ITFI20090230A1 - Glicoconiugato sintetico immunogeno utile per l'immunoterapia del melanoma. - Google Patents

Glicoconiugato sintetico immunogeno utile per l'immunoterapia del melanoma. Download PDF

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ITFI20090230A1
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antibodies
ganglioside
lactone
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Carlotta Lunghi
Cristina Nativi
Barbara Richichi
Lucio Toma
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Azienda Ospedaliero Universitaria C Areggi
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Description

DOMANDA DI BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO:
Glicoconiugato sintetico immunogeno utile per l'immunoterapia del melanoma
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce al campo della chimica sintetica ed in particolare la sintesi di composti glicoconiugati immunogeni, loro metodo di sintesi e impiego per l’immunoterapia attiva o passiva e la prognosi di forme tumorali le cui cellule iper-esprimono GM-3 ganglioside e GM-3 lattone .
STATO DELL’ARTE
L’immunoterapia dei tumori e del melanoma in particolare ha una lunga storia, solo recentemente pero’ per questo tipo di approccio terapeutico si e’ trovato un solido razionale scientifico. L’obiettivo di questa terapia biologica e’ insegnare al sistema immunitario del paziente a riconoscere gli antigeni espressi sulle cellule tumorali e a distruggerle, lasciando inalterate le cellule sane. Il successo di questa terapia dipende enormemente dalla scelta di quegli antigeni essenziali per la crescita e proliferazione del tumore. L’iper-espressione del GM-3 ganglioside 1 (in fig. 1) e specialmente l’espressione del suo metabolita il GM-3 lattone 2 (in fig. 1) caratterizzano il melanoma sia murino che umano giocando un ruolo importante nella progressione del tumore e rendono questi antigeni erroneamente riconosciuti come “self’ dal sistema immunitario del malato, obiettivi potenziali per l’immunoterapia di questo tipo di neoplasia. Il GM-3 lattone 2, nonostante sia piu’ immunogeno del suo precursore, a causa della sua instabilita’ in condizioni fisiologiche non e’ adatto per essere utilizzato in immunoterapia come antigene associato al melanoma. Toma et al. ChemBioChem, 2007, 8, 1646 descrive il disegno razionale e la sintesi del mimetico, idroliticamente stabile, 3 (in fig. 1) che e’ notevolmente piu’ semplice del lattone nativo 2. Il mimetico 3, da indagini successive alla sua pubblicazione, è risultato essere scarsamente immunogeno. Scopo della presente invenzione è quello di fornire un derivato sintetico del GM-3 lattone che sia idroliticamente stabile in condizioni fisiologiche e capace di stimolare una risposta immunitaria per l’ottenimento dì anticorpi capaci di legarsi ad antigeni espressi sulle cellule tumorali che iper-esprimono GM-3 ganglioside (es. cellule di melanoma o linee cellulari di tumore al colon).
DEFINIZIONI E ABBREVIAZIONI
KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin
CRM: Cross-Reacting Material 197 (mutazione non tossica della tossina difterica) OMP: Outer Membrane Protein
BSA: Bovine Serum Albumin
cBSA: cationized Bovine Serum Albumin
HSA: Human Serum Albumin
BCG Bacillus Calmette and Guerin
MPL: Membrane-Patched Proteoliposomes
MDP: Muramyl DiPeptide
Pal3CysSer: N-a-palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-Cys-Ser-OH Pal3Cys: N-a-palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-L-cysteine
QS-21 : Quillaja Saponaria Molina based immunological adjiuvant
CpG: Cytosine linked to a Guanine by a phosphate bond
RAFT : Regioselectively Addressable Functional tT empiate
ODN: OligoDeoxyNucleotides
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione risolve i problemi suddetti mediante composti di formula (I)
(I) '
- in cui -X è 0, NH, S, CH2;
L è un linker ovvero uno spaziatore di-valente;
A è un adiuvante o carrier ovvero una molecola o particella immunogena ;
ed in cui i legami fra linker e porzione carboidratica e fra linker e carrier sono di tipo covalente.
Sorprendentemente composti di formula (I) come sopra descritta sono risultati essere immunogeni. Pertanto, per un aspetto, la presente invenzione riguarda composti di formula (I) per l’uso come medicamenti, ovvero come antigeni per l'immunizzazione attiva. Per un altro aspetto l’invenzione riguarda quindi composizioni farmaceutiche comprendenti almeno un composto di formula (I) come sopra definita ed almeno un altro ingrediente farmaceuticamente accettabile.
Per un ulteriore aspetto la presente invenzione riguarda anticorpi ottenibili dall’immunizzazione di una cavia di genere murino in seguito a somministrazione di un composto di formula (I) di cui sopra. Suddetti anticorpi sono specifici, cioè’ si legano specificamente alle cellule che iper-esprimono GM-3 ganglioside e GM-3 lattone, e pertanto per un ulteriore aspetto l’invenzione riguarda anticorpi di cui sopra per uso come medicamento, ovvero come principi attivi in composizioni farmaceutiche per l'immunizzazione passiva e come diagnostici e/o prognostici . BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE FIGURA 1 - Struttura del GM3 ganglioside 1, GM3 lattone 2, mimetico tioetereo 3 e GM1 ganglioside.
FIGURA 2 - Schema di sintesi di un glicoconiugato di formula (I) secondo l’invenzione, in particolare del composto 5 KLFI-coniugato; FIGURA 3 - Test ELISA eseguiti per la determinazione dell’ isotipo. Il sovranatante l'ibridoma IV1 :4C5C4 risulta essere composto da due isotipi: IgM and lgG3.
FIGURA 4 - Test ELISA per confrontare l’immunoreattivita’ dell’anticorpo verso GM3- e GM-i-ganglioside;
FIGURA 5 - Immunocitochimica su cellule di melanoma murino B16F1. A) Cellule trattate con il solo medium (controllo negativo); B) Cellule trattate con il sovranatante l'ibridoma IV1:4C5C4, diluito 1:100 in PBS DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Ai fini della presente invenzione il linker L è un opportuno spaziatore divalente la cui struttura chimica consenta di distanziare la porzione carboidratica e il carrier/adiuvante in modo tale che essi non mascherino vicendevolmente la loro porzione antigenica: preferibilmente il linker ha una struttura chimica tale da distanziare la porzione carboidratica e il carrier di 7-30 atomi, più preferibilmente 12-16 atomi quando l’adiuvante/carrier A è una biomacromolecola oppure 19-30 atomi quando radiuvante/carrier A è una nano particella metallica.
Ai fini della presente invenzione l'adiuvante/carrier A è una sostanza immunogena ovvero che sia in grado di provocare una risposta immunitaria qualora somministrata ad un soggetto animale; suddetto carrier/adiuvante A può essere scelto fra una macromolecola, un macrociclo, un composto dendrimerico, un liposoma, una nano particella metallica un oligosaccaride costituito da un minimo di 2 a un massimo di 5 unita’ monosaccaridiche o cellule quali le cellule dendritiche (DC).
Per macromolecola s’intende una molecola che contenga almeno 100 atomi, fra queste s’intendono incluse le biomacromolecole come le proteine, i lipidi, i polisaccaridi.
Per macrocicli s’intendono composti che comprendano un ciclo formato da sette o più atomi ne sono esempi i caiixareni, le ftalocianine, le porfirine, le ciclodestrine e gli oligopeptidi ciclici.
Composti dendrimerici possono essere di generazione 0, 1 o 2. Esempi di composti dendrimerici atti allo scopo sono i PAMAM (poliammidoammine) Nano particelle metalliche sono particelle delle dimensioni comprese fra 1e 100 nm; esse sono costituite da metalli o ossidi di metalli scelti fra Au, Fe, Ti.
Opzionalmente qualora A sia un carrier con modesta immunogenicità un composto di formula (I) può essere associato ad un’opportuna altra sostanza adiuvante che sia in grado di potenziare l’immunogenicità del carrier. In tal caso oggetto dell’invenzione è una composizione comprendente un composto di formula (I) come descritta sopra ed un ulteriore adiuvante B capace di potenziare l’immunogenitcità del carrier A. _
Preferibilmente il carrier/adiuvante A e B è scelto nel gruppo consistente in KLH, CRM, OMP, BSA, HSA, BCG, MPL, MDP, Pal3CysSer, Pal3Cys, QS21, trealosio-6,6’-dimicolato, CpG di sintesi, CpG-DNA, Nisseria Meningitis, tossina tetanica, tossina batterica, liposomi, nanoparticelle d’oro, nanoparticelle di ossido di Fe(ll), caiixareni, dendrimeri, RAFT, DC, presi singolarmente o in combinazione;
Quando il carrier/adiuvante è di natura proteica allora il legame tra linker e carrier/adiuvante e’ scelto nel gruppo consistente in ammidici, amminici, imminici, eterei, tioeterei, disolfuro, esterei, tioesterei, fosfati, fosfonati, ureidici, tioureidici, carbammati, carbonati, in cui almeno un atomo proviene dalla proteina.
Quando il carrier A è una nanoparticella metallica il linker è legato alla nanoparticella in maniera pseudo covalente tramite un’atomo di zolfo o un gruppo disolfuro. Quando A è una proteina preferibilmente il linker L ha struttura R1-Z-W1-R2-W2 in cui R1 e R2 indipendentemente fra loro sono C2-C8-alchile, C2-C8-alchenile, C5-C7-cicloalchile, 1-4-fenile; Z è O, S, NH; W1 è assente, C=0, C=NH, S; W2 è assente, C=0, C=NH, S, 1 ,4-succinimmide. Suddetti alchili sono preferibilmente lineari.
Esempi specifici di possibili linker sono:
Più preferiti sono quei composti in cui:
X è O;
A è una proteina;
L è uno spaziatore di-valente di formula (CH2)n-NH-CO-(CH2)m-CO-Y dove n ed m indipendentemente fra loro sono numeri interi scelti nell’intervallo 2-8 ed Y è NH proveniente da A.
Composto particolarmente preferito è il composto 5 (figura 2) di formula (I) in cui X è O, linker L è -(CH2)6NHCO-(CH2)4-CO e carrier A è KLH legato mediante legame ammidico tramite la funzione amminica dei residui di lisina della proteina e il gruppo carbossilico del linker.
Composti di formula (I) come sopra definiti sono ottenibili da composti di formula (II)
in cui
G è F, Br o CI; SR, SAr o tricloroacetimmide, fosfato in cui Rè Et, o C1-C4 alchile; Ar è Ph, Ph sostituito, Piridina, chinolina o altri etera cicli aromatici;
P indipendentemente fra loro sono opportuni gruppi protettori delle funzioni ossidriliche scelti fra quelli noti all’uomo deH’arte come ad esempio e preferibilmente acetile, benzoile, silile o benzile;
mediante metodologie sintetiche note per l’introduzione di un linker L o L-A.
In maniera preferita i composti di formula (II) presentano P uguali fra loro.
Nel caso in cui la molecola di formula (II) come sopra descritta venga accoppiata al solo linker poi seguirà, dopo eventuale opportuna deprotezione delle funzioni ossidriliche, accoppiamento, mediante metodologie sintetiche note, con un carrier/adiuvante A.
In particolare a titolo d’esempio è qui riportato (nella figura 2) lo schema di sintesi del composto 5 ottenuto a partire dal composto 15, ovvero un composto di formula (II) in cui G è F. Il composto 15 è stato preparato secondo quanto già riportato in Toma et al. ChemBioChem, 2007, 8, 1646. Il ω-amino glicosil derivato 4 (Figura 2) e’ stato preparato dal fluoro derivato 15 per trattamento con azido esanolo secondo le condizioni di glicosilazione di Ley. Lo pseudo-α azido derivato 17 ottenuto dopo rimozione dei gruppi acetilici, e’ stato sottoposto alla riduzione di Staudinger per dare 4 che e’ stato fatto reagire con l’estere bis-p nitrofenil adipico 18 (Wu, X., Ling, C.-C., Bundle, D. Org. Leti. 2004, 6, 4407) a formare il derivato carbossilico attivato 19 (87%, su due passaggi) (Schema 3). 19 viene infine coniugato con il carrier proteico KLH. Il coniugato KLH-tioeterereo 5 e’ stato preparato mescolando 19 con KLH (tampone fosfato, temperatura ambiente, 20 h). Il caricamento saccaride/KLH, determinato attraverso il test trinitrobenzensulfonic o (TNBS) (Habeeb, F.S.A. Anal. Biochem. 1966, 14, 328), e’ risultato ~ 27% dei gruppi amminici liberi della proteina.
I composti di formula (I) come sopra definiti sono antigeni artificiali, mimetici del GM3-lattone e pertanto sono utili come principi attivi per vaccini contro forme tumorali le cui cellule iper-esprimono GM-3 ganglioside e/o GM-3 lattone, in particolare sono utili per il trattamento e/o la prevenzione e/o la diagnosi del melanoma e del tumore al colon.
— I composti di formula (I) come sopra descritti possono anche essere utili come -sonde diagnostiche per i tumori le cui cellule iper-esprimono GM-3 ganglioside e/o GM-3 lattone.
Sorprendentemente infatti il composto esemplificato 5, quando somministrato a cavie del genere murino, ha data una evidente risposta anticorpale e gli anticorpi ottenuti sono risultati capaci di legarsi al GM3-ganglioside iperespresso su linee tumorali di melanoma e di tumore al colon.
Per determinare rimmunogenicita' deli’antigene artificiale 5, questo è stato somministrato a topi BALB/c. Seguendo la procedura di Milstein (Galfrè, G., Milstein, C., “Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures” in Methods Enzymol. , 73(Pt B), 3-46, (1981)) per la produzione di anticorpi monoclonali, dopo una serie di immunizzazioni le cellule della milza del topo immunizzato sono state raccolte e fuse con linee cellulari di mieloma murino (NSO) HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) sensibili. Gli ibridomi risultanti sono stati selezionati attraverso test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) dei sovranatanti per saggiarne il legame col GM3ganglioside 1. Il sovranatante che ha mostrato l’assorbanza piu’ elevata (!V1:4C5C4) e’ stato quindi scelto per le analisi successive. Test ELISA per la determinazione dell’isotipo sono stati eseguiti. Il supernatante IV1:4C5C4 e’ risultato esser composto da due isotipi: IgM and lgG3, con Γ IgM quantitativamente prevalente su Γ lgG3 (Figura 3).
L’immunoreattivita’ del sovranatante IV1:4C5C4 verso GM3- e/o GMrganglioside e’ stata saggiata attraverso test ELISA. I risultati (Figura 4) indicano chiaramente che il surnatante lega effettivamente il GM3mentre nessun apprezzabile legame e’ osservabile con il GM-i. Infine, e’ stata valutata la capacita’ del sovranatante IV1:4C5C4 di legare il GM3espresso sulla membrana delle cellule di melanoma. Esperimenti di immunocitochimica sono stati eseguiti su cellule di melanoma B16F1 trattate con il sovranatante IV1:4C5C4. Campioni di riferimento sono stati trattati con l’anticorpo commerciale anti-GM3(M2590) (controllo positivo) e con il sovranatante di un ibridoma che era risultato negativo al primo test ELISA (preso come controllo negativo). La positività’ della reazione e’ testimoniata dalla colorazione marrone localizzata a livello della membrana citoplasmatica. E’ evidente (Figura 5) che il sovranatante IV1:4C5C4 e’ capace di riconoscere il GM3e il GM3lattone sulle cellule di melanoma in modo migliore^rispetto all'anticorpo -anti-GM3M2590.
Nell’insieme, i dati qui riportati indicano che il glicoconiugato 5 e’ effettivamente immunogenico in vivo, essendo capace di evocare la formazione di anticorpi GM3-specifici. Tali anticorpi riconoscono l’antigene nativo sia in test ELISA che su cellule di melanoma.
Due importanti punti devono quindi essere considerati: i composti di formula (I) come sopra descritti, ed in particolare il KLH-glicoconiugato 5, superano il problema della scarsa immunogenicita’ tipica dei gangliosidi e fa venir meno l'immunotolleranza generalmente mantenuta dal GM3ganglioside covalentemente legato a carriere quali il KLH (Bitton, R.J., et al. Oncology Report 2002, 9, 267; Gabri, M.R.; et al. Clin. CancerRes. 2006, 12, 7092).
Questi risultati incoraggiano l’ulteriore clonazione deH’ibridoma IV1 :4C5C4 e purificazione del sovranatante IV1 :4C5C4 per ottenere un anticorpo monoclonale anti GM3e GM3lattone da essere usato in futuro per l’immunoterapia passiva dei tumori le cui cellule iper-esprimono GM-3 ganglioside e GM-3 lattone, come ad esempio il melanoma o il tumore al colon.
Ulteriore oggetto dell’invenzione sono anticorpi specifici per l’antigene artificiale di formula (I).
Per un aspetto quindi la presente invenzione riguarda ibridomi ottenibili da immunizzazione di cavie del genere murino mediante somministrazione di composti di formula (I).
Per un aspetto l’invenzione riguarda anticorpi chimerici o umanizzati che comprendano le sequenze variabili o ipervariabili degli anticorpi monoclonali ottenibili da immunizzazione di cavie del genere murino mediante somministrazione di composti di formula (I).
Suddetti anticorpi possono essere utili principi attivi in composizioni farmaceutiche per l’immunizzazione passiva in particolare per l'immunizzazione di forme tumorali le cui cellule iper-esprimono GM-3 ganglioside e GM-3 lattone, in particolare sono utili per il trattamento del melanoma e del tumore al colon.
Suddetti anticorpi possono essere utili inoltre come agenti diagnostici e/o _ prognostici delle suddette forme tumorali. - - - - - -Ai fini della presente invenzione per forme tumorali le cui cellule iper-esprimono GM-3 ganglioside e/o GM-3 lattone s’intendono quei tumori che analizzati mediante test antigene-anticorpo (anticorpo commerciale anti-GM3) e con test di immunocitochimica risultano positivi alla suddetta iper-espressione.
La presente invenzione potrà essere meglio compresa alla luce dei seguenti esempi realizzativi.
PARTE SPERIMENTALE
Sintesi del composto 20:
OAc -40° C OAc
A una miscela di 15 (16 mg, 0.025 mmol), Cp2HfCI2(17 mg, 0.045 mmol), AgOTf (25 mg, 0.097 mmol) e 6-azido-1-hexanol (7 mg, 0.05 mmol) viene aggiunto a -40°C CH2CI2anidro (3 mL). Dopo 40 min a -40°C la soluzione e’ neutralizzata con NEt3e filtrata su uno strato di Celite® e il filtrato lavato con una soluzione satura di NaHC03(1 x 5 mL) e brine (1 x 5 mL). La fase organica viene seccata su Na2S04e concentrata per dare 20 mg di prodotto grezzo che viene purificato per colonna cromatografica flash su gel di silice (EP/EtOAc 1/1) a dare 20 (15 mg, 80%), come solido vetroso.
<1>H NMR (400MHz, CDCI3): δ 5.37 (d, 1 H, J= 2.4 Hz), 5.32 (bs, 1 H), 5.26-5.21 (m, 1 H), 5.12-5.09 (m,1 H), 4.97 (s, 1 H), 4.50-4.46 (m, 1 H), 4.25-4.16 (m, 2H), 4.18-4.14 (parte X sist. AXY, 1H, J= 6.4 Hz, J= 11.6 Hz), 4.11-4.06 (parte Y sist. AXY, 1 H, J= 7.6 Hz, J = 11.6 Hz), 3.96 (ad, 1H, J = 10.0 Hz), 3.75-3.69 (m, 1 H), 3.53-3.47 (m 1 H), 3.24 (t, 2H, J= 7.2 Hz), 3.02-2.98 (parte A sist. AB, 1 H, J = 13.0 Hz, H), 2.97-2.94 (parte B sist. AB, 1 H, JBA= 13.0 Hz), 2.15 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.99-1.98 (m 2H), 1.95 (s, 3H), 1.62-1.56 (m, 4H), 1.43-1.36 (m, 4H).<13>C NMR (50MHz, CDCI3): δ 170.8, 170.2, 170.1 , 169.6, 169.5, 137.4, 109.0, 95.7, 93.0, 68.6, 68.0, 67.4, 67.3, 66.4, 64.4, 62.0, 61.7, 51.3, 33.8, 33.6, 29.3, 28.7, 26.4, 25.7, 20.7 (3C), 20.6. [α]η<23>+22.31 (c 1.09. CH,CI2). Anal. Elem. per C32H45N3Oi6S: Cale. C 50.59, H 5.97, N 5.53. Trovato: C 50.62, H 6.01, N 5.42; ESI-MS 782.2 [M+Na]<+>, 798.2 [M+K]<+>.
Sintesi del composto 17:
A una soluzione di 20 (120 mg, 0.158 mmol) in CH3OH (3.2 mL), viene aggiunto MeONa (2 mg, 0.032 mmol). La miscela e’ agitata a ta per 2.5 h e il pH portato a neutralità’ con HCI (10% in MeOH). Dopo evaporazione del solvente si ottiene un prodotto grezzo che viene purificato per colonna cromatografica su gel di silice (EtOAc/CH3OH 5:1) a dare 17 (72 mg, 90%) come solido vetroso.<1>H NMR (400MHz, CD3OD): δ 4.97 (s, 1 H), 4.17-4.12 (m, 1H), 4.09-4.06 (m, 1 H), 4.02 (dd, 1 H, J= 3.2 Hz, J= 1.2 Hz), 3.94 (dd, 1 H, J= 9.6 Hz, J= 1.2 Hz), 3.84-3.79 (parte A sist. ABX2, 1H, J = 10.0 Hz, J= 6.4 Hz), 3.77-3.62 (m, 6H), 3.52-3.47 (parte B sist. ABX2, 1H, J= 10.0 Hz, J= 6.4 Hz), 3.31-3.28 (m, 2H), 3.05-3.01 (parte A sist., 1 H, J= 13.0 Hz), 2.99-2.96 (parte B sist. AB, 1 H, J= 13.0 Hz), 1.94-1.92 (m, 2H), 1.64-1.57 (m, 4H), 1.46-1.41 (m, 4H).<13>C NMR (50MHz, CD3OD): δ 141.6, 106.4,
96.3, 92.3, 72.6, 70.9, 68.5, 67.8, 66.5, 66.3, 64.6, 62.8, 61.1, 51.1 , 36.3, 33.4,
29.2, 28.6, 26.3, 25.6. [a]D<23>+51.64 (c 0.25, CH3OH). ESI-MS 530.3 [M+Na]<+>.
Sintesi del composto 19:
A una soluzione di 17 (13.2 mg, 0.026 mmol) in una miscela di THF anidro (1 mL) e DMF anidro (0.1 mL), si aggiungono Ph3P (13.6 mg, 0.052 mmol) e H20 (2.3 pL, 0.13 mmol). La miscela di reazione viene scaldata a 40 °C e agitata per 18 h. Dopo evaporazione del solvente si ottiene 4 che viene utilizzato senza ulteriore purificazione per la seguente reazione:
A una soluzione di 4 in DMF anidro (1 mL), si aggiunge 18 (50 mg, 0.130 mmol) e la miscela di reazione agitata a ta per 6 h. Dopo evaporazione del solvente il prodotto grezzo viene purificato per colonna cromatografica flash su gel di silice (CH2CI2/CH3OH 2:1) per dare 19 (16.5 mg, 87%) come solido vetroso.
<1>H NMR (400MHz, CD3OD): δ 8.30-8.29 (parte AA’ sist. AA'MM’, 2H, J = 4.8 Hz), 7.38-7.37 (parte MM‘ sist. AA’MM’, 2H, J= 4.8 Hz), 4.96 (s, 1 H), 4.15 (adt, 1 H, J = 2.8 Hz, J= 8.8 Hz), 4.09-4.05 (m, 1 H), 4.03-4.02 (dd, 1 H, J= 2.8 Hz, J= 0.8 Hz), 3.94 (dd, 1 H, J = 9.6 Hz, J= 0.8 Hz), 3.82-3.77 (parte A sist. ABX2, 1 H, J= 10.0 Hz, J = 6.4 Hz), 3.76-3.61 (m, 6H), 3.51-3.45 (parte B sist. ABX2, 1 H, J= 10.0 Hz, J= 6.4 Hz), 3.184 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.03-3.00 (parte A sist. AB, 1H, J= 13.0 Hz), 2.98-2.95 (parte B sist. AB, 1 H, J= 13.0 Hz), 2.67 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 2.25 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 1.93-1.91 (m, 2H), 1.78-1.72 (m, 4H), 1 .62-1 .49 (m, 4H), 1 .44-1.33 (m, 4H).<13>C NMR (50MHz, CD3OD): δ 174.2, 171.1 , 155.7, 141.7, 124.7, 122.5,
106.4, 96.3, 92.3, 72.5, 70.8, 68.4, 67.8, 66.4, 66.2, 64.5, 62.7, 60.9, 38.9, 36.1 ,
35.2, 33.2, 33.1 , 29.2, 28.9, 26.3, 25.5, 24.8, 23.8. Anal. Elem. per C^H^OÌSS: Cale. C 52.59, H 6.34, N 3.83. Trovato: C 52.79, H 6.61 , N 5.51 ; ESI-MS 753.3 [M+Na]<+>.
Sintesi del composto 5:
A una soluzione di KLH (20 mg) in 20 mL di tampone (0.1 M sodio fosfato e 0.15 M sodio cloruro, pH 7.2) si aggiunge 19 (15 mg, 0.020 mmol) e la miscela agitata per la notte a ta. La soluzione viene liofilizzata e il solido dializzato a dare 18.5 mg di glicoconiugato 5. il rapporto tioetere-proteina viene stimato attraverso la determinazione dei residui di lisina liberi prima e dopo la coniugazione, per titolazione con acido trinitrobenzensolfonico.
Immunizzazione e Fusione
Due topi femmina, BALB/c, di 8 settimane, (Ce.S.A.L., Firenze) sono stati immunizzati quattro volte, due a settimana, con soluzioni di glicoconiugato antigene-KLH attraverso iniezioni intraperitoneali (topo A) e intravenose (topo B). Nella prima immunizzazione il glicoconiugato e’ stato iniettato come emulsione 1:1 (v/v) nell’adiuvante completo di Freund (topo A) fino a un volume finale di 0.2 mi e in soluzione 1:1 (v/v) di PBS sterile (topo B) fino a un volume totale di 0.2 mi. La -seconda e terza immunizzazione sono state esguite come sopra con la differenza che e’ stato usato un adiuvante incompleto di Freund (topo A). L’immunizzazione finale e’ stata fatta 3 giorni prima della fusione cellulare attraverso un’ iniezione intravenosa in entrambi i topi (topo A e B). Il giorno della fusione i topi sono stati sacrificati per dislocazione cervicale, le milze sono state estratte e collezionate e usate 1x10<8>cellule per ogni fusione. Le cellule della milza sono state fuse con linee cellulari di mieloma murino, NSO, HAT sensibili, attraverso il metodo PEG (polyethylene glycol) (Galfre et al. 1981). Le cellule NSO sono state coltivate in terreno DMEM con Fetalclone I 10% (HyClone) e divise 1:2 il giorno prima della fusion. 1x10<8>cellule NSO sono state mescolate in DMEM “serum-free” centrifugate e dopo rimozione del sovranatante, sono state poste in un bagno di acqua a 37°C; viene quindi aggiunto goccia a goccia 1 mi di PEG (Sigma-Aldrich) preriscaldato. Al termine dell’aggiunta del PEG e’ stato aggiunto del medium privo di siero, preriscaldato e il tubo e’ stato posto in centrifuga per rimuovere il sovranatatnte. Il prodotto della fusione e’ stato risospeso in DMEM contenente Fetalclone I 20% e 1x HAT e la sospensione di cellule risultante e' stata trasferita in cluster da 24 pozzetti. Le cellule sono state incubate a 37°C in un incubatore a C02.
Test ELISA.
Il sovranatante gli ibridoma e’ stato saggiato per il binding con il GM3ganglioside attraverso test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Il cluster a 96 pozzetti per ELISA (Corning) e<1>stato prima trattato con 100 pi di GM3(30 pg/ml in 100% etanolo) per una notte a temperatura ambiente. Per minimizzare l'assorbimento non specifico durante un’ora sono stati aggiunti 300 μΙ di PBS contenente 0,05% di Tween (TPBS) e 3% di BSA e poi fatti 3 lavaggi con TPBS. Al cluster di pozzetti vengono aggiunti i sovranatanti le colture di ibridomi (100 μΙ/well) e si incuba per due ore a temperature ambiente. Successivamente la piastra viene lavata e incubate per 1 h con un anticorpo secondario coniugato alla perossidasi (peroxidase-labeled anti-mouse, 1 :500 in TPBS) La piastra viene lavata tre volte con TPBS, poi a ogni pozzetto vengono aggiunti 100 μΙ di tetrametilbenzidina (TMB, Sigma). La piastra Vienne incubata per ulteriori 5 min e infine la reazione viene fermata con HCI 0,5M. L’assorbanza viene misurata un lettore ELISA (ELX800, Bio-Tek Instruments, Ine.) a 450 nm.
Immunocitochimica (ICC)
Per l’ICC sono state utilizzate cellule di melanoma B16F1. Le cellule di melanoma B16 sono state cresciute in DMEM addizionato di FCS 10% e L-glutamine 2 mM. Le cellule sono state adese su vetrini ricoperti di polisina e fissate con una soluzione di formalina. Dopo aver bloccato le perossidasi endogene, le cellule sono state trattate con proteinasi K (Roche; 5 g/ml in PBS) e una soluzione UltraVBIock (LabVision) e quindi incubate per la notte a 4°C con l’anticorpo primario (sovranatante ibridomi) e con l’anticorpo anti-GM3 (M2590), diluito 1:100 in PBS-UltraVBIock (10:1 v/v). L’immunostaining e’ stato realizzato usando un kit disponibile commercialmente (PicTure Plus kit; Zymed). Per il controllo negativo l’anticorpo primario e’ stato sostituito con il solo medium.

Claims (11)

  1. RIVENDICAZIONI 1 . Composti di formula (I)
    in cui X è O, NH, S. CH2; L è un linker ovvero uno spaziatore di-valente; A è un adiuvante o carrier ovvero una molecola o particella immunogena; ed in cui i legami fra linker e porzione carboidratica e fra linker e carrier sono di tipo covalente.
  2. 2. Composti di formula (I) secondo la rivendicazione 1 per l’uso come medicamenti.
  3. 3. Composti di formula (I) secondo la rivendicazione 1 per l’uso nel trattamento e/o prevenzione di tumori le cui cellule iper-esprimono GM-3 ganglioside e/o GM-3 lattone.
  4. 4. Composizioni farmaceutiche contenenti almeno un composto di formula (I) secondo la rivendicazione 1 ed almeno un altro ingrediente farmaceuticamente accettabile.
  5. 5. Processo per la sintesi di composti di formula (I) secondo la rivendicazione 1 , detto processo comprendente l’impiego di un composto di formula (II)
    in cui G è F, Br o CI; SR, SAr, tricloroacetimmide, fosfato in cui R è Et, o C1-C4 alchile; Ar è Ph, Ph sostituito, Piridina, chinolina o altri etera cicli aromatici; P indipendentemente fra loro sono opportuni gruppi protettori delle funzioni ossidriliche scelti fra quelli noti aH’uomo dell’arte come ad esempio e preferibilmente acetile, benzoile, silile o benzile.
  6. 6. Anticorpi specifici per i composti di formula (I) secondo la rivendicazione 1.
  7. 7. Anticorpi secondo le rivendicazione 6 ottenibili mediante immunizzazione di cavie del genere murino mediante somministrazione di composti di formula (I) secondo la rivendicazione 1.
  8. 8. Anticorpi secondo una qualunque delle rivendicazioni 6-7 per l’uso come medicamento.
  9. 9. Anticorpi secondo una qualunque delle rivendicazioni 6-7 per l’uso nel trattamento e/o prevenzione di tumori le cui cellule iper-esprimono GM-3 ganglioside e/o GM-3 lattone.
  10. 10. Anticorpi secondo una qualunque delle rivendicazioni 6-7 per l’uso diagnostico e/o prognostico di tumori le cui cellule iper-esprimono GM-3 ganglioside e/o GM-3 lattone).
  11. 11. Composizioni farmaceutiche contenenti almeno un anticorpo secondo una qualunque delle rivendicazioni 6-7 ed almeno un altro ingrediente farmaceuticamente accettabile.
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RISTORI S ET AL: "Structural study of liposomes loaded with a GM3 lactone analogue for the targeting of tumor epitopes", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. BIOMEMBRANES, AMSTERDAM, NL LNKD- DOI:10.1016/J.BBAMEM.2009.10.005, vol. 1788, no. 12, 23 October 2008 (2008-10-23), pages 2518 - 2525, XP026764786, ISSN: 0005-2736, [retrieved on 20091023] *
TOMA ET AL.: "Synthesis, Conformational studies, Binding assessment and Liposome Insertion of a Thioether-Bridged Mimetic of the Antigen GM3 Ganglioside Lactone", CHEMBIOCHEM, vol. 8, 24 September 2007 (2007-09-24) - 24 September 2007 (2007-09-24), pages 1646 - 1649, XP002579807 *

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