziona timidina tritiata (3HTdR) (Amersham), Dopo ulteriori 16 ore di incibazione, le singole colture sono passate su filtro mediante apposito Harvester (Tomtec) e la radioattività misurata in un βcounter. Le linee sono considerate specifiche quando l’indice di stimolazione (cpm nelle colture in presenza di MNC e allergene/cpm nelle colture in presenza di soli MNC) à ̈ superiore a 3 come già descritto in altre pubblicazioni (Brugnolo F et al, J Allergy Clin Immunol 2003 Feb;111(2):380-9; Filì L et al, J Allergy Clin immunol 2006 Aug; 118(2):511-7).

Per l’analisi fenotipica, 2x10<5>cellule delle linee cellulari (TCL) sono risospese in PBS-BSA 0.5% e sodio azide 0.02% e saturate nei siti non specifici con IgG di coniglio, sono incubate per 20 min con gli anticorpi monoclonali anti-CD3, anti-TCRαβ, anti-TCRγΠ́, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD16, anti-CD20 and anti-CD56 (Becton Dickinson) o con il rispettivo isotipo di controllo (Southern Biotechnologies). Al termine dell’incubazione, le cellule lavate sono analizzate al citofluorimetro FACSCalibur (Becton Dickinson) con l’acquisizione di almeno 10<4>eventi per ciascun campione. Le linee ottenute in presenza di DP-conj e nDer p2-conj mostrano percentuali di cellule CD3+γΠ́+ e CD16+CD56+ più elevate rispetto alle TCL ottenute con gli allergeni non coniugati ma analoghe a quelle ottenute utilizzando R-848 come agente modulante.

Per l’analisi funzionale, si analizza i) la produzione intracitoplasmatica di citochine con tecnica citofluorimetrica dopo stimolazione con attivatori policlonali (PMA e ionomicina), ii) l’espressione dei fattori di trascrizione caratteristici delle cellule TH1, TH2, TH17 e Treg, iii) la produzione di citochine nel supernatante di coltura dopo stimolazione con PMA ed anticorpo monoclonale anti-CD3 e iv) l’espressione di mRNA per citochine TH2- o TH1-correlate con RT-PCR quantitativa.

Per l’analisi delle citochine prodotte a livello intracitoplasmatico dalle singole cellule si stimolano 1x10<6>/ml blasti T delle linee specifiche per DP, nDer p2 od i loro rispettivi coniugati per 4 ore (le ultime due in presenza del veleno del Golgi Brefeldina A 5 Î1⁄4g/ml) con PMA (10 ng/ml) e ionomicina (1 Î1⁄4M) secondo un sistema già descritto (Brugnolo F et al, J Allergy Clin Immunol 2003 Feb;111(2):380-9; Filì L et al, J Allergy Clin immunol 2006 Aug; 118(2):511-7). Dopo l’incubazione, le cellule lavate prima con PBS pH 7.2 e poi fissate per 15 min con formaldeide 2% in PBS, lavate nuovamente con 0.5% BSA in PBS pH 7.2 e infine permeabilizzate con PBS pH 7.2 contenente 0.5% BSA e 0.5% saponina, sono incubate con lo specifico anticorpo monoclonale, analizzando le seguenti citochine: IL-4, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-9 e L-17. L’analisi à ̈ condotta al citofluorimetro FACSCalibur utilizzando il software CellQuest (Becton Dickinson) acquisendo un totale di 10<4>eventi per ciascun campione di cellule CD3+CD4+TCRαβ+o CD3-CD16+ .

Per la determinazione delle citochine (IL-4, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10 e IL-17) nel supernatante di coltura si stimolano 10<6>/ml blasti delle linee T allergenespecifiche con PMA (20 ng/ml) ed anticorpo monoclonale anti-CD3 mAb (UCHT1, Pharmingen, 50 ng/ml) in 1 ml di volume per 36 h. Il dosaggio utilizza la tecnica ELISA con coppie di anticorpi del commercio secondo un sistema già descritto (Brugnolo F et al J Allergy Clin Immunol. 2003 Feb;111(2):380-8, Filì L et al J Allergy Clin Immunol. 2006 Aug;118(2):511-7): IL-4. IL-5, IL-10 (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ), IL-17 ed IL-13 (R&D System), IFN-γ (Endogen, Woburn, MA).

L’espressione dei fattori di trascrizione caratteristici delle cellule TH1, TH2, TH17 e Treg (T-bet, GATA-3, RoR C e FoxP3, rispettivamente) à ̈ stata determinata utilizzando la real-time PCR quantitativa.

Per la determinazione dell’ espressione di mRNA per citochine (IFN-γ IL-2, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17, TGF-β1, IL-22, IL-27, CXCL10, MMIF) si à ̈ utilizzata la tecnica della real-time PCR quantitativa. In breve, l’RNA totale estratto da 10<6>/ml blasti delle linee T con RNeasy kit e trattato successivamente con DNase I in modo da eliminare ogni traccia di contaminazione da parte di DNA genomico (Qiagen), à ̈ quantificato in ciascun campione con NanoDrop (Celbio). E’ quindi e sintetizzato il cDNA (TaqMan Reverse Transcription Reagents, Applied Biosystems, Foster City, CA). La reazione di polimerizzazione (PCR) à ̈ eseguita utilizzando il sistema ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) e le amplificazioni su piastre a 96 pozzetti MicroAmp con TaqMan Universal Master Mix e Assay-on-Demand (Applied Biosystems). Ciascun campione à ̈ analizzato in duplicato inserendo un campione senza template come controllo negativo, confrontando i livelli di espressione relativa di mRNA con una curva standard generata con diluizioni seriali di cDNA ottenuti da PBMC umani. Il gene della β-Actina à ̈ il gene di riferimento per la normalizzazione.

Con l’induzione di linee allergene-specifiche [Esempio 5 (step a)] abbiamo osservato che la percentuale delle cellule capaci di produrre IFN-γ à ̈ significativamente maggiore nelle linee ottenute con gli allergeni coniugati DP-conj e nDer p2-conj (Conj-5) rispetto alle linee specifiche ottenute con l’uso degli allergeni non coniugati DP e nDer p2 con parallela e significativa riduzione della percentuale delle cellule capaci di produrre IL-4. L’effetto di redirezionamento delle cellule allergene-specifiche da un fenotipo TH2 verso TH1/TH0 osservato con l’uso degli allergeni coniugati à ̈ analogo a quello che si ottiene con l’aggiunta in coltura di R-848 solubile agli allergeni DP e nDer p2 non coniugati, mentre la miscela nDer p2 e SA-26E solubile (10 Î1⁄4g/ml e 0.085 Î1⁄4g/ml, rispettivamente) non à ̈ in grado di modificare il fenotipo cellulare. Non vi à ̈ invece differenza nella percentuale di cellule capaci di esprimere IL-17 ed IL-9 tra le linee specifiche per allergeni e linee indotte con i rispettivi coniugati. In particolare, la percentuale di cellule capaci di esprimere IL-17 à ̈ molto bassa in entrambe le condizioni. Analogamente a quanto osservato con l’IL-4, la percentuale delle cellule ottenute dalle linee specifiche per gli allergeni coniugati DP-conj e nDer p2-conj esprimono quantità significativamente minori anche di IL-5 ed IL-13 rispetto alle linee specifiche per gli allergeni non coniugati DP e nDer p2 (dati non mostrati).

Nella Figure 3 e 4 sono riportate le medie (±SE) delle percentuali delle cellule CD3+CD4+ specifiche per DP o DP-conj (Figura 3) e per nDer p2 od il suo rispettivo coniugato (Figura 4) che producono IL-4, IFN-γ od entrambe le citochine (media di 10 donatori).

Questi risultati sono confermati con il saggio della produzione di citochine nel supernatante di coltura. I blasti T delle linee cellulari specifiche per DP-conj o nDer p2-conj (Conj-5) producono quantità significativamente inferiori di citochine TH2 (IL-4, IL-5, IL-13) e significativamente maggiori di IFN-γ rispetto alle linee specifiche per DP o nDer p2. In nessun caso abbiamo osservato la produzione di quantità significative di IL-17 (dati non mostrati).

Analogamente, l’analisi in real-time PCR quantitativa dimostra che le linee ottenute con DP-conj e nDer p2-conj sono in grado di esprimere livelli significativamente più alti di IFN-γ e significativamente più bassi di IL-4, IL-5 ed IL-13 rispetto alle linee specifiche per estratto DP e nDer p2. Non à ̈ stata osservata alcuna differenza nell’espressione di IL-10, IL-9, IL-17, IL-22, TGF-β1, CXCL10 o MMIF.

Nella Figura 5 Ã ̈ riportato un caso esemplificativo.

Il ridirezionamento delle cellule allergene-specifiche dal fenotipo TH2 al fenotipo TH1/TH0 osservato con l’uso degli allergeni coniugati à ̈ confermato anche a livello trascrizionale. Infatti, le linee ottenute con l’uso di DP-conj e nDer p2-conj esprimono più elevati livelli del fattore di trascrizione T-bet (TH1-correlato) e più bassi livelli del fattore GATA-3 (TH2-correlato) rispetto alle linee specifiche per estratto DP e nDer p2. In nessun caso abbiamo osservato diversità nella espressione del fattore di trascrizione RoR C correlato al fenotipo TH17. Parimenti, non à ̈ stata osservata alcuna modificazione del fattore trascrizionale correlato a cellule Treg FoxP3.

In tutti gli esperimenti, la miscela nDer p2 e SA-26E solubile (10 Î1⁄4g/ml e 0.085 Î1⁄4g/ml, rispettivamente) non à ̈ attiva (dati non mostrati).

I risultati sono mostrati nella figura 6 (un caso rappresentativo).

Step (b) procedura per il monitoraggio del fenotipo funzionale dei cloni allergene-specifici

Per l’analisi funzionale di cloni specifici per nDer p2 e nDer p2-conj, sono ottenute inizialmente linee allergene-specifiche per nDer p2 ed il suo coniugato nDer p2-conj da due soggetti atopici (G.E. e M.A.) ed affetti da asma bronchiale e rinite allergica per sensibilizzazione a Dermatophagoides pteronyssinus. Come controllo, da uno dei due donatori (G.E.) sono anche ottenute linee specifiche per nDer p2 in presenza di R-848 solubile già descritto come capace di provocare un re-direzionamento delle cellule TH2 verso il fenotipo TH1/TH0. Dalle linee indotte in presenza di nDer p2 sono ottenuti 28 cloni specifici per Der p dal donatore G.E. e 37 dal donatore M.A. mentre dalle linee indotte in presenza di nDer p2-conj sono ottenuti 28 cloni specifici da entrambi i donatori. Dodici cloni specifici per Der p2 sono anche ottenuti dal donatore G.E. a partire dalle linee indotte con nDer p2 e R-848 aggiunto solubile. L’efficienza di clonazione nelle diverse condizioni sperimentali à ̈ indicata nella seguente tabella:

Donatore Efficienza di clonazione (%)

nDer p2 nDer p2 R-848 nDer p2-conj

G.E. 24 12 21

M.A. 30 Nd 37

I cloni allergene-specifici ottenuti nelle diverse condizioni sperimentali sono quindi saggiati per la capacità di produrre IL-4 (pg/ml) e IFN-γ pg/ml) nel supernatante di coltura dopo stimolazione policlonale con PMA ed anticorpo monoclonale anti-CD3.

I risultati ottenuti dallo step (a) sono stati confermati a livello clonale [Esempio 5 (step b)] come mostrato nella figura 7. Nel donatore M.A. virtualmente tutti i cloni ottenuti dalla linea nDer p2 producevano IL-4 (asse delle x, pg/ml) (23 cloni) da sola (21 cloni, 56.7%) o insieme a IFN-γ (asse delle y, pg/ml) (11 cloni, 29.7%), mostrando quindi un chiaro fenotipo TH2/TH0. Viceversa, quando era utilizzato il coniugato nDer p2-conj all’inizio della coltura, soltanto quattro cloni sono in grado di produrre IL-4 (14.2%), mentre sono ottenuti 10 cloni TH1 (35.7%) e 12 TH0 (42.8%). Nel donatore G.E., l’allergene non coniugato nDer p2 espandeva 21 cloni allergene-specifici in grado di produrre IL-4 (75%) da sola o insieme a IFN-γ, mentre con il coniugato nDer p2-conj 7 cloni (23%) producono esclusivamente IFN-γ (perciò mostrando un chiaro fenotipo TH1) e 11 (48%) producono anche IL-4, ma nessuno produce IL-4 da sola.

Nella Figura 7 sono riassunti i dati ottenuti dal donatore M.A. Nel riquadro sono indicate le percentuali dei cloni che producono le citochine indicate (nDer p2 37 cloni, nDer p2-Conj 28 cloni).

Step (c) procedura per il monitoraggio del fenotipo delle cellule CRTH2 allergene-specifiche

Le cellule mononucleate (CMN) circolanti vengono isolate mediante gradiente di densità (Ficoll-Hypaque) usando buffy coats di donatori sensibilizzati a Dermatophagoides pteronyssinus (Servizio Immunotrasfusionale e terapie cellulari, Azienda Ospedaliero Universitaria Pediatrica A. Meyer, Firenze). Vengono separate 500 x 10<6>CMN aggiungendo dapprima 500 Î1⁄4l di anticorpo monoclonale anti-CRTH2 per 20 minuti a temperatura ambiente, lavando estensivamente e poi incubando nuovamente con un anticorpo secondario policlonale legato a microbiglie ferrose e passando su colonna (LS column) in campo magnetico. Vengono recuperati per selezione positiva 10 x 10<6>cellule effettrici che sono lavate estensivamente con una soluzione sterile di PBS senza calcio e magnesio e poste in coltura alla concentrazione di 1x10<6>/ml/pozzetto in terreno di coltura completo addizionato di siero umano AB 5% in piastre a 24 pozzi a fondo piatto. Sono utilizzati come stimolanti gli allergeni non coniugati (DP o nDer) o i coniugati (DP-conj o nDer p2-conj) (tutti a 10 Î1⁄4g/ml). Le colture sono incubate per 6 giorni a 37° C in atmosfera umidificata al 5% di CO2ed espanse con rIL-2 25 UI/ml fino al 14° giorno quando i blasti T sono raccolti, lavati estensivamente, contati, risospesi alla concentrazione di 1x10<6>/ml e stimolati con PMA e ionomicina, come già descritto, per la produzione intracitoplasmatica di IL-4, IFN-γ.

L’ulteriore e definitiva conferma della capacità modulante dei prodotti coniugati à ̈ stata ottenuta con gli studi delle cellule CRTH2 [Esempio 5 (step c)] che, quando stimolate in vitro con l’allergene non coniugato, esprimono IL-4, mentre la cultura con allergeni coniugati riduce in modo significativo (e in due casi dimezza) l’espressione di IL-4 contemporaneamente all’acquisizione della capacità di produrre IFN-γ da solo (cellule TH1) o insieme a IL-4 (cellule TH0).

I risultati sono illustrati nella tabella seguente:

Donatore Allergene % delle cellule che esprimono la citochina IL-4+ IL-4+ IFN-γ+

IFN-γ+

# 1 Dp estratto 85.5 1.5 0.3

DP-conj 72.5 12.5 1.7

#2 Dp estratto 87.6 1.1 0.6

DP-conj 49.2 6.0 19.8

#3 nDer p2 47.6 1.3 5.8

nDer p2-conj 33.1 5.5 18.5

# 4 nDer p2 78.2 2.3 2.0

nDer p2-conj 52.1 19.3 17.8

In figura 8, si riporta un caso rappresentativo (donatore #3)

Nelle linee così ottenute non stata osservata la produzione di quantità significative di IL-17 che, in letteratura, à ̈ correlata con l’induzione di reazioni autoimmuni a seguito dell’attivazione di alcuni TLR, mentre si osserva una riduzione statisticamente significativa di altre citochine correlate al fenotipo TH2 ( IL-5, IL-13) (dati non mostrati).

Step (d) procedura per il monitoraggio del fenotipo delle cellule allergenespecifiche con diversi rapporti allergene-adenina modificata

Linee cellulari da due soggetti atopici sensibilizzati al Dermatophagoides pteronyssinus sono ottenute come descritto nello step (a) utilizzando come allergeni nDer p2 non coniugato e tre diverse preparazioni dell’ allergene coniugato (vedi tabella esempio 2: nDer p2-conj 2, nDer p2-conj 5, nDer p2-conj 6,) ottenuti con la medesima procedura di coniugazione come descritto nell’esempio 2 ma miscelando quantità fisse di proteina nDer p2 con quantità variabili di estere attivo SA-26E (step b) (Conj 2 > Conj 5) oppure miscelando, in momenti diversi, quantità fisse di proteina nDer p2 con le stesse quantità di estere attivo SA-26E (Conj-5 e Conj-6).

I coniugati ottenuti con diversi rapporti proteina e adenina modificata (vedi tabella esempio 2) saggiati in due soggetti [Esempio 5 (step d)] sono in grado di ridurre in modo significativo l’espressione di IL-4, IL-5 ed IL-13 (nonché del fattore di trascrizione TH2-correlato GATA-3) e di aumentare l’espressione di IFN-γ rispetto alla linea cellulare ottenuta con l’uso di nDer p2 non coniugato (dati non mostrati). L’effetto TH1-inducente era maggiore con il coniugato nDer p2-conj 5 (minima quantità di adenina coniugata) rispetto al coniugato 2 (massima quantità di adenina coniugata) con effetti sovrapponibili quando era utilizzato il Conj-5 od il Conj-6 indicando che a) la quantità di estere attivo coniugato alla molecola allergenica critica per la modulazione funzionale delle cellule allergene-specifiche b) può essere modificata a piacimento per ottenere effetti di diversa entità, c) gli effetti modulanti migliori si ottengono con le dosi più basse di estere attivo coniugato alla molecola proteica di natura antigenica.

Come atteso, R-848 era in grado di diminuire in modo sensibile la percentuale delle cellule capaci di produrre IL-4 insieme ad un parallelo aumento della produzione di IFN-gamma. Coniugati prodotti in condizioni sperimentali identiche (i.e. nDer-conj5 e nDer-conj6) ma in momenti diversi producevano effetti assolutamente sovrapponibili indicando la ottima ripetibilità degli esperimenti.

Condizione

sperimentale

IL-4+ IFN-gamma nDer p2 55,5 5

nDer p2 R848 3,7 17.3

nDer-conj2 32,3 18.9

nDer-conj5 3,8 12.5

nDer-conj6 4 14

Step (e) procedura per il monitoraggio dell’attività dalle cellule dell’immunità innata nell’influenzare il fenotipo delle cellule allergene-specifiche

Per dimostrare che le citochine prodotte dalle cellule presentanti l’antigene stimolate dal prodotto coniugato sono le responsabili della modificazione del fenotipo funzionale dei linfociti T allergene-specifici, linee cellulari specifiche per DP e DP-conj sono ottenute da due soggetti atopici in assenza o presenza di anticorpi monoclonali ad attività neutralizzante anti-IL-12 (R&D System), anti-IL-29 (R&D System), anti-IFN-α ed anti-IFN-αR (entrambi PBL, Piscataway, NJ, USA), ciascuno alla concentrazione di 5 Î1⁄4g/ml, utilizzando la stessa metodica già descritta nello step a). Come controllo negativo, à ̈ stata aggiunta una preparazione di IgG di topo.

Gli effetti di re-direzionamento funzionale da parte dei prodotti coniugati sulle cellule T sono da imputare alla loro capacità di stimolare la produzione di citochine modulatorie da parte delle cellule dell’immunità innata. Infatti, nei due soggetti dell’Esempio 5 (step e), l’aggiunta degli anticorpi anti-IL12 o anti-IFN alle cellule coltivate in presenza di DP-conj era in grado di ripristinare la produzione di IL-4 (e

di ridurre la produzione di IFN-γ) indotta dal coniugato, mentre la neutralizzazione

della IL-29 era inefficace. La miscela degli anticorpi anti-IL-12 ed anti-IFN consentiva di inibire completamente l’attività dell’allergene coniugato indicando che queste due citochine sono entrambe responsabili degli effetti TH1-inducenti, mentre il ruolo svolto dalla IL-29 à ̈ marginale.

I risultati degli esperimenti sono illustrati nelle tabelle riportate qui sotto:

Donatore #1

Allergene Anticorpo % delle cellule producenti le seguenti citochine

<IL-4+>IL-4+ IFN-γ+ IFN-γ+ DP 28.6 15.6 14.1

DP-conj 1.9 4.3 40.6

DP-conj IgG di topo 1.9 1.8 27.7

DP-conj Anti-IL-29 1.5 1.7 41.0

DP-conj Anti-IL-12 39.9 5.2 17.7

anti-IFNα

DP-conj Anti-IL-12 45.9 6.9 16.0

anti-IFNα+

anti-IL-29

Donatore #2

Allergene Anticorpo % delle cellule producenti le seguenti citochine

<IL-4+>IL-4+ IFN-γ+ IFN-γ+ DP 39.3 7.3 17.5

DP-conj 6.5 12.5 63.9

DP-conj IgG di topo 6.1 5.7 57.3

DP-conj Anti-IL-29 nd nd nd

DP-conj Anti-IL-12 20.3 7.6 33.4

DP-conj anti-IFNα16.1 3.3 50.2

DP-conj Anti-IL-12 48.5 1.9 10.7

anti-IFNα+

anti-IL-29

Step (f) procedura per il monitoraggio del riconoscimento allergenico

Per valutare se il coniugato allergenico à ̈ correttamente riconosciuto dai linfociti T specifici per l’allergene del Dermatophagoides, linee cellulari T indotte da tre donatori allergici sono ottenute utilizzando la procedura descritta nello step (a) utilizzando l’allergene DP non coniugato. Al termine dei 14 giorni di coltura, i blasti T recuperati, lavati e contati, sono stati posti in coltura alla concentrazione di 1x10<6>/ml e stimolati con 1x10<6>/ml cellule mononucleate autologhe irradiate a 9000 R (come cellule presentanti l’antigene) in presenza di DP o di DP-conj (10 Î1⁄4g/ml). Dopo 3 giorni di incubazione, à ̈ aggiunta timidina tritiata per ulteriori 16 ore. La radioattività incorporata nelle singole colture, misurata come conte per minuto (cpm) e direttamente proporzionale alla quantità di timidina tritiata incorporata nel DNA cellulare, à ̈ valutata dopo trasferimento delle cellule su filtro di cellulosa mediante Harvester (Tomtec, Turku) e lettura a β-counter. La proliferazione cellulare à ̈ espressa in Indice di Stimolazione (IS) che à ̈ calcolato come segue: media delle cpm nelle colture stimolate X 100

media delle cpm nelle colture non stimolate

L’effetto modulatorio non à ̈ correlato con un minor riconoscimento dell’allergene coniugato da parte delle cellule T, in quanto linee specifiche per DP [ Esempio 5 (step f)] proliferano ugualmente sia in risposta a DP che a DP coniugato come dimostrato dalla figura 9, indicando che la procedura di coniugazione dell’allergene non modifica la struttura allergenica che à ̈, quindi, riconosciuta regolarmente dai linfociti T specifici.

Esempio 6 - Valutazione degli effetti su altri tipi cellulari

Step (a) procedura per il monitoraggio dell’attivazione dei granulociti basofili

100 Î1⁄4l di sangue intero di quattro pazienti sensibilizzati al Dermatophagoides pteronyssinus sono incubati con 20 Î1⁄4l di tampone di stimolazione (controllo negativo) fornito dalla ditta produttrice del kit (Becton Dickinson) o con 20 Î1⁄4l di diluizioni seriali di DP o nDer p2 o i loro rispettivi coniugati DP-conj o nDer p2-conj (0.5-0.05-0.005 Î1⁄4g/ml) o 20 Î1⁄4l fMLP o 10 Î1⁄4g/ml anticorpo monoclonale anti-IgE come controllo positivo per 15 minuti a 37° in bagnetto. Al termine dell’incubazione, i campioni sono messi in ghiaccio per 5 minuti per fermare la degranulazione basofila e colorati con l’aggiunta di 20 Î1⁄4l di una miscela di tre anticorpi monoclonali (FITCanti-CD63, PEanti-CD123 and PerCPanti-HLA-DR) per 20 minuti in ghiaccio. La lisi e la fissazione delle cellule à ̈ ottenuta con l’aggiunta di 2 ml di una soluzione pre-riscaldata per 10 minuti a temperatura ambiente a ciascuna provetta che viene infine centrifugata e lavata ed analizzata al citofluorimetro acquisendo almeno 500 cellule CD123+ per ciascun campione.

I basofili circolanti (CD123+ HLA-DR-) ottenuti secondo quanto specificato [Esempio 6 (step a)] aumentano facilmente l’espressione della molecola CD63 quando posti in presenza di anti-IgE così come dimostriamo nell’ esempio (media dell’espressione 41.3±6.5%), così come quando vengono aggiunti fLMP o degli allergeni non coniugati con una curva dose-risposta (dati non mostrati). Viceversa, il coniugato DP perde la capacità di attivare le cellule FCεRI+ in modo dipendente dalla dose.

I risultati ottenuti con l’uso dell’allergene DP e del coniugato DP-conj sono riportati nella tabella seguente:

Allergene % delle cellule CD63+ (media±ES)

0.5 Î1⁄4g/ml 0.05 Î1⁄4g/ml 0.005 Î1⁄4g/ml

DP 62.3 ± 8.5 47.3 ± 10.6 15.0 ± 1.9

DP-conj 56.1 ± 11.1 24.8 ± 11.2* 4.0 ± 1.5**

* p <0.0.5; ** p<0.005

Step (b) procedura per il monitoraggio dell’attivazione dei linfociti B

Le cellule mononucleate (CMN) circolanti vengono isolate mediante gradiente di densità (Ficoll-Hypaque) usando buffy coats di tre donatori normali (Servizio Immunotrasfusionale e terapie cellulari, Azienda Ospedaliera Universitario Pediatrica A. Meyer, Firenze). Vengono separate 200 x 10<6>CMN utilizzando il kit del commercio (CD19 isolation kit, Miltenyi) aggiungendo 400 Î1⁄4l di anticorpo monoclonale anti-CD19 legato a microbiglie ferrose e passando su colonna (LS column) in campo magnetico. Vengono recuperati per selezione positiva 20 x 10<6>linfociti B che sono lavati estensivamente con una soluzione sterile di PBS senza calcio e magnesio e posti in coltura in triplicato alla concentrazione di 1x10<6>/ml/pozzetto in terreno di coltura completo addizionato di siero bovino fetale al 10% in piastre a 96 pozzi a fondo a U. Sono utilizzati come stimolanti i seguenti prodotti: allergeni non coniugati (DP o nDer) (10 Î1⁄4g/ml), loro rispettivi coniugati (DP-conj o nDer p2-conj) (10 Î1⁄4g/ml), R-848 (2 Î1⁄4g/ml) , e CpG-ODN 2006 (10 Î1⁄4g/ml). Le piastre sono incubate per 72 ore a 37° C in atmosfera umidificata al 5% di CO2e al termine della coltura à ̈ aggiunto 0.5 Î1⁄4Ci di timidina tritiata a ciascun pozzetto per ulteriori 16 ore. La radioattività incorporata nelle singole colture à ̈ stata misurata secondo quanto già descritto nello step (f) dell’esempio 4.

I ligandi solubili dei TLRs (R-848, CpG) inducono alti valori di incorporazione di timidina tritiata nei linfociti B purificati [Esempio 6 (step b)] come espresso dagli indici si stimolazione mentre gli allergeni coniugati mostrano capacità di indurre risposta proliferativa bassa od assente garantendo un miglior profilo di sicurezza. Come atteso, gli allergeni non coniugati non sono in grado di determinare alcuna risposta proliferativa nelle cellule B-linfocitarie.

I risultati relativi agli esperimenti condotti con l’allergene purificato nDer p2 ed il rispettivo coniugato sono riportati nella tabella qui sotto:

Stimolo concentrazione Indici di stimolazione

(media±ES)

CpG10 Î1⁄4g/ml90.3 ± 7.5

R-8482 Î1⁄4g/ml71.7 ± 7.5

<nDer p2>10 Î1⁄4g/ml 1.7 ± 0.1

2.5 Î1⁄4g/ml 1.7 ± 0.2

0.5 Î1⁄4g/ml 1.6 ± 0.4

nDer p2-conj10 Î1⁄4g/ml3.8 ± 0.4

2.5 Î1⁄4g/ml 1.7 ± 0.2

0.5 Î1⁄4g/ml 1.6 ± 0.0

Esempio 7 - Valutazione degli effetti in vivo in un modello sperimentale murino di sensibilizzazione allergica

Step (a) procedura per la misurazione dell’iperreattività bronchiale

Dieci topi di ceppo BALB/C e dieci C57BL/6 dell’età di 6-8 settimane di sesso femminile (Charles River labs) vengono sensibilizzati al giorno 0 e al giorno 7 per via intraperitoneale con 10 Î1⁄4g OVA (5 animali per ceppo) od OVA-conj (5 animali per ceppo) in presenza di alum. Al giorno 14 e al giorno 18 gli animali sono stimolati per via intratracheale con 10 Î1⁄4g OVA e 24 ore dopo viene misurata la reattività bronchiale non specifica dapprima facendo inalare all’animale una soluzione di PBS per la determinazione del valore di base e poi somministrando per aerosol per 3 minuti una soluzione di metacolina a dosi progressivamente crescenti (6.25-12.5-25-50 mg/ml). Il pletismografo nel quale l’animale à ̈ inserito registra i valori di resistenza al flusso.

Step (b) procedura per la misurazione della modificazione della risposta anticorpale

I livelli di IgE totali ed IgE specifiche nei confronti di OVA sono determinati al giorno 14 e giorno 18 (prima della stimolazione allergenica per via intra-tracheale) nel siero degli animali sensibilizzati mediante l’uso di un sistema del commercio.

La sensibilizzazione con ovalbumina coniugata con adenina modificata OVA-conj dell’animale da esperimento come descritto [Esempio 7 (step b)] provoca una ridotta risposta IgE (sia delle IgE totali come mostrato nella tabella che delle IgE specifiche verso OVA come mostrato nalla tabella successiva e nella Figura 10) rispetto all’animale trattato con OVA non coniugata che mostra, come atteso, una chiara attivazione delle risposte TH2. Parallelamente, si osserva un significativo aumento della classe di immunoglobuline G2a negli animali trattati con proteina coniugata (dati non mostrati).

Sensibilizzazione IgE totali (pg/ml) (media±ES)

d14 d18

pre-challenge post-challenge

controllo 190±130 394±50

OVA 966±268 680±234

OVA-conj 780±64 618±91

Inoltre, il gruppo degli animali sensibilizzati con il prodotto coniugato OVA-conj mostra una significativa riduzione della broncoreattività indotta dalla metacolina [Esempio 7 (step a)] rispetto agli animali sensibilizzati con OVA non coniugata, indicando che la coniugazione dell’OVA con adenina modificata à ̈ in grado di ridurre significativamente il grado di ostruzione bronchiale conseguente alla inalazione di molecole allergeniche come OVA (vedi figura 11). Tale dato si correla con la riduzione della proporzione di granulociti eosinofili nel liquido di lavaggio broncoalveolare (dati non mostrati).

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composti coniugati stabili di formula (II) NH2 N N O OH P ( )nX N N m (II) dove X=S; n à ̈ un numero intero compreso fra 0 e 18; P rappresenta un antigene proteico, sia altamente purificata, ricombinante o come estratto semipurificato, legata, ad esempio ma non in modo esclusivo, per mezzo dei suoi residui di lisina; m à ̈ un numero intero che può variare da m = 1 fino a m = numero di lisine disponibili presenti sulla proteina P.
2. 2. Composti secondo la rivendicazione 1 in cui la proteina P à ̈ scelta fra antigeni batterici, allergeni inalatori (quali allergeni pollinici o derivati epidermici di animali), allergeni alimentari; preferibilmente la proteina P à ̈ scelta fra i seguenti allergeni: estratto semipurificato dell’acaro della polvere Dermatophagoides pteronyssinus (DP), allergene purificato naturale Der p2 (nDer), allergene ricombinante Der p2 (rDer) oppure ovalbumina (OVA grade V).
3. 3. Composti di formula (II), secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-2, per l’uso come medicamenti.
4. 4. Composti di formula (II), secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-2, per l’uso in immunoterapia specifica.
5. 5. Composizioni farmaceutiche comprendenti almeno un composto di formula (II), secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-2, ed almeno un altro ingrediente farmaceuticamente accettabile.
6. 6. Un processo per la preparazione di composti di formula (II), secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-2, detto processo comprendente l’accoppiamento di una proteina P con un acido di formula (V), NH2 O N N OH HO n<S>NN Ph (V) od un corrispondente estere attivato, dove n à ̈ come sopra definito.
7. 7. Processo secondo la rivendicazione 6 in cui s’impiega un estere attivato di formula (I) NH2 N O N O OH N O( )nX N<N> O Linker (I) in cui X = S ed n rappresenta il numero di unità metileniche CH2che à ̈ compreso da 0 a 18.
8. 8. Processo secondo una qualunque delle rivendicazioni 6-7 in cui detti composti di formula (V) o corrispondente estere attivato sono ottenuti a partire dal composto (III) NH2 N N OH H SNN Ph (III)
9. 9. Composti di formula (I) NH2 N O N O OH N O( )nX N<N> O Linker (I) in cui X = S ed n rappresenta il numero di unità metileniche CH2compreso da 0 a 18.