KR102663480B1 - 항-cd123 항체 및 이들의 접합체와 유도체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로, CD123 항원 (인터류킨 3 수용체의 α 사슬, 또는 IL-3Rα)에 결합하는 항체, 이들의 항원 결합 단편, 폴리펩티드 및 면역접합체에 관계한다. 본 발명은 또한, 질환, 예를 들면, B-세포 악성을 진단하고 치료하기 위해 이런 CD123-결합 분자를 이용하는 방법에 관계한다.

Description

항-CD123 항체 및 이들의 접합체와 유도체
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에, 2015년 6월 29일자 제출된 U.S. 가출원 번호 62/186,161, 2016년 5월 18일자 제출된 U.S. 가출원 번호 62/338,203, 그리고 2016년 6월 7일자 제출된 U.S. 가출원 번호 62/346,730에 우선권을 주장한다. 상기-참조된 출원의 전체 내용은 본원에 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로, CD123 항원 (인터류킨-3 수용체의 α 사슬, 또는 IL-3Rα)에 결합하는 항체, 이들의 항원 결합 단편, 폴리펩티드 및 면역접합체에 관계한다. 본 발명은 또한, 질환, 예를 들면, B-세포 악성을 진단하고 치료하기 위해 이런 CD123-결합 분자를 이용하는 방법에 관계한다.
발명의 배경
CD123 (인터류킨 3 수용체 알파, IL-3Rα)은 인터류킨 3 수용체 (IL-3R) 복합체의 일부인 40 kDa 분자이다. 사이토킨 인터류킨 3 (IL-3)은 다분화성 줄기 세포의 적혈구성, 골수성 및 림프성 선조체의 세포로의 초기 분화를 주동한다. CD123은 CD34+-수임된 선조체에서는 발현되지만, CD34+/CD38- 정상적인 조혈 줄기 세포 (HSCs)에 의해서는 발현되지 않는다. CD123은 호염기구, 비만 세포, 형질세포양 수지상 세포에 의해 발현되고, 단핵구, 대식세포 및 호산구에 의해 일부 발현되고, 그리고 호중구 및 거대핵세포에 의해 낮게 발현되거나 또는 발현되지 않는다. 일부 비-조혈 조직, 예를 들면, 태반, 고환의 라이디히 세포, 일정한 뇌 세포 요소 및 일부 내피 세포 역시 CD123을 발현한다. 하지만, 발현은 주로 세포질에서 일어난다.
CD123은 백혈병성 모세포 ("백혈병 모구") 및 백혈병 줄기 세포 (LSC)에 의해 발현되는 것으로 보고된다 (Jordan et al., Leukemia 14:1777-1784, 2000; Jin et al., Blood 113:6603-6610, 2009). 인간 정상적인 전구체 개체군에서, CD123은 조혈 선조체 세포 (HPC)의 부분집합에 의해 발현되지만, 정상적인 HSCs에 의해 발현되지 않는다. CD123은 또한, 보고된 바에 따르면 형질세포양 수지상 세포 (pDC) 및 호염기구에 의해 발현되고, 그리고 정도가 덜하긴 하지만, 단핵구 및 호산구에 의해 발현된다.
CD123은 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 골수형성이상 증후군 (MDS)을 비롯한 넓은 범위의 혈액암에서 악성 세포에서 과다발현되는 것으로 보고되었다 (Mu
Figure 112018009762973-pct00001
oz et al., Haematologica 86(12):1261-1269, 2001). CD123의 과다발현은 AML에서 더욱 불량한 예후와 연관된다 (Tettamanti et al., Br. J. Haematol. 161:389-401, 2013). AML 및 MDS는 백혈병성 줄기 세포 (LSCs)의 작은 개체군에서 발생하고 이들에 의해 영속화되는 것으로 생각되는데, 이들은 일반적으로 휴면 상태이고 (다시 말하면, 급속히 분열하는 세포가 아니고) 그리고 이런 이유로, 세포 사멸 (아폽토시스) 및 전통적인 화학요법 작용제에 저항한다. LSCs는 CD123의 과다발현에 의해 특징화되고, 반면 CD123은 정상적인 인간 골수 내에 상응하는 정상적인 조혈 줄기 세포 개체군에서 존재하지 않는다 (Jin et al., Blood 113:6603-6610, 2009; Jordan et al., Leukemia 14:1777-1784, 2000). CD123 발현은 또한, 복수의 다른 악성 / 전악성: 만성 골수성 백혈병 (CML) 선조체 세포 (모구 발증 CML 포함); 호지킨 리드 스턴버그 (RS) 세포; 형질전환된 비호지킨 림프종 (NHL); 일부 만성 림프성 백혈병 (CLL) (CD11c+); 급성 T 림프모구성 백혈병 (T-ALL)의 부분집합 (16%, 대부분 미성숙, 주로 성인), 형질세포양 수지상 세포 (pDC) (DC2) 악성 및 CD34+/CD38- 골수형성이상 증후군 (MDS) 골수 세포 악성과 연관된다.
AML은 골수 내에 형질전환된 골수성 선조체 세포의 증식 및 축적에 의해 특징화되는 클론 질환인데, 이것은 궁극적으로 조혈 실패를 야기한다. AML의 발생은 늙어감에 따라 증가하고, 그리고 더욱 나이든 환자는 전형적으로, 더욱 어린 환자보다 더욱 나쁜 치료 결과를 갖는다 (Robak et al., Clin. Ther. 2:2349-2370, 2009). 유감스럽게도, 현재는, AML을 앓는 대부분의 성인이 그들의 질환으로 사망한다.
AML에 대한 치료는 초기에, 관해의 유도 (유도 요법)에 집중한다. 일단 관해가 달성되면, 치료 초점이 이런 관해 (관해후 또는 강화 요법)의 확보 및 일부 경우에, 유지 요법으로 이동한다. AML에 대한 표준 관해 유도 패러다임은 안트라사이클린 / 시타라빈 조합으로 화학요법, 그 이후에 통상적으로, 집중 치료를 견디는 환자의 능력 및 화학요법 단독으로 구제의 가능성에 따라, 유도기 동안 이용된 바와 동일한 약물의 더욱 높은 용량으로 강화 화학요법, 또는 인간 줄기 세포 이식이다 (Roboz, Curr. Opin. Oncol. 24:711-719, 2012를 참조한다).
유도 요법에서 빈번하게 이용되는 작용제는 시타라빈 및 안트라사이클린을 포함한다. AraC로서 또한 알려져 있는 시타라빈은 DNA 합성을 간섭함으로써, 암 세포 및 다른 급속히 분열하는 정상적인 세포를 사멸시킨다. AraC 치료와 연관된 부작용은 감소된 백혈구 생산의 결과인 감염에 대한 감소된 저항성; 감소된 혈소판 생산의 결과로서 출혈; 그리고 적혈구에서 잠재적 감소로 인한 빈혈을 포함한다. 다른 부작용은 메스꺼움 및 구토를 포함한다. 안트라사이클린 (가령, 다우노루비신, 독소루비신 및 이다루비신)은 DNA 및 RNA 합성의 저해, DNA의 고차 구조의 붕괴, 그리고 세포 손상 유리 산소 라디칼의 생산을 비롯한 여러 작용 방식을 갖는다. 안트라사이클린의 가장 결정적인 부작용은 심장독성인데, 이것은 투여된 평생 용량을 상당히 제한하고 이들의 유용성을 얼마간 제한한다.
따라서, 유감스럽게도, 새로 진단된 AML의 치료에서 실제적인 진전에도 불구하고, 환자 중에서 20% 내지 40%는 표준 유도 화학요법으로 관해를 달성하지 못하고, 그리고 첫 번째 완전 관해에 들어가는 환자 중에서 50% 내지 70%는 3 년 이내에 재발할 것으로 예상된다. 재발의 시점에서, 또는 내성 질환을 앓는 환자에 대한 최적 전략은 불확실한 상태로 남아있다. 줄기 세포 이식은 첫 번째 또는 차후 관해에서 AML을 앓는 환자에서 항백혈병 요법의 가장 효과적인 형태로서 확립되었다 (Roboz, 2012).
항체-약물 접합체 (ADC) 및 다른 세포 결합 작용제-약물 접합체가 다양한 암을 교차하여 효력을 갖는 항암제의 유력한 부류로서 급부상하고 있다. 세포 결합 작용제-약물 접합체 (가령, ADCs)는 통상적으로, 3가지 상이한 요소로 구성된다: 세포 결합 작용제 (가령, 항체); 링커; 및 세포독성 모이어티. 전통적으로, 세포독성 약물 모이어티는 항체 상에서 리신 잔기에, 또는 사슬간 이황화 결합의 환원을 통해 획득된 시스테인 잔기에 공유 부착되고, 항체 분자 상에 상이한 위치에서 부착된 변하는 숫자의 약물을 보유하는 이질성 혼합물인 ADCs를 유발한다.
발명의 요약
본 발명은 본 발명의 접합체가 다양한 CD123-발현 암 세포, 특히 최소한 하나의 부정적인 예후 인자를 갖는 백혈병에 대항하여 고도로 강력하다는 놀라운 조사 결과에 근거된다.
본 발명의 한 가지 양상은 (a) 인간 CD123 / IL3-Rα 항원의 아미노산 101 내지 346 내에 에피토프에 결합하고, 그리고 (b) 항원-양성 TF-1 세포에서 IL3-의존성 증식을 저해하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD123 항원의 아미노산 101 내지 204 내에 에피토프에 결합한다. 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD123 항원의 아미노산 205 내지 346 내에 에피토프에 결합한다.
본 발명의 관련된 양상은 (a) 인간 CD123 항원의 아미노산 1 내지 100 내에 에피토프에 결합하고, 그리고 (b) 0.1 nM 또는 그 이하 (가령, 0.08 nM, 0.05 nM, 0.03 nM)의 IC50 값으로, 항원-양성 TF-1 세포에서 IL3-의존성 증식을 저해하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 백혈병성 줄기 세포 또는 백혈병성 모세포의 증식을 저해하지만 조혈 줄기 세포의 증식을 저해하지 않는다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.3 nM 또는 그 이하, 예를 들면, 0.01 nM 및 0.3 nM 사이에, 0.01 nM 및 0.2 nM 사이에, 0.01 nM 및 0.19 nM 사이에, 0.01 nM 및 0.18 nM 사이에, 0.01 nM 및 0.15 nM 사이에, 또는 0.01 nM 및 0.1 nM 사이에 해리 상수 (Kd)로 인간 CD123 항원-양성 세포에 결합한다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 시노몰구스 원숭이 CD123에 결합한다. 가령, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.05 및 0.3 nM 사이에, 0.05 및 0.2 nM 사이에, 0.05 nM 및 0.19 nM 사이에, 0.05 nM 및 0.18 nM 사이에, 0.05 nM 및 0.15 nM 사이에, 또는 0.05 및 0.1 nM 사이에 Kd로 시노몰구스 원숭이 CD123에 결합할 수 있다. 일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 실제적으로 유사한 결합 친화성으로 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD123 둘 모두에 결합한다. 가령, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.05 및 0.3 nM 사이에, 0.05 및 0.2 nM 사이에, 또는 0.05 및 0.1 nM 사이에 Kd로 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD123에 결합할 수 있다. Kd는 유세포분석법, 표면 플라스몬 공명, 또는 방사면역검정에 의해 계측될 수 있다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원-양성 TF-1 세포에서 0.5 nM 또는 그 이하의 농도에서 IL3-의존성 증식의 최소한 50%를 저해한다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 각각, 3개의 순차적 상보성 결정 영역 (CDR) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역 또는 이의 단편, 여기서 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고, CDR1은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 1, 5 및 12, CDR2는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 2, 3, 6-10, 13 및 14, 그리고 임의선택적으로, CDR3은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 4, 11, 15 및 70; 그리고 b) 각각, 3개의 순차적 상보성 결정 영역 (CDR) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편, 여기서 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고, CDR1은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 16, 19, 20, 23 및 72, CDR2는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 17, 21, 24 및 71, 그리고 임의선택적으로, CDR3은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 서열 번호: 18, 22 및 25.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 각각, 3개의 순차적 상보성 결정 영역 (CDR) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역 또는 이의 단편, 여기서 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고, CDR1은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 1, 5 및 12, CDR2는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 2, 3, 6-10, 13 및 14, 그리고 임의선택적으로, CDR3은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 4, 11 및 15; 그리고 b) 각각, 3개의 순차적 상보성 결정 영역 (CDR) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편, 여기서 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고, CDR1은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 16, 19, 20 및 23, CDR2는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 17, 21 및 24, 그리고 임의선택적으로, CDR3은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 서열 번호: 18, 22 및 25.
일정한 구체예에서, 보존성 아미노산 치환은 CDR 내에서 Arg에 의한 최소한 하나의 Lys의 치환을 포함한다.
일정한 구체예에서, 항체는 생쥐 CDR 영역을 포함하는 CDR-합체된 인간화 항체이고, 그리고 여기서 상기 항체의 하나 또는 그 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개)의 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 버니어 구역 잔기는 생쥐 기원한다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 39 또는 40에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 34에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 서열 번호: 34의 N 말단으로부터 두 번째 잔기, Xaa는 Phe이다. 다른 구체예에서, Xaa는 Val이다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) N 말단 잔기가 Ser이라는 점을 제외하고, 서열 번호: 39 또는 40에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 39 또는 40에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) N 말단 잔기가 Ser이라는 점을 제외하고, 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) N 말단 잔기가 Ser이라는 점을 제외하고, 그리고 서열 번호: 54의 마지막 잔기로부터 5번째에 상응하는 잔기가 Cys (다시 말하면, EU/OU 넘버링 위치 442에서 Cys)라는 점을 제외하고, 서열 번호: 59 또는 60에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 54의 마지막 잔기로부터 5번째에 상응하는 잔기가 Cys라는 점을 제외하고, 서열 번호: 59 또는 60에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) N 말단 잔기가 Ser이라는 점을 제외하고, 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 38에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 34에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 서열 번호: 37에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 56에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 54에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 37에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 서열 번호: 38, 34, 56 및 54의 N 말단으로부터 두 번째 잔기, Xaa는 Phe이다. 다른 구체예에서, Xaa는 Val이다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 54의 마지막 잔기로부터 5번째에 상응하는 잔기가 Cys라는 점을 제외하고, 서열 번호: 59 또는 60에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 54에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 서열 번호: 54 또는 56의 N 말단으로부터 두 번째 잔기, Xaa는 Phe이다. 다른 구체예에서, Xaa는 Val이다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 1에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 2 또는 3에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 4에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 그리고 b) 서열 번호: 16에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 17에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 18에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 5에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 6, 7, 8, 9 또는 10에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 11에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 그리고 b) 서열 번호: 19 또는 20에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 21에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 22에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 12에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 13 또는 14에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 15에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 그리고 b) 서열 번호: 23에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 24에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 25에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 및 40 (바람직하게는 26, 28, 30, 32, 34 및 38)으로 구성된 군에서 선택되는 참고 VH 서열과 최소한 95% 동일한 VH 서열; 및/또는 b) 서열 번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 41 (바람직하게는 27, 29, 31, 35 및 37)로 구성된 군에서 선택되는 참고 VL 서열과 최소한 95% 동일한 VL 서열. 일정한 구체예에서, VH 서열은 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 및 40 (바람직하게는 26, 28, 30, 32, 34 및 38) 중에서 한 가지와 최소한 99% 동일하고 및/또는 여기서 VL 서열은 서열 번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 41 (바람직하게는 27, 29, 31, 35 및 37) 중에서 한 가지와 최소한 99% 동일하다. 일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함할 수 있다: a) 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 및 40 (바람직하게는 26, 28, 30, 32, 34 및 38)으로 구성된 군에서 선택되는 VH 서열; 및/또는 b) 서열 번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 41 (바람직하게는 27, 29, 31, 35 및 37)로 구성된 군에서 선택되는 VL 서열. 일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 26의 VH 서열 및 서열 번호: 27의 VL 서열, 또는 서열 번호: 28의 VH 서열 및 서열 번호: 29의 VL 서열, 또는 서열 번호: 30의 VH 서열 및 서열 번호: 31의 VL 서열, 또는 서열 번호: 34의 VH 서열 및 서열 번호: 35의 VL 서열을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 항체는 뮤린, 비인간 포유동물, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체이다. 가령, 인간화 항체는 CDR-합체된 항체 또는 표면치환된 항체일 수 있다. 일정한 구체예에서, 항체는 전장 항체이다. 일정한 구체예에서, 이의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fv 또는 scFv, 이황화 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgG△CH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc이다.
본 발명의 다른 양상은 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중에서 한 가지의 VH 및 VL 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 폴리펩티드는 슈도모나스 독소가 아닌 단백질과의 융합일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 본 발명의 세포를 배양하고; 그리고, (b) 배양된 세포로부터 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함한다. 일정한 구체예에서, 세포는 진핵 세포이다.
본 발명의 다른 양상은 다음의 화학식을 갖는 면역접합체를 제공하고:
,
여기서:
CBA는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드이고, 리신 잔기를 통해 CyL1에 공유 연결되고;
WL은 1 내지 20의 정수이고; 그리고
CyL1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:,
,
,
, 또는
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이고;
W'는 -NRe'이고,
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Rx3은 (C1-C6)알킬이고;
L'은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)- (B1'); 또는
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1- (B3');
R5는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
Ra 및 Rb는 각 경우에, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화가능 기 Q이고;
m은 1 내지 6의 정수이고; 그리고
Zs1은 다음의 화학식 중에서 한 가지에서 선택되고:
(b1); (b2); (b3);
(b4); (b5),
(b6),
(b7); (b8); (b9); 및
(b10),
여기서:
q는 1 내지 5의 정수이고; 그리고
M은 H+ 또는 양이온이다.
일정한 구체예에서, Ra 및 Rb는 둘 모두 H이고; 그리고 R5는 H 또는 Me이다.
일정한 구체예에서, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이다. 가령, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala에서 선택될 수 있다. 일정한 구체예에서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala이다.
일정한 구체예에서, Q는 -SO3M이다.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
; 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 WL은 1 내지 10의 정수이고; N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다.
관련된 양상은 다음 화학식을 갖는 면역접합체를 제공하고:
,
여기서:
CBA는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드이고, 리신 잔기를 통해 CyL2에 공유 연결되고;
WL은 1 내지 20의 정수이고; 그리고
CyL2는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
; 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이고;
Rx1 및 Rx2는 독립적으로 (C1-C6)알킬이고;
Re는 -H 또는 (C1-C6)알킬이고;
W'는 -NRe'이고,
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Zs1은 다음의 화학식 중에서 한 가지에서 선택되고:
(b1); (b2); (b3);
(b4); (b5),
(b6),
(b7); (b8); (b9); 및
(b10),
여기서:
q는 1 내지 5의 정수이고; 그리고
M은 -H+ 또는 양이온이다.
일정한 구체예에서, Re는 H 또는 Me이고; Rx1 및 Rx2는 독립적으로 -(CH2)p-(CRfRg)-이고, 여기서 Rf 및 Rg는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 p는 0, 1, 2 또는 3이다.
일정한 구체예에서, Rf 및 Rg는 동일하거나 상이하고, 그리고 -H 및 -Me에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
; 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 WL은 1 내지 10의 정수이고; N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다.
일정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 이중 결합을 나타내고, X는 부재하고 Y는 -H이다. 일정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합을 나타내고, X는 -H이고 Y는 -SO3M이다. 일정한 구체예에서, M은 H+, Na+ 또는 K+이다.
본 발명의 다른 관련된 양상은 다음 화학식을 갖는 면역접합체를 제공하고:
,
여기서:
CBA는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 폴리펩티드이고, Lys 잔기를 통해 CyL3에 공유 연결되고;
WL은 1 내지 20의 정수이고;
CyL3은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
,
m'은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고; 그리고
Zs1은 다음의 화학식 중에서 한 가지에서 선택되고:
(b1); (b2); (b3);
(b4); (b5),
(b6),
(b7); (b8); 및 (b9),
여기서:
q는 1 내지 5의 정수이고; 그리고
M은 H+ 또는 양이온이다.
일정한 구체예에서, m'은 1이고, 그리고 R1 및 R2는 둘 모두 H이다. 일정한 다른 구체예에서, m'은 2이고, 그리고 R1 및 R2는 둘 모두 Me이다.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
; 또는
, 또는
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 WL은 1 내지 10의 정수이다.
일정한 구체예에서, M은 H+, Na+ 또는 K+이다.
본 발명의 다른 양상은 다음의 화학식을 갖는 면역접합체를 제공하고:
;
여기서:
CBA는 JCB' 기에 공유 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드이고;
WS는 1, 2, 3, 또는 4이고;
JCB'는 본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드의 N 말단 상에서 2-히드록시에틸아민 모이어티 (여기서 2-히드록시에틸아민 모이어티는 세린, 트레오닌, 히드록실리신, 4-히드록시오르니틴 또는 2,4-디아미노-5-히드록시 발레르산 잔기의 부분일 수 있다)의 산화로부터 유래된 알데히드 기 및 Cys1 상에서 알데히드 반응성 기를 반응시킴으로써 형성된 모이어티이고, 그리고 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; ; 또는 ,
여기서 s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고; 그리고 s2는 Cys1에 공유 연결된 부위이고;
Cys1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
,
,
, 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이고, M은 H+ 또는 양이온이고;
R5는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
Zd1은 부재하거나, -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
R9는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
Ra 및 Rb는 각 경우에, 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화가능 기 Q이고;
r 및 r'는 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;
W'는 -NRe'이고,
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Rx3은 (C1-C6)알킬이고;
L은 -NR9-(CRaRb)r"이거나 또는 부재하고; 그리고
r"은 0 내지 6의 정수이다.
단순함을 위해, 아래에서 Ser을 N 말단 잔기로서 다시 인용하는 각 경우에, 세린, 트레오닌, 히드록실리신, 4-히드록시오르니틴 또는 2,4-디아미노-5-히드록시 발레르산 잔기의 일부로서 다른 2-히드록시에틸아민 모이어티가 특히, Thr에 대하여 적용가능한 경우에 예기되는 것으로 이해되어야 한다.
일정한 구체예에서, Ra 및 Rb는 둘 모두 H이고, 그리고 R5 및 R9는 둘 모두 H 또는 Me이다.
일정한 구체예에서, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이다. 가령, P는 다음과 같이 구성된 군에서 선택될 수 있다: Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala. 일정한 구체예에서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala이다. 일정한 구체예에서, Q는 -SO3M이다.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
; 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고, 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다.
본 발명의 다른 양상은 다음의 화학식을 갖는 면역접합체를 제공하고:
;
여기서:
CBA는 JCB' 기에 공유 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드이고,
JCB'는 본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드의 N 말단 상에서 2-히드록시에틸아민 모이어티의 산화로부터 유래된 알데히드 기 및 Cys2 상에서 알데히드 반응성 기를 반응시킴으로써 형성된 모이어티이고, 그리고 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; ; 또는 ,
여기서 s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고; 그리고 s2는 Cys2에 공유 연결된 부위이고;
Cys2는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
; 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이고;
M은 H+ 또는 양이온이고;
Rx1은 (C1-C6)알킬이고;
Re는 -H 또는 (C1-C6)알킬이고;
W'는 -NRe'이고,
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Rx2는 (C1-C6)알킬이고;
L1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
여기서:
s3은 기 JCB'에 공유 연결된 부위이고;
s4는 Cys2 상에 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
Za2는 부재하거나, -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
R9는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
Q는 H, 하전된 치환체 또는 이온화가능 기이고;
Ra1, Ra2, Ra3, Ra4는 각 경우에, 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고; 그리고
q1 및 r1은 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고, 단서로서 q1 및 r1은 둘 모두 0은 아니다.
일정한 구체예에서, -L1-은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; 또는
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 R은 H 또는 -SO3M이다.
일정한 구체예에서, Re은 H 또는 Me이고; 그리고 Rx1은 -(CH2)p-(CRfRg)-이고, 그리고 Rx2는 -(CH2)p-(CRfRg)-이고, 여기서 Rf 및 Rg는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 p는 0, 1, 2 또는 3이다. 일정한 구체예에서, Rf 및 Rg는 동일하거나 상이하고, 그리고 -H 및 -Me에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
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; 또는
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또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다.
일정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 이중 결합을 나타내고, X는 부재하고, Y는 -H이다.
일정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합을 나타내고, X는 -H이고, Y는 -SO3M이다. 일정한 구체예에서, M은 H+, Na+ 또는 K+이다.
본 발명의 다른 양상은 다음의 화학식을 갖는 면역접합체를 제공하고:
;
여기서:
CBA는 JCB' 기에 공유 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드이고;
JCB'는 본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드의 N 말단 상에서 2-히드록시에틸아민 모이어티의 산화로부터 유래된 알데히드 기 및 Cys3 상에서 알데히드 반응성 기를 반응시킴으로써 형성된 모이어티이고, 그리고 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; ; 또는 ,
여기서 s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고; 그리고 s2는 Cys3에 공유 연결된 부위이고;
Cys3은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
여기서:
m'은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고;
L1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
여기서:
s3은 기 JCB'에 공유 연결된 부위이고;
s4는 Cys3 상에 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
Za2는 부재하거나, -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
R9는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
Q는 H, 하전된 치환체 또는 이온화가능 기이고;
Ra1, Ra2, Ra3, Ra4는 각 경우에, 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고; 그리고
q1 및 r1은 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고, 단서로서 q1 및 r1은 둘 모두 0은 아니다.
일정한 구체예에서, m'은 1이고, 그리고 R1 및 R2는 둘 모두 H이다. 일정한 구체예에서, m'은 2이고, 그리고 R1 및 R2는 둘 모두 Me이다.
일정한 구체예에서, -L1-은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; 또는
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 R은 H 또는 -SO3M이고, 그리고 M은 H+ 또는 양이온이다.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
;`
;
;
;
;
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염; 여기서 DM은 다음의 화학식에 의해 대표된다:
.
본 발명의 다른 양상은 다음의 화학식을 갖는 면역접합체를 제공하고:
,
여기서:
CBA는 JCB' 기에 공유 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드이고,
JCB'는 본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드의 N 말단 상에서 2-히드록시에틸아민 모이어티의 산화로부터 유래된 알데히드 기 및 Cys4 상에서 알데히드 반응성 기를 반응시킴으로써 형성된 모이어티이고, 그리고 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; ; 또는 ,
여기서 s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고; 그리고 s2는 Cys4에 공유 연결된 부위이고;
Cys4는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
,
L1'은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; 또는
,
여기서:
s3은 JCB' 기에 공유 연결된 부위이고;
s4는 Cys4 상에 -NMe- 기에 공유 연결된 부위이고;
Zb1 및 Zb2는 둘 모두 부재하거나, 또는 Zb1 및 Zb2 중에서 하나는 부재하고 다른 하나는 -CH2-O- 또는 -O-CH2-이고;
Zb1' 및 Zb2'는 각각 독립적으로 부재하거나, -CH2-O-, -O-CH2-, -NR9-C(=O)-CH2-, 또는 -CH2-C(=O)-NR9-이고;
R9는 H 또는 (C1-C3)알킬이고;
n1 및 m1은 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;
E1 및 E2 중에서 하나는 -C(=O)-이고 다른 하나는 -NR9-이거나; 또는 E1 및 E2 중에서 하나는 -C(=O)- 또는 -NR9-이고 다른 하나는 부재하고;
P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고; 그리고
Rb1, Rb2, Rb3, Rb4, Rb5 및 Rb6은 각 경우에, 각각 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이다.
일정한 구체예에서, Rb1, Rb2, Rb3, Rb4, Rb5 및 Rb6은 모두 H이다. 일정한 구체예에서, R9는 H이다.
일정한 구체예에서, Zb1' 및 Zb2'는 둘 모두 부재하거나; 또는 Zb1'은 -CH2-O-이고; 그리고 Zb2'는 부재하거나; 또는 Zb1'은 -CH2-C(=O)-NR9-이고; 그리고 Zb2'는 -OCH2-이거나 또는 부재한다.
일정한 구체예에서, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이다. 가령, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala에서 선택될 수 있다. 일정한 구체예에서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 그리고 D-Ala-D-Ala이다.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
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또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 DM은 다음의 구조식에 의해 대표된다:
.
본 발명의 다른 양상은 다음의 화학식에 의해 대표되는 면역접합체를 제공하고:
,
여기서:
CBA는 시스테인 잔기를 통해 CyC1에 공유 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드이고;
WC는 1 또는 2이고;
CyC1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
; 또는
,
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이고, M은 H+ 또는 양이온이고;
R5는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
Ra 및 Rb는 각 경우에, 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화가능 기 Q이고;
W'는 -NRe'이고,
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Rx3은 (C1-C6)알킬이고; 그리고
LC는 에 의해 대표되고, s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고, 그리고 s2는 CyC1 상에서 -C(=O)- 기에 공유 연결된 부위이고; 여기서:
R19 및 R20은 각 경우에, 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
m"은 1 및 10 사이에 정수이고; 그리고
Rh는 -H 또는 (C1-C3)알킬이다.
일정한 구체예에서, Ra 및 Rb는 둘 모두 H이고; 그리고 R5는 H 또는 Me이다.
일정한 구체예에서, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이다. 가령, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala에서 선택될 수 있다. 일정한 구체예에서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala이다. 일정한 구체예에서, Q는 -SO3M이다.
일정한 구체예에서, R19 및 R20은 둘 모두 H이고; 그리고 m"은 1 내지 6의 정수이다.
일정한 구체예에서, -LC-는 다음의 화학식에 의해 대표된다:
.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
; 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고, 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다.
본 발명의 다른 양상은 다음의 화학식에 의해 대표된 면역접합체를 제공하고:
,
여기서:
CBA는 시스테인 잔기를 통해 CyC2에 공유 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드이고;
WC는 1 또는 2이고;
CyC2는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
,
,
, 또는
,
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이고, M은 H+ 또는 양이온이고;
Rx1은 (C1-C6)알킬이고;
Re는 -H 또는 (C1-C6)알킬이고;
W'는 -NRe'이고;
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Rx2는 (C1-C6)알킬이고;
LC'는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
여기서:
s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고, 그리고 s2는 CyC2 상에 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
Z는 -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
Q는 -H, 하전된 치환체 또는 이온화가능 기이고;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 및 R22는 각 경우에, 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
q 및 r은 각 경우에, 독립적으로 0 및 10 사이에 정수이고;
m 및 n은 각각 독립적으로 0 및 10 사이에 정수이고;
Rh는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고; 그리고
P'는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이다.
일정한 구체예에서, P'는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이다. 가령, P'는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala에서 선택될 수 있다. 일정한 구체예에서, P'는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala이다.
일정한 구체예에서, 면역접합체에서 -LC'-는 다음의 화학식에 의해 대표된다:
;
; 또는
.
일정한 구체예에서, Re은 H 또는 Me이고; Rx1은 -(CH2)p-(CRfRg)-이고, 그리고 Rx2는 -(CH2)p-(CRfRg)-이고, 여기서 Rf 및 Rg는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 p는 0, 1, 2 또는 3이다. 일정한 구체예에서, Rf 및 Rg는 동일하거나 상이하고, 그리고 -H 및 -Me에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
;
;
;
;
; 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고, 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다.
일정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 이중 결합을 나타내고, X는 부재하고, Y는 -H이다.
일정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합을 나타내고, X는 -H이고, Y는 -SO3M이다. 일정한 구체예에서, M은 H+, Na+ 또는 K+이다.
본 발명의 다른 양상은 다음의 화학식을 갖는 면역접합체를 제공하고:
,
여기서:
CBA는 시스테인 잔기를 통해 CyC3에 공유 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 이들의 폴리펩티드이고;
WC는 1 또는 2이고;
CyC3은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
여기서:
m'은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
LC'는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
여기서:
s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고; 그리고 s2는 CyC3 상에 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
Z는 -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
Q는 H, 하전된 치환체, 또는 이온화가능 기이고;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 및 R22는 각 경우에, 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
q 및 r은 각 경우에, 독립적으로 0 및 10 사이에 정수이고;
m 및 n은 각각 독립적으로 0 및 10 사이에 정수이고;
Rh는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고; 그리고
P'는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이다.
일정한 구체예에서, P'는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이다. 가령, P'는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala에서 선택된다. 일정한 구체예에서, P'는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala이다.
일정한 구체예에서, -LC'-는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
; 또는
,
여기서 M은 H+ 또는 양이온이다.
일정한 구체예에서, m'은 1이고, 그리고 R1 및 R2는 둘 모두 H이다. 일정한 구체예에서, m'은 2이고, 그리고 R1 및 R2는 둘 모두 Me이다.
일정한 구체예에서, 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
; 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 DM은 다음의 화학식에 의해 대표되는 약물 모이어티이다:
.
본 발명의 다른 양상은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 면역접합체, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 CD123을 발현하는 세포의 성장을 저해하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 면역접합체, 또는 본 발명의 제약학적 조성물을 상기 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
일정한 구체예에서, 세포는 종양 세포이다. 일정한 구체예에서, 세포는 백혈병 세포 또는 림프종 세포이다.
본 발명의 다른 양상은 암을 앓는 개체를 치료하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 암의 세포는 CD123을 발현하고, 상기 방법은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 면역접합체, 또는 본 발명의 제약학적 조성물의 치료 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다.
일정한 구체예에서, 암 또는 세포-증식성 장애는 백혈병 또는 림프종이다. 일정한 구체예에서, 암 또는 세포-증식성 장애는 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 급성 골수성 백혈병 (AML); 만성 골수성 백혈병 (CML); B-세포 계통 급성 림프모구성 백혈병 (B-ALL)을 비롯한 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 만성 림프성 백혈병 (CLL); 모양 세포성 백혈병 (HCL); 골수형성이상 증후군; 기본 형질세포양 DC 신생물 (BPDCN) 백혈병; 외투 세포 림프종을 비롯한 비호지킨 림프종 (NHL); 그리고 호지킨 백혈병 (HL). 일정한 구체예에서, 암은 급성 골수성 백혈병 (AML)이다. 일정한 구체예에서, 암은 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (B-ALL)이다.
본 발명의 다른 양상은 개체에서 세포-증식성 장애를 치료하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 세포-증식성 장애의 세포는 CD123을 발현하고, 상기 방법은 상기 세포-증식성 장애를 치료하는데 충분한 양으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 면역접합체, 또는 본 발명의 제약학적 조성물의 치료 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 단지 한 양상에서만 설명된 것들 (다른 양상에서는 설명되지 않거나 또는 다른 양상에서는 반복되지 않는 것들), 그리고 단지 실시예에서만 설명된 것들을 비롯하여, 본원에서 설명된 임의의 한 가지 구체예는 명시적으로 부인되거나 또는 적용할 수 없는 경우가 아니라면, 본 발명의 임의의 한 가지 또는 그 이상의 다른 구체예와 합동될 수 있는 것으로 예기된다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 키메라 CD123-6 항체 (chCD123-6) 및 이의 CDR-합체된 huCD123-6 항체 (huCD123-6Gv4.6 및 huCD123-6Gv4.7)에 의한 TF-1 세포의 IL-3-의존성 증식의 저해를 보여준다.
도면 2a 및 2b는 3가지 뮤린 항-CD123 항체 (muCD123-3, -6 및 -14)가 최소한 TF-1 세포뿐만 아니라 7G3의 IL-3 의존성 증식을 저해한다는 것을 보여준다. 도면 2a는 CD123-결합 대조 항체 7G3, 6H6 및 9F5를 비롯한 다양한 항-CD123 항체에 의한, IL-3 (1 ng/mL)의 존재에서 배양된 TF-1 세포의 저해를 보여준다. 도면 2b는 동일한 항-CD123 항체에 의한, GM-CSF (2 ng/mL)의 존재에서 배양된 TF-1 세포의 저해를 보여준다.
도면 3은 뮤린 항-CD123 항체 muCD123-3, -6 및 -14가 TF-1 세포의 IL-3 (1 ng/mL) 의존성 증식을 용량 의존성 방식으로, 그리고 7G3 항체보다 더욱 높은 정도로 저해한다는 것을 보여준다. muCD123-16은 CD123에 결합하지만, TF-1 세포의 IL-3-의존성 증식을 저해하지 않는 음성 대조 항-CD123 항체이다.
도면 4a 및 4b는 뮤린 muCD123-3, -6 및 -14 항체가 CD123-발현 TF-1 (도면 4a) 및 HNT-34 (도면 4b) 세포에서 7G3 항체의 결합 친화성보다 CD123-양성 AML 세포에 대한 더욱 높은 결합 친화성을 갖는다는 것을 보여준다.
도면 5a 및 5b는 키메라 항-CD-123 항체 chCD123-3, -6 및 -14가 HNT-34 세포 (도면 5a) 또는 CD123-양성 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포주 MOLM-13 (도면 5b)을 이용하여, 그들의 뮤린 대응물의 높은 결합 친화성을 유지한다는 것을 보여준다. CD123에 결합하지 않는 키메라 항체 chKTI는 음성 대조로서 포함되었다.
도면 6은 키메라 chCD123-3, -6 및 -14 항-CD-123 항체가 TF-1 세포의 IL-3 의존성 증식을 저해하는 그들의 능력에 의해 증거된 바와 같이, 그들의 뮤린 대응물의 기능적 활성을 유지한다는 것을 보여준다. CD123에 결합하지만, TF-1 세포의 IL-3-의존성 증식을 저해하지 않는 비기능적 키메라 항-CD123 항체 (chCD123-18)는 음성 대조로서 포함되었다.
도면 7a는 뮤린 (muCD123-6), 키메라 (chCD123-6), 그리고 CDR-합체된 huCD123-6 항체 (huCD123-6Gv4.7S2 및 huCD123-6Gv4.7S3) 모두 CD123-발현 HNT-34 세포에 대해 7G3보다 높은 친화성을 갖는다는 것을 보여준다. CD123에 결합하지 않는 키메라 항체 chKTI는 음성 대조로서 포함되었다. 도면 7b 및 7c는 Lys-, Ser-, 또는 Cys-연쇄를 통한 D1 또는 D2 화합물에 huCD123-6Gv4.7S3 또는 -Gv4.7 항체의 접합이 이들 ADC 접합체, 다시 말하면, Ser-연결된 huCD123-6Gv4.7S3-SeriMab-sD1 (도면 17에서 구조를 참조한다) 및 huCD123-6Gv4.7S3-SeriMab-D8, 그리고 도면 7b에서 Lys-연결된 huCD123-6Gv4.7S3-sSPDB-D1 및 huCD123-6Gv4.7S3-D2; 그리고 도면 7c에서 Cys-연결된 huCD123-6Gv4.7-CysMab-D4 및 huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5의 결합 친화성에 단지 중간 정도로만 영향을 주었다는 것을 보여준다. 도면 7c에서, 접합되지 않은 huCD123-6Gv4.7 항체는 서열 번호: 54의 중쇄 서열을 갖는데, 여기서 Xaa는 Val이다. "S3-SeriMab"를 갖는 접합체는 경쇄 상에서 산화된 N 말단 Ser을 통한 세포독소 (이 경우에 있어서, 인돌리노벤조디아제핀 또는 이하 "IGN" 화합물) 연쇄를 갖는다. "CysMab"를 갖는 접합체는 중쇄에서 가공된 Cys (즉, 서열 번호: 54에서 마지막 Cys로부터 5번째에 상응하는 Cys)를 통한 세포독소 (이 경우에 있어서, IGN 화합물) 연쇄를 갖는다.
도면 8a는 키메라 (chCD123-6) 및 CDR-합체된 (huCD123-6Gv4.7S2 및 huCD123-6Gv4.7S3) huCD123-6 항체가 7G3 항체보다 우수하게 TF-1 세포의 IL-3 의존성 증식을 저해한다는 것을 보여준다. 저해는 IL-3 의존성인데, 그 이유는 이들 항체가 이들 세포가 GM-CSF의 존재에서 성장될 때 저해 효과가 없었기 때문이다 (도면 8b).
도면 9a는 IL-3Rα (회색) 및 GMRα 도메인 (백색)을 포함하는 IL-3Rα (CD123) 세포외 도메인 및 키메라 수용체 단백질의 발현 구조체를 보여준다. 도면 9b는 CD123-6 항체가 IL-3Rα의 CRM 도메인 (잔기 101-306)에 일차적으로 결합한다는 것을 보여준다. 도면 9c는 CD123-3 항체가 IL-3Rα의 CRM 도메인 (잔기 101-306)에 일차적으로 결합한다는 것을 보여준다. 도면 9d는 CD123-14 항체가 IL-3Rα의 N 말단 도메인 (잔기 1-100)에 배타적으로 결합한다는 것을 보여준다. 도면 9e는 7G3 항체가 IL-3Rα의 N 말단 도메인 (잔기 1-100)에 배타적으로 결합한다는 것을 보여준다. 도면 9f는 6H6 항체가 IL-3Rα의 N 말단 도메인 (잔기 1-100)에 배타적으로 결합한다는 것을 보여준다. 도면 9g는 9F5 항체가 IL-3Rα의 N 말단 도메인 (잔기 1-100)에 배타적으로 결합한다는 것을 보여준다.
도면 10은 표면치환된 huCD123-6Rv1.1 항체, huCD123-6Rv1.1-CX1-1-DM1의 메이탄시노이드 DM1 접합체가 성장 인자-독립된 CD123-발현 AML 세포주 OCI-AML4에 대한 용량 의존성 세포독성을 전시한다는 것을 증명한다. 세포독성은 세포독성을 차단하는 과잉 접합되지 않은 huCD123-6 항체 (500 nM)의 능력에 의해 증거된 바와 같이, CD123-의존성이다.
도면 11a는 상이한 기원의 복수 CD123-양성 악성 세포주에 대한 다양한 표면치환된 리신-연결된 huCD123-6Rv1.1-IGN 접합체의 시험관내 세포독성을 보여준다.
도면 11b는 복수 CD123-양성 B-ALL 세포주에 대한 다양한 리신- 또는 시스테인-연결된 huCD123-6-IGN 접합체의 시험관내 세포독성을 보여준다. 비결합 KTI 항체 기초된 접합체는 음성 대조로서 포함된다.
도면 11c는 다양한 Lys- 또는 Cys-연결된 IGN 화합물이 P-gp (P-당단백질) 양성 AML 세포주 Kasumi-3 및 MOLM-1에서 고도로 활성이라는 것을 보여준다. 열린 데이터 포인트를 갖는 대조 곡선은 과잉의 접합되지 않은 정합 huCD123 항체의 존재에서 생산된다.
도면 11d는 본 발명의 다양한 Lys- 또는 Cys-연결된 CD123-IGN 접합체 중에서 거의 모두가 nM 또는 하위-nM 농도에서 9개 AML 환자 표본으로부터 AML 선조체 세포의 90%를 사멸시킨다는 것을 보여준다.
도면 11e는 Cys-연결된 huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 접합체가 AML 선조체를 사멸시키는데 필요한 것들보다 >100-배 높은 농도에서 정상적인 혈액 세포를 사멸시킨다는 것을 보여준다. 대조적으로, 밀로타르그는 이런 우선적 사멸 효과를 전시하지 않는다.
도면 12a 및 12b는 AML 환자로부터 일차 세포에 대한 다양한 리신-연결된 huCD123-6Rv1.1-IGN 접합체의 시험관내 세포독성을 보여준다. 하나의 일차 환자 표본에 대한 전형적인 CFU 검정으로부터 결과는 도면 12a에서 제공된다. 도면 12b는 접합체로 처리된 모든 AML 환자 표본에 대한 IC90 값을 보여준다.
도면 13a-13c는 huCD123-6의 CysMab의 IGN 접합체 (huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5, 채워진 흑색 원)가 AML 세포주 EOL-1 (도면 13a), B-ALL 세포주 KOPN-8 (도면 13b) 및 CML 세포주 MOLM-1 (도면 13c)에 대하여 최소한, 동일한 항체의 리신-연결된 접합체 (huCD123-6Gv4.6-D2, 채워진 흑색 사각형)만큼 활성적이라는 것을 보여준다. 각 도면에서 열린 데이터 포인트를 연결하는 점선 곡선은 차단 농도 (500 nM)의 접합되지 않은 chCD123-6 항체의 존재에서 개별 접합체의 활성 (다시 말하면, huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5의 경우 열린 원 및 huCD123-6Gv4.6-D2의 경우 열린 사각형)을 나타낸다.
도면 14a-14c는 huCD123-6의 SeriMab (huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8, 채워진 흑색 원)가 AML 세포주 SHI-1 (도면 14a) 및 HNT-34 (도면 14b)에서 뿐만 아니라 CML 세포주 MOLM-1 (도면 14c)에서 최소한, 동일한 항체의 리신-연결된 접합체 (huCD123-6Rv1.1-D2, 채워진 하향 흑색 삼각형)만큼 활성적이라는 것을 보여준다. 각 도면에서 열린 데이터 포인트를 연결하는 점선 곡선은 차단 농도 (500 nM)의 접합되지 않은 huCD123-6 항체의 존재에서 개별 접합체의 활성 (다시 말하면, huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8의 경우 열린 원 및 huCD123-6Rv1.1-D2의 경우 열린 하향 삼각형)을 나타낸다.
도면 15는 본 발명의 Ser-연쇄 접합체를 합성하는데 이용될 수 있는 전반적인 단계를 보여주는 계통도 도면을 보여준다.
도면 16은 본 발명의 Ser-연쇄 접합체를 합성하는데 이용될 수 있는 전반적인 단계를 보여주는 계통도 도면을 보여준다.
도면 17은 본 발명의 Ser-연쇄 접합체를 합성하는데 이용될 수 있는 전반적인 단계를 보여주는 계통도 도면을 보여준다.
도면 18은 Cys-연결된 huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 접합체가 비선택된 AML 환자 표본에서 겜투주맙 오조가미신 (GO) (밀로타르그로서 또한 알려져 있음)보다 더욱 높은 활성을 갖는다는 것을 보여준다.
도면 19는 Cys-연결된 huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 접합체가 AML 선조체를 사멸시키는데 필요한 것들보다 >100-배 높은 농도에서 정상적인 선조체 세포를 사멸시킨다는 것을 보여준다. 대조적으로, 밀로타르그 및 huCD123-6G4.7-CysMab-D5' (DNA 교차연결제 D5'의 ADC)는 이런 우선적 사멸 효과를 전시하지 않는다.
도면 20은 MV4-11 AML 피하 생쥐 모형에서 CD123-IGN 접합체의 생체내 효력을 보여준다.
도면 21은 Cys-연결된 huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 접합체가 불량한 예후 인자를 갖는 다양한 CD123-양성 AML 세포주에서 고도로 활성이라는 것을 보여준다.
도면 22는 26 일자에, 운반제 및 대조로 처리된 생쥐와 비교하여 huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 접합체로 처리된 생쥐의 생체내 생물발광 영상을 보여준다. 접합체로 처리는 생쥐에서 종양 부담을 유의미하게 감소시킨다.
도면 23은 huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 접합체로 처리가 운반제 및 대조로 처리된 생쥐와 비교하여 6/6 생쥐의 생존을 연장시켰다는 것을 보여준다.
도면 24는 huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5 접합체와 함께 MV4-11 세포의 배양이 DNA 손상, 세포 주기의 S-시기에서 정지, 그리고 아폽토시스-매개된 세포 사멸을 야기한다는 것을 보여준다.
도면 25는 Molm-13 AML 파종성 모형에서 CD123-IGN 접합체의 생체내 효력을 보여준다.
도면 26은 EOL-1 피하 모형에서 CD123-IGN 접합체의 생체내 효력을 보여준다.
도면 27은 EOL-1 피하 모형에서 다양한 용량에서 huCD123-CysMab-D5 접합체의 생체내 효력을 보여준다.
도면 28은 EOL-1 피하 모형에서 상응하는 유리 약물 형태의 유상하중 (FGN849 또는 D5), 나신 항체, 대조, 시타라빈 및 아자시티딘과 비교하여 huCD123-CysMab-D5 접합체의 생체내 효력을 보여준다.
도면 29는 MV4-11 AML 파종성 모형에서 CD123-IGN 접합체의 생체내 효력을 보여준다.
도면 30은 MV4-11 AML 피하 모형에서 CD123-IGN 접합체의 생체내 효력을 보여준다.
도면 31은 huCD123-CysMab-D5 접합체로 처리가 운반제 및 대조로 처리된 생쥐와 비교하여 생쥐의 생존을 연장시켰다는 것을 보여준다.
도면 32는 생쥐에서 huCD123-CysMab-D5 및 huCD123-SeriMab-sD1 접합체의 생체내 내약성을 보여준다.
도면 33은 생쥐에서 huCD123-리신 연결된-D2 접합체의 생체내 내약성을 보여준다.
발명의 상세한 설명
1. 정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어와 관용구가 아래에 규정된다.
본원에서 교체 가능하게 이용된 바와 같이, 용어 "(인간) IL-3Rα," "인터류킨-3 수용체 알파," 또는 "CD123"은 달리 지시되지 않으면, 임의의 선천적 (인간) IL-3Rα 또는 CD123을 지칭한다. CD123 단백질은 이형이합체성 사이토킨 수용체 (IL-3 수용체, 또는 IL-3R)의 인터류킨 3-특이적 아단위이다. IL-3R은 리간드 특정한 알파 아단위, 그리고 인터류킨 3 (IL3), 집락 자극 인자 2 (CSF2 / GM-CSF) 및 인터류킨 5 (IL5)에 대한 수용체에 의해 공유된 신호전달 공통 베타 아단위 (CD131로서 또한 알려져 있음)로 구성된다. IL3에 CD123/IL-3Rα의 결합은 베타 아단위에 의존한다. 베타 아단위는 리간드 결합에 의해 활성화되고, 그리고 IL3의 생물학적 활성에 필요하다.
CD123에 대한 이들 모든 용어는 본원에서 지시된 바와 같은 단백질 또는 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 용어 "CD123/IL-3Rα"는 "전장" 처리되지 않은 CD123/IL-3Rα뿐만 아니라 세포 내에서 처리로부터 발생하는 CD123/IL-3Rα의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, CD123/IL-3Rα 단백질 또는 핵산의 자연발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체, 대립형질 변이체 및 동종형을 포괄한다. 본원에서 설명된 CD123/IL-3Rα 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 다양한 공급원으로부터, 예를 들면, 인간 조직 유형으로부터 또는 다른 공급원으로부터 단리되거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. CD123/IL-3Rα 서열의 실례는 NCBI 참조 번호 NP_002174 & NM_002183 (인간 CD123 변이체 1에 대한 단백질 및 핵산 서열), 그리고 NP_001254642 & NM_001267713 (인간 CD123 변이체 2에 대한 단백질 및 핵산 서열)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
용어 "항체"는 표적, 예를 들면, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 이들의 조합을, 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 최소한 하나의 항원 인식 부위를 통해 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체"는 무손상 다중클론 항체, 무손상 단일클론 항체, 항체 단편 (가령, Fab, Fab', F(ab')2, 그리고 Fv 단편), 단일 사슬 Fv (scFv) 돌연변이체, 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 그리고 원하는 생물학적 활성을 전시하기만 하면, 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 항체는 각각, 알파, 델타, 엡실론, 감마, 그리고 뮤로서 지칭되는 그들의 중쇄 불변 도메인의 정체에 기초하여, 면역글로불린의 5가지 주요 부류 중에서 한 가지일 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 그리고 IgM, 또는 이들의 하위부류 (아이소타입) (가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2). 상이한 부류의 면역글로불린은 상이하고 널리 공지된 아단위 구조와 3차원 형상을 갖는다. 항체는 나신이거나 또는 다른 분자, 예를 들면, 독소, 방사성동위원소 등에 접합될 수 있다.
일부 구체예에서, 항체는 비자연발생 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 자연 성분으로부터 정제된다. 일부 구체예에서, 항체는 재조합적으로 생산된다. 일부 구체예에서, 항체는 하이브리도마에 의해 생산된다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 자신이 결합하는 항원, 예를 들면, CD123/IL-3Rα의 생물학적 활성을 저해하거나 또는 감소시키는 항체이다. 일정한 구체예에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실제적으로 또는 완전하게 저해한다. 바람직하게는, 생물학적 활성은 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 100% 감소된다.
용어 "항-CD123 항체", "항-IL-3Rα 항체" 또는 "CD123/IL-3Rα에 (특이적으로) 결합하는 항체"는 항체가 CD123/IL-3Rα을 표적화하는데 있어서 진단적 및/또는 치료적 작용제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 CD123 / IL-3Rα에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 달리 명시되지 않으면, 관련 없는, 비-CD123/IL-3Rα 단백질에 대한 항-CD123/IL-3Rα 항체의 결합의 정도는 예로서, 방사면역검정 (RIA)에 의해 계측될 때, CD123/IL-3Rα에 대한 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 구체예에서, CD123/IL-3Rα에 결합하는 항체는 ≤0.5 nΜ, ≤0.3 nM, ≤0.1 nM, ≤0.05 nM, 또는 ≤0.01 nM의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체는 공통 베타 사슬 CD131에 결합하지 않는다. 한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체는 공지되고 상업적으로 가용한 CD123 항체, 예를 들면, 7G3 (생쥐 IgG2a), 6H6 (생쥐 IgG1) 및 9F5 (생쥐 IgG1)에 의해 결합되는 CD123의 동일한 에피토프에 결합하지 않는다 (Sun et al., Blood 87(1): 83-92, 1996).
본 발명의 항-CD123/IL-3Rα 항체 및 이들의 항원 결합 단편의 서열은 아래의 표 1-6에서 제공된다. 본 발명의 다양한 항체 및 면역접합체에 대한 명명법은 아래에 별도로 제공된다.
용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 부분을 지칭하고, 그리고 무손상 항체의 항원성 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 실례에는 Fab, Fab', F(ab')2, 그리고 Fv 단편, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 용어 항체의 "항원 결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 또는 그 이상의 단편을 포함한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 일정한 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원 결합 단편" 내에 포괄되는 결합 단편의 실례는 다음을 포함한다 (제한 없이): (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 일가 단편 (가령, 파파인에 의해 소화된 항체는 3개의 단편을 산출한다: 2개의 항원 결합 Fab 단편, 그리고 항원에 결합하지 않는 1개의 Fc 단편); (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편 (가령, 펩신에 의해 소화된 항체는 2개의 단편을 산출한다: 이가 항원 결합 F(ab')2 단편, 그리고 항원에 결합하지 않는 pFc' 단편) 및 이의 관련된 F(ab') 일가 단위; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편 (다시 말하면, Fab 내에 포함되는 중쇄의 부분); (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편, 그리고 관련된 이황화 연결된 Fv; (v) dAb (도메인 항체) 또는 sdAb (단일 도메인 항체) 단편 (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), 이것은 VH 도메인으로 구성된다; 그리고 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR).
"단일클론 항체"는 단일 항원 결정인자, 또는 에피토프의 고도로 특이적 인식과 결합에 관련된 균질한 항체 개체군을 지칭한다. 이것은 상이한 항원 결정인자에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체와 대조적이다. 용어 "단일클론 항체"는 무손상과 전장 단일클론 항체 둘 모두뿐만 아니라 항체 단편 (가령, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 그리고 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 게다가, "단일클론 항체"는 하이브리도마, 파지 선별, 재조합 발현, 그리고 유전자도입 동물이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 수많은 방식으로 만들어진 이와 같은 항체를 지칭한다.
용어 "인간화 항체"는 최소 비인간 (가령, 뮤린) 서열을 내포하는 특정한 면역글로불린 사슬, 키메라 면역글로불린, 또는 이들의 단편인 비인간 (가령, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비인간 종 (가령, 생쥐, 쥐, 토끼, 햄스터)의 CDR로부터 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린이다 (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988).
일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비인간 종으로부터 항체에서 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 항체 특이성, 친화성 및/또는 능력을 정밀화하고 최적화하기 위해, Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비인간 잔기 내에서 추가 잔기의 치환에 의해 더욱 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 면역글로불린에 상응하는 모든 또는 실제적으로 모든 CDR 영역을 내포하는 최소한 하나, 그리고 전형적으로 2개 또는 3개의 가변 도메인 중에서 실제적으로 모두를 포함할 것이고, 반면 모든 또는 실제적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 서열의 것들이다. 인간화 항체는 또한, 전형적으로 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc) 중에서 최소한 일부를 포함할 수 있다. 인간화 항체를 산출하는데 이용된 방법의 실례는 U.S. 특허 5,225,539 및 5,639,641, Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(3):969-973, 1994; 및 Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904, 1996 (이들 모두 본원에 참조로서 편입됨)에서 설명된다. 일부 구체예에서, "인간화 항체"는 표면치환된 항체이다. 일부 구체예에서, "인간화 항체"는 CDR-합체된 항체이다.
항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 합동으로, 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 각각, 초가변 영역으로서 또한 알려져 있는 3개의 상보성 결정 영역 (CDRs)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 구성된다. 각 사슬에서 이들 CDR은 FR에 의해 매우 근접하여 결합되고, 그리고 다른 사슬로부터 CDR과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 최소한 2가지 기술이 있다: (1) 종간 서열 가변성에 기초된 접근법 (즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.); 그리고 (2) 항원 항체 복합체의 결정학적 연구에 기초된 접근법 (Al-lazikani et al., J. Molec. Biol. 273:927-948, 1997). 이에 더하여, 이들 2가지 접근법의 조합이 CDR을 결정하기 위해 당분야에서 때때로 이용된다.
가변 도메인 내에 잔기 (대략, 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭할 때, Kabat 넘버링 시스템이 일반적으로 이용된다 (가령, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
Kabat에서처럼 아미노산 위치 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) (본원에 참조로서 편입됨)에서 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 이용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 이것 내로 삽입에 상응하는 더욱 적은 또는 추가 아미노산을 내포할 수 있다. 가령, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입물 (Kabat에 따라 잔기 52a), 그리고 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (가령, Kabat에 따라 잔기 82a, 82b, 그리고 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 항체의 서열과 "표준" Kabat 넘버링된 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다. Chothia는 그 대신에, 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917,1987). Kabat 넘버링 규약을 이용하여 넘버링될 때 Chothia CDR-H1 루프의 단부는 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 변한다. 이것은 Kabat 넘버링 설계가 H35A와 H35B에서 삽입을 배치하기 때문이다 - 35A와 35B 둘 모두 존재하지 않으면, 루프는 32에서 끝난다; 단지 35A만 존재하면, 루프는 33에서 끝난다; 35A와 35B 둘 모두 존재하면, 루프는 34에서 끝난다. AbM 초가변 영역은 Kabat CDR 및 Chothia 구조적 루프 사이에 타협을 나타내고, 그리고 Oxford Molecular의 AbM 항체 모형화 소프트웨어에 의해 이용된다.
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용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체 또는 당분야에서 공지된 임의의 기술을 이용하여 만들어진 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 일정한 구체예에서, 인간 항체는 비인간 서열을 갖지 않는다. 인간 항체의 이러한 정의는 무손상 또는 전장 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편을 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2개 또는 그 이상 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄와 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 포유동물의 한 가지 종 (가령, 생쥐, 쥐, 토끼 등)로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하고, 반면 불변 영역은 상기 종 (가령, 인간)에서 면역 반응을 이끌어내는 것을 방지하거나 또는 가능성을 감소시키기 위해 다른 종 (통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체에서 서열에 상동하다. 일정한 구체예에서, 키메라 항체는 최소한 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들면, 예로서, 뮤린 경쇄와 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함할 수 있다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정인자"는 본원에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 특정 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드일 때, 에피토프는 단백질의 삼차 접힘에 의해 병치된 인접한 아미노산 및 비인접한 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로, 단백질 변성 시에 유지되고, 반면 삼차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로, 단백질 변성 시에 상실된다. 에피토프는 전형적으로, 독특한 공간적 입체형태에서 최소한 3개, 그리고 더욱 통상적으로, 최소한 5개 또는 8-10개 아미노산을 포함한다.
"결합 친화성"은 일반적으로, 분자 (가령, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 상대 (가령, 항원) 사이에 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (가령, 항체와 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 상대 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (Kd) 또는 반극대 효과적인 농도 (EC50)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한 당분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 계측될 수 있다. 낮은 친화성 항체는 일반적으로, 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리하는 경향이 있고, 반면 높은 친화성 항체는 일반적으로, 항원에 더욱 빨리 결합하고 더욱 길게 결합된 상태로 남아있는 경향이 있다. 결합 친화성을 계측하는 다양한 방법이 당분야에서 공지되는데, 이들 중에서 한 가지가 본 발명을 위해 이용될 수 있다. 특정한 예시적인 구체예가 본원에서 설명된다.
"또는 더욱 우수한"은 결합 친화성을 지칭하기 위해 본원에서 이용될 때, 분자와 이의 결합 상대 사이에 더욱 강한 결합을 지칭한다. "또는 더욱 우수한"은 본원에서 이용될 때, 더욱 작은 수치 Kd 값에 의해 표시되는, 더욱 강한 결합을 지칭한다. 가령, "0.3 nM 또는 더욱 우수한" 항원에 대한 친화성을 갖는 항체의 경우에, 항원에 대한 항체의 친화성은 ≤0.3 nM, 예를 들면, 0.29 nM, 0.28 nM, 0.27 nM 등 또는 0.3 nM와 동등하거나 또는 이보다 적은 임의의 값이다. 한 구체예에서, 항체의 친화성은 Kd에 의해 결정될 때, 약 10-3 내지 약 10-12 M, 약 10-6 내지 약 10-11 M 사이, 약 10-6 내지 약 10-10 M 사이, 약 10-6 내지 약 10-9 M 사이, 약 10-6 내지 약 10-8 M 사이, 또는 약 10-6 내지 약 10-7 M 사이일 것이다.
"특이적으로 결합한다"는 항체가 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 그리고 상기 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 사이에 일부 상보성을 수반한다는 것으로 일반적으로 의미된다. 이러한 정의에 따라, 항체는 무작위, 관련 없는 에피토프에 결합하는 것보다 더욱 쉽게 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합할 때, 상기 에피토프에 "특이적으로 결합한다"라고 일컬어진다. 용어 "특이성"은 일정한 항체가 일정한 에피토프에 결합하는 상대적 친화성에 대한 자격을 부여하기 위해 본원에서 이용된다. 가령, 항체 "A"는 항체 "B"보다 소정의 에피토프에 대해 더욱 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대해서보다 더욱 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합하는 것으로 일컬어질 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 이것이 비-CD123 항원에 대한 결합 특이성보다 CD123 항원 (임의의 종으로부터)에 더욱 높은 결합 특이성을 갖는다는 점에서, CD123 항원에 "특이적으로 결합한다." 일정한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 이것이 비인간 CD123 항원 (가령, 생쥐 또는 쥐 CD123)에 대한 결합 특이성보다 인간 CD123 항원에 더욱 높은 결합 특이성을 갖는다는 점에서, 인간 CD123 항원에 "특이적으로 결합한다."
"우선적으로 결합한다"는 항체가 관련된, 유사한, 상동한, 또는 닮은 에피토프에 결합하는 것보다 더욱 쉽게 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 의미된다. 따라서, 소정의 에피토프에 "우선적으로 결합"하는 항체는 비록 이런 항체가 관련된 에피토프와 교차 반응할 수도 있긴 하지만, 관련된 에피토프보다 상기 에피토프에 더욱 높은 가능성으로 결합할 것이다. 가령, 일정한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 생쥐 CD123보다 인간 CD123 항원에 "우선적으로 결합한다."
항체는 에피토프에 참고 항체의 결합을 어느 정도 차단할 정도까지 상기 에피토프에 우선적으로 결합하면, 소정의 에피토프에 참고 항체의 결합을 "경쟁적으로 저해한다"라고 일컬어진다. 경쟁적 저해는 당분야에서 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 경쟁 ELISA 검정에 의해 결정될 수 있다. 항체는 소정의 에피토프에 참고 항체의 결합을 최소한 90%, 최소한 80%, 최소한 70%, 최소한 60%, 또는 최소한 50% 경쟁적으로 저해하는 것으로 일컬어질 수 있다.
관용구 "실제적으로 유사한," 또는 "실제적으로 동일한"은 본원에서 이용된 바와 같이, 당업자가 2가지 수치 값 사이에 차이를 상기 값 (가령, Kd 값)에 의해 계측된 생물학적 특성의 배경에서 생물학적 및/또는 통계 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 고려할 만큼, 이들 두 수치 값 (일반적으로, 본 발명의 항체와 연관된 수치 값 및 참고/비교측정기 항체와 연관된 다른 수치 값) 사이에 충분히 높은 정도의 유사성을 표시한다. 상기 2가지 값 사이에 차이는 참고/비교측정기 항체에 대한 값의 함수로서 약 50%보다 적거나, 약 40%보다 적거나, 약 30%보다 적거나, 약 20%보다 적거나, 또는 약 10%보다 적다.
"단리된" 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태인 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 그들이 더 이상 자연에서 발견되는 형태에 있지 않는 정도까지 정제된 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, 단리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실제적으로 순수하다.
본원에서 이용된 바와 같이, "실제적으로 순수한"은 최소한 50% 순수한 (즉, 오염체가 없는), 최소한 90% 순수한, 최소한 95% 순수한, 최소한 98% 순수한, 또는 최소한 99% 순수한 물질을 지칭한다.
용어 "면역접합체", "접합체" 또는 "ADC"는 본원에서 이용된 바와 같이, 세포 결합 작용제 (즉, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이의 단편)에 연결되고 하기 일반식에 의해 규정되는 화합물 또는 이의 유도체를 지칭한다: A-L-C, 여기서 C = 세포독소, L = 링커, 그리고 A = 세포 결합 작용제 (CBA), 예를 들면, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 항체 단편. 면역접합체는 또한, 역순으로 일반식: C-L-A에 의해 규정될 수 있다.
"링커"는 화합물, 통상적으로 약물, 예를 들면, 본원에서 설명된 세포독성 작용제 (가령, 메이탄시노이드 또는 IGN (인돌리노벤조디아제핀) 화합물)를 안정된, 공유 방식으로, 세포 결합 작용제, 예를 들면, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이의 단편에 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티이다. 링커는 화합물 또는 항체가 활성 상태로 남아있는 조건에서, 산-유도된 개열, 광-유도된 개열, 펩티드분해효소-유도된 개열, 에스테르분해효소-유도된 개열, 그리고 이황화 결합 개열에 감수성이거나 또는 실제적으로 내성일 수 있다. 적합한 링커는 당분야에서 널리 공지되고, 그리고 예로서, 이황화 기, 티오에테르 기, 산 불안정 기, 광불안정 기, 펩티드분해효소 불안정 기 및 에스테르분해효소 불안정 기를 포함한다. 링커는 또한, 본원에서 설명되고 당분야에서 공지된 하전된 링커, 그리고 이들의 친수성 형태를 포함한다.
용어 "상승된" CD123/IL-3Rα, CD123/IL-3Rα의 "증가된 발현" 및 CD123/IL-3Rα의 "과다발현"은 상승된 수준의 CD123 발현을 내포하는 표본을 지칭한다. CD123은 대조 값 (가령, 암이 없는 개체로부터 생물학적 표본, 조직 또는 세포, CD123/IL-3Rα을 발현하지 않거나 또는 적게 발현하는 것으로 알려진 표본 또는 암, 정상적인 표본, 또는 상승된 CD123/IL-3Rα 값을 갖지 않는 암에서 발현 수준)과 비교하여 상승되거나, 증가되거나, 또는 과다발현될 수 있다. 가령, 증가된 발현을 갖는 표본 (가령, 혈액학적 암, 예를 들면, 백혈병 및 림프종으로부터 표본)은 대조 / 정상치에 비하여 최소한 2-, 3-, 4-, 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 또는 최소한 50-배의 증가를 내포할 수 있다.
"참고 표본"은 시험 표본으로부터 본 발명의 방법에서 획득된 결과를 상관시키고 비교하는데 이용될 수 있다. 참고 표본은 세포 (가령, 세포주, 세포 펠렛) 또는 조직일 수 있다. "참고 표본"에서 CD123/IL-3Rα 수준은 CD123/IL-3Rα의 절대적 또는 상대적 양, 양의 범위, 최소량 및/또는 최대량, 평균량 및/또는 중간 양일 수 있다. "참고 표본"은 또한, 시험 표본이 비교되는 CD123/IL-3Rα 발현의 기준선으로서 역할을 할 수 있다. "참고 표본"은 동일한 환자로부터 이전 표본 또는 기준선 표본, 공지된 수준의 CD123/IL-3Rα 발현을 갖는 정상적인 참고, 또는 공지된 수준의 CD123/IL-3Rα 발현을 갖는 유관한 환자 개체군으로부터 참고를 포함할 수 있다. CD123/IL-3Rα 수준은 또한, 표준 곡선에서 값으로서 표현될 수 있다. 표준 곡선은 표본에서 CD123/IL-3Rα의 농도를 결정하기 위해 검정 데이터를 플롯팅하는 정량적 방법이다. 한 구체예에서, 참고 표본은 정제된 CD123/IL-3Rα를 포함하는 항원 표준이다. 본 발명의 진단적 방법은 시험 표본에서 CD123/IL-3Rα의 발현 수준 및 "참조값" 사이에 비교를 수반할 수 있다. 일부 구체예에서, 참조값은 참고 표본에서 CD123/IL-3Rα의 발현 수준이다. 참조값은 미리 결정된 값일 수 있고, 그리고 또한, 시험 표본과 병렬로 시험된 참고 표본 (가령, 대조 생물학적 표본 또는 참고 표본)으로부터 결정될 수 있다. 참조값은 단일 컷오프 값, 예를 들면, 중앙 값 또는 평균 값 또는 값의 범위, 예를 들면, 신뢰 구간일 수 있다. 참조값은 개체의 다양한 하위군에 대해 확립될 수 있다.
본원에서 용어 "일차 항체"는 표본 내에 표적 단백질 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 일차 항체는 일반적으로, ELISA 검정 또는 IHC 절차에서 이용되는 첫 번째 항체이다. 한 구체예에서, 일차 항체는 IHC 절차에서 이용된 유일 항체이다.
본원에서 용어 "이차 항체"는 일차 항체에 특이적으로 결합하고, 따라서 일차 항체 및 차후 시약 (만약 존재하면) 사이에 가교 또는 연결을 형성하는 항체를 지칭한다. 이차 항체는 일반적으로, 면역조직화학 절차에서 이용되는 두 번째 항체이다.
본 발명의 "표본" 또는 "생물학적 표본"은 생물학적 기원이다, 특정한 구체예에서, 예로서 진핵 생물체로부터 기원한다. 일부 구체예에서, 표본은 인간 표본이지만, 동물 표본 역시 이용될 수 있다. 본 발명에서 이용을 위한 표본의 무제한적 공급원은 예로서, 고형 조직, 생검 흡인물, 복수, 유체 추출물, 혈액, 혈장, 혈청, 척수액, 림프 유체, 피부의 외부 섹션, 호흡기, 장관 및 비뇨생식기로, 눈물, 타액, 모유, 종양, 장기, 세포 배양액 및/또는 세포 배양 성분을 포함한다. "암성 표본"은 암성 세포를 내포하는 표본이다. 상기 방법은 CD123/IL-3Rα의 발현의 양상 또는 표본의 상태를 조사하는데 이용될 수 있고, 상이한 유형의 세포 또는 조직을 비교하고, 상이한 발달 단계를 비교하고, 그리고 질환 또는 이상의 존재 및/또는 유형을 검출하거나 또는 결정하는 것을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "포획 시약"은 적합한 조건 하에서, 포획 시약-표적 분자 복합체가 표본의 나머지로부터 분리될 수 있도록, 표본 내에서 표적 분자에 결합하고 이를 포획할 수 있는 시약을 지칭한다. 한 구체예에서, 포획 시약은 고정된다. 한 구체예에서, 샌드위치 면역검정에서 포획 시약은 표적 항원에 대한 항체 또는 상이한 항체의 혼합물이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "검출가능한 항체"는 검출 수단에 의해 증폭된 표지를 통해 직접적으로, 또는 예로서, 표지화되는 다른 항체를 통해 간접적으로 검출될 수 있는 항체를 지칭한다. 직접적인 표지화의 경우에, 항체는 전형적으로, 일부 수단에 의해 검출가능한 모이어티에 접합된다. 한 구체예에서, 검출가능한 항체는 비오틴화된 항체이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "검출 수단"은 검출가능한 항체의 존재를 검출하는데 이용되는 모이어티 또는 기술을 지칭하고, 그리고 고정된 표지, 예를 들면, 마이크로역가 평판 위에 포획된 표지를 증폭하는 검출 작용제를 포함한다. 한 구체예에서, 검출 수단은 형광측정 검출 작용제, 예를 들면, 아비딘 또는 스트렙타비딘이다.
통상적으로, "샌드위치 ELISA"는 다음의 단계를 이용한다: (1) 마이크로역가 평판이 포획 항체로 코팅된다; (2) 표본이 첨가되고, 그리고 존재하는 임의의 항원이 포획 항체에 결합한다; (3) 검출 항체가 첨가되고 항원에 결합한다; (4) 효소-연결된 이차 항체가 첨가되고 검출 항체에 결합한다; 그리고 (5) 기질이 첨가되고 효소에 의해 검출가능한 형태로 전환된다.
단어 "표지"는 본원에서 이용될 때, "표지화된" 항체를 산출하기 위해 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수 있거나 (가령, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소적 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매작용할 수 있다.
"상관한다" 또는 "상관하는"은 어떤 방식으로도, 첫 번째 분석의 성과 및/또는 결과를 두 번째 분석의 성과 및/또는 결과와 비교하는 것으로 의미된다. 가령, 두 번째 분석을 실행하는데 첫 번째 분석의 결과가 이용될 수 있고 및/또는 두 번째 분석이 수행되어야 하는 지를 결정하기 위해 첫 번째 분석의 결과가 이용될 수 있고 및/또는 첫 번째 분석의 결과가 두 번째 분석의 결과와 비교될 수 있다. 한 구체예에서, CD123/IL-3Rα의 증가된 발현은 CD123/IL-3Rα-표적화 요법의 유용성의 증가된 가능성과 상관한다.
용어 "암"과 "암성"은 세포 개체군이 조절되지 않은 세포 성장에 의해 특징화되는 포유동물에서 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 설명한다. "종양"과 "신생물"은 전암성 병변을 비롯하여, 양성 (비암성) 또는 악성 (암성)인, 과도한 세포 성장 또는 증식으로부터 발생하는 하나 이상의 세포를 지칭한다.
암의 실례는 림프종 및 백혈병을 포함한다. 본 발명의 방법 및 시약 (가령, 항-CD123 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 면역접합체)에 의해 치료되고 및/또는 예방될 수 있는 암 또는 종양형성 질환의 실례는 AML, CML, ALL (가령, B-ALL), CLL, 골수형성이상 증후군, 기본 형질세포양 DC 신생물 (BPDCN) 백혈병, 비호지킨 림프종 (NHL)을 비롯한 B-세포 림프종, 전구체 B-세포 림프모구성 백혈병 / 림프종 및 성숙 B-세포 신생물, 예를 들면, B-세포 만성 림프성 백혈병 (B-CLL) / 소형 림프성 림프종 (SLL), B-세포 전림프구성 백혈병, 림프구형질세포 림프종, 외투 세포 림프종 (MCL), 저등급, 중간-등급 및 고등급 FL을 비롯한 여포성 림프종 (FL), 피부 난포 센터 림프종, 변연대 B-세포 림프종 (MALT 유형, 결절성 및 비장 유형), 모양 세포성 백혈병 (HCL), 미만성 큰 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식후 림프세포증식성 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 역형성 큰-세포 림프종 (ALCL), 그리고 호지킨 백혈병 (HL)을 포함한다.
암은 또한, 상승된 CD123/IL-3Rα 발현 수준을 갖는 세포를 내포하는 암을 포괄한다. 이런 CD123/IL-3Rα-상승된 암은 AML, CML, ALL (가령, B-ALL) 및 CLL을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
용어 "암 세포," "종양 세포," 그리고 문법적 등가물은 대부분의 종양 세포 개체군을 포함하는 비종양형성 세포, 그리고 종양형성 줄기 세포 (암 줄기 세포) 둘 모두를 비롯하여, 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 전체 세포 개체군을 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "종양 세포"는 종양 세포를 암 줄기 세포로부터 식별하기 위해, 재생하고 분화하는 능력을 결여하는 종양 세포만을 언급할 때, 용어 "비종양형성"에 의해 수식될 것이다.
용어 "개체"는 인간, 비인간 영장류, 설치류, 기타 등등이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 임의의 동물 (가령, 포유동물)을 지칭하는데, 이것은 특정 치료의 수용자이다. 전형적으로, 용어 "개체"와 "환자"는 인간 개체에 관하여 본원에서 교체가능하게 이용된다.
하나 또는 그 이상의 추가 치료적 작용제"와 합동으로" 투여는 동시적 (동시) 투여 및 임의의 순서에서 연속적 투여를 포함한다.
용어 "제약학적 제제"는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하고, 그리고 이러한 제제가 투여될 개체에 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 형태의 제조물을 지칭한다. 이런 제제는 무균일 수 있다.
본원에서 개시된 바와 같은 항체 또는 면역접합체의 "효과량"은 구체적으로 언급된 목적을 실행하는데 충분한 양이다. "효과량"은 언급된 목적에 관계하여, 경험적으로 및 일과적인 방식으로 결정될 수 있다.
용어 "치료 효과량"은 개체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 항체 또는 다른 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 약물의 치료 효과량은 암 세포의 숫자를 감소시키고; 종양 크기를 감소시키고; 말초 장기 내로 암 세포 침윤을 저해하고 (즉, 얼마간 늦추고, 그리고 일정한 구체예에서, 중단시키고); 종양 전이를 저해하고 (즉, 얼마간 늦추고, 그리고 일정한 구체예에서, 중단시키고); 종양 성장을 얼마간 저해하고; 암과 연관된 증상 중에서 하나 또는 그 이상을 얼마간 완화하고; 및/또는 우호적인 반응, 예를 들면, 증가된 진행 없는 생존 (PFS), 질환 없는 생존 (DFS), 또는 전반적인 생존 (OS), 완전한 반응 (CR), 부분적인 반응 (PR), 또는 일부 경우에, 안정된 질환 (SD), 진행성 질환 (PD)에서 감소, 진행까지 감소된 시간 (TTP), 또는 이들의 임의의 조합을 유발할 수 있다. 본원에서 "치료하는"의 정의를 참조한다. 약물은 암 세포의 성장을 예방하고 및/또는 현존하는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지, 정균성 및/또는 세포독성일 수 있다.
"예방적 효과량"은 원하는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 하지만 반드시 그러한 것은 아니지만, 예방적 분량이 질환에 앞서 또는 질환의 초기 단계에서 개체에서 이용되기 때문에, 예방적 효과량은 치료 효과량보다 적을 것이다.
용어 "우호적으로 반응한다"는 일반적으로, 개체에서 유익한 상태를 유발하는 것을 지칭한다. 암 치료에 관하여, 상기 용어는 치료 효과를 개체에 제공하는 것을 지칭한다. 암에서 긍정적인 치료 효과는 다수의 방식에서 계측될 수 있다 (참조: W.A. Weber, J. Nucl. Med. 50: 1S-10S (2009)). 가령, 종양 성장 저해, 분자 마커 발현, 혈청 마커 발현, 그리고 분자 영상 기술 모두 항암 치료제의 치료적 효능을 사정하는데 이용될 수 있다. 종양 성장 저해에 대하여, NCI 기준에 따라, T/C < 42%가 항종양 활성의 최소 수준이다. T/C <10%은 높은 항종양 활성 수준인 것으로 고려되는데, T/C (%) = 치료의 중앙 종양 체적 / 대조의 중앙 종양 체적 x 100이다. 우호적인 반응은 예로서, 증가된 진행 없는 생존 (PFS), 질환 없는 생존 (DFS), 또는 전반적인 생존 (OS), 완전한 반응 (CR), 부분적인 반응 (PR), 또는 일부 경우에, 안정된 질환 (SD), 진행성 질환 (PD)에서 감소, 진행까지 감소된 시간 (TTP), 또는 이들의 임의의 조합에 의해 사정될 수 있다.
PFS, DFS, 그리고 OS는 새로운 약물의 승인을 위한 국립 암 연구소 및 미국 식품의약국에 의한 기준 세트에 의해 계측될 수 있다. Johnson et al., (2003) J. Clin. Oncol. 21(7): 1404-1411을 참조한다.
"진행 없는 생존" (PFS)는 등록에서부터 질환 진행 또는 사망까지의 시간을 지칭한다. PFS는 일반적으로, 카플란 마이어 방법 및 고형 종양에서 반응 평가 규준 (RECIST) 1.1 기준을 이용하여 계측된다. 일반적으로, 진행 없는 생존은 환자가 암 악화 없이 생존하는 상황을 지칭한다.
"완전한 반응" 또는 "완전 완화" 또는 "CR"은 치료에 대한 응답으로 종양 또는 암의 모든 징후의 소실을 지시한다. 이것은 암이 치유되었다는 것을 항상 의미하는 것은 아니다.
"부분적인 반응" 또는 "PR"은 치료에 대한 응답으로, 하나 또는 그 이상의 종양 또는 병변의 크기 또는 부피에서 감소, 또는 체내에서 암의 정도에서 감소를 지칭한다.
"안정된 질환"은 진행 또는 재발 없는 질환을 지칭한다. 안정된 질환에서, 부분적인 반응에 대한 자격을 부여하는데 충분한 종양 수축 및 진행성 질환으로서 자격을 부여하는데 충분한 종양 증가가 없다.
"진행성 질환"은 하나 이상의 새로운 병변 또는 종양의 출현 및/또는 현존하는 비-표적 병변의 명백한 진행을 지칭한다. 진행성 질환은 또한, 종양의 질량 또는 확산에서 증가로 인해, 치료가 시작된 이후, 20 퍼센트보다 많은 종양 성장을 지칭할 수 있다.
"질환 없는 생존" (DFS)은 환자가 질환 없이 살아남는, 치료 동안과 후에 시간의 길이를 지칭한다.
"전반적인 생존" (OS)은 환자 등록에서부터 사망까지 또는 살아있는 것으로 알려진 마지막 일자에서 감시까지의 시간을 지칭한다. OS는 경험 없는 또는 치료되지 않은 개체 또는 환자와 비교하여 기대 수명에서 연장을 포함한다. 전반적인 생존은 환자가 예로서, 진단 또는 치료의 시간으로부터 규정된 기간, 예를 들면, 1 년, 5 년 등 동안 살아남아있는 상황을 지칭한다.
"화학치료제"는 작용 기전에 상관없이, 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 용어, 예를 들면, "치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위해" 또는 "경감하는" 또는 "경감하기 위해"는 진단된 병리학적 장애 또는 질환을 치유하고, 이의 속도를 늦추고, 이의 증상을 줄이고 및/또는 이의 진행을 중단시키는 치료적 조치를 지칭한다. 따라서, 치료가 필요한 개체는 장애로 이미 진단된 개체를 포함하고, 그리고 또한, 최소 잔존 질환, 또는 저항성 질환, 또는 재발된 질환을 갖는 개체를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 개체는 환자가 다음 중에서 하나 또는 그 이상을 보여주면, 본 발명의 방법에 따라 암에 대해 성공적으로 "치료된다": 암 세포의 숫자에서 감소 또는 암 세포의 완전한 부재; 종양 크기에서 감소; 예로서, 연조직과 뼈 내로 암의 확산을 비롯하여 말초 장기 내로 암 세포 침윤의 저해 또는 부재; 종양 전이의 저해 또는 부재; 종양 성장의 저해 또는 부재; 특정한 암과 연관된 하나 또는 그 이상의 증상의 경감; 감소된 이환율과 사망률; 삶의 질에서 향상; 종양의 종양형성, 종양형성 빈도, 또는 종양형성 능력에서 감소; 종양에서 암 줄기 세포의 숫자 또는 빈도에서 감소; 종양형성 세포의 비종양형성 상태로의 분화; 증가된 진행 없는 생존 (PFS), 질환 없는 생존 (DFS), 또는 전반적인 생존 (OS), 완전한 반응 (CR), 부분적인 반응 (PR), 안정된 질환 (SD), 진행성 질환 (PD)에서 감소, 진행까지 감소된 시간 (TTP), 또는 이들의 임의의 조합.
예방적 또는 방지적 조치는 표적화된 병리학적 질환 또는 장애의 발달을 예방하고 및/또는 늦추는 조치를 지칭한다. 따라서, 예방적 또는 방지적 조치가 필요한 개체는 장애를 앓기 쉬운 개체 및 장애가 예방되어야 하는 개체를 포함한다.
예방적 또는 방지적 조치는 표적화된 병리학적 질환 또는 장애의 발달을 예방하고 및/또는 늦추는 치료적 조치를 지칭한다. 따라서, 예방적 또는 방지적 조치가 필요한 개체는 장애를 앓기 쉬운 개체 및 장애가 예방되어야 하는 개체를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "건강 관리 제공자"는 살아있는 개체, 예를 들면, 인간 환자와 직접적으로 상호작용하고 이들을 관리하는 개체 또는 기관을 지칭한다. 건강 관리 제공자의 무제한적 실례는 의사, 간호사, 기술자, 요법사, 약사, 카운슬러, 대안 의학 의사, 의학적 시설, 의원, 병원, 응급실, 진료소, 응급 간호 센터, 대안 의학 진료소/시설, 그리고 일반적인 의학적, 특수한 의학적, 외과적 및/또는 임의의 다른 유형의 치료, 사정, 유지, 요법, 약물 요법 및/또는 조언을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 일반적인 및/또는 특수한 치료, 사정, 유지, 요법, 약물 요법 및/또는 환자의 건강 상태의 모든 또는 임의의 부분에 관련된 조언을 제공하는 임의의 다른 실체를 포함한다.
일부 양상에서, 건강 관리 제공자는 암을 치료하기 위한 요법을 투여하거나 또는 다른 건강 관리 제공자에게 상기 요법을 투여하도록 지시할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 요법의 "투여"는 요법을 개체에게 처방하는 것뿐만 아니라 상기 요법을 개체에게 전달하거나, 적용하거나, 또는 제공하는 것을 포함한다. 건강 관리 제공자는 다음의 행위를 실행하거나 또는 다른 건강 관리 제공자 또는 환자에게 다음의 행위를 수행하도록 지시할 수 있다: 표본을 획득하고, 표본을 처리하고, 표본을 제출하고, 표본을 제공받고, 표본을 전달하고, 표본을 분석하거나 또는 계측하고, 표본을 정량하고, 표본을 분석/계측/정량한 후 획득된 결과를 제공하고, 표본을 분석/계측/정량한 후 획득된 결과를 제공받고, 하나 또는 그 이상의 표본을 분석/계측/정량한 후 획득된 결과를 비교하고/채점하고, 하나 또는 그 이상의 표본으로부터 비교/점수를 제공하고, 하나 또는 그 이상의 표본으로부터 비교/점수를 획득하고, 요법 또는 치료적 작용제 (가령, CD123/IL-3Rα 결합 작용제)를 투여하고, 요법의 투여를 시작하고, 요법의 투여를 중단하고, 요법의 투여를 계속하고, 요법의 투여를 일시적으로 중단하고, 투여된 치료적 작용제의 양을 증가시키고, 투여된 치료적 작용제의 양을 감소시키고, 치료적 작용제의 양의 투여를 계속하고, 치료적 작용제의 투여 빈도를 증가시키고, 치료적 작용제의 투여 빈도를 감소시키고, 치료적 작용제에서 동일한 투약 빈도를 유지하고, 요법 또는 치료적 작용제를 최소한 다른 요법 또는 치료적 작용제로 대체하고, 요법 또는 치료적 작용제를 최소한 다른 요법 또는 추가 치료적 작용제와 합동한다. 이들 행위는 컴퓨터-실행된 방법 (가령, 웹 서비스 또는 독립형 컴퓨터 시스템을 통해)을 이용하여 건강 관리 제공자에 의해 자동적으로 수행될 수 있다.
본원에서 교체 가능하게 이용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, 그리고 DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체 내로 통합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들면, 메틸화된 뉴클레오티드 및 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하면, 뉴클레오티드 구조에 변형은 중합체의 어셈블리 전후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분이 끼어들 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합화 후, 예로서 표지화 성분과의 접합에 의해 더욱 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은 예로서, 유사체로 자연발생 뉴클레오티드 중에서 하나 또는 그 이상의 "캡" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들면, 예로서, 하전되지 않은 연쇄 (가령, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연쇄 (가령, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로 변형, 펜던트 모이어티, 예를 들면, 예로서 단백질 (가령, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, ply-L-리신 등)을 내포하는 변형, 삽입제 (가령, 아크리딘, 소랄렌 등)로 변형, 킬레이터 (가령, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 내포하는 변형, 알킬레이터를 내포하는 변형, 변형된 연쇄 (가령, 알파 아노머 핵산 등)로 변형뿐만 아니라 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 게다가, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실 기는 예로서, 포스포네이트 기, 인산염 기에 의해 대체되거나, 표준 보호 기에 의해 보호되거나, 또는 추가 뉴클레오티드에 추가 연쇄를 준비하기 위해 활성화되거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 아민 또는 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실은 또한, 표준 보호 기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 예로서 2'-0-메틸-, 2'-0-알릴, 2'-플루오르- 또는 2'- 아지도-리보오스, 탄소환상 당 유사체, 알파-아노머 당, 에피머성 당, 예를 들면, 아라비노오스, 자일로오스 또는 릭소오스, 피라노오스 당, 푸라노오스 당, 세도헵툴로오스, 비환상 유사체 및 무염기 뉴클레오시드 유사체, 예를 들면, 메틸 리보시드를 비롯하여, 당분야에서 전반적으로 공지되어 있는 리보오스 또는 데옥시리보오스 당의 유사한 형태를 내포할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 포스포디에스테르 연쇄는 대안적 연결 기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적 연결 기는 인산염이 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR*, CO 또는 CH2 ("포름아세탈")에 의해 대체되는 구체예를 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 여기서 각 R 또는 R은 독립적으로 H, 또는 에테르 (-O-) 연쇄, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜을 임의선택적으로 내포하는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 (1-20 C)이다. 폴리뉴클레오티드 내에 모든 연쇄가 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 비롯하여, 본원에서 지칭된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
용어 "벡터"는 숙주 세포에서 관심되는 하나 또는 그 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달하고 발현할 수 있는 구조체를 의미한다. 벡터의 실례는 바이러스 벡터, 나신 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 연관된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 피포된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 그리고 일정한 진핵 세포, 예를 들면, 생산자 세포를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
용어 "폴리펩티드," "펩티드," 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다. 중합체는 선형이거나 또는 분지될 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그리고 비-아미노산이 끼어들 수 있다. 이들 용어는 또한, 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들면, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들면, 표지화 성분으로 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 상기 정의 내에는 예로서, 아미노산의 하나 또는 그 이상의 유사체 (예로서, 비자연적인 아미노산 등 포함)뿐만 아니라 당분야에서 공지된 다른 변형을 내포하는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드가 항체에 기초되기 때문에, 일정한 구체예에서, 이들 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 연관된 사슬로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드, 펩티드, 또는 단백질은 비자연발생이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드, 펩티드, 또는 단백질은 다른 자연발생 성분으로부터 정제된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드, 펩티드, 또는 단백질은 재조합적으로 생산된다.
2개 또는 그 이상 핵산 또는 폴리펩티드의 배경에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 임의의 보존성 아미노산 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않으면서, 최고 상응을 위해 비교되고 정렬될 때 (필요하면, 갭을 도입), 동일하거나 또는 특정된 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 또는 그 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용하여 또는 시각적 검사에 의해 계측될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 획득하는데 이용될 수 있는 다양한 알고리즘과 소프트웨어가 당분야에서 공지된다. 서열 정렬 알고리즘의 이와 같은 한 가지 무제한적 실례는 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2264-2268, 1990에서 설명되고, Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873-5877, 1993에서처럼 변형되고, 그리고 NBLAST와 XBLAST 프로그램 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1991) 내로 통합된 알고리즘이다. 일정한 구체예에서, 갭트 BLAST는 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997에서 설명된 바와 같이 이용될 수 있다; BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) 또는 Megalign (DNASTAR)은 서열을 정렬하는데 이용될 수 있는 추가의 공개적으로 가용한 소프트웨어 프로그램이다. 일정한 구체예에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어에서 GAP 프로그램을 이용하여 결정된다 (가령, NWSgapdna.CMP 매트릭스, 40, 50, 60, 70 또는 90의 갭 가중 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중을 이용). 일정한 대안적 구체예에서, Needleman과 Wunsch의 알고리즘 (J. Mol. Biol. (48):444-453, 1970)을 통합하는, GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램이 2개의 아미노산 서열 사이에 퍼센트 동일성을 결정하는데 이용될 수 있다 (가령, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 그리고 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중 및 1, 2, 3, 4, 5의 길이 가중을 이용). 대안으로, 일정한 구체예에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이에 퍼센트 동일성은 Myers와 Miller의 알고리즘 (CABIOS, 4: 11-17, 1989)을 이용하여 결정된다. 가령, 퍼센트 동일성은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)을 이용하고, 그리고 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 갖는 PAM120을 이용하여 결정될 수 있다. 특정 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬을 위한 적절한 파라미터는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일정한 구체예에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 파라미터가 이용된다. 일정한 구체예에서, 두 번째 서열 아미노산에 대한 첫 번째 아미노산 서열의 백분율 동일성 "X"는 100 x (Y/Z)로서 계산되는데, 여기서 Y는 첫 번째와 두 번째 서열의 정렬에서 동일한 정합으로서 채점된 아미노산 잔기의 숫자 (시각적 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬될 때)이고, 그리고 Z는 두 번째 서열에서 잔기의 총수이다. 첫 번째 서열의 길이가 두 번째 서열보다 길면, 두 번째 서열에 대한 첫 번째 서열의 퍼센트 동일성은 첫 번째 서열에 대한 두 번째 서열의 퍼센트 동일성보다 길 것이다.
무제한적 실례로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드가 참고 서열에 일정한 백분율 서열 동일성 (가령, 최소한 80% 동일한, 최소한 85% 동일한, 최소한 90% 동일한, 그리고 일부 구체예에서, 최소한 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한)을 갖는 지는 일정한 구체예에서, Bestfit 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix용 버전 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)을 이용하여 결정될 수 있다. Bestfit은 두 서열 사이에 상동성의 최고 분절을 찾기 위해, Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489, 1981의 국부 상동성 알고리즘을 이용한다. 특정 서열이 예로서, 본 발명에 따른 참고 서열과 95% 동일한 지를 결정하기 위해 Bestfit 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용할 때, 파라미터는 동일성의 백분율이 참고 뉴클레오티드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고, 그리고 참고 서열에서 뉴클레오티드의 총수의 최대 5%의 상동성에서 갭이 허용되도록 설정된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 2개의 핵산 또는 폴리펩티드는 실제적으로 동일한데, 이것은 이들이 최고 상응을 위해 비교되고 정렬될 때, 서열 비교 알고리즘을 이용하거나 또는 시각적 검사에 의한 계측에서, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 그리고 일부 구체예에서, 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일정한 구체예에서, 동일성은 길이에서 최소한 약 10, 약 20, 약 40-60개 잔기 또는 그들 사이에 임의의 정수 값인 서열의 영역에 걸쳐, 또는 60-80개 잔기보다 긴 영역, 최소한 약 90-100개 잔기에 걸쳐 존재하거나, 또는 서열은 비교되는 서열, 예를 들면, 예로서 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역의 전장에 걸쳐 실제적으로 동일하다.
"보존성 아미노산 치환"은 한 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄 (가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (가령, 아스파르트산, 글루타민산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (가령, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (가령, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 비롯한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당분야에서 규정되었다. 가령, 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환은 보존성 치환이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드와 항체의 서열에서 보존성 치환은 이러한 폴리펩티드 또는 항체가 결합하는 항원(들), 즉, CD123/IL-3Rα에 대한, 아미노산 서열을 내포하는 폴리펩티드 또는 항체의 결합을 제거하지 않는다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드와 아미노산 보존성 치환을 확인하는 방법은 당분야에서 널리 공지된다 (가령, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187, 1993; Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884, 1999; 및 Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417, 1997을 참조한다).
본원에서 이용된 바와 같이, "투과성 당단백질," "P-gp 또는 Pgp," "다중 약제 내성 단백질 1 (MDR1)," "ATP-결합 카세트 아과 B 구성원 1 (ABCB1)," 또는 "분화 클러스터 243 (CD243)"으로서 또한 알려져 있는 "P-당단백질 1"은 세포외 및 세포내 막을 교차하여 매우 다양한 기질을 수송하는 MDR/TAP 아과의 ABC-전달체이다. 이것은 광범위한 기질 특이성을 갖는 ATP-의존성 유출 펌프이다. P-gp는 장관 상피 (여기서 이것은 생체이물 (가령, 독소 또는 약물)을 장관 내강 내로 되돌려 펌핑한다)에서, 간 세포 (여기서 이것은 이들을 담관 내로 펌핑한다)에서, 신장의 근위 세뇨관의 세포 (여기서 이것은 이들을 소변-통행 관 내로 펌핑한다)에서, 그리고 혈액 뇌 장벽 및 혈액 고환 장벽을 구성하는 모세관 내피 세포 (여기서 이것은 이들을 모세관 내로 되돌려 펌핑한다)에서 광범위하게 분포되고 발현된다.
일부 암 세포 역시 대량의 P-gp를 발현하는데, 이것은 이들 암이 다제 내성이 되게 만든다.
본원에서 이용된 바와 같이, "알킬"은 1 내지 20개 탄소 원자의 포화된 선형 또는 분지쇄 일가 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 알킬의 실례는 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, 1-부틸, 2-메틸-1-프로필, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸, 2-메틸-2-프로필, 1-펜틸, 2-펜틸 3-펜틸, 2-메틸-2-부틸, 3-메틸-2-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-1-부틸, 1-헥실), 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3-메틸-3-펜틸, 2-메틸-3-펜틸, 2,3-디메틸-2-부틸, 3,3-디메틸-2-부틸, 1-헵틸, 1-옥틸, 기타 등등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 알킬은 1 내지 10개 탄소 원자를 갖는다. 더욱 바람직하게는, 알킬은 1 내지 4개 탄소 원자를 갖는다.
기 (group)에서 탄소 원자의 숫자는 본원에서 접두사 "Cx-xx"에 의해 특정될 수 있는데, 여기서 x 및 xx는 정수이다. 가령, "C1-4알킬"은 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기이다.
용어 "화합물" 또는 "세포독성 화합물"은 교체가능하게 이용된다. 이들은 구조 또는 화학식 또는 임의의 유도체가 본 발명에서 개시된 화합물, 또는 참조로서 편입된 구조 또는 화학식 또는 임의의 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 또한, 본 발명에서 개시된 모든 화학식의 화합물의 입체이성질체, 기하학적 이성질체, 호변체, 용매화합물, 대사산물 및 염 (가령, 제약학적으로 허용되는 염)을 포함한다. 상기 용어는 또한, 임의의 전술한 것들의 임의의 용매화합물, 수화물 및 다형체를 포함한다. 본 출원에서 설명된 발명의 일정한 양상에서 "입체이성질체," "기하학적 이성질체," "호변체," "용매화합물," "대사산물," "염," "접합체," "접합체 염," "용매화합물," "수화물," 또는 "다형체"의 특정한 열거는 용어 "화합물"이 이들 다른 형태의 열거 없이 이용되는 본 발명의 다른 양상에서 이들 형태의 의도된 생략으로서 해석되지 않아야 한다.
용어 "키랄"은 거울상 상대의 비중첩의 성질을 갖는 분자를 지칭하고, 반면 용어 "아키랄"은 그들의 거울상 상대와 겹침가능한 분자를 지칭한다.
용어 "입체이성질체"는 동일한 화학적 구성 및 연결성, 하지만 단일 결합 주변에서 회전에 의해 상호전환될 수 없는, 공간에서 원자의 상이한 방향을 갖는 화합물을 지칭한다.
"부분입체이성질체"는 2개 또는 그 이상의 키랄 중심을 갖고 분자가 서로의 거울상이 아닌 입체이성질체를 지칭한다. 부분입체이성질체는 상이한 물리적 성질, 예를 들면, 융점, 끓는점, 스펙트럼 성질 및 반응성을 갖는다. 부분입체이성질체의 혼합물은 고해상 분석적 절차, 예를 들면, 결정화, 전기이동 및 크로마토그래피 하에 분리될 수 있다.
"거울상이성질체"는 서로의 비중첩 거울상인, 화합물의 2가지 입체이성질체를 지칭한다.
본원에서 이용된 입체화학적 정의 및 규약은 일반적으로, S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill, Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; 및 Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994에 따른다. 본 발명의 화합물은 비대칭 또는 키랄 중심을 내포할 수 있고, 그리고 이런 이유로, 상이한 입체이성질체 형태에서 존재할 수 있다. 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 회전장애이성질체뿐만 아니라 이들의 혼합물, 예를 들면, 라세미 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 본 발명의 화합물의 모든 입체이성질체 형태는 본 발명의 일부를 형성하는 것으로 의도된다. 많은 유기 화합물은 광학적으로 활성 형태에서 존재하다, 다시 말하면, 이들은 평면 편광의 평면을 회전하는 능력을 갖는다. 광학적으로 활성 화합물을 설명함에 있어서, 접두사 D 및 L, 또는 R 및 S는 키랄 중심(들) 주변에서 분자의 절대적 형상을 표시하는데 이용된다. 접두사 d 및 I 또는 (+) 및 (-)는 화합물에 의한 평면 편광의 회전의 징후를 명명하는데 이용되는데, (-) 또는 1은 상기 화합물이 좌선성이라는 것을 의미한다. (+) 또는 d가 접두사로 붙은 화합물은 우선성이다. 소정의 화학 구조에 대해, 이들 입체이성질체는 이들이 서로의 거울상이라는 점을 제외하고 동일하다. 특정한 입체이성질체는 또한, 거울상이성질체로서 지칭될 수 있고, 그리고 이런 이성질체의 혼합물은 종종, 거울상이성질성 혼합물로 불린다. 거울상이성질체의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라셈체로서 지칭되는데, 이것은 화학 반응 또는 과정에서 입체선택 또는 입체특이성이 없는 경우에 일어날 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라셈체"는 광학적 활성을 결여하는, 2개의 거울상이성질성 종류의 등몰 혼합물을 지칭한다.
용어 "호변체" 또는 "호변체 형태"는 낮은 에너지 장벽을 통해 호환성인 상이한 에너지의 구조 이성질체를 지칭한다. 가령, 양성자 호변체 (양성자성 호변체로서 또한 알려져 있음)는 양성자의 이주를 통한 상호전환, 예를 들면, 케토-에놀 및 이민-에나민 이성화를 포함한다. 원자가 호변체는 결합 전자 중에서 일부의 재편성에 의한 상호전환을 포함한다.
용어 "이민 반응성 시약"은 이민 기와 반응할 수 있는 시약을 지칭한다. 이민 반응성 시약의 실례는 아황산염 (H2SO3, H2SO2, 또는 양이온으로 형성된 HSO3 -, SO3 2- 또는 HSO2 -의 염), 메타중아황산염 (H2S2O5, 또는 양이온으로 형성된 S2O5 2-의 염), 모노, 디, 트리 및 테트라- 티오포스페이트 (PO3SH3, PO2S2H3, POS3H3, PS4H3, 또는 양이온으로 형성된 PO3S3-, PO2S2 3-, POS3 3- 또는 PS4 3-의 염), 티오 인산염 에스테르 ((RiO)2PS(ORi), RiSH, RiSOH, RiSO2H, RiSO3H), 다양한 아민 (히드록실 아민 (가령, NH2OH), 히드라진 (가령, NH2NH2), NH2O-Ri, Ri'NH-Ri, NH2-Ri), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2 , 티오황산염 (H2S2O3, 또는 양이온으로 형성된 S2O3 2-의 염), 디티오산염 (H2S2O4, 또는 양이온으로 형성된 S2O4 2-의 염), 포스포로디티오에이트 (P(=S)(ORk)(SH)(OH) 또는 양이온으로 형성된 이의 염), 히드록삼산 (RkC(=O)NHOH 또는 양이온으로 형성된 염), 히드라지드 (RkCONHNH2), 포름알데히드 술폭실산염 (HOCH2SO2H, 또는 양이온으로 형성된 HOCH2SO2 -의 염, 예를 들면, HOCH2SO2 -Na+), 당화된 뉴클레오티드 (가령, GDP-만노오스), 플루다라빈 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 여기서 Ri 및 Ri'는 각각 독립적으로, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지된 알킬이고, 그리고 -N(Rj)2, -CO2H, -SO3H 및 -PO3H에서 선택되는 최소한 하나의 치환체로 치환되고; Ri 및 Ri'는 본원에서 설명된 알킬에 대한 치환체로 임의선택적으로 더욱 치환될 수 있고; Rj는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지된 알킬이고; 그리고 Rk는 선형, 분지된 또는 환상 알킬, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 또는 알키닐, 아릴, 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴이다 (바람직하게는, Rk는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지된 알킬이다; 더욱 바람직하게는, Rk는 메틸, 에틸 또는 프로필이다). 바람직하게는, 양이온은 일가 양이온, 예를 들면, Na+ 또는 K+이다. 바람직하게는, 이민 반응성 시약은 아황산염, 히드록실 아민, 요소 및 히드라진에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 이민 반응성 시약은 NaHSO3 또는 KHSO3이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 관용구 "제약학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 제약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 예시적인 염은 황산염, 구연산염, 아세트산염, 옥살산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 질산염, 중황산염, 인산염, 산 인산염, 이소니코틴산염, 젖산염, 살리실산염, 산 구연산염, 주석산염, 올레산염, 탄닌산염, 판토텐산염, 중주석산염, 아스코르브산염, 숙신산염, 말레인산염, 겐티시네이트, 푸마르산염, 글루콘산염, 글루쿠론산염, 사카라이드산염, 포름산염, 벤조산염, 글루타민산염, 메탄술폰산염 "메실레이트," 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염, 파모산염 (다시 말하면, 1,1'-메틸렌-비스-(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염, 알칼리 금속 (가령, 나트륨 및 칼륨) 염, 알칼리성 토류 금속 (가령, 마그네슘) 염, 그리고 암모늄 염을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 제약학적으로 허용되는 염은 다른 분자, 예를 들면, 아세트산염 이온, 숙신산염 이온 또는 다른 반대 이온의 포함을 수반할 수 있다. 반대 이온은 부모 화합물에서 전하를 안정시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 게다가, 제약학적으로 허용되는 염은 구조 내에 하나 이상의 하전된 원자를 가질 수 있다. 복수의 하전된 원자가 제약학적으로 허용되는 염의 일부인 경우는 복수의 반대 이온을 가질 수 있다. 따라서, 제약학적으로 허용되는 염은 하나 또는 그 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 또는 그 이상의 반대 이온을 가질 수 있다.
본 발명의 화합물이 염기이면, 원하는 제약학적으로 허용되는 염은 당분야에서 가용한 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 무기 산, 예를 들면, 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 메탄술폰산, 인산 등으로, 또는 유기 산, 예를 들면, 아세트산, 말레산, 숙신산, 만델산, 푸마르산, 말론산, 피루브산, 옥살산, 글리콜산, 살리실산, 피라노시딜산, 예를 들면, 글루쿠론산 또는 갈락투론산, 알파 히드록시산, 예를 들면, 구연산 또는 주석산, 아미노산, 예를 들면, 아스파르트산 또는 글루타민산, 방향족산, 예를 들면, 벤조산 또는 신남산, 술폰산, 예를 들면, p-톨루엔술폰산 또는 에탄술폰산 등으로 유리 염기의 처리에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물이 산이면, 원하는 제약학적으로 허용되는 염은 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 무기 또는 유기 염기, 예를 들면, 아민 (일차, 이차 또는 삼차), 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리성 토류 금속 수산화물, 또는 기타 유사한 것으로 유리 산의 처리에 의해 제조될 수 있다. 적합한 염의 예시적인 실례는 아미노산, 예를 들면, 글리신 및 아르기닌, 암모니아, 일차, 이차 및 삼차 아민, 그리고 환상 아민, 예를 들면, 피페리딘, 모르폴린 및 피페라진으로부터 유래된 유기 염, 그리고 나트륨, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 알루미늄 및 리튬으로부터 유래된 무기 염을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "용매화합물"은 비공유 분자간 힘에 의해 결합된 용매, 예를 들면, 물, 이소프로판올, 아세톤, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세트산염, 아세트산, 그리고 에탄올아민 디클로로메탄, 2-프로판올, 또는 기타 유사한 것의 화학양론적 또는 비화학양론적 양을 더욱 포함하는 화합물을 의미한다. 화합물의 용매화합물 또는 수화물은 이민 모이어티의 용매화 또는 수화를 유발하기 위한, 화합물에 최소한 1 몰 당량의 히드록실릭 용매, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 또는 물의 첨가에 의해 쉽게 제조된다.
"대사산물" 또는 "분해대사산물"은 체내에서 특정 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 접합체, 또는 이의 염의 물질대사 또는 분해대사를 통해 생산된 산물이다. 화합물, 이의 유도체 또는 이의 접합체의 대사산물은 당분야에서 공지된 일과적인 기술을 이용하여 확인될 수 있고, 그리고 이들의 활성은 시험, 예를 들면, 본원에서 설명된 것들을 이용하여 결정될 수 있다. 이런 산물은 예로서, 투여된 화합물의 산화, 히드록실화, 환원, 가수분해, 아미드화, 탈아미드화, 에스테르화, 탈에스테르화, 효소적 개열, 기타 등등으로부터 발생할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 이의 유도체 또는 이의 접합체를 이의 물질대사 산물을 산출하는데 충분한 기간 동안 포유동물과 접촉시키는 것을 포함하는 과정에 의해 생산된 화합물, 이의 유도체 또는 이의 접합체를 비롯하여, 본 발명의 화합물, 이의 유도체 또는 이의 접합체의 대사산물을 포함한다.
관용구 "제약학적으로 허용되는"은 물질 또는 조성물이 제제를 구성하는 다른 성분 및/또는 그것으로 치료되는 포유동물과 화학적으로 및/또는 독물학적으로 양립성이어야 한다는 것을 지시한다.
용어 "보호 기" 또는 "보호 모이어티"는 화합물, 이의 유도체 또는 이의 접합체 상에서 다른 기능기와 반응하면서, 특정 기능성을 차단하거나 또는 보호하는데 통상적으로 이용되는 치환체를 지칭한다. 가령, "아민-보호 기" 또는 "아미노-보호 모이어티"는 화합물 내에서 아미노 기능성을 차단하거나 또는 보호하는, 아미노 기에 부착된 치환체이다. 이런 기는 당분야에서 널리 공지되고 (가령, P. Wuts and T. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 7, J. Wiley & Sons, NJ를 참조하고), 그리고 카바메이트, 예를 들면, 메틸 및 에틸 카바메이트, FMOC, 치환된 에틸 카바메이트, 1,6-β-제거에 의해 개열된 카바메이트 (또한 "자기 희생"으로 명명됨), 요소, 아미드, 펩티드, 알킬 및 아릴 유도체에 의해 구현된다. 적합한 아미노-보호 기는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐 (BOC), 벤질옥시카르보닐 (CBZ) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐 (Fmoc)을 포함한다. 보호 기 및 이들의 용도에 관한 일반적인 설명을 위해, P. G.M. Wuts & T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2007을 참조한다.
용어 "아미노산"은 자연발생 아미노산 또는 비자연발생 아미노산을 지칭한다. 한 구체예에서, 아미노산은 NH2-C(Raa'Raa)-C(=O)OH에 의해 대표되고, 여기서 Raa 및 Raa'는 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 임의선택적으로 치환된 선형, 분지된 또는 환상 알킬, 알케닐 또는 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릴이거나, 또는 Raa 및 N 말단 질소 원자는 함께 헤테로환상 고리를 형성할 수 있다 (가령, 프롤린에서처럼). 용어 "아미노산 잔기"는 아미노산, 예를 들면, -NH-C(Raa'Raa)-C(=O)O-의 아민 및/또는 카르복시 단부로부터 하나의 수소 원자가 제거될 때 상응하는 잔기를 지칭한다.
용어 "양이온"은 양성 전하를 갖는 이온을 지칭한다. 양이온은 일가 (가령, Na+, K+, NH4 + 등), 이가 (가령, Ca2+, Mg2+ 등) 또는 다가 (가령, Al3+ 등)일 수 있다. 바람직하게는, 양이온은 일가이다.
용어 "반응성 에스테르 기"는 아민 기와 쉽게 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있는 일군의 에스테르 기를 지칭한다. 예시적인 반응성 에스테르 기는 N-히드록시숙신이미드 에스테르, N-히드록시프탈리미드 에스테르, N-히드록시 술포-숙신이미드 에스테르, 파라-니트로페닐 에스테르, 디니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르 및 이들의 유도체를 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 여기서 상기 유도체는 아미드 결합 형성을 용이하게 한다. 일정한 구체예에서, 반응성 에스테르 기는 N-히드록시숙신이미드 에스테르 또는 N-히드록시 술포-숙신이미드 에스테르이다.
용어 "아민 반응성 기"는 아민 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 기를 지칭한다. 예시적인 아민 반응성 기는 반응성 에스테르 기, 아실 할로겐화물, 술포닐 할로겐화물, 이미도에스테르, 또는 반응성 티오에스테르 기를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 아민 반응성 기는 반응성 에스테르 기이다. 한 구체예에서, 아민 반응성 기는 N-히드록시숙신이미드 에스테르 또는 N-히드록시 술포-숙신이미드 에스테르이다.
용어 "티올-반응성 기"는 티올 (-SH) 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 기를 지칭한다. 예시적인 티올-반응성 기는 말레이미드, 할로아세틸, 알로아세트아미드, 비닐 술폰, 비닐 술폰아미드 또는 비닐 피리딘을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 티올-반응성 기는 말레이미드이다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다.
구체예가 본원에서 언어 "포함하는"으로 설명될 때는 언제나, "으로 구성되는" 및/또는 "으로 본질적으로 구성되는"의 면에서 설명된 다른 모든 면에서 유사한 구체예 역시 제공되는 것으로 이해된다.
본원에서 관용구, 예를 들면, "A 및/또는 B"에서 이용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A와 B," "A 또는 B," "A," 그리고 "B"를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 관용구, 예를 들면, "A, B 및/또는 C"에서 이용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 다음의 구체예 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 그리고 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 그리고 C (단독).
항체, 화합물 및 면역접합체 명명법
본원에서 이용된 바와 같이, 항-CD123 항체, 세포독성 화합물 및 이들의 면역접합체에 이용된 명명법은 일반적으로 다음의 의미를 채택한다.
CD123-3, -6 및 -14 (또는 CD123 Mu-3, -6 및 -14; 또는 muCD123-3, -6 및 14)는 3개의 뮤린 항-CD123 단일클론 항체이다. 중쇄와 경쇄의 CDR1-3 서열 (VH-CDR1-3 및 VL-CDR1-3)은 연관된 서열 번호: 1-25와 함께, 표 1 및 2에서 제공된다. 중쇄 가변 영역 (HCVR) 서열은 연관된 서열 번호: 26, 28 및 30과 함께 표 3A에서 제공된다. 이들의 경쇄 가변 영역 (LCVR) 서열은 연관된 서열 번호: 27, 29 및 31과 함께 표 4A에서 제공된다. 뮤린 항체의 전장 중쇄 (HC) 서열은 표 5에서 제공되고 (서열 번호: 42, 44 및 46), 그리고 뮤린 항체의 전장 경쇄 (LC) 서열은 표 6에서 제공된다 (서열 번호: 43, 45 및 47).
chCD123-3, -6 및 -14는 뮤린 중쇄와 경쇄 가변 영역 및 인간 불변 영역 서열을 갖는 상응하는 뮤린-인간 키메라 항체이다. 가령, 키메라 항체 chCD123-6은 각각, 중쇄와 경쇄에 대한 인간 IgG1 및 카파 불변 서열과 함께, 각각 서열 번호: 28 및 29의 생쥐 HCVR 및 LCVR로 구성된다. 실시예 3을 참조한다.
huCD123-3, -6 및 -14는 상응하는 인간화 항체이다. 인간화가 6개의 상응하는 뮤린 CDR 영역 (HC 및 LC CDR1-3)의 CDR 합체에 의하여 이루어질 때, 문자 "G"가 클론 명칭 바로 뒤에 오고, 이것은 차례로, 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열의 기원을 명명하는 버전 번호가 이어진다. 따라서 huCD123-6Gv4.6은 상응하는 muCDR123-6 항체로부터 6개 CDR 영역을 인간 경쇄 가변 영역 Gv4 및 중쇄 가변 영역 Gv6 위에 합체하는 ("G") 것에 기초된 인간화 CD123 항체를 지칭한다. 유사하게, -Gv4.7은 인간 경쇄 가변 영역 Gv4 및 중쇄 가변 영역 Gv7를 포함하고; 그리고 -Gv1.1은 인간 경쇄 가변 영역 Gv1 및 중쇄 가변 영역 Gv1을 포함한다.
3개의 HCVR 서열, huCD123-6Gv1, -Gv6 및 -Gv7은 표 3A에서 제공되고 (서열 번호: 32 및 34, 여기서 서열 번호: 34는 -Gv6 및 -Gv7 둘 모두를 나타내는데, 그 이유는 이들이 단지 2번째 잔기 Xaa에서만 다르기 때문이다), 그리고 이들의 DNA 코딩 서열은 표 3B에서 제공된다 (서열 번호: 62, 64 및 66). 3개의 전장 HC 서열, huCD123-6Gv1, -Gv6 및 -Gv7은 표 5에서 제공된다 (서열 번호: 48 및 50, 여기서 서열 번호: 50은 전장 -Gv6 및 -Gv7 둘 모두를 나타내는데, 그 이유는 이들이 단지 2번째 잔기 Xaa에서만 다르기 때문이다).
2개의 LCVR 서열, huCD123-6Gv1 및 -Gv4는 표 4A에서 제공되고 (서열 번호: 33 및 35), 그리고 이들의 DNA 코딩 서열은 표 4B에서 제공된다 (서열 번호: 63 및 65). 2개의 전장 LC 서열, huCD123-6Gv1 및 -Gv4는 표 6에서 제공된다 (서열 번호: 49 및 51).
인간화가 표면치환에 의하여 이루어질 때, 표면치환된 중쇄 서열은 뮤린 CD123 항체 클론 번호 직후에 "rh"에 의해 지정되고, 그리고 표면치환된 서열의 2가지 버전, v1.0 또는 v1.1 중에서 한 가지에 의해 더욱 지정된다. 따라서 huCD123-6rhv1.0 및 -rhv1.1은 각각, 1.0 및 1.1의 버전 지정을 갖는, muCD123-6 항체에 상응하는 CDR 영역을 갖는 표면치환된 중쇄 서열이다. 표 3A에서 HCVR 서열 번호: 39 및 40, 그리고 표 3B에서 서열 번호: 68 및 69를 참조한다. 또한, 표 5에서 전장 HC 서열 번호: 59 및 60을 참조한다.
유사하게, 표면치환된 경쇄 서열의 유일 버전, huCD123-6rlv1.0은 표 4A에서 LCVR 서열 번호: 41 및 표 6에서 전장 LC 서열 번호: 61을 갖는다.
huCD123-6rhv1.0 및 huCD123-6rlv1.0을 갖는 표면치환된 항체는 huCD123-6Rv1.0이고; 그리고 huCD123-6rhv1.1 및 huCD123-6rlv1.0을 갖는 표면치환된 항체는 huCD123-6Rv1.1이다.
NTS2 또는 줄여서 "S2"는 중쇄의 N 말단에서 가공된 Ser을 갖는 항체를 지칭한다. huCD123-6Gv6/7의 S2 변이체는 표 3A에서 HCVR 서열 서열 번호: 38 및 표 5에서 전장 HC 단백질 서열 서열 번호: 53을 갖는다.
유사하게, NTS3 또는 줄여서 "S3"은 경쇄의 N 말단에서 가공된 Ser을 갖는 항체를 지칭한다. huCD123-6Gv4의 S3 변이체는 표 4A에서 LCVR 서열 서열 번호: 37 및 표 6에서 전장 LC 단백질 서열 서열 번호: 58을 갖는다.
가공된 N 말단 Ser을 포함하는 항체 (S2 또는 S3)는 산화된 N 말단 Ser을 통해, 또는 "전통적인" Lys 연쇄를 통해 세포독성 약물 / 작용제와 접합될 수 있다. 약물 연쇄가 산화된 N 말단 Ser을 통해 이루어지면, 접합체 명칭은 "SeriMab" 지정을 내포한다. 약물 연쇄가 Lys을 통해 이루어지면, 접합체 명칭은 SeriMab을 내포하지 않는다 (N 말단에서 가공된 Ser의 존재를 신호하는 S2 또는 S3 지정이 있다는 사실에도 불구하고). 특정 연쇄 유형은 또한, 세포독소 반응성 기에 기초하여 명확할 것이다. 가령, huCD123-6Gv4.7S3-SeriMab-D8은 경쇄 상에서 산화된 N 말단 Ser을 통한, D8 및 인간화 CD123 항체 huCD123-6Gv4.7S3 사이에 접합체를 지칭한다. 인간화 CD123 항체는 합체된 뮤린 CD123-6 CDR 영역, 인간 LC Gv4 및 중쇄 Gv7을 갖고, 그리고 경쇄의 N 말단이 가공된 Ser (S3)을 갖는다. 대조적으로, huCD123-6Gv4.7S3-sSPDB-D1은 술폰화된 SPDB 링커를 거쳐 Lys 연쇄를 통한, D1 및 동일한 인간화 CD123 항체 huCD123-6Gv4.7S3 사이에 접합체를 지칭한다.
일정한 구체예에서, 경쇄와 중쇄 N 말단 둘 모두 가공된 Ser을 내포하면, "S2S3" 또는 "S2S3-SeriMab"가 항체 명칭에서 나타날 수 있다.
본 발명의 일정한 항체는 중쇄 CH3 도메인 내에, 서열 번호: 54에서 마지막 Cys로부터 5번째의 동일한 Kabat 위치에 상응하는 위치에서 가공된 Cys를 갖는다. 이런 HCs 또는 이런 HCs를 포함하는 항체는 지정 CysMab를 내포한다. 따라서 huCD123-6Gv4.6-CysMab는 합체된 muCD123-6 CDR 영역을 갖고, 인간 경쇄 Gv4 및 중쇄 Gv6 서열에 기초되는 인간화 CD123 항체인데, 여기서 가공된 Cys는 HC CH3 영역 내에, 서열 번호: 54에서 마지막 Cys로부터 5번째에 상응하는 위치에서 위치된다. 유사하게, 이의 중쇄 서열은 huCD123-6Gv6-CysMab이다. 이에 더하여, huCD123-6Gv4.6S2-CysMab는 다른 모든 면에서 동일하지만, 중쇄의 N 말단에서 가공된 Ser을 갖고, 그리고 이의 중쇄 서열은 huCD123-6Gv6S2-CysMab이다.
앞서 설명된 표면치환된 항체는 경쇄 (표면치환된 항체의 S3 변이체) 또는 중쇄 (표면치환된 항체의 S2 변이체), 또는 둘 모두 (하기를 참조한다)에서 N 말단 Ser을 내포하도록 더욱 가공될 수 있다. 대안으로 또는 이에 더하여, 표면치환된 항체는 중쇄 CH3 도메인 내에, 서열 번호: 54에서 마지막 Cys로부터 5번째의 동일한 Kabat 위치에 상응하는 위치에서 가공된 Cys를 가질 수 있다 (표면치환된 항체의 CysMab 버전). 표면치환된 항체는 가공된 Cys 및 N 말단 Ser 둘 모두를 가질 수 있다.
하지만, 이런 CysMab 및 세포독소 사이에 형성된 접합체에서, 최소한 이론적으로, 세포독소는 Cys를 통해 또는 전통적인 Lys를 통해 CysMab에 연결될 수 있다. 하지만, 본원에서 이용된 바와 같이, 특정한 지시가 없으면, CysMab 지정을 갖는 접합체는 Cys-연쇄 (Lys 연쇄가 아님)를 통한 CysMab 및 세포독소 사이에 접합체를 지칭한다. 특정 연쇄 유형은 또한, 세포독소 반응성 기에 기초하여 명확할 것이다.
상기 일반적인 명명법의 다른 변이 또는 조합 또한 예기되고, 그리고 당업자에게 쉽게 명확할 것이다. 가령, huCD123-6Rv1.1-CysMab는 HC CH3 영역 내에, 서열 번호: 54에서 마지막 Cys로부터 5번째에 상응하는 위치에서 위치된 가공된 Cys를 갖는 huCD123-6의 표면치환된 버전 (v1.1)이다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Lys 측쇄 아미노 기, Cys 측쇄 티올 기, 또는 산화된 N 말단 Ser/Thr과의 연쇄를 통해, 일정한 세포독성 작용제에 접합될 수 있다. 본 명세서 (실시예 포함)에서 설명된 일정한 대표적인 (무제한적) 세포독성 작용제가 예시 목적으로 아래에 열거된다. 주목할 것은 대부분의 화합물, 예를 들면, D1, D2, D4, DGN462, D3, D6 등이 일정한 실례에서 인돌리노벤조디아제핀 단위체 중에서 하나에서 술폰화될 수 있다는 점이다 (여기에는 도시되지 않지만, 도면 17 화합물 sD1, 도면 15 화합물 sDGN462, 그리고 도면 16 화합물 sD8을 참조한다). 화합물 D5'의 경우, 양쪽 인돌리노벤조디아제핀 단위체가 술폰화될 수 있다.
Figure 112018009762973-pct00310
Figure 112018009762973-pct00311
주목할 것은 여러 작용제가 세포독소를 상이한 항체 측쇄에 연결하기 위해 필요한 상이한 연쇄 화학 (다시 말하면, Lys-연쇄, Cys-연쇄, 산화된 N 말단 Ser 연쇄)으로 인해 단지 약간만 다르다는 점이다. 그럼에도 불구하고, 이들 관련된 세포독소는 상이한 "D" 지정이 제공된다. D1 및 D4뿐만 아니라 D2, D5 및 D8을 참조한다.
주제 항체 및 세포독성 작용제의 접합체는 일반적으로, 앞서 설명된 바와 같은 항체 및 세포독성 작용제의 명명법에 따른다.
가령, huCD123-6Gv4.6-술포-SPDB-D1은 상기 항체의 하나 또는 그 이상의 Lys 잔기에서, 술폰화된 SPDB 링커를 통한 화합물 D1에 huCD123-6Gv4.6 항체의 접합체이다. huCD123-6-CX1-1-DM1은 상기 항체의 Lys 잔기 중에서 하나 또는 그 이상에서, "CX1-1 링커"로 명명된 트리글리실 링커를 통해 세포독성 작용제 DM1과 접합된 huCD123-6 항체의 접합체이다. 실시예 9e를 참조한다.
한 가지 주목할 만한 예외는 도면 7b 및 17에서 도시된 접합체 huCD123-6-SeriMab-sD1인데, 여기서 huCD123-6-SeriMab 및 sD1 세포독소 사이에 짧은 링커 서열이 접합체 명칭에서 명시적으로 언급되지 않는다. 유사하게, 도면 15에서 접합체 huCD123-6-SeriMab-sDGN462 역시 상기 일반적인 규칙에 대한 예외이다.
2. CD123-결합 작용제
첫 번째 양상에서, 본 발명은 CD123/IL-3Rα, 예를 들면, 인간 CD123/IL-3Rα에 특이적으로 결합하는 작용제를 제공한다. 이들 작용제는 본원에서 일반적으로 "CD123/IL-3Rα-결합 작용제"로서 지칭된다. 일정한 구체예에서, CD123/IL-3Rα-결합 작용제는 항체 또는 이들의 항원 결합 단편 (또는 단순함을 위해 "항체"), 이들의 면역접합체 또는 이들의 폴리펩티드이다.
CD123/IL-3Rα의 인간 및 다른 종에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 당분야에서 공지된다. 가령, NCBI RefSeq NP_002174에서 묘사된 바와 같은 인간 CD123/IL-3Rα 스플라이싱 변이체 1 단백질 서열은 아래에 재현된다:
1 MVLLWLTLLL IALPCLLQTK EDPNPPITNL RMKAKAQQLT WDLNRNVTDI ECVKDADYSM
61 PAVNNSYCQF GAISLCEVTN YTVRVANPPF STWILFPENS GKPWAGAENL TCWIHDVDFL
121 SCSWAVGPGA PADVQYDLYL NVANRRQQYE CLHYKTDAQG TRIGCRFDDI SRLSSGSQSS
181 HILVRGRSAA FGIPCTDKFV VFSQIEILTP PNMTAKCNKT HSFMHWKMRS HFNRKFRYEL
241 QIQKRMQPVI TEQVRDRTSF QLLNPGTYTV QIRARERVYE FLSAWSTPQR FECDQEEGAN
301 TRAWRTSLLI ALGTLLALVC VFVICRRYLV MQRLFPRIPH MKDPIGDSFQ NDKLVVWEAG
361 KAGLEECLVT EVQVVQKT (서열 번호: 36)
상기 서열은 CD123/IL-3R 알파 전구체 사슬 단백질을 보여주는데, 이것은 세포외 도메인 (잔기 1-306, 18-잔기 N 말단 신호 펩티드 포함), 20개 아미노산 막경유 도메인, 그리고 52개 아미노산의 짧은 세포질 꼬리를 내포하는 378개 아미노산에 의해 구성된다.
NCBI RefSeq NM_002183에서 묘사된 바와 같은 인간 CD123/IL-3Rα 스플라이싱 변이체 1 핵산 서열은 아래에 재현된다:
1 GTCAGGTTCA TGGTTACGAA GCTGCTGACC CCAGGATCCC AGCCCGTGGG AGAGAAGGGG
61 GTCTCTGACA GCCCCCACCC CTCCCCACTG CCAGATCCTT ATTGGGTCTG AGTTTCAGGG
121 GTGGGGCCCC AGCTGGAGGT TATAAAACAG CTCAATCGGG GAGTACAACC TTCGGTTTCT
181 CTTCGGGGAA AGCTGCTTTC AGCGCACACG GGAAGATATC AGAAACATCC TAGGATCAGG
241 ACACCCCAGA TCTTCTCAAC TGGAACCACG AAGGCTGTTT CTTCCACACA GTACTTTGAT
301 CTCCATTTAA GCAGGCACCT CTGTCCTGCG TTCCGGAGCT GCGTTCCCGA TGGTCCTCCT
361 TTGGCTCACG CTGCTCCTGA TCGCCCTGCC CTGTCTCCTG CAAACGAAGG AAGATCCAAA
421 CCCACCAATC ACGAACCTAA GGATGAAAGC AAAGGCTCAG CAGTTGACCT GGGACCTTAA
481 CAGAAATGTG ACCGATATCG AGTGTGTTAA AGACGCCGAC TATTCTATGC CGGCAGTGAA
541 CAATAGCTAT TGCCAGTTTG GAGCAATTTC CTTATGTGAA GTGACCAACT ACACCGTCCG
601 AGTGGCCAAC CCACCATTCT CCACGTGGAT CCTCTTCCCT GAGAACAGTG GGAAGCCTTG
661 GGCAGGTGCG GAGAATCTGA CCTGCTGGAT TCATGACGTG GATTTCTTGA GCTGCAGCTG
721 GGCGGTAGGC CCGGGGGCCC CCGCGGACGT CCAGTACGAC CTGTACTTGA ACGTTGCCAA
781 CAGGCGTCAA CAGTACGAGT GTCTTCACTA CAAAACGGAT GCTCAGGGAA CACGTATCGG
841 GTGTCGTTTC GATGACATCT CTCGACTCTC CAGCGGTTCT CAAAGTTCCC ACATCCTGGT
901 GCGGGGCAGG AGCGCAGCCT TCGGTATCCC CTGCACAGAT AAGTTTGTCG TCTTTTCACA
961 GATTGAGATA TTAACTCCAC CCAACATGAC TGCAAAGTGT AATAAGACAC ATTCCTTTAT
1021 GCACTGGAAA ATGAGAAGTC ATTTCAATCG CAAATTTCGC TATGAGCTTC AGATACAAAA
1081 GAGAATGCAG CCTGTAATCA CAGAACAGGT CAGAGACAGA ACCTCCTTCC AGCTACTCAA
1141 TCCTGGAACG TACACAGTAC AAATAAGAGC CCGGGAAAGA GTGTATGAAT TCTTGAGCGC
1201 CTGGAGCACC CCCCAGCGCT TCGAGTGCGA CCAGGAGGAG GGCGCAAACA CACGTGCCTG
1261 GCGGACGTCG CTGCTGATCG CGCTGGGGAC GCTGCTGGCC CTGGTCTGTG TCTTCGTGAT
1321 CTGCAGAAGG TATCTGGTGA TGCAGAGACT CTTTCCCCGC ATCCCTCACA TGAAAGACCC
1381 CATCGGTGAC AGCTTCCAAA ACGACAAGCT GGTGGTCTGG GAGGCGGGCA AAGCCGGCCT
1441 GGAGGAGTGT CTGGTGACTG AAGTACAGGT CGTGCAGAAA ACTTGAGACT GGGGTTCAGG
1501 GCTTGTGGGG GTCTGCCTCA ATCTCCCTGG CCGGGCCAGG CGCCTGCACA GACTGGCTGC
1561 TGGACCTGCG CACGCAGCCC AGGAATGGAC ATTCCTAACG GGTGGTGGGC ATGGGAGATG
1621 CCTGTGTAAT TTCGTCCGAA GCTGCCAGGA AGAAGAACAG AACTTTGTGT GTTTATTTCA
1681 TGATAAAGTG ATTTTTTTTT TTTTAACCCA AAA (서열 번호: 52)
다른 비인간 종으로부터 CD123/IL-3Rα의 단백질 및 핵산 서열은 각각, 당분야에서 공지된 서열 검색 도구 (가령, NCBI BLASTp 또는 BLASTn) 및 조회 서열로서 상기 단백질 및 핵산 서열을 이용하여, 공공 데이터베이스, 예를 들면, GenBank로부터 쉽게 검색될 수 있다.
비인간 종으로부터 이런 서열은 소정의 인간 서열 또는 서열의 영역"에 상응하는" 임의의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 쉽게 획득될 수 있도록, 많은 당분야에서 인정된 서열 정렬 도구 중에서 한 가지, 예를 들면, 본원에서 및 상기에서 설명된 것들을 이용하여 인간 서열에 맞추어 정렬될 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 가지 양상은 (a) 인간 CD123 항원의 아미노산 101 내지 346 내에 에피토프에 결합하고, 그리고 (b) 항원-양성 TF-1 세포에서 IL3-의존성 증식을 저해하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 36의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 일정한 구체예에서, 에피토프는 인간 CD123/IL-3Rα의 잔기 101-346에 상응하는 영역의 범위 안에 있다. 일정한 구체예에서, 에피토프는 서열 번호: 36의 잔기 101-204에 상응하는 영역의 범위 안에 있다. 일정한 다른 구체예에서, 에피토프는 서열 번호: 36의 잔기 205-346에 상응하는 영역의 범위 안에 있다. 일정한 구체예에서, 에피토프는 인간 CD123/IL-3Rα의 잔기 1-100에 상응하는 영역 내에 있지 않다.
일정한 구체예에서, CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 항체)는 IL3-의존성 신호전달, 예를 들면, CD123-양성 TF-1 세포의 IL-3-의존성 증식을 저해한다. 임의의 특정 이론에 의해 한정됨 없이, 본 발명의 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 항체)는 CD123, 예를 들면, 인간 CD123/IL-3Rα의 잔기 101-346 (가령, 잔기 101-204, 또는 205-346)에 상응하는 CD123 영역 내에 결합하고, 그리고 CD123 및 IL-3 리간드 사이에 생산적 결합 및/또는 CD123 및 공통 베타 사슬 CD131 사이에 생산적 결합을 예방하거나, 감소시키거나, 축소하거나, 또는 달리 저해하여, 감소된 또는 전폐된 IL-3 의존성 신호전달을 야기한다.
관련된 양상에서, 본 발명은 (a) 인간 CD123 항원의 아미노산 1 내지 100 내에 에피토프에 결합하고, 그리고 (b) 0.1 nM 또는 그 이하 (가령, 0.08 nM, 0.05 nM, 0.03 nM)의 IC50 값으로, 항원-양성 TF-1 세포에서 IL3-의존성 증식을 저해하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 항체)에 의한 결합은 백혈병성 줄기 세포 (LSCs), 백혈병 선조체 (LPs), 또는 백혈병성 모구의 증식을 저해하지만 (가령, 우선적으로 저해하지만), 정상적인 조혈 줄기 세포 (HSCs)의 증식을 실제적으로 저해하지 않는다.
세포 증식의 저해는 유세포분석법을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당분야에서 공지된 임의의 표준 검정을 이용하여 수행될 수 있다. 가령, 정상적인 HSCs, LSCs, LPs 및 백혈병 모구는 세포 표면 마커의 발현에서 차이에 근거된 유세포분석법을 이용하여 분리될 수 있고, 그리고 시험 작용제와 함께 배양한 후, 생존 세포 또는 남아있는 세포의 상대적 숫자는 정량적으로 계측되고 비교될 수 있다.
정상적인 HSCs와 비교하여 LSCs, LPs 또는 백혈병 모구의 세포 증식의 저해는 또한, 원발암 세포, 예를 들면, 원발성 AML 세포에서 시험관내 효능 검정을 이용하여 검정될 수 있다. 가령, AML 세포 (또는 정상적인 HSCs를 내포하는 정상적인 인간 골수 표본)는 다양한 농도의 주제 항-CD123 항체, 이들의 항원 결합 단편, 이들의 면역접합체, 또는 이들 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드에 24 시간 동안 노출될 수 있다. 비표적화 (아이소타입-정합된) 항체, 또는 면역접합체 (ADC) 대조 역시 검정에서 이용될 수 있다. 표본은 LSCs, LPs 또는 백혈병 모구를 향한 세포독성을 계측하기 위한 단기 액체 배양 (STLC) 검정; 및 LSCs 및 정상적인 HSCs에 대한 효과를 계측하기 위한 장기 액체 배양 (LTLC) 검정으로 나눠질 수 있다. STLC는 예로서, 반고체 MethoCult H4230 배지 (Stemcell technologies)에서 도말한 이후에 10-14 일에, 세포에서 집락 형성 단위를 계측하는데 이용될 수 있다. LTLC 검정은 5-7 주의 장기 배양 동안 성장 인자의 첨가로 유사하게 수행될 수 있다. 양쪽 검정에서, 초기에 도말된 세포의 숫자당 집락 형성 단위를 결정하기 위해 집락이 계수될 수 있다. LTLC 집락은 PCR 또는 FISH 또는 둘 모두를 이용하여, 암 (가령, AML) 분자 마커의 존재에 대해 더욱 분석될 수 있다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.3 nM 또는 그 이하의 해리 상수 (Kd)로 인간 CD123 항원-양성 세포에 결합한다. 일정한 구체예에서, 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 0.05 및 0.3 nM 사이에, 또는 0.05 및 0.2 nM 사이에, 또는 0.05 및 0.1 nM 사이에, 또는 0.01 nM 및 0.3 nM 사이에, 또는 0.01 nM 및 0.2 nM 사이에, 또는 0.01 nM 및 0.1 nM 사이에 Kd로 인간 CD123에 결합한다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 시노몰구스 원숭이 CD123에 결합한다. 일정한 구체예에서, 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 0.05 및 0.3 nM 사이에, 또는 0.05 및 0.2 nM 사이에, 또는 0.05 및 0.1 nM 사이에 Kd로 시노몰구스 원숭이 CD123에 결합한다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 실제적으로 유사한 결합 친화성으로 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD123 둘 모두에 결합한다. 일정한 구체예에서, 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 0.05 및 0.3 nM 사이에, 또는 0.05 및 0.2 nM 사이에, 또는 0.05 및 0.1 nM 사이에 Kd로 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD123 둘 모두에 결합한다.
일정한 구체예에서, Kd 값은 세포-기초된 결합 검정에 근거된다. 일정한 구체예에서, Kd 값은 유세포분석법에 의해 계측된다. 일정한 구체예에서, Kd 값은 표면 플라스몬 공명 (가령, BIOCORETM 표면 플라스몬 공명 시스템을 이용함으로써)에 의해 계측된다. 일정한 구체예에서, Kd 값은 방사면역검정 (RIA)에 의해 계측된다. 일정한 구체예에서, Kd는 임의의 다른 당분야에서 인정된 방법에 의해 계측된다.
일정한 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항원-양성 TF-1 세포에서 0.5 nM 또는 그 이하의 농도에서 IL3-의존성 증식의 최소한 50%를 저해한다.
일정한 구체예에서, CD123/IL-3Rα-결합 작용제는 3개의 CDR 영역 (가령, HCVR에 대한 CDR1-CDR3 및 LCVR에 대한 CDR1-CDR3)을 각각 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하는 CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이고, 여기서 HCVR 및 LCVR에 대한 복합 CDRs는 아래의 표 1 및 2에서 제공된 서열 중에서 한 가지이다.
Figure 112018009762973-pct00312
Figure 112018009762973-pct00313
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 각각, 3개의 순차적 상보성 결정 영역 (CDR) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역 또는 이의 단편, 여기서 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고, CDR1은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 1, 5 및 12, CDR2는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 2-3, 6-10 및 13-14, 그리고 임의선택적으로, CDR3은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 4, 11, 15 및 70; 그리고 b) 각각, 3개의 순차적 상보성 결정 영역 (CDR) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편, 여기서 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고, CDR1은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 16, 19-20, 23 및 72, CDR2는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 17, 21, 24 및 71, 그리고 임의선택적으로, CDR3은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 서열 번호: 18, 22 및 25.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 각각, 3개의 순차적 상보성 결정 영역 (CDR) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 최소한 하나의 중쇄 가변 영역 또는 이의 단편, 여기서 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고, CDR1은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 1, 5 및 12, CDR2는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 2-3, 6-10 및 13-14, 그리고 임의선택적으로, CDR3은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 4, 11 및 15; 그리고 b) 각각, 3개의 순차적 상보성 결정 영역 (CDR) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 최소한 하나의 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편, 여기서 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 제외하고, CDR1은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 16, 19-20 및 23, CDR2는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: 서열 번호: 17, 21 및 24, 그리고 임의선택적으로, CDR3은 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: 서열 번호: 18, 22 및 25.
일정한 구체예에서, 보존성 아미노산 치환은 CDR에서 Arg에 의한 Lys의 치환 (가령, 서열 번호: 6 및 7, 8 및 9, 그리고 19 및 20에서 Lys에서 Arg로 치환)을 포함한다. 일정한 구체예에서, 항체는 생쥐 CDR 영역을 포함하는 CDR-합체된 인간화 항체이고, 그리고 여기서 상기 항체의 하나 또는 그 이상 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개)의 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 버니어 구역 잔기는 생쥐 기원한다.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 1에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 2 또는 3에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 임의선택적으로, 서열 번호: 4에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 그리고 2) 서열 번호: 16에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 17에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 임의선택적으로, 서열 번호: 18에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 2이다. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 3이다.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 5에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 6, 7, 8, 9 또는 10에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 임의선택적으로, 서열 번호: 11에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 그리고 2) 서열 번호: 19 또는 20에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 21에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 임의선택적으로, 서열 번호: 22에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 6이고, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 번호: 19이다. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 7이고, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 번호: 19이다. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 8이고, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 번호: 19이다. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 9이고, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 번호: 19이다. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 10이고, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 번호: 19이다. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 6이고, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 번호: 20이다. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 7이고, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 번호: 20이다. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 8이고, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 번호: 20이다. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 9이고, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 번호: 20이다. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 10이고, 그리고 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 번호: 20이다. 중쇄 가변 영역 CDR2 및 경쇄 가변 영역 CDR1의 각 쌍별 조합의 경우에, 중쇄 가변 영역 CDR1 및 3은 각각, 서열 번호: 5 및 11이고, 그리고 경쇄 가변 영역 CDR2 및 3은 각각, 서열 번호: 21 및 22이다.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 12에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 13 또는 14에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 임의선택적으로, 서열 번호: 15에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 그리고 2) 서열 번호: 23에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 24에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 임의선택적으로, 서열 번호: 25에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 13이다. 일정한 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 번호: 14이다.
일정한 구체예에서, 한 항체의 경쇄 및 중쇄로부터 CDR1 서열 (가령, 서열 번호: 5 및 19)은 다른 항체의 경쇄 및 중쇄로부터 CDR2 서열 (가령, 서열 번호: 2 및 17)과 합동될 수 있고, 그리고 임의선택적으로, 동일한 항체 (가령, 서열 번호: 4 및 18, 또는 11 및 22) 또는 또 다른 항체 (가령, 서열 번호: 15 및 25)의 경쇄 및 중쇄로부터 CDR3 서열과 합동될 수 있다. 표 1에서 서열 번호: 1-25에 근거된 모든 가능한 조합, 특히 동일한 항체 번호에 관계하는 것들 (가령, 6개의 경쇄 및 중쇄 CDRs 모두 CD123-3으로부터, 또는 CD123-6으로부터, 또는 CD123-14로부터 비롯된다)은 모든 특정한 조합을 철저하게 열거하지 않더라도, 본원에서 예기된다.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 및 이들의 항원 결합 단편은 상기 임의의 한 가지 또는 그 이상 CDR 서열에서 1, 2 또는 3개의 연속 잔기에 걸쳐 보존된 아미노산 치환을 갖는다. 다시 말하면, 일부 구체예에서, 주제 항체 및 이들의 항원 결합 단편은 서열 번호: 1-25 중에서 임의의 한 가지 또는 그 이상에서 1, 2 또는 3개의 연속 잔기에 걸쳐 보존된 아미노산 치환을 가질 수 있다.
일정한 구체예에서, CD123/IL-3Rα-결합 작용제는 중쇄 가변 영역 (HCVR) 및 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하는 CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이고, 여기서 HCVR 및 LCVR은 아래의 표 3A 및 4A에서 제공된 서열 중에서 한 가지이다. HCVR 및 LCVR을 인코딩하는 선별된 상응하는 핵산 서열은 표 3B 및 4B에서 제공된다.
Figure 112018009762973-pct00314
Figure 112018009762973-pct00315
Figure 112018009762973-pct00316
Figure 112018009762973-pct00317
Figure 112018009762973-pct00318
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 및 40 (또는 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34 및 38)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VH 서열과 최소한 95% 동일한 VH 서열; 및/또는 b) 서열 번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 41 (또는 서열 번호: 27, 29, 31, 35 및 37)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VL 서열과 최소한 95% 동일한 VL 서열.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 및 40 (또는 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34 및 38)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VH 서열과 최소한 96% 동일한 VH 서열; 및/또는 b) 서열 번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 41 (또는 서열 번호: 27, 29, 31, 35 및 37)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VL 서열과 최소한 96% 동일한 VL 서열.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 및 40 (또는 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34 및 38)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VH 서열과 최소한 97% 동일한 VH 서열; 및/또는 b) 서열 번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 41 (또는 서열 번호: 27, 29, 31, 35 및 37)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VL 서열과 최소한 97% 동일한 VL 서열.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 및 40 (또는 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34 및 38)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VH 서열과 최소한 98% 동일한 VH 서열; 및/또는 b) 서열 번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 41 (또는 서열 번호: 27, 29, 31, 35 및 37)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VL 서열과 최소한 98% 동일한 VL 서열.
일정한 구체예에서, 항-CD123 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 및 40 (또는 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34 및 38)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VH 서열과 최소한 99% 동일한 VH 서열; 및/또는 b) 서열 번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 41 (또는 서열 번호: 27, 29, 31, 35 및 37)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VL 서열과 최소한 99% 동일한 VL 서열.
일정한 구체예에서, 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 및 40 (바람직하게는 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34 및 38) 및/또는 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 41 (또는 서열 번호: 27, 29, 31, 35 및 37)에 일정한 백분율의 서열 동일성을 갖는 CD123/IL-3Rα 항체 / 이의 항원 결합 단편은 보존성 아미노산 치환, 예를 들면, 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환에 의해서만 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 및 40 (또는 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34 및 38) 및/또는 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 41 (또는 서열 번호: 27, 29, 31, 35 및 37)과 상이하다. 일정한 구체예에서, 보존성 아미노산 치환은 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 또는 그 이상의 CDR 영역에서 1, 2 또는 3개의 연속 아미노산의 치환이다.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34, 38, 39 및 40 (또는 서열 번호: 26, 28, 30, 32, 34 및 38)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VH 서열과 동일한 VH 서열; 및/또는 b) 서열 번호: 27, 29, 31, 33, 35, 37 및 41 (또는 서열 번호: 27, 29, 31, 35 및 37)에 의해 대표되는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 참고 VL 서열과 동일한 VL 서열.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 및 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호: 26에서 진술된 바와 같은 VH 서열 및/또는 서열 번호: 27에서 진술된 바와 같은 VL 서열.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 및 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호: 28에서 진술된 바와 같은 VH 서열 및/또는 서열 번호: 29에서 진술된 바와 같은 VL 서열.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 및 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호: 30에서 진술된 바와 같은 VH 서열 및/또는 서열 번호: 31에서 진술된 바와 같은 VL 서열.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 및 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: 서열 번호: 34에서 진술된 바와 같은 VH 서열 및/또는 서열 번호: 35에서 진술된 바와 같은 VL 서열.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 및 이들의 항원 결합 단편은 다음과 같이 구성된 군에서 선택되는 서열 번호의 조합을 갖는 VH 서열 및 VL 서열을 포함한다: 32/33, 34/33, 38/33, 39/33, 40/33, 32/35, 34/35, 38/35, 39/35, 40/35, 32/37, 34/37, 38/37, 39/37, 40/37, 39/33, 39/35, 39/37, 39/41, 40/33, 40/35, 40/37, 그리고 40/41.
가령, 한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 39 또는 40에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, VH 서열은 서열 번호: 39에서 진술되고, 그리고 VL 서열은 서열 번호: 41에서 진술된다. 일정한 구체예에서, VH 서열은 서열 번호: 40에서 진술되고, 그리고 VL 서열은 서열 번호: 41에서 진술된다.
관련된 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 34에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 34에서 Xaa는 Phe (F)이다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 34에서 Xaa는 Val (V)이다.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 첫 번째 잔기가 Ser (S)에 의해 대체되는 점을 제외하고, 서열 번호: 39 또는 40에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 39 또는 40에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 첫 번째 잔기가 Ser (S)에 의해 대체되는 점을 제외하고, 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) N 말단 잔기가 Ser인 점을 제외하고, 그리고 서열 번호: 54의 마지막 잔기로부터 5번째에 상응하는 잔기가 Cys라는 점을 제외하고, 서열 번호: 59 또는 60에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 54의 마지막 잔기로부터 5번째에 상응하는 잔기가 Cys라는 점을 제외하고, 서열 번호: 59 또는 60에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) N 말단 잔기가 Ser인 점을 제외하고, 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 38에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 38에서 Xaa는 Phe (F)이다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 38에서 Xaa는 Val (V)이다.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 34에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 b) 서열 번호: 37에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 34에서 Xaa는 Phe (F)이다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 34에서 Xaa는 Val (V)이다.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 56에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 56에서 Xaa는 Phe (F)이다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 56에서 Xaa는 Val (V)이다.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 54에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 37에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 54에서 Xaa는 Phe (F)이다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 54에서 Xaa는 Val (V)이다.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 54의 마지막 잔기로부터 5번째에 상응하는 잔기가 Cys라는 점을 제외하고, 서열 번호: 59 또는 60에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 54에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 54에서 Xaa는 Phe (F)이다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 54에서 Xaa는 Val (V)이다.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 56에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 56에서 Xaa는 Phe (F)이다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 56에서 Xaa는 Val (V)이다.
다른 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 또는 이들의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: a) 서열 번호: 54에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 37에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 54에서 Xaa는 Phe (F)이다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 54에서 Xaa는 Val (V)이다.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체 및 이들의 항원 결합 단편은 CD123/IL-3Rα에 특이적으로 결합한다. 일정한 구체예에서, CD123/IL-3Rα 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD123/IL-3Rα에 특이적으로 결합하는 뮤린, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR-합체된 또는 표면치환된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체는 전장 항체이다. 전장 항체는 1-4개의 CDR (가령, 중쇄의 CDR1 및 CDR2; 중쇄와 경쇄의 CDR1 및 CDR2), 1-6개의 CDR 서열 (가령, 중쇄의 CDR1-CDR3; 중쇄와 경쇄의 CDR1-CDR3), 또는 LCVR 및/또는 HCVR에 의해 규정된 상기 항체 중에서 한 가지, 또는 표 5에서 중쇄 서열을 갖는 전장 항체 중에서 한 가지, 또는 표 6에서 경쇄 서열을 갖는 전장 항체 중에서 한 가지, 또는 표 5에서 중쇄 서열 및 표 6에서 경쇄 서열을 갖는 전장 항체 중에서 한 가지에 의해 규정된 상기 항체 중에서 한 가지를 포함할 수 있다.
Figure 112018009762973-pct00319
Figure 112018009762973-pct00320
Figure 112018009762973-pct00321
Figure 112018009762973-pct00322
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체는 다음을 포함하는 전장 항체이다: (a) 상기 전장 중쇄 서열 중에서 한 가지, 예를 들면, 표 5에서 전장 중쇄 서열 중에서 한 가지에 최소한 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄; 및/또는 (b) 상기 전장 경쇄 서열 중에서 한 가지, 예를 들면, 표 6에서 전장 경쇄 서열 중에서 한 가지에 최소한 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄. 일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체는 다음의 서열 번호로 구성된 군에서 선택되는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열 조합: 42/43, 44/45, 46/47, 48/49, 50/49, 53/49, 54/49, 56/49, 59/49, 60/49, 48/51, 50/51, 53/51, 54/51, 56/51, 59/51, 60/51, 48/58, 50/58, 53/58, 54/58, 56/58, 59/58, 60/58, 59/49, 59/51, 59/58, 59/61, 60/49, 60/51, 60/58, 그리고 60/61을 포함하는 전장 항체, 또는 이들의 전장 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열 중에서 한 가지에 최소한 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 항체이다.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체는 서열 번호: 59/61 및 60/61로 구성된 군에서 선택되는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열 조합을 포함하는 전장 항체, 또는 이들의 전장 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열 중에서 한 가지에 최소한 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 항체이다. 이런 항체는 경쇄, 중쇄, 또는 둘 모두에서 가공된 N 말단 Ser/Thr을 더욱 포함할 수 있다. 이런 항체는 중쇄 CH3 도메인 내에, 서열 번호: 54의 마지막 Cys로부터 5번째에 상응하는 위치에서 가공된 Cys를 더욱 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 항-CD123/IL-3Rα 항체는 CD123/IL-3Rα에 특이적으로 결합하는 뮤린, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체이다. 일정한 구체예에서, 전장 서열 번호 중에서 한 가지에 일정한 백분율의 서열 동일성을 갖는 항-CD123/IL-3Rα 항체는 보존성 아미노산 치환에 의해서만, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 연속 보존성 아미노산 치환에 의해서만 이런 서열 번호와 상이하다. 일정한 구체예에서, 보존성 아미노산 치환은 CDRs 외부이다.
일정한 구체예에서, 이의 항원 결합 단편은 상기 항체 중에서 한 가지의 Fab, Fd, Fab', F(ab')2, 단일 사슬 Fv 또는 scFv, 이황화 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgG△CH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc이거나 또는 이것을 포함한다.
관련된 양상에서, 본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이들의 항원 결합 단편 중에서 한 가지, 상기 VH 및/또는 VL 서열 중에서 한 가지, 상기 HCVR 및/또는 LCVR 중에서 한 가지, 또는 상기 HCVR 및/또는 LCVR의 CDR 서열(들) 중에서 한 가지를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 폴리펩티드는 예로서, 비항체 단백질 또는 도메인과의 융합일 수 있다. 일정한 구체예에서, 융합 단백질은 슈도모나스 독소와의 융합이 아니다.
항원에 대한 항체의 친화성 또는 결합능은 당분야에서 널리 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 유세포분석법, 효소-연결된 면역흡착성 검정 (ELISA), 또는 방사면역검정 (RIA), 또는 동역학 (가령, BIACORE™ 분석)을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 직접적인 결합 검정뿐만 아니라 경쟁적 결합 분석 형식이 쉽게 이용될 수 있다. 가령, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions," in Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); 그리고 본원에서 설명된 방법을 참조한다.
특정 항체-항원 상호작용의 계측된 친화성은 상이한 조건 (가령, 염 농도, pH, 온도) 하에 계측되면 변할 수 있다. 따라서, 친화성 및 다른 항원 결합 파라미터 (가령, KD 또는 Kd, k 온 , k 오프 )의 계측은 항체 및 항원의 표준화된 용액, 그리고 당분야에서 공지된 바와 같은 표준화된 완충액, 그리고 예를 들면, 본원에서 설명된 완충액으로 수행된다.
한 양상에서, 결합 검정은 표면 상에서 CD123/IL-3Rα 항원을 발현하는 세포에서 유세포분석법을 이용하여 수행될 수 있다. 가령, CD123/IL-3Rα-양성 세포는 100 μL FACS 완충액 (가령, 2% 정상적인 염소 혈청으로 보충된 RPMI-1640 배지)에서 표본당 1 x 105 세포를 이용하여, 변하는 농도의 항-CD123/IL-3Rα 항체와 함께 배양될 수 있다. 이후, 세포는 펠렛화되고, 세척되고, 그리고 100 μL의 FITC-접합된 염소-항생쥐 또는 염소-항인간 IgG-항체 (가령, 예로서 Jackson Laboratory로부터 획득가능하다, FACS 완충액에서 6 μg/mL)와 함께 1 시간 동안 배양될 수 있다. 이들 세포는 이후, 다시 한 번 펠렛화되고, FACS 완충액으로 세척되고, 그리고 1% 포름알데히드를 내포하는 200 μL의 PBS에서 재현탁된다. 표본은 예로서, HTS 다중웰 샘플러가 있는 FACSCalibur 유세포분석기를 이용하여 획득되고 CellQuest Pro를 이용하여 분석될 수 있다 (이들 모두 BD Biosciences, San Diego, US로부터). 각 표본에 대해, FL1에 대한 평균 형광 강도 (MFI)는 이출되고, 그리고 결합 곡선을 산출하기 위해 반-로그 플롯에서 항체 농도에 대하여 플롯팅될 수 있다. S자 모양 용량 반응 곡선은 결합 곡선에 적합되고, 그리고 EC50 값은 프로그램, 예를 들면, 디폴트 파라미터를 갖는 GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA)를 이용하여 계산된다. EC50 값은 각 항체에 대한 겉보기 해리 상수 "Kd" 또는 "KD"에 대한 척도로서 이용될 수 있다.
단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 예를 들면, Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495에 의해 설명된 것들을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법을 이용하여, 생쥐, 햄스터, 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구에 의한 생산을 이끌어내기 위해 면역화된다. 림프구는 또한, 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화 이후에, 림프구는 단리되고, 그리고 예로서, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 적합한 골수종 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성하고, 이들은 이후, 융합되지 않은 림프구 및 골수종 세포로부터 선별될 수 있다. 면역침전, 면역블롯팅, 또는 시험관내 결합 검정 (가령, 방사면역검정 (RIA); 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA))에 의해 결정될 때 선택된 항원에 대하여 특이적으로 지향된 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 이후, 표준 방법 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986)을 이용하여 시험관내 배양액으로서 또는 동물에서 생체내 복수 종양으로서 증식될 수 있다. 단일클론 항체는 이후, 다중클론 항체에 대해 설명된 바와 같이 배양 배지 또는 복수액으로부터 정제될 수 있다.
대안으로, 단일클론 항체는 또한, U.S. 특허 4,816,567에서 설명된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 이용하여 만들어질 수 있다. 단일클론 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예로서, 이러한 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해 성숙 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리되고, 그리고 그들의 서열은 전통적인 절차를 이용하여 결정된다. 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 이후, 적합한 발현 벡터 내로 클로닝되고, 이들은 숙주 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 만약 그렇지 않으면, 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염될 때, 단일클론 항체가 숙주 세포에 의해 산출된다. 또한, 원하는 종의 재조합 단일클론 항체 또는 이들의 단편은 기존 문헌에서 설명된 바와 같이, 원하는 종의 CDR을 발현하는 파지 전시 라이브러리로부터 단리될 수 있다 (McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990; Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; and Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991).
단일클론 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 대안적 항체를 산출하기 위해, 재조합 DNA 기술을 이용한 다수의 상이한 방식으로 더욱 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 예로서 생쥐 단일클론 항체의 경쇄와 중쇄의 불변 도메인은 1) 예로서, 키메라 항체를 산출하기 위해 인간 항체의 이들 영역에 대해, 또는 2) 융합 항체를 산출하기 위해 비면역글로불린 폴리펩티드에 대해 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 단일클론 항체의 원하는 항체 단편을 산출하기 위해 절두되거나 또는 제거된다. 가변 영역의 부위-지향된 또는 고밀도 돌연변이유발이 단일클론 항체의 특이성, 친화성 등을 최적화하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 인간 CD123/IL-3Rα에 대한 단일클론 항체는 인간화 항체이다. 일정한 구체예에서, 이런 항체는 인간 개체에 투여될 때 항원성 및 HAMA (인간 항생쥐 항체) 반응을 감소시키기 위해 치료적으로 이용된다.
비인간 또는 인간 항체를 가공하거나, 인간화하거나 또는 표면치환하기 위한 방법 역시 이용될 수 있고 당분야에서 널리 공지된다. 인간화, 표면치환된 또는 유사하게 가공된 항체는 비인간인 공급원, 예를 들면, 하지만 제한 없이, 생쥐, 쥐, 토끼, 비인간 영장류 또는 다른 포유동물로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 "이입" 잔기로서 종종 지칭되는 잔기에 의해 대체되는데, 이들은 전형적으로, 공지된 인간 서열의 "이입" 가변, 불변 또는 다른 도메인으로부터 획득된다.
이런 이입된 서열은 당분야에서 공지된 바와 같이, 면역원성을 감소시키거나, 또는 결합, 친화성, 온 레이트, 오프 레이트, 결합능, 특이성, 반감기, 또는 임의의 다른 적합한 특징을 감소시키거나, 증강하거나 또는 변형하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 CD123/IL-3Rα 결합에 영향을 주는데 직접적으로 및 가장 실제적으로 관련된다. 따라서, 비인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는 유지되고, 반면 가변과 불변 영역의 비인간 서열은 인간 또는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.
또한, 항체는 임의선택적으로, 항원 CD123/IL-3Rα에 대한 높은 친화성 및 다른 우호적인 생물학적 성질을 유지하도록 가공된 인간화, 표면치환된, 가공된 또는 인간 항체일 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 인간화 (또는 인간) 또는 가공된 항-CD123/IL-3Rα 항체 및 표면치환된 항체는 임의선택적으로, 부모, 가공된 및 인간화 서열의 3차원 모형을 이용한, 부모 서열 및 다양한 개념적 인간화 및 가공된 산물의 분석의 과정에 의해 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모형은 통상적으로 가용하고 당업자에게 익숙하다. 선별된 후보 면역글로불린 서열의 개연적인 3차원 입체형태적 구조를 예시하고 전시하는 컴퓨터 프로그램이 가용하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 예상 역할의 분석, 다시 말하면, 항원, 예를 들면, CD123/IL-3Rα에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, 프레임워크 (FR) 잔기는 원하는 항체 특징, 예를 들면, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성이 달성되도록 선별되고 공통 및 이입 서열로부터 합동될 수 있다.
본 발명의 항체의 인간화, 표면치환 또는 가공은 임의의 공지된 방법, 예를 들면, 하지만 제한 없이, Winter (Jones et al., Nature 321:522, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988, Sims et al., J. Immunol. 151:2296, 1993; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901, 1987, Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151:2623, 1993; Raguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91(3):969-973, 1994; U.S. 특허 번호 5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7,557,189; 7,538,195; 및 7,342,110에서 설명된 것들을 이용하여 수행될 수 있고, 그 안에 인용된 참고문헌을 비롯하여 이들은 각각 완전하게 본원에 참조로서 편입된다.
일정한 대안적 구체예에서, CD123/IL-3Rα에 대한 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 직접적으로 제조될 수 있다. 시험관내에서 면역화된 또는 표적 항원에 대해 지향된 항체를 생산하는 면역화된 개체로부터 단리된 영속화된 인간 B 림프구가 산출될 수 있다 (가령, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol, 147 (l):86-95; 그리고 U.S. 특허 5,750,373을 참조한다). 또한, 인간 항체는 파지 라이브러리에서 선택될 수 있는데, 여기서 상기 파지 라이브러리는 예로서, Vaughan et al., Nat. Biotech. 14:309- 314, 1996, Sheets et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 95:6157-6162, 1998, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381, 1991, 그리고 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991)에서 설명된 바와 같이 인간 항체를 발현한다. 항체 파지 라이브러리의 산출과 이용을 위한 기술 역시 U.S. 특허 번호 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; 및 7,264,963; 그리고 Rothe et al., J. Mol. Bio. doi: 10.1016/j.jmb.2007.12.018, 2007에서 설명된다 (이들은 각각 전체적으로 참조로서 편입된다). 친화성 성숙 전략 및 사슬 뒤섞음 전략 (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783, 1992, 전체적으로 참조로서 편입됨)은 당분야에서 공지되고 높은 친화성 인간 항체를 산출하는데 이용될 수 있다.
인간화 항체는 또한, 내인성 면역글로불린 생산의 부재에서 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 면역화 시에 생산할 수 있는 인간 면역글로불린 좌위를 내포하는 유전자도입 생쥐에서 만들어질 수 있다. 이러한 접근법은 U.S. 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에서 설명된다.
일정한 구체예에서 예로서, 종양 침투를 증가시키는 항체 단편이 제공된다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 알려져 있다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해 소화를 통해 유래된다 (가령, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117, 1993; Brennan et al., Science 229:81, 1985). 일정한 구체예에서, 항체 단편은 재조합적으로 생산된다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 대장균 (E. coli) 또는 다른 숙주 세포에서 발현되고 이들로부터 분비될 수 있고, 따라서 이들 단편의 대량 생산을 허용한다. 이런 항체 단편은 또한, 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 단편은 또한, 예로서 U.S. 특허 5,641,870에서 설명된 바와 같이 선형 항체일 수 있고, 그리고 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명을 위해, 변형된 항체는 상기 항체 및 인간 CD123/IL-3Rα의 폴리펩티드의 연관을 제공하는 임의의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 하다. 이점에 관하여, 가변 영역은 체액성 반응이 증가하고 원하는 종양 연관된 항원에 대한 면역글로불린이 산출되도록 유도될 수 있는 임의의 유형의 포유동물을 포함하거나 또는 이것으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 변형된 항체의 가변 영역은 예로서, 인간, 뮤린, 비인간 영장류 (가령, 시노몰구스 원숭이, 마카크 등) 또는 루핀 기원일 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 면역글로불린의 가변과 불변 영역 둘 모두 인간이다. 다른 구체예에서, 양립성 항체의 가변 영역 (통상적으로, 비인간 공급원으로부터 유래됨)은 결합 성질을 향상시키거나 또는 분자의 면역원성을 감소시키기 위해 가공되거나 또는 특이적으로 맞춤될 수 있다. 이점에 관하여, 본 발명에서 유용한 가변 영역은 인간화되거나, 또는 만약 그렇지 않으면, 이입된 아미노산 서열의 포함을 통해 변경될 수 있다.
일정한 구체예에서, 중쇄와 경쇄 둘 모두에서 가변 도메인은 하나 또는 그 이상의 CDRs의 최소한 일부 대체에 의해, 그리고 필요하면, 부분적인 프레임워크 영역 대체 및 서열 변화에 의해 변경된다. 비록 CDRs가 프레임워크 영역이 유래되는 항체와 동일한 부류 또는 심지어 하위부류의 항체로부터 유래될 수 있긴 하지만, 이들 CDRs는 상이한 부류의 항체로부터 및 일정한 구체예에서, 상이한 종으로부터 항체로부터 유래될 것으로 구상된다. 한 가변 도메인의 항원 결합 능력을 다른 가변 도메인에 전달하기 위해 모든 CDRs를 공여자 가변 영역으로부터 완전한 CDRs로 대체하는 것이 반드시 필요한 것은 아니다. 오히려, 항원 결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기를 전달하는 것만이 필요할 수도 있다. U.S. 특허 번호 5,585,089, 5,693,761 및 5,693,762에서 진술된 설명을 고려하면, 이것은 일과적인 실험을 실행함으로써, 또는 감소된 면역원성을 갖는 기능적 항체를 획득하기 위한 시행착오 시험에 의해, 당업자의 적격성 내에 있을 것이다.
가변 영역에 변경에도 불구하고, 당업자는 본 발명의 변형된 항체가 선천적 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 거의 동일한 면역원성의 항체와 비교할 때 원하는 생화학적 특징, 예를 들면, 증가된 종양 국부화 또는 감소된 혈청 반감기를 제공하기 위해, 불변 영역 도메인 중에서 하나 또는 그 이상의 최소한 일부가 결실되거나 또는 만약 그렇지 않으면 변경된 항체 (가령, 전장 항체 또는 이들의 면역반응성 단편)을 포함할 것이라는 것을 인지할 것이다. 일부 구체예에서, 변형된 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 본 발명과 양립성인 불변 영역에 변형은 하나 또는 그 이상의 도메인에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 다시 말하면, 본원에서 개시된 변형된 항체는 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2, 또는 CH3) 중에서 하나 또는 그 이상에 및/또는 경쇄 불변 도메인 (CL)에 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 도메인이 부분적으로 또는 완전하게 결실되는 변형된 불변 영역이 예기된다. 일부 구체예에서, 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실된 구조체 또는 변이체를 포함할 것이다 (ACH2 구조체). 일부 구체예에서, 제외된 불변 영역 도메인은 부재하는 불변 영역에 의해 전형적으로 부여되는 분자 유연성 중에서 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (가령, 10개 잔기)에 의해 대체될 것이다.
일정한 구체예에서, 변형된 항체는 CH3 도메인을 개별 변형된 항체의 힌지 영역에 직접적으로 융합하도록 가공될 수 있는 것으로 확인될 것이다. 다른 구조체에서 힌지 영역 및 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 펩티드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 가령, CH2 도메인이 결실되고, 그리고 나머지 CH3 도메인 (변형된 또는 변형되지 않은)이 5-20개 아미노산 스페이서로 힌지 영역에 연결되는 양립성 구조체가 발현될 수 있었다. 이런 스페이서는 예로서, 불변 도메인의 조절 요소가 자유롭고 접근가능한 상태로 남아있거나, 또는 힌지 영역이 유연한 상태로 남아있도록 담보하기 위해 부가될 수 있다. 하지만, 주목해야 할 것은 아미노산 스페이서가 일부 경우에, 면역원성인 것으로 입증되고 구조체에 대한 원치 않는 면역 반응을 이끌어낼 수 있다는 점이다. 따라서, 일정한 구체예에서, 구조체에 부가된 임의의 스페이서는 변형된 항체의 원하는 생화학적 품질을 유지하기 위해, 상대적으로 비면역원성이거나, 또는 심지어 완전히 제외될 것이다.
전체 불변 영역 도메인의 결실 이외에, 본 발명의 항체는 소수의 또는 심지어 단일 아미노산의 부분적인 결실 또는 치환에 의해 제공될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 가령, CH2 도메인의 선별된 구역에서 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실제적으로 감소시키고, 그리고 따라서, 종양 국부화를 증가시키는데 충분할 수 있다. 유사하게, 조정되는 작동체 기능 (가령, 보체 C1Q 결합)을 제어하는 하나 또는 그 이상의 불변 영역 도메인의 부분을 단순히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 불변 영역의 이런 부분적인 결실은 주제 불변 영역 도메인과 연관된 다른 바람직한 기능을 무손상 상태로 남겨두면서, 항체의 선별된 특징 (혈청 반감기)을 향상시킬 수 있다. 게다가, 상기에 암시된 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 예로서, 하나 또는 그 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형될 수 있는데, 이것은 결과의 구조체의 프로필을 증강할 수 있다. 이점에 관하여, 변형된 항체의 형상 및 면역원성 프로필을 실제적으로 유지하면서, 보존된 결합 부위 (가령, Fc 결합)에 의해 제공되는 활성을 방해하는 것이 가능할 수 있다. 일정한 구체예는 바람직한 특징을 증강하거나, 예를 들면, 작동체 기능을 감소 또는 증가시키거나, 또는 더욱 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 불변 영역에 하나 또는 그 이상의 아미노산의 부가를 포함할 수 있다. 이런 구체예에서, 선별된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특정한 서열을 삽입하거나 또는 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 본원에서 진술된 키메라, 인간화 및 인간 항체, 또는 이들의 항체 단편에 실제적으로 상동성인 변이체 및 등가물을 더욱 아우른다. 이들은 예로서, 보존성 치환 돌연변이, 다시 말하면, 유사한 아미노산에 의한 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 내포할 수 있다. 가령, 보존성 치환은 동일한 일반적인 부류 내에 다른 아미노산으로 아미노산의 치환, 예를 들면, 예로서 다른 산성 아미노산으로 산성 아미노산의 치환, 다른 염기성 아미노산으로 염기성 아미노산의 치환, 또는 다른 중성 아미노산으로 중성 아미노산의 치환을 지칭한다. 보존성 아미노산 치환에 의해 의도되는 것은 당분야에서 널리 공지된다, 예를 들면, 위에서 규정된 것들이다.
본 발명의 폴리펩티드는 인간 CD123/IL-3Rα에 대한 항체, 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드, 자연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 당분야에서, 본 발명의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능의 유의미한 효과 없이 변할 수 있는 것으로 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 실제적인 활성을 보여주거나, 또는 CD123 항원, 예를 들면, 인간 CD123에 대한 항체 또는 이의 단편의 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변이를 더욱 포함한다. 이런 돌연변이체는 결실, 삽입, 전도, 반복 및 유형 치환을 포함한다.
폴리펩티드와 유사체는 정상적으로 단백질의 일부가 아닌 추가 화학적 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 이들 유도체화된 모이어티는 단백질의 용해도, 생물학적 반감기 또는 흡수를 향상시킬 수 있다. 이들 모이어티는 또한, 단백질 등의 임의의 바람직한 부작용을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 이들 모이어티에 대한 개요는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)에서 발견될 수 있다.
본원에서 설명된 단리된 폴리펩티드는 당분야에서 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 생산될 수 있다. 이런 방법은 직접적인 단백질 합성 방법에서부터 단리된 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 작제하고 이들 서열을 적합한 형질전환된 숙주에서 발현하는 것까지의 범위에 있다. 일부 구체예에서, DNA 서열은 관심되는 야생형 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 단리하거나 또는 합성함으로써 재조합 기술을 이용하여 작제된다. 임의선택적으로, 서열은 이의 기능적 유사체를 제공하기 위해 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 돌연변이화될 수 있다. 가령, Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066, 1984 및 U.S. 특허 번호 4,588,585를 참조한다.
일부 구체예에서, 관심되는 폴리펩티드 (가령, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드)를 인코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성장치를 이용한 화학적 합성에 의해 완전하게 또는 부분적으로 작제될 것이다. 이런 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 관심되는 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주 세포에서 선호되는 코돈의 선별에 기초하여 설계될 수 있다. 관심되는 단리된 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는데 표준 방법이 적용될 수 있다. 가령, 완전한 아미노산 서열이 역-번역된 유전자를 작제하는데 이용될 수 있다. 게다가, 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 내포하는 DNA 소중합체가 합성될 수 있다. 가령, 원하는 폴리펩티드의 부분을 코딩하는 여러 작은 올리고뉴클레오티드가 합성되고, 그리고 이후 결찰될 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 상보성 어셈블리를 위한 5' 또는 3' 오버행을 내포한다.
일단 조립되면 (합성, 특정 부위 돌연변이유발 또는 다른 방법에 의해), 관심되는 특정 단리된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 내로 삽입되고, 그리고 원하는 숙주에서 상기 단백질의 발현에 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. 적절한 어셈블리는 뉴클레오티드 염기서열결정, 제한효소 지도화, 그리고 적합한 숙주에서 생물학적으로 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확증될 수 있다. 당분야에서 널리 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 획득하기 위해, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사와 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다.
일정한 구체예에서, 재조합 발현 벡터가 인간 CD123/IL-3Rα에 대한 항체, 또는 이들의 단편을 인코딩하는 DNA를 증폭하고 발현하는데 이용된다. 재조합 발현 벡터는 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된 항-CD123/IL-3Rα 항체, 또는 이의 단편의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 합성 또는 cDNA-유래된 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 구조체이다. 전사 단위는 일반적으로, (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 유전자 원소 또는 원소들, 예를 들면, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 그리고 (3) 적절한 전사와 번역 개시와 종결 서열의 어셈블리를 포함한다. 이런 조절 요소는 전사를 제어하는 오퍼레이터 서열을 포함할 수 있다. 숙주에서 복제하는 능력은 통상적으로 복제 기점에 의해 부여되고, 그리고 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선별 유전자가 부가적으로 통합될 수 있다. DNA 영역은 그들이 서로에 기능적으로 관련될 때 작동가능하게 연결된다. 가령, 신호 펩티드 (분비성 리더)에 대한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되면, 이것은 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된다; 프로모터가 서열의 전사를 제어하면, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 허용하기 위해 배치되면, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 효모 발현 시스템에서 이용에 의도된 구조적 원소는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포외 분비를 실시가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 대안으로, 재조합 단백질이 리더 또는 운반 서열 없이 발현되는 경우에, 이것은 N 말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 임의선택적으로, 최종 산물을 제공하기 위해, 발현된 재조합 단백질로부터 차후에 개열될 수 있다.
발현 제어 서열과 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 의존할 것이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는 예로서, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스로부터 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 세균 숙주에 유용한 발현 벡터는 pCR 1, pBR322, pMB9와 이들의 유도체를 비롯한 공지된 세균 플라스미드, 예를 들면, 대장균 (Escherichia coli)으로부터 플라스미드, 더욱 넓은 숙주 범위 플라스미드, 예를 들면, M13과 실모양 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다.
CD123/IL-3Rα-결합 폴리펩티드 또는 항체 (또는 항원으로서 이용을 위한 CD123/IL-3Rα 단백질)의 발현에 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 제어 하에 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 생물체, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 또는 바실루스를 포함한다. 고등 진핵 세포는 포유류 기원의 확립 세포주, 예를 들면, CHO 세포를 포함한다. 무세포 번역 시스템 역시 이용될 수 있었다. 세균, 진균, 효모, 그리고 포유류 세포 숙주에서 이용을 위한 적절한 클로닝과 발현 벡터는 Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)에 의해 설명되고, 이것의 유관한 개시는 여기에 참조로서 편입된다. 항체 생산을 비롯하여, 단백질 생산의 방법에 관한 추가 정보는 예로서, U.S. 특허 공개 번호 2008/0187954, U.S. 특허 번호 6,413,746과 6,660,501, 그리고 국제 특허 공개 번호 WO 04009823에서 발견될 수 있고, 이들은 각각 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
다양한 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템 역시 재조합 단백질을 발현하는데 유리하게 이용된다. 포유류 세포에서 재조합 단백질의 발현이 수행될 수 있는데, 그 이유는 이런 단백질이 일반적으로 정확하게 접힘되고, 적절하게 변형되고, 그리고 완전하게 기능적이기 때문이다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 실례는 HEK-293 및 HEK-293T, Gluzman (Cell 23:175, 1981)에 의해 설명된 원숭이 신장 세포의 COS-7 라인, 그리고 예로서, L 세포, CI 27, 3T3, 중국 햄스터 난소 (CHO), HeLa와 BHK 세포주를 비롯한 다른 세포주를 포함한다. 포유류 발현 벡터는 비전사된 원소, 예를 들면, 복제 기점, 발현되는 유전자에 연결된 적합한 프로모터와 인핸서, 그리고 다른 5' 또는 3' 측면에 접하는 비전사된 서열, 그리고 5' 또는 3' 비번역된 서열, 예를 들면, 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자와 수용자 부위, 그리고 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이종성 단백질의 생산을 위한 배큘로바이러스 시스템은 Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)에 의해 재고된다.
따라서 본 발명의 한 가지 양상은 또한, 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중에서 한 가지, 또는 주제 폴리펩티드 중에서 한 가지를 생산하는 세포를 제공한다. 일정한 구체예에서, 세포는 포유류 세포이다. 일정한 구체예에서, 세포는 HEK-293 또는 HEK-293T 세포, COS-7 세포, L 세포, CI 27 세포, 3T3 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 또는 BHK 세포이다. 일정한 구체예에서, 세포는 CHO 세포이다.
형질전환된 숙주에 의해 생산된 단백질은 임의의 적절한 방법에 따라 정제될 수 있다. 이런 표준 방법은 크로마토그래피 (가령, 이온 교환, 친화성과 크기산정 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 포함한다. 친화성 태그, 예를 들면, 헥사히스티딘, 말토오스 결합 도메인, 인플루엔자 피막 서열 및 글루타티온-S-전달효소가 적절한 친화성 칼럼 위에서 통과에 의한 쉬운 정제를 허용하도록 단백질에 부착될 수 있다. 단리된 단백질은 또한, 단백질분해, 핵 자기 공명 및 x-선 결정학과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특징화될 수 있다.
가령, 재조합 단백질을 배양 배지 내로 분비하는 시스템으로부터 상층액은 먼저, 상업적으로 가용한 단백질 농축 필터, 예를 들면, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 이용하여 농축될 수 있다. 농축 단계 이후에, 농축물은 적합한 정제 매트릭스에 적용될 수 있다. 대안으로, 음이온 교환 수지, 예를 들면, 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기를 갖는 매트릭스 또는 기질이 이용될 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 단백질 정제에서 통상적으로 이용되는 다른 유형일 수 있다. 대안으로, 양이온 교환 단계가 이용될 수 있다. 적합한 양이온 교환체는 술포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 최종적으로, 소수성 RP-HPLC 매체, 예를 들면, 펜던트 메틸 또는 다른 지방족 기를 갖는 실리카 겔을 이용한 하나 또는 그 이상의 역상 고성능 액체크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계가 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 더욱 정제하는데 이용될 수 있다. 다양한 조합에서 전술한 정제 단계의 일부 또는 전부가 균질한 재조합 단백질을 제공하는데 또한 이용될 수 있다.
세균 배양에서 생산된 재조합 단백질은 예로서, 세포 펠렛으로부터 초기 추출, 그 이후에 하나 또는 그 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)가 최종 정제 단계를 위해 이용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에서 이용된 미생물 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 교란, 또는 세포 용해 작용제의 이용을 비롯한 임의의 편의한 방법에 의해 교란될 수 있다.
항체 및 다른 단백질을 정제하기 위한 당분야에서 공지된 방법은 예로서, U.S. 특허 공개 번호 2008/0312425, 2008/0177048, 그리고 2009/0187005에서 설명된 것들을 또한 포함하고, 이들은 각각 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 CD123/IL-3Rα-결합 작용제는 N 말단 세린을 갖는데, 이것은 N 말단 알데히드 기를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 형성하기 위해 산화제로 산화될 수 있다.
임의의 적합한 산화제는 앞서 설명된 방법의 단계 (a)에서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 산화제는 과옥소산염이다. 더욱 특정하게는, 산화제는 나트륨 과옥소산염이다.
CD123/IL-3Rα-결합 작용제에 비하여 과잉 몰 당량의 산화제가 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 약 2-100, 5-80, 10-50, 1-10 또는 5-10 몰 당량의 산화제가 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 약 10 또는 약 50 당량의 산화제가 이용될 수 있다. 대량의 산화제가 이용될 때, 초과 산화를 방지하기 위해 짧은 반응 시간이 이용된다. 가령, 50 당량의 산화제가 이용될 때, 산화 반응은 약 5 내지 약 60 분 동안 실행된다. 대안으로, 10 당량의 산화제가 이용될 때, 반응은 약 30 분 내지 약 24 시간 동안 실행된다. 한 구체예에서, 5-10 몰 당량의 산화제가 이용되고, 그리고 산화 반응은 약 5 내지 약 60 분 (가령, 약 10 내지 약 30 분, 약 20 내지 약 30 분) 동안 실행된다.
일정한 구체예에서, 산화 반응은 유의미한 비표적화된 산화를 야기하지 않는다. 가령, N 말단 알데히드 기를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 산출하기 위한 N 말단 세린의 산화 과정 동안, 유의미하지 않은 정도 (가령, 20%보다 적은, 10%보다 적은, 5%보다 적은, 3%보다 적은, 2%보다 적은 또는 1%보다 적은)의 메티오닌 및/또는 글리칸이 산화된다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 CD123/IL-3Rα-결합 작용제는 재조합적으로 가공된 Cys 잔기, 예를 들면, 예로서 서열 번호: 54 또는 56에서 마지막 Cys로부터 5번째에 상응하는 Cys 잔기 (다시 말하면, EU/OU 넘버링 위치 442에서 Cys 잔기)를 갖는다. 따라서 용어 "시스테인 가공된 항체"는 항체 경쇄 또는 중쇄의 소정의 잔기에서 정상적으로 존재하지 않는 최소한 하나의 Cys를 갖는 항체를 포함한다. "가공된 Cys"로서 또한 지칭될 수 있는 이런 Cys는 임의의 전통적인 분자생물학 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 가공될 수 있다 (가령, 표적 잔기에서 비-Cys 잔기에 대한 코딩 서열을 Cys에 대한 코딩 서열로 대체함으로써). 가령, 본래 잔기가 5'-UCU-3'의 코딩 서열을 갖는 Ser이면, 코딩 서열은 Cys를 인코딩하는 5'-UGU-3'으로 돌연변이될 수 있다 (가령, 특정 부위 돌연변이유발에 의해). 일정한 구체예에서, 본 발명의 Cys 가공된 항체는 중쇄에서 가공된 Cys를 갖는다. 일정한 구체예에서, 가공된 Cys는 중쇄의 CH3 도메인 내에 있거나 또는 이것에 근접한다. 일정한 구체예에서, 예로서 서열 번호: 54 또는 56에서 마지막 Cys로부터 5번째에 상응하는 가공된 Cys. 가공된 항체 중쇄 (또는 경쇄) 서열은 본래 Ser 잔기 대신에 가공된 Cys 잔기를 갖는 가공된 항체를 생산하기 위해 적합한 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
3. 면역접합체
두 번째 양상에서, 본 발명은 또한, 본원에서 설명된 세포독성 작용제의 하나 또는 그 이상의 분자에 공유 연결된, 본원에서 설명된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
첫 번째 구체예에서, 본 발명의 면역접합체는 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 상에 위치된 하나 또는 그 이상의 리신 잔기의 ε-아미노 기를 통해, 본원에서 설명된 세포독성 작용제에 공유 연결된 본원에서 설명된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드 포함)를 포함한다.
첫 번째 구체예의 1번째 특정한 구체예에서, 본 발명의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(L1),
여기서:
CBA는 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 앞서 설명된 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앞서 설명된 이의 주제 폴리펩티드)이고, 리신 잔기를 통해 CyL1에 공유 연결되고;
WL은 1 내지 20의 정수이고; 그리고
CyL1은 다음의 화학식에 의해 대표되는 세포독성 화합물이고:
(L1a),
(L1a1),
(L1b), 또는
(L1b1);
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이고;
W'는 -NRe'이고,
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Rx3은 (C1-C6)알킬이고;
L'은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)- (B1'); 또는
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1 (B2');
R5는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
Ra 및 Rb는 각 경우에, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화가능 기 Q이고;
m은 1 내지 6의 정수이고; 그리고
Zs1은 다음의 화학식 중에서 한 가지에서 선택되고:
(b1); (b2); (b3);
(b4); (b5),
(b6),
(b7); (b8); (b9); 및
(b10),
여기서:
q는 1 내지 5의 정수이고; 그리고
M은 H+ 또는 양이온이다.
2번째 특정한 구체예에서, 화학식 (L1)의 접합체의 경우에, CyL1은 화학식 (L1a) 또는 (L1a1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 1번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
3번째 특정한 구체예에서, 화학식 (L1)의 접합체의 경우에, CyL1은 화학식 (L1b) 또는 (L1b1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 1번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 더욱 특정하게는, Rx3은 (C2-C4)알킬이다.
4번째 특정한 구체예에서, 화학식 (L1)의 접합체의 경우에, CyL1은 화학식 (L1a)에 의해 대표되고; Ra 및 Rb는 둘 모두 H이고; R5는 H 또는 Me이고, 그리고 나머지 변수는 1번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
5번째 특정한 구체예에서, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고; 그리고 나머지 변수는 1번째, 2번째 또는 4번째 특정한 구체예에서 전술된다. 더욱 특정한 구체예에서, P는 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala. 더욱 특정하게는, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala이다.
6번째 특정한 구체예에서, Q는 -SO3M이고; 그리고 나머지 변수는 1번째, 2번째, 4번째 또는 5번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
7번째 특정한 구체예에서, 첫 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
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; 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 WL은 1 내지 10의 정수이고; N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다. 더욱 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 이중 결합을 나타내고, X는 부재하고, Y는 -H이다. 다른 더욱 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합을 나타내고, X는 -H이고, Y는 -SO3M이다.
8번째 특정한 구체예에서, 첫 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(L2),
여기서:
CBA는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 앞서 설명된 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앞서 설명된 이의 주제 폴리펩티드)이고, 리신 잔기를 통해 CyL2에 공유 연결되고;
WL은 1 내지 20의 정수이고; 그리고
CyL2는 다음의 화학식에 의해 대표되는 세포독성 화합물이고:
(L2a);
(L2a1);
(L2b); 또는
(L2b1)
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이고;
Rx1 및 Rx2는 독립적으로 (C1-C6)알킬이고;
Re는 -H 또는 (C1-C6)알킬이고;
W'는 -NRe'이고,
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Zs1은 다음의 화학식 중에서 한 가지에서 선택되고:
(b1); (b2); (b3);
(b4); (b5),
(b6),
(b7); (b8); (b9); 및
(b10),
여기서:
q는 1 내지 5의 정수이고; 그리고
M은 -H+ 또는 양이온이다.
9번째 특정한 구체예에서, 화학식 (L2)의 면역접합체의 경우에, CyL2는 화학식 (L2a) 또는 (L2a1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 8번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
10번째 특정한 구체예에서, 화학식 (L2)의 면역접합체의 경우에, CyL2는 화학식 (L2b) 또는 (L2b1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 8번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
11번째 특정한 구체예에서, 화학식 (L2)의 면역접합체의 경우에, Re는 H 또는 Me이고; Rx1 및 Rx2는 독립적으로 -(CH2)p-(CRfRg)-이고, 여기서 Rf 및 Rg는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 p는 0, 1, 2 또는 3이고; 그리고 나머지 변수는 8번째, 9번째 또는 10번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 더욱 특정하게는, Rf 및 Rg는 동일하거나 상이하고, 그리고 -H 및 -Me에서 선택된다.
12번째 특정한 구체예에서, 첫 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
;
;
;
;
;
;
;
; 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 WL은 1 내지 10의 정수이고; N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다. 더욱 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 이중 결합을 나타낸다. 다른 더욱 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합을 나타내고, X는 -H이고, Y는 -SO3M이다.
13번째 특정한 구체예에서, 첫 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(L3),
여기서:
CBA는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 앞서 설명된 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앞서 설명된 이의 주제 폴리펩티드)이고, Lys 잔기를 통해 CyL3에 공유 연결되고;
WL은 1 내지 20의 정수이고;
CyL3은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
,
m'은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고; 그리고
Zs1은 다음의 화학식 중에서 한 가지에서 선택되고:
(b1); (b2); (b3);
(b4); (b5),
(b6),
(b7); (b8); 및 (b9),
여기서:
q는 1 내지 5의 정수이고; 그리고
M은 H+ 또는 양이온이다.
14번째 특정한 구체예에서, 화학식 (L3)의 면역접합체의 경우에, m'은 1이고, 그리고 R1 및 R2는 둘 모두 H이고; 그리고 나머지 변수는 13번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
15번째 특정한 구체예에서, 화학식 (L3)의 면역접합체의 경우에, m'은 2이고, 그리고 R1 및 R2는 둘 모두 Me이고; 그리고 나머지 변수는 13번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
16번째 특정한 구체예에서, 첫 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
; 또는
,
,
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 WL은 1 내지 10의 정수이다.
17번째 특정한 구체예에서, 첫 번째 구체예의 면역접합체의 경우에, M은 H+, Na+ 또는 K+이고; 그리고 나머지 변수는 1번째 내지 16번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
상기 1번째 내지 17번째 특정한 구체예 중에서 한 가지에서, 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 6개의 경쇄 및 중쇄 CDR 영역 중에서 한 가지에서 Arg에 의해 치환된 Lys 잔기 (존재하면) 중에서 하나 또는 그 이상 (가령, 실제적으로 모두, 또는 100%)을 가질 수 있다. 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 39 또는 40에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (HCVR); 및 서열 번호: 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함할 수 있다. 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한, 서열 번호: 34에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig HCVR; 및 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig LCVR을 포함할 수 있다. 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 32, 34, 38, 39 또는 40에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig HCVR; 및 서열 번호: 33, 35, 37 또는 41에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig LCVR을 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 34의 N 말단으로부터 두 번째 잔기는 Phe이고, 반면 일정한 다른 구체예에서, 서열 번호: 34의 N 말단으로부터 두 번째 잔기는 Val이다.
첫 번째 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 특정한 구체예에서 설명된 면역접합체는 당분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다, 가령, WO 2012/128868 및 WO2012/112687을 참조하고, 이들은 본원에 참조로서 편입된다.
일정한 구체예에서, 첫 번째 구체예의 면역접합체는 CBA를 아민 반응성 기를 갖는 세포독성 작용제와 반응시키는 단계를 포함하는 첫 번째 방법에 의해 제조될 수 있다.
한 구체예에서, 앞서 설명된 첫 번째 방법의 경우에, 반응은 이민 반응성 시약, 예를 들면, NaHSO3의 존재에서 실행된다.
한 구체예에서, 앞서 설명된 첫 번째 방법의 경우에, 아민 반응성 시약을 갖는 세포독성 작용제는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(L1a'),
(L1a'1),
(L1b'), 또는
(L1b'1);
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
Lc'는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)E (B1); 또는
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs (B2)
C(=O)E는 반응성 에스테르 기, 예를 들면, N-히드록시숙신이미드 에스테르, N-히드록시 술포숙신이미드 에스테르, 니트로페닐 (가령, 2 또는 4-니트로페닐) 에스테르, 디니트로페닐 (가령, 2,4-디니트로페닐) 에스테르, 술포-테트라플루오로페닐 (가령, 4-술포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 에스테르, 또는 펜타플루오로페닐 에스테르, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드 에스테르이고;
Zs는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(a1); (a2); (a3);
(a4); (a5),
(a6),
(a7); (a8); (a9); 및
(a10),
여기서:
q는 1 내지 5의 정수이고; 그리고
U는 -H 또는 SO3M이고; 그리고
나머지 변수는 1번째 내지 7번째 및 17번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 설명된 바와 같다.
일정한 구체예에서, 첫 번째 구체예의 면역접합체는 다음 단계를 포함하는 두 번째 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) 세포독성 작용제를 아민 반응성 기 및 티올 반응성 기를 갖는 링커 화합물과 반응시켜, 아민 반응성 기가 거기에 결합된 세포독성 작용제-링커 화합물을 형성하고; 그리고
(b) CBA를 세포독성 작용제-링커 화합물과 반응시킨다.
한 구체예에서, 앞서 설명된 두 번째 방법의 경우에, 단계 (a)에서 반응은 이민 반응성 시약의 존재에서 실행된다.
한 구체예에서, 앞서 설명된 두 번째 방법의 경우에, 세포독성 작용제-링커 화합물은 정제 없이 CBA와 반응된다. 대안으로, 세포독성 작용제-링커 화합물은 CBA와 반응하기 전에, 먼저 정제된다.
일정한 구체예에서, 첫 번째 구체예의 면역접합체는 다음 단계를 포함하는 세 번째 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) CBA를 아민 반응성 기 및 티올 반응성 기를 갖는 링커 화합물과 반응시켜, 티올 반응성 기가 거기에 결합된 변형된 CBA를 형성하고; 그리고
(b) 변형된 CBA를 세포독성 작용제와 반응시킨다.
한 구체예에서, 앞서 설명된 세 번째 방법의 경우에, 단계 (b)에서 반응은 이민 반응성 시약의 존재에서 실행된다.
일정한 구체예에서, 첫 번째 구체예의 면역접합체는 CBA, 세포독성 화합물, 그리고 아민 반응성 기 및 티올 반응성 기를 갖는 링커 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 네 번째 방법에 의해 제조될 수 있다.
한 구체예에서, 네 번째 방법의 경우에, 반응은 이민 반응성 시약의 존재에서 실행된다.
일정한 구체예에서, 앞서 설명된 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 구체예의 경우에, 아민 반응성 기 및 티올 반응성 기를 갖는 링커 화합물은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(a1L); (a2L); (a3L);
(a4L); (a5L),
(a6L),
(a7L); (a8L); (a9L); 및
(a10L),
여기서 X는 할로겐이고; JD는 -SH, -SSRd, 또는 -SC(=O)Rg이고; Rd는 페닐, 니트로페닐, 디니트로페닐, 카르복시니트로페닐, 피리딜 또는 니트로피리딜이고; Rg는 알킬이고; 그리고 나머지 변수는 화학식 (a1) - (a10)에 대해 전술한 바와 같고; 그리고 세포독성 작용제는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
; 또는
,
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 이들 변수는 8번째 내지 12번째 및 17번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 및 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 설명된 바와 같다.
일정한 구체예에서, 앞서 설명된 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 방법의 경우에, 아민 반응성 기 및 티올 반응성 기를 갖는 링커 화합물은 화학식 (a1L) - (a10L) 중에서 한 가지에 의해 대표되고, 그리고 세포독성 작용제는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
여기서 이들 변수는 13번째 내지 17번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 및 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
두 번째 구체예에서, 본 발명의 면역접합체는 산화된 CD123-결합 작용제 상에 위치된 하나 또는 그 이상의 알데히드 기를 통해 본원에서 설명된 세포독성 작용제에 공유 연결된, 본원에서 설명된 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드 포함) (가령, 산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 폴리펩티드)를 포함한다. 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 상에 위치된 알데히드 기는 CD123/IL-3Rα-결합 작용제의 하나 또는 그 이상의 2-히드록시에틸아민 모이어티를 산화시킴으로써 산출될 수 있고, 여기서 2-히드록시에틸아민 모이어티는 세린, 트레오닌, 히드록실리신, 4-히드록시오르니틴 또는 2,4-디아미노-5-히드록시 발레르산 잔기의 일부이다. 한 구체예에서, 알데히드 기는 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 상에 위치된 하나 또는 그 이상의 N 말단 세린 잔기(들) (가령, 경쇄 및/또는 중쇄의 N 말단에서 1, 2, 3, 또는 최대 4개의 Ser 잔기)의 2-히드록시에틸아민 모이어티를 산화시킴으로써 산출될 수 있다.
두 번째 구체예의 1번째 특정한 구체예에서, 본 발명의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(S1);
여기서:
CBA는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 앞서 설명된 주제 산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앞서 설명된 이의 주제 산화된 폴리펩티드)이고;
WS는 1, 2, 3, 또는 4이고;
JCB'는 CBA 상에 알데히드 기를 Cys1 상에 알데히드 반응성 기와 반응시킴으로써 형성된 모이어티이고, 그리고 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; ; 또는 ,
여기서 s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고; 그리고 s2는 Cys1에 공유 연결된 부위이고;
Cys1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(S1a),
(S1a1),
(S1b), 또는
(S1b1);
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이고, M은 H+ 또는 양이온이고;
R5는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
Zd1은 부재하거나, -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
R9는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
Ra 및 Rb는 각 경우에, 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화가능 기 Q이고;
r 및 r'는 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;
W'는 -NRe'이고,
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Rx3은 (C1-C6)알킬이고;
L은 -NR9-(CRaRb)r"이거나 또는 부재하고; 그리고
r"은 0 내지 6의 정수이다.
2번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S1)의 면역접합체의 경우에, Cys1은 화학식 (S1a) 또는 (S1a1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 1번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
3번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S1)의 면역접합체의 경우에, Cys1은 화학식 (S1b) 또는 (S1b1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 1번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 더욱 특정하게는, Rx3은 (C2-C4)알킬이다.
4번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S1)의 면역접합체의 경우에, Ra 및 Rb는 둘 모두 H이고, 그리고 R5 및 R9는 둘 모두 H 또는 Me이고; 그리고 나머지 변수는 1번째 또는 2번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
5번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S1)의 면역접합체의 경우에, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고; 그리고 나머지 변수는 1번째, 2번째 또는 4번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 더욱 특정한 구체예에서, P는 다음과 같이 구성된 군에서 선택된다: Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala. 훨씬 특정하게는, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala이다.
6번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S1)의 면역접합체의 경우에, Q는 -SO3M이고; 그리고 나머지 변수는 1번째, 2번째, 4번째 또는 5번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
7번째 특정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
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;
; 또는
,
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다. 더욱 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 이중 결합을 나타내고, X는 부재하고, Y는 -H이다. 다른 더욱 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합을 나타내고, X는 -H이고, Y는 -SO3M이다.
8번째 특정한 구체예에서, 본 발명의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(S2);
여기서:
CBA는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 앞서 설명된 주제 산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앞서 설명된 이의 주제 산화된 폴리펩티드)이고;
JCB'는 CBA 상에 알데히드 기를 Cys2 상에 알데히드 반응성 기와 반응시킴으로써 형성된 모이어티이고, 그리고 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; ; 또는 ,
여기서 s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고; 그리고 s2는 Cys2에 공유 연결된 부위이고;
Cys2는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(S2a);
(S2a1);
(S2b); 또는
(S2b1),
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이고;
M은 H+ 또는 양이온이고;
Rx1은 (C1-C6)알킬이고;
Re는 -H 또는 (C1-C6)알킬이고;
W'는 -NRe'이고,
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Rx2는 (C1-C6)알킬이고;
L1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
여기서:
s3은 기 JCB'에 공유 연결된 부위이고;
s4는 Cys2 상에 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
Za2는 부재하거나, -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
R9는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
Q는 H, 하전된 치환체 또는 이온화가능 기이고;
Ra1, Ra2, Ra3, Ra4는 각 경우에, 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고; 그리고
q1 및 r1은 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고, 단서로서 q1 및 r1은 둘 모두 0은 아니다.
더욱 특정한 구체예에서, Za2는 부재하고; q1 및 r1은 각각 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, 단서로서 q1 및 r1은 둘 모두 0은 아니고; 그리고 나머지 변수는 8번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 훨씬 특정하게는, Ra1, Ra2, Ra3, Ra4는 모두 -H이다.
다른 더욱 특정한 구체예에서, Za2는 -C(=O)-NH-, 또는 -NH9-C(=O)-이고; q1 및 r1은 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고; 그리고 나머지 변수는 8번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 훨씬 특정하게는, Ra1, Ra2, Ra3, Ra4는 모두 -H이다.
9번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S2)의 면역접합체의 경우에, Cys2는 화학식 (S2a) 또는 (S2a1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 8번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
10번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S2)의 면역접합체의 경우에, Cys2는 화학식 (S2b) 또는 (S2b1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 8번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
11번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S2)의 면역접합체의 경우에, -L1-은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; 또는
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 R은 H 또는 -SO3M이고; 그리고 나머지 변수는 8번째, 9번째 또는 10번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
12번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S2)의 면역접합체의 경우에, Re은 H 또는 Me이고; 그리고 Rx1은 -(CH2)p-(CRfRg)-이고, 그리고 Rx2는 -(CH2)p-(CRfRg)-이고, 여기서 Rf 및 Rg는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 p는 0, 1, 2 또는 3이다. 더욱 특정하게는, Rf 및 Rg는 동일하거나 상이하고, 그리고 -H 및 -Me에서 선택된다.
13번째 특정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
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; 또는
,
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다. 더욱 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 이중 결합을 나타내고, X는 부재하고, Y는 -H이다. 다른 더욱 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합을 나타내고, X는 -H이고, Y는 -SO3M이다.
14번째 특정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(S3);
여기서:
CBA는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 앞서 설명된 주제 산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앞서 설명된 이의 주제 산화된 폴리펩티드)이고;
JCB'는 CBA 상에 알데히드 기를 Cys3 상에 알데히드 반응성 기와 반응시킴으로써 형성된 모이어티이고, 그리고 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; ; 또는 ,
여기서 s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고; 그리고 s2는 Cys3에 공유 연결된 부위이고;
Cys3은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
여기서:
m'은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고;
L1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
여기서:
s3은 기 JCB'에 공유 연결된 부위이고;
s4는 Cys3 상에 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
Za2는 부재하거나, -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
R9는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
Q는 H, 하전된 치환체 또는 이온화가능 기이고;
Ra1, Ra2, Ra3, Ra4는 각 경우에, 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고; 그리고
q1 및 r1은 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고, 단서로서 q1 및 r1은 둘 모두 0은 아니다.
더욱 특정한 구체예에서, Za2는 부재하고; q1 및 r1은 각각 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, 단서로서 q1 및 r1은 둘 모두 0은 아니고; 그리고 나머지 변수는 14번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 훨씬 특정하게는, Ra1, Ra2, Ra3, Ra4는 모두 -H이다.
다른 더욱 특정한 구체예에서, Za2 는 -C(=O)-NH-, 또는 -NH9-C(=O)-이고; q1 및 r1은 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고; 그리고 나머지 변수는 14번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 훨씬 특정하게는, Ra1, Ra2, Ra3, Ra4는 모두 -H이다.
15번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S3)의 면역접합체의 경우에, m'은 1이고; R1 및 R2는 둘 모두 H이고; 그리고 나머지 변수는 14번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
16번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S3)의 면역접합체의 경우에, m'은 2이고; R1 및 R2는 둘 모두 Me이고; 그리고 나머지 변수는 14번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
17번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S3)의 면역접합체의 경우에, -L1-은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; 또는
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 R은 H 또는 -SO3M이고, 그리고 M은 H+ 또는 양이온이다.
18번째 특정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
;
;
;
;
;
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염; 여기서 DM은 다음의 화학식에 의해 대표된다:
.
19번째 특정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(S4)
여기서:
CBA는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 앞서 설명된 주제 산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앞서 설명된 이의 주제 산화된 폴리펩티드)이고;
JCB'는 CBA 상에 알데히드 기를 Cys4 상에 알데히드 반응성 기와 반응시킴으로써 형성된 모이어티이고, 그리고 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; ; ; ; 또는 ,
여기서 s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고; 그리고 s2는 Cys4에 공유 연결된 부위이고;
Cys4는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(S4a),
L1'은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; 또는
,
여기서:
s3은 JCB' 기에 공유 연결된 부위이고;
s4는 Cys4 상에 -NMe- 기에 공유 연결된 부위이고;
Zb1 및 Zb2는 둘 모두 부재하거나, 또는 Zb1 및 Zb2 중에서 하나는 부재하고 다른 하나는 -CH2-O- 또는 -O-CH2-이고;
Zb1' 및 Zb2'는 각각 독립적으로 부재하거나, -CH2-O-, -O-CH2-, -NR9-C(=O)-CH2-, 또는 -CH2-C(=O)-NR9-이고;
R9는 H 또는 (C1-C3)알킬이고;
n1 및 m1은 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;
E1 및 E2 중에서 하나는 -C(=O)-이고 다른 하나는 -NR9-이거나; 또는 E1 및 E2 중에서 하나는 -C(=O)- 또는 -NR9-이고 다른 하나는 부재하고;
P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고; 그리고
Rb1, Rb2, Rb3, Rb4, Rb5 및 Rb6은 각 경우에, 각각 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이다.
20번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S4)의 면역접합체의 경우에, Rb1, Rb2, Rb3, Rb4, Rb5 및 Rb6은 모두 H이고; 그리고 나머지 변수는 19번째 특정한 구체예 전술한 바와 같다.
21번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S4)의 면역접합체의 경우에, R9는 H이고; 그리고 나머지 변수는 19번째 또는 20번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
22번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S4)의 면역접합체의 경우에, Zb1' 및 Zb2'는 둘 모두 부재하거나; 또는 Zb1'은 -CH2-O-이고; 그리고 Zb2'는 부재하거나; 또는 Zb1'은 -CH2-C(=O)-NR9-이고; 그리고 Zb2'는 -OCH2-이거나 또는 부재하고; 그리고 나머지 변수는 19번째, 20번째 또는 21번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
23번째 특정한 구체예에서, 화학식 (S4)의 면역접합체의 경우에, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고; 그리고 나머지 변수는 19번째, 20번째, 21번째 또는 22번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 더욱 특정한 구체예에서, P는 다음과 같이 구성된 군에서 선택되고: Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala; 그리고 나머지 변수는 23번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 훨씬 특정하게는, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala이다.
24번째 특정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 DM은 다음의 구조식에 의해 대표된다:
.
25번째 특정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체의 경우에, M은 H+, Na+ 또는 K+이고; 그리고 나머지 변수는 1번째 내지 24번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
상기 1번째 내지 25번째 특정한 구체예 중에서 한 가지에서, 주제 산화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에서 설명된 독성 작용제를 세포에 공유적으로 연결하기 위한, 알데히드 기(들)로 산화된 1, 2, 3, 또는 최대 4개의 N 말단 2-히드록시에틸아민 모이어티를 가질 수 있다. N 말단 2-히드록시에틸아민 모이어티는 세린, 트레오닌, 히드록실리신, 4-히드록시오르니틴 또는 2,4-디아미노-5-히드록시 발레르산 잔기, 바람직하게는 Ser 또는 Thr의 부분일 수 있다. 단순함을 위해, 산화 반응 및 링커 또는 세포독성 작용제와의 임의의 차후 접합을 비롯한 아래의 설명은 이런 N 말단 2-히드록시에틸아민 모이어티의 특정한 실례로서 Ser을 지칭할 수 있지만, 일반적으로 모든 N 말단 2-히드록시에틸아민 모이어티를 지칭하는 것으로 해석되어야 한다. 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 38에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (HCVR); 및 서열 번호: 33, 35, 37 또는 41 (바람직하게는 서열 번호: 35 또는 37)에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함할 수 있다. 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한, 서열 번호: 32, 34, 38, 39 또는 40 (바람직하게는 서열 번호: 34)에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig HCVR; 및 서열 번호: 37에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig LCVR을 포함할 수 있다. 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한, 서열 번호: 53 또는 56에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig 중쇄 (HC) 영역; 및 서열 번호: 33, 35, 37 또는 41 (바람직하게는 서열 번호: 35 또는 37)에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig LCVR을 포함할 수 있다. 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한, 서열 번호: 48, 50, 53, 54, 56, 59 또는 60 (바람직하게는 서열 번호: 53)에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig HC 영역; 및 서열 번호: 37에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig LCVR을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 34, 38, 50, 53, 54 또는 56의 N 말단으로부터 두 번째 잔기는 Phe이고, 반면 일정한 다른 구체예에서, 서열 번호: 34, 38, 50, 53, 54 또는 56의 N 말단으로부터 두 번째 잔기는 Val이다.
일정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 N 말단 알데히드를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 알데히드 반응성 기를 갖는 세포독성 작용제와 반응시키는 것을 포함하는 첫 번째 방법에 의해 제조될 수 있다.
일정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 N 말단 알데히드를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 알데히드 반응성 기를 갖는 링커 화합물과 반응시켜 링커가 거기에 결합된 변형된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 형성하고, 그 이후에 변형된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 세포독성 작용제와 반응시키는 것을 포함하는 두 번째 방법에 의해 제조될 수 있다.
일정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 N 말단 알데히드를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 세포독성 작용제와 접촉시키고, 그 이후에 알데히드 반응성 기를 갖는 링커 화합물의 첨가를 포함하는 세 번째 방법에 의해 제조될 수 있다.
일정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 다음 단계를 포함하는 네 번째 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) N 말단 2-히드록시에틸아민 모이어티 (가령, Ser/Thr)를 갖는 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 산화제로 산화시켜 N 말단 알데히드 기를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 형성하고; 그리고
(b) N 말단 알데히드 기를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 알데히드 반응성 기를 갖는 세포독성 작용제와 반응시킨다.
일정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 다음 단계를 포함하는 다섯 번째 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) N 말단 2-히드록시에틸아민 모이어티 (가령, Ser/Thr)를 갖는 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 산화제로 산화시켜 N 말단 알데히드 기를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 형성하고;
(b) N 말단 알데히드 기를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 알데히드 반응성 기를 갖는 링커 화합물과 반응시켜 링커가 거기에 결합된 변형된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 형성하고, 그 이후에 변형된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 세포독성 작용제와 반응시킨다.
일정한 구체예에서, 두 번째 구체예의 면역접합체는 다음 단계를 포함하는 여섯 번째 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) N 말단 2-히드록시에틸아민 모이어티 (가령, Ser/Thr)를 갖는 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 산화제로 산화시켜 N 말단 알데히드 기를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 형성하고;
(b) N 말단 알데히드 기를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제를 세포독성 작용제와 접촉시키고, 그 이후에 알데히드 반응성 기를 갖는 링커 화합물을 첨가한다.
한 구체예에서, 앞서 설명된 첫 번째 또는 네 번째 방법의 경우에, 알데히드 반응성 기를 갖는 세포독성 작용제는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(S1a'),
(S1a'1),
(S1b'), 또는
(S1b'1),
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 JCB는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; ; 또는 ;
나머지 변수는 1번째 내지 7번째 및 25번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 및 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
다른 구체예에서, 앞서 설명된 첫 번째 또는 네 번째 방법의 경우에, 알데히드 반응성 기를 갖는 세포독성 작용제는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(S4a'),
또는 이의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 JCB는 전술한 바와 같고, 그리고 나머지 변수는 19번째 내지 25번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 및 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 설명된 바와 같다.
한 구체예에서, 앞서 설명된 두 번째, 세 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째 방법의 경우에, 링커 화합물은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(Lsa)
여기서 JD는 -SH, -SSRd, 또는 -SC(=O)Rg이고; Rd는 페닐, 니트로페닐, 디니트로페닐, 카르복시니트로페닐, 피리딜 또는 니트로피리딜이고; Rg는 알킬이고; JCB는 전술한 바와 같고; 세포독성 작용제는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
; 또는
,
그리고 나머지 변수는 8번째 내지 13번째 및 25번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 및 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
다른 구체예에서, 앞서 설명된 두 번째, 세 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째 방법의 경우에, 링커 화합물은 상기 화학식 (Lsa)에 의해 대표되고; 세포독성 화합물은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
,
그리고 나머지 변수는 14번째 내지 18번째 및 25번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 및 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 설명된 바와 같다.
한 구체예에서, 앞서 설명된 첫 번째 또는 네 번째 방법의 경우에, 세포독성 작용제는 N 말단 알데히드를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제와 반응하기 전에, 이민-반응성 시약, 예를 들면, NaHSO3과 반응되어 변형된 세포독성 작용제를 형성한다. 한 구체예에서, 변형된 세포독성 작용제는 N 말단 알데히드를 갖는 산화된 CBA와 반응하기 전에 정제되지 않는다. 대안으로, 변형된 세포독성 작용제는 N 말단 알데히드를 갖는 산화된 CBA와 반응하기 전에 정제된다.
다른 구체예에서, 앞서 설명된 두 번째 또는 다섯 번째 방법의 경우에, 세포독성 작용제는 링커가 거기에 결합된 변형된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제와 반응하기 전에, 이민-반응성 시약, 예를 들면, NaHSO3과 반응되어 변형된 세포독성 작용제를 형성한다. 한 구체예에서, 변형된 세포독성 작용제는 링커가 거기에 결합된 변형된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제와 반응하기 전에 정제된다. 대안으로, 변형된 세포독성 작용제는 N 말단 알데히드를 갖는 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제와 반응하기 전에 정제되지 않는다.
또 다른 구체예에서, 앞서 설명된 세 번째 또는 여섯 번째 방법의 경우에, 산화된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제, 세포독성 작용제 및 링커 화합물의 반응은 이민 반응성 시약, 예를 들면, NaHSO3의 존재에서 실행된다.
임의의 적합한 산화제는 앞서 설명된 네 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째 방법의 단계 (a)에서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 산화제는 과옥소산염이다. 더욱 특정하게는, 산화제는 나트륨 과옥소산염이다.
CD123/IL-3Rα-결합 작용제에 비하여 과잉 몰 당량의 산화제가 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 약 2-100, 5-80, 10-50, 1-10 또는 5-10 몰 당량의 산화제가 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 약 10 또는 약 50 당량의 산화제가 이용될 수 있다. 대량의 산화제가 이용될 때, 초과 산화를 방지하기 위해 짧은 반응 시간이 이용된다. 가령, 50 당량의 산화제가 이용될 때, 산화 반응은 약 5 내지 약 60 분 동안 실행된다. 대안으로, 10 당량의 산화제가 이용될 때, 반응은 약 30 분 내지 약 24 시간 동안 실행된다. 한 구체예에서, 5-10 몰 당량의 산화제가 이용되고, 그리고 산화 반응은 약 5 내지 약 60 분 (가령, 약 10 내지 약 30 분, 약 20 내지 약 30 분) 동안 실행된다.
일정한 구체예에서, 촉매제는 앞서 설명된 첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 방법에서 반응에서 또는 앞서 설명된 네 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째 방법에서 단계 (b)의 반응에서 존재한다. 당분야에서 임의의 적합한 촉매제가 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 촉매제는 아닐린 또는 치환된 아닐린이다. 예시적인 아닐린 촉매제는 아닐린, o-페닐렌디아민, m-페닐렌디아민, 3,5-디아미노벤조산, p-페닐렌디아민, 2-메틸-p-페닐렌디아민, N-메틸-p-페닐렌디아민, o-아미노페놀, m-아미노페놀, p-아미노페놀, p-메톡시아닐린, 5-메톡시-안트라닐산, o-아미노벤조산, 그리고 4-아미노펜에틸알코올을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 촉매제는 4-아미노펜에틸알코올이다. 일정한 구체예에서, 단계 (b)의 반응은 pH 약 5.0 내지 약 6.5에서 실행된다. 일정한 구체예에서, 단계 (b)의 반응은 pH 약 5.0에서 실행된다.
일정한 구체예에서, 앞서 설명된 첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 방법에서 반응, 또는 앞서 설명된 네 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째 방법에서 단계 (b)의 반응의 경우에, 알데히드 반응성 기를 갖는 화합물 (가령, 세포독성 작용제, 또는 본원에서 설명된 링커 화합물)은 산화된 세포 결합 작용제 (가령, 산화된 항체 또는 산화된 항원 결합 부분)에 비하여 몰 과잉으로 이용된다. 일정한 구체예에서, 알데히드 반응성 기를 갖는 화합물 대 산화된 세포 결합 작용제에 대한 비율은 약 10:1 내지 약 1.1:1 사이, 약 5:1 내지 약 2:1 사이이다. 한 구체예에서, 비율은 약 4:1이다.
세 번째 구체예에서, 본 발명의 면역접합체는 CD123-결합 작용제 상에 위치된 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기의 티올 기 (-SH)를 통해, 본원에서 설명된 세포독성 작용제에 공유 연결된 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드 포함)를 포함한다.
1번째 특정한 구체예에서, 세 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(C1),
여기서:
CBA는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 앞서 설명된 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앞서 설명된 이의 주제 폴리펩티드)이고, 시스테인 잔기를 통해 CyC1에 공유 연결되고;
WC는 1 또는 2이고;
CyC1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(C1a);
(C1a1);
(C1b), 또는
(C1b1)
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이고, M은 H+ 또는 양이온이고;
R5는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
Ra 및 Rb는 각 경우에, 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화가능 기 Q이고;
W'는 -NRe'이고,
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Rx3은 (C1-C6)알킬이고; 그리고
LC는 다음에 의해 대표되고:
,
여기서 s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고, 그리고 s2는 CyC1 상에서 -C(=O)- 기에 공유 연결된 부위이고; 여기서:
R19 및 R20은 각 경우에, 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
m"은 1 및 10 사이에 정수이고; 그리고
Rh는 -H 또는 (C1-C3)알킬이다.
2번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C1)의 면역접합체의 경우에, CyC1은 화학식 (C1a) 또는 (C1a1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 1번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
3번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C1)의 면역접합체의 경우에, CyC1은 화학식 (C1b) 또는 (C1b1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 1번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
4번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C1)의 면역접합체의 경우에, CyC1은 화학식 (C1a) 또는 (C1a1)에 의해 대표되고; Ra 및 Rb는 둘 모두 H이고; 그리고 R5는 H 또는 Me이고; 그리고 나머지 변수는 1번째 또는 2번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
5번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C1)의 면역접합체의 경우에, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고; 그리고 나머지 변수는 1번째, 2번째 또는 4번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 더욱 특정한 구체예에서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala에서 선택된다. 다른 더욱 특정한 구체예에서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala이다.
6번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C1)의 면역접합체의 경우에, Q는 -SO3M이고; 그리고 나머지 변수는 1번째, 2번째, 4번째 또는 5번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
7번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C1)의 면역접합체의 경우에, R19 및 R20은 둘 모두 H이고; 그리고 m"은 1 내지 6의 정수이고; 그리고 나머지 변수는 1번째, 2번째, 3번째, 4번째, 5번째 또는 6번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
8번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C1)의 면역접합체의 경우에, -L-LC-는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
,
그리고 나머지 변수는 1번째, 2번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째 또는 7번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
9번째 특정한 구체예에서, 세 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
; 또는
,
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고, 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다. 더욱 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 이중 결합을 나타내고, X는 부재하고, Y는 -H이다. 다른 더욱 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합을 나타내고, X는 -H이고, Y는 -SO3M이다.
10번째 특정한 구체예에서, 세 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(C2),
여기서:
CBA는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 앞서 설명된 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앞서 설명된 이의 주제 폴리펩티드)이고, 시스테인 잔기를 통해 CyC2에 공유 연결되고;
WC는 1 또는 2이고;
CyC2는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(C2a),
(C2a1),
(C2b), 또는
(C2b1),
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이고, M은 H+ 또는 양이온이고;
Rx1은 (C1-C6)알킬이고;
Re는 -H 또는 (C1-C6)알킬이고;
W'는 -NRe'이고;
Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이고;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Rx2는 (C1-C6)알킬이고;
LC'는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; 또는
;
여기서:
s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고, 그리고 s2는 CyC2 상에 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
Z는 -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
Q는 -H, 하전된 치환체 또는 이온화가능 기이고;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 및 R22는 각 경우에, 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
q 및 r은 각 경우에, 독립적으로 0 및 10 사이에 정수이고;
m 및 n은 각각 독립적으로 0 및 10 사이에 정수이고;
Rh는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고; 그리고
P'는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이다.
더욱 특정한 구체예에서, q 및 r은 각각 독립적으로 1 내지 6 사이에 정수, 더욱 특정하게는, 1 내지 3 사이에 정수이다. 훨씬 특정하게는, R10, R11, R12 및 R13은 모두 H이다.
다른 더욱 특정한 구체예에서, m 및 n은 각각 독립적으로 1 및 6 사이에 정수, 더욱 특정하게는, 1 내지 3 사이에 정수이다. 훨씬 특정하게는, R19, R20, R21 및 R22는 모두 H이다.
11번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C2)의 면역접합체의 경우에, CyC2는 화학식 (C2a) 또는 (C2a1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 10번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
12번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C2)의 면역접합체의 경우에, CyC2는 화학식 (C2b) 또는 (C2b1)에 의해 대표되고; 그리고 나머지 변수는 10번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
13번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C2)의 면역접합체의 경우에, P'는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고; 그리고 나머지 변수는 10번째, 11번째 또는 12번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 설명된 바와 같다. 더욱 특정한 구체예에서, P'는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala에서 선택된다. 다른 더욱 특정한 구체예에서, P'는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala이다.
14번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C2)의 면역접합체의 경우에, -LC'-는 다음의 화학식에 의해 대표된다:
;
; 또는
.
15번째 특정한 구체예에서, (C2)의 면역접합체의 경우에, Re는 H 또는 Me이고; Rx1은 -(CH2)p-(CRfRg)-이고, 그리고 Rx2는 -(CH2)p-(CRfRg)-이고, 여기서 Rf 및 Rg는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 p는 0, 1, 2 또는 3이고; 그리고 나머지 변수는 10번째, 11번째, 12번째, 13번째 또는 14번째 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 더욱 특정하게는, Rf 및 Rg는 동일하거나 상이하고, 그리고 -H 및 -Me에서 선택된다.
16번째 특정한 구체예에서, 세 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
;
;
;
;
;
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고, 그리고 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다. 더욱 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 이중 결합을 나타내고, X는 부재하고, Y는 -H이다. 다른 특정한 구체예에서, N 및 C 사이에 이중 라인 은 단일 결합을 나타내고, X는 -H이고, Y는 -SO3M이다.
17번째 특정한 구체예에서, 세 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(C3),
여기서:
CBA는 본 발명의 첫 번째 양상에서 설명된 CD123/IL-3Rα-결합 작용제 (가령, 앞서 설명된 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 앞서 설명된 이의 주제 폴리펩티드)이고, 시스테인 잔기를 통해 CyC3에 공유 연결되고;
WC는 1 또는 2이고;
CyC3은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(C3a)
여기서:
m'은 1 또는 2이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
LC'는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
;
여기서:
s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고, 그리고 s2는 CyC3 상에 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
Z는 -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
Q는 H, 하전된 치환체, 또는 이온화가능 기이고;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 및 R22는 각 경우에, 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
q 및 r은 각 경우에, 독립적으로 0 및 10 사이에 정수이고;
m 및 n은 각각 독립적으로 0 및 10 사이에 정수이고;
Rh는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고; 그리고
P'는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이다.
더욱 특정한 구체예에서, q 및 r은 각각 독립적으로 1 내지 6 사이에 정수, 더욱 특정하게는, 1 내지 3 사이에 정수이다. 훨씬 특정하게는, R10, R11, R12 및 R13은 모두 H이다.
다른 더욱 특정한 구체예에서, m 및 n은 각각 독립적으로 1 및 6 사이에 정수, 더욱 특정하게는, 1 내지 3 사이에 정수이다. 훨씬 특정하게는, R19, R20, R21 및 R22는 모두 H이다.
18번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C3)의 면역접합체의 경우에, P'는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고; 그리고 나머지 변수는 17번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다. 더욱 특정한 구체예에서, P'는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (서열 번호: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (서열 번호: 73), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 그리고 Met-Ala에서 선택된다. 다른 더욱 특정한 구체예에서, P'는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala이다.
19번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C3)의 면역접합체의 경우에, -LC'-는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
; 또는
,
여기서 M은 H+ 또는 양이온이고; 그리고 나머지 변수는 17번째 또는 18번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
20번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C3)의 면역접합체의 경우에, m'은 1이고, 그리고 R1 및 R2는 둘 모두 H이고; 그리고 나머지 변수는 17번째, 18번째 또는 19번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
21번째 특정한 구체예에서, 화학식 (C3)의 면역접합체의 경우에, m'은 2이고, 그리고 R1 및 R2는 둘 모두 Me이고; 그리고 나머지 변수는 17번째, 18번째 또는 19번째 특정한 구체예 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
22번째 특정한 구체예에서, 세 번째 구체예의 면역접합체는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
;
; 또는
;
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 DM은 다음의 화학식에 의해 대표되는 약물 모이어티이다:
.
23번째 특정한 구체예에서, 세 번째 구체예의 면역접합체의 경우에, M은 H+, Na+ 또는 K+이고; 그리고 나머지 변수는 1번째 내지 22번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
상기 1번째 내지 23번째 특정한 구체예 중에서 한 가지에서, 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드는 서열 번호: 54 또는 56의 중쇄 CH3 도메인 내에 가공된 Cys에 상응하는 위치 (다시 말하면, 마지막 잔기로부터 5번째)에서 Cys 잔기를 갖는다. 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호: 54에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역 (HC); 및 서열 번호: 33, 35, 37 또는 41 (바람직하게는 서열 번호: 35 또는 37)에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함할 수 있다. 주제 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한, 서열 번호: 56에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig 중쇄 영역; 및 서열 번호: 33, 35, 37 또는 41 (바람직하게는 서열 번호: 35 또는 37)에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 Ig LCVR을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 서열 번호: 54 및 56의 N 말단으로부터 두 번째 잔기는 Phe이고, 반면 일정한 다른 구체예에서, 서열 번호: 54 및 56의 N 말단으로부터 두 번째 잔기는 Val이다.
앞서 설명된 세 번째 구체예의 면역접합체 (가령, 1번째 내지 23번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예의 면역접합체)는 하나 또는 그 이상의 유리 시스테인을 갖는 CBA를 본원에서 설명된 티올-반응성 기를 갖는 세포독성 작용제와 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
한 구체예에서, 티올-반응성 기를 갖는 세포독성 작용제는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(C1a');
(C1a'1);
(C1b'); 또는
(C1b'1),
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 -LC c는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
여기서 이들 변수는 1번째 내지 9번째 및 23번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 및 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
다른 구체예에서, 티올-반응성 기를 갖는 세포독성 작용제는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(C2a"),
(C2a"1),
(C2b"),
(C2b"1)
또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 Lcc'는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
; 또는
;
여기서 이들 변수는 10번째 내지 16번째 및 23번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
또 다른 구체예에서, 티올-반응성 기를 갖는 세포독성 작용제는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
(C3a'),
또는 이의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 LC c'는 전술되고, 그리고 나머지 변수는 17번째 내지 23번째 특정한 구체예 중에서 한 가지 또는 그 안에 설명된 임의의 더욱 특정한 구체예에서 전술한 바와 같다.
일정한 구체예에서, 유기 용매가 세포독성 작용제를 가용화시키기 위해 CBA 및 세포독성 작용제의 반응에서 이용된다. 예시적인 유기 용매는 디메틸아세트아미드 (DMA), 프로필렌 글리콜 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, CBA 및 세포독성 작용제의 반응은 DMA 및 프로필렌 글리콜의 존재에서 실행된다.
4. 조성물 및 이용 방법
본 발명은 본원에서 설명된 주제 항체 또는 이들의 항원 결합 단편, 또는 이들의 면역접합체 (가령, 화학식 (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (C2) 및 (C3)의 접합체) 및 담체 (제약학적으로 허용되는 담체)를 포함하는 조성물 (가령, 제약학적 조성물)을 포함한다. 본 발명은 또한, 주제 항체 또는 이들의 항원 결합 단편, 또는 화학식 (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (C2) 및 (C3)의 접합체 및 담체 (제약학적으로 허용되는 담체)를 포함하고, 그리고 두 번째 치료적 작용제를 더욱 포함하는 조성물 (가령, 제약학적 조성물)을 포함한다. 본 발명 조성물은 포유동물 (가령, 인간)에서 비정상적인 세포 성장을 저해하거나 또는 혈액학적 암, 백혈병 또는 림프종을 비롯한 증식성 장애를 치료하는데 유용하다.
특히, 본 발명은 본원에서 설명된 CD123-결합 작용제 또는 이들의 면역접합체 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용되는 운반제를 더욱 포함한다. 이들 제약학적 조성물은 인간 환자에서 종양 성장을 저해하고, 그리고 혈액학적 암, 백혈병, 또는 림프종을 비롯한 암을 치료하는데 용도를 발견한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 정제된 항체 또는 이의 접합체를 제약학적으로 허용되는 운반제 (가령, 담체, 부형제)와 합동함으로써, 보관과 이용을 위한 제제가 제조된다 (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). 적합한 제약학적으로 허용되는 운반제에는 비독성 완충액, 예를 들면, 인산염, 구연산염, 그리고 다른 유기 산; 염, 예를 들면, 염화나트륨; 아스코르빈산과 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (가령, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 염화물; 벤잘코늄 염화물; 벤제토늄 염화물; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 그리고 m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드 (가령, 약 10개 아미노산 잔기보다 적음); 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 탄수화물, 예를 들면, 단당류, 이당류, 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착물 (가령, Zn-단백질 복합체); 그리고 비이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 설명된 제약학적 조성물은 국부 또는 전신 치료를 위해 수많은 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 (가령, 질과 직장 전달을 비롯하여 점막으로), 예를 들면, 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적약, 좌약, 스프레이, 액체와 분말; 폐 (가령, 연무기에 의해; 기관내, 비내, 표피와 경피를 비롯하여, 분말 또는 에어로졸의 흡기 또는 흡입에 의해); 경구; 또는 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내 또는 근육내 주사 또는 주입을 비롯한 비경구; 또는 두개내 (가령, 척수강내 또는 뇌실내) 투여일 수 있다. 일부 특정 구체예에서, 투여는 정맥내이다. 본원에서 설명된 제약학적 조성물은 또한, 시험관내에서 또는 탈체에서 이용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 제약학적 조합 제제에서, 또는 복합 요법으로서 투약 섭생에서 두 번째 화합물, 예를 들면, 관심되는 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 것으로 공지된 화합물과 합동될 수 있다. 일부 구체예에서, 두 번째 화합물은 항암제이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 두 번째 화합물 및 면역접합체 단독의 투여와 비교하여 더욱 우수한 효력을 유발하는 본 발명의 면역접합체를 투여하는 것을 포괄한다. 두 번째 화합물은 예로서, 국소, 폐, 경구, 비경구, 또는 두개내 투여를 비롯한 수많은 방식을 통해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 투여는 경구이다. 일부 구체예에서, 투여는 정맥내이다. 일부 구체예에서, 투여는 경구와 정맥내 둘 모두이다.
항체 또는 면역접합체는 또한, 제약학적 조합 제제에서, 또는 복합 요법으로서 투약 섭생에서, 진통제, 또는 다른 약제와 합동될 수 있다.
항체 또는 면역접합체는 제약학적 조합 제제에서, 또는 복합 요법으로서 투약 섭생에서, 항암 성질을 갖는 두 번째 화합물과 합동될 수 있다. 제약학적 조합 제제 또는 투약 섭생의 두 번째 화합물은 이들이 서로에 부정적으로 영향을 주지 않도록, 이러한 조합의 ADC에 상보성 활성을 가질 수 있다. CD123-결합 작용제 및 두 번째 항암제를 포함하는 제약학적 조성물 역시 제공된다.
본 발명은 포유동물 (가령, 인간)에서 비정상적인 세포 성장을 저해하거나 또는 증식성 장애를 치료하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에서 설명된 주제 항체 또는 이들의 항원 결합 단편, 또는 면역접합체 (가령, 화학식 (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (C2) 및 (C3)의 접합체), 또는 이들의 조성물의 치료 효과량을 단독으로 또는 두 번째 치료적 작용제와 합동으로 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함한다.
일정한 구체예에서, 포유동물에서 비정상적인 세포 성장 또는 증식성 장애는 CD123의 발현과 연관되거나 또는 이것에 의해 특징화되는 질환 또는 장애, 예를 들면, 혈액학적 암, 백혈병, 또는 림프종을 비롯한 암이다. 일정한 구체예에서, 증식성 장애는 림프성 장기의 암, 또는 혈액학적 악성이다.
가령, 암은 다음과 같이 구성된 군에서 선택될 수 있다: 급성 골수성 백혈병 (CD33-낮은 AML, P-당단백질 양성 AML, 재발성 AML, 또는 난치성 AML을 비롯한 AML), CML의 분아형 위기 및 CML과 연관된 Abelson 종양유전자 (Bcr-ABL 전위)를 비롯한 만성 골수성 백혈병 (CML), 골수형성이상 증후군 (MDS), 급성 B 림프모구성 백혈병 또는 B-세포 급성 림프모구성 백혈병 (B-ALL), CLL의 리히터 증후군 또는 리히터 형질전환을 비롯한 만성 림프성 백혈병 (CLL), 모양 세포성 백혈병 (HCL), 급성 전골수성 백혈병 (APL), B-세포 만성 림프구증식 질환 (B-CLPD), 비정형성 만성 림프성 백혈병 (가급적, 현저한 CD11c 발현을 동반), 분아형 형질세포양 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 외투 세포 백혈병 (MCL) 및 소형 림프성 림프종 (SLL)을 비롯한 비호지킨 림프종 (NHL), 호지킨 림프종, 전신성 비만세포증, 그리고 버킷 림프종.
일정한 구체예에서, B-ALL은 CD19 양성 B-ALL이다. 일정한 다른 구체예에서, B-ALL은 CD19 음성 B-ALL이다.
일정한 구체예에서, 암은 최소한 하나의 부정적인 예후 인자, 예를 들면, P-당단백질의 과다발현, EVI1의 과다발현, p53 변경, DNMT3A 돌연변이, FLT3 내부 탠덤 중복을 갖는다.
일정한 구체예에서, 단독으로 또는 두 번째 치료적 작용제와 합동으로, 본원에서 설명된 주제 항체 또는 이들의 항원 결합 단편, 또는 면역접합체 (가령, 화학식 (L1), (L2), (L3), (S1), (S2), (S3), (S4), (C1), (C2) 및 (C3)의 접합체), 또는 이들의 조성물의 치료 효과량은 정상적인 조혈 줄기 세포 (HSCs)에 비하여, 백혈병성 줄기 세포 (LSCs), 백혈병 선조체 (LPs) 및/또는 백혈병성 모구의 증식을 우선적으로 저해한다. 일정한 구체예에서, 백혈병성 줄기 세포 (LSCs), 백혈병 선조체 (LPs) 및/또는 백혈병성 모구의 증식을 저해하는 상기 주제 작용제의 IC50 값 또는 반극대 농도는 정상적인 조혈 줄기 세포 (HSCs)에 대한 것보다 최소한 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 100-, 150-, 300-, 500-배 또는 그 이상 낮다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 항-백혈병 요법은 백혈병성 모구를 표적으로 하고 사멸시킬 뿐만 아니라, 바람직하게는 백혈병성 선조체 (LP) 및 백혈병성 줄기 세포 (LSCs)를 또한 표적으로 하고 사멸시킨다. 일정한 구체예에서, 상기 요법은 또한, 정상적인 HSCs에 대해 덜 선별적이다. 일정한 구체예에서, LSCs, LPs 및 백혈병 모구 상에서 CD123 발현은 정상적인 림프구 (이것은 음성에 가까울 수 있다)와 비교하여 훨씬 높다 (가령, LSC, AML 선조체 및 AML 모구에서 최소한 20-25 배 높다). 일정한 구체예에서, LPs 및 LSCs 상에서 CD123 발현 수준은 최소한 백혈병성 모구 상에서 것들만큼 높다.
유사하게, 본 발명은 선별된 세포 개체군에서 세포 사멸을 유도하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 표적 세포 또는 표적 세포를 내포하는 조직을 본 발명의 주제 항체 또는 이들의 항원 결합 단편, 또는 면역접합체의 효과량과 접촉시키는 것을 포함한다. 표적 세포는 이들 접합체의 세포 결합 작용제가 결합할 수 있는 세포이다.
원하는 경우에, 다른 활성제, 예를 들면, 다른 항암제가 이들 접합체와 함께 투여될 수 있다.
암 요법 및 이들의 용량, 투여 루트 및 권장된 용법은 당분야에서 공지되고 Physician's Desk Reference (PDR)와 같은 문헌에서 설명되었다. PDR은 다양한 암의 치료에서 이용된 작용제의 용량을 개시한다. 치료적으로 효과적인 이들 전술한 화학요법 약물의 투약 섭생 및 용량은 치료되는 특정 암, 질환의 정도 및 당분야의 의사에게 익숙한 다른 인자에 의존할 것이고, 그리고 의사에 의해 결정될 수 있다. PDR의 내용은 본원에서 전체적으로 참조로서 명시적으로 통합된다. 당업자는 본 발명의 교시에 따라서 이용될 수 있는 화학요법 작용제 및 접합체의 투약 섭생 및 용량을 결정하기 위해, 다음의 파라미터 중에서 하나 또는 그 이상을 이용하여 PDR을 검토할 수 있다. 이들 파라미터는 다음을 포함한다: 포괄적인 지수; 제조업체; 제품 (기업의 또는 상표가 등록된 약물 명칭에 의해); 범주 지수; 일반명/화학적 지수 (비-상표 통상적 약물 명칭); 약제의 컬러 이미지; FDA 표지와 일치하는 제품 정보; 화학적 정보; 기능/작용; 징후 & 금기; 시험 연구, 부작용, 주의사항.
시험관내 이용의 실례는 병든 또는 악성 세포를 사멸시키기 위해 동일한 환자 내로 이식에 앞서 자가 골수의 처리: 적격성 T 세포를 사멸시키고 이식편-대-숙주-질환 (GVHD)을 예방하기 위해 이식에 앞서 골수의 처리; 표적 항원을 발현하지 않는 원하는 변이체를 제외하고, 모든 세포를 사멸시키기 위해 세포 배양액의 처리; 또는 바람직하지 않은 항원을 발현하는 변이체의 사멸을 포함한다.
비-임상적 시험관내 이용의 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
임상적 탈체 이용의 실례는 암 치료에서 또는 자가면역 질환의 치료에서 자가 이식에 앞서 골수로부터 종양 세포 또는 림프구양 세포를 제거하거나, 또는 GVHD를 예방하기 위해 이식에 앞서 자가 또는 동종이계 골수 또는 조직으로부터 T 세포 및 다른 림프구양 세포를 제거하는 것이다. 처리는 아래와 같이 실행될 수 있다. 골수가 환자 또는 다른 개체로부터 수확되고, 그리고 이후, 약 37℃에서 약 30 분 내지 약 48 시간 동안 약 10 μΜ 내지 1 pM 범위의 농도에서 본 발명의 세포독성 작용제가 첨가된 혈청을 내포하는 배지에서 배양된다. 배양의 농도 및 시간의 정확한 조건, 다시 말하면, 용량은 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 배양 후, 골수 세포는 혈청을 내포하는 배지로 세척되고 공지된 방법에 따라 정맥내로 환자에게 복귀된다. 환자가 골수의 수확 시점 및 처리된 세포의 재주입 사이에 다른 치료, 예를 들면, 절제 화학요법 또는 전신 조사의 코스를 제공받는 경우에, 처리된 골수 세포는 표준 의학적 설비를 이용하여 액체 질소에서 동결 보관된다.
임상적 생체내 이용의 경우에, 본 발명의 세포독성 화합물 또는 접합체는 무균 및 내독소 수준에 대해 시험되는 용액 또는 동결건조된 분말로서 공급될 것이다.
적합한 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제는 널리 알려져 있고, 그리고 임상적 상황에 따라서 당업자에 의해 결정될 수 있다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 실례는 다음을 포함하고: (1) 약 1 mg/mL 내지 25 mg/mL 인간 혈청 알부민을 내포하거나 또는 내포하지 않는 Dulbecco의 인산염 완충된 식염수, pH 약 7.4, (2) 0.9% 식염수 (0.9% w/v NaCl), 그리고 (3) 5% w/v) 덱스트로스; 그리고 항산화제, 예를 들면, 트립타민 및 안정화제, 예를 들면, Tween 20을 또한 내포할 수 있다.
선별된 세포 개체군에서 세포 사멸을 유도하기 위한, 세포 성장을 저해하기 위한 및/또는 암을 치료하기 위한 본 발명의 방법은 시험관내에서, 생체내에서, 또는 탈체에서 실시될 수 있다.
실시예
실시예 1 인간 및 시노몰구스 CD123 항원에 대항하여 생쥐 단일클론 항체의 산출
뮤린 항-CD123 항체를 생산하기 위해, 야생형 BALB/c 암컷 생쥐 (Charles River Laboratory, Wilmington, MA)는 5회 동안 2 주마다 5 x106 세포/ 생쥐의 용량에서 PBS에 담긴 인간 CD123 발현 안정된 300-19 세포주가 피하 주사되었는데, 이것은 BALB/c 유래된 프레-B 세포주이다 (M. G. Reth et al. 1985, Nature, 317: 353-355). 하이브리도마 산출을 위해 희생되기 전 3 일에, 면역화된 생쥐는 다른 용량의 항원의 복강내 주사를 제공받았다. 생쥐로부터 비장은 표준 동물 프로토콜에 따라 수집되었고, 그리고 RPMI-1640 배지에서 단일 세포 현탁액을 획득하기 위해 2개의 무균, 반투명 현미경적 슬라이드 사이에서 갈아졌다. 적혈구가 ACK 용해 완충액으로 용해된 후, 비장 세포는 이후, 1 P3 세포: 3 비장 세포의 비율에서 뮤린 골수종 P3X63Ag8.653 세포 (P3 세포)와 혼합되었다 (J. F. Kearney et al., 1979, J. Immunol, 123: 1548-1550). 비장 세포 및 P3 세포의 혼합물은 세척되고, 그리고 실온에서 3 분 동안 융합 배지 (0.3 M 만니톨/D-소르비톨, 0.1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2 및 1 mg/mL BSA)에서 프로나아제로 처리되었다. 반응은 소 태아 혈청 (FBS, Invitrogen)의 첨가에 의해 중지되었다; 세포는 이후, 세척되고, 2 mL 차가운 융합 배지에서 재현탁되고, BTX ECM 2001 전기세포융합 기계 (Harvard Apparatus)로 융합되었다. 융합된 세포는 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) (Sigma Aldrich)을 내포하는 RPMI-1640 선별 배지에 부드럽게 첨가되고, 37℃에서 20 분 동안 배양되고, 그리고 이후, 200 μL/웰에서 편평 바닥 96-웰 평판 내로 파종되었다. 평판은 이후, 하이브리도마 클론이 항체 선별검사에 대해 준비될 때까지 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 배양되었다. J. Langone 및 H. Vunakis (Eds., Methods in Enzymology, Vol. 121, Immunochemical Techniques, Part I, Academic Press, Florida); 그리고 E. Harlow 및 D. Lane (Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY)에서 설명된 것들을 비롯하여, 면역화 및 하이브리도마 생산의 다른 기술이 또한 이용될 수 있다.
하이브리도마 선별검사 및 선별
하이브리도마 선별검사는 인간 CD123 발현 안정된 300-19 세포주 및 야생형 300-19 세포를 이용한 유세포 계측 결합 검정으로 행위되었다. 간단히 말하면, 야생형 300-19 세포는 먼저, CellTraceTM 초적색 DDAO-SE (Invitrogen)로 표지화되고, 1:1 비율에서 처리되지 않은 세포와 혼합되고, 그리고 얼음 위에서 2 시간 동안 하이브리도마 상층액과 함께 배양되었다. 세포는 이후, 세척되고, PE-표지화된 항생쥐 IgG (Jackson Immunoresearch)와 함께 배양되고, 세척되고, 포르말린으로 고정되고, 그리고 FACS 어레이 (BD Bioscience)를 이용하여 분석되었다. 인간 CD123 항원에 특정한 반응성을 갖는 하이브리도마는 확대되었고, 그리고 상층액은 3가지 독립된 세포주: 인간 CD123 발현 안정된 300-19 세포주, 시노몰구스 CD123 발현 안정된 300-19 세포주 및 야생형 300-19 세포주를 이용한 유세포 계측 결합 검정에 의해 재선별검사되었다. 인간 및 시노몰구스 CD123 항원에 양성 결합을 갖지만 야생형 300-19 세포에서 음성인 하이브리도마는 제한 희석에 의해 더욱 하위클로닝되었다. 인간 및 시노몰구스 CD123 항원에 특이적 결합을 보여주는, 각 하이브리도마로부터 한 하위클론이 차후 분석을 위해 선택되었다.
총 6개 융합이 이러한 조사의 코스에 걸쳐 수행되었다. 거의 6,000개의 하이브리도마가 선별검사되었고, 인간 및 시노몰구스 CD123 항원에 특정한 33개의 하이브리도마가 산출되었고, 그리고 18개의 하이브리도마가 하위클로닝되었다. 안정된 하위클론은 배양되었고, 그리고 단일클론 항체의 아이소타입은 상업적인 생쥐 IgG 아이소타이핑 시약 (가령, Roche Diagnostics GmbH, Germany, 제품 번호 11493027001에 의한 IsoStrip 생쥐 단일클론 항체 아이소타이핑 키트)을 이용하여 확인되었다.
항체 정제
항체는 표준 방법, 예를 들면, 예로서 단백질 A 또는 G 크로마토그래피 (HiTrap 단백질 A 또는 G HP, 1 mL, Amersham Biosciences)를 이용하여 하이브리도마 하위클론 상층액으로부터 정제되었다. 간단히 말하면, 상층액은 1/10 용적의 1 M Tris/HCl 완충액, pH 8.0의 첨가에 의해 크로마토그래피에 대해 준비되었다. pH-조정된 상층액은 0.22 μm 필터 막을 통해 여과되고, 그리고 결합 완충액 (PBS, pH 7.3)으로 평형화된 칼럼 위에 부하되었다. 칼럼은 280 nm에서 흡광도가 없는 안정된 기준선이 획득될 때까지, 결합 완충액으로 세척되었다. 항체는 0.5 mL/분의 유속을 이용하여, 0.15 M NaCl을 내포하는 0.1 M 아세트산 완충액, pH 2.8로 용리되었다. 거의 0.25 mL의 분획물이 수집되고 1/10 용적의 1M Tris/HCl, pH 8.0의 첨가에 의해 중화되었다. 피크 분획물(들)은 하룻밤 동안 1 x PBS에 대해 2회 투석되고 0.2 μm 필터 막을 통해 여과함으로써 살균되었다. 정제된 항체는 A280에서 흡광도에 의해 정량되었다.
단백질 A 정제된 분획물은 뮤린 항체에 대한 사차 암모늄 (Q) 크로마토그래피와 함께, 이온 교환 크로마토그래피 (IEX)를 이용하여 더욱 연마되었다. 간단히 말하면, 단백질 A 정제로부터 표본은 결합 완충액 (10 mM Tris, 10 mM 염화나트륨, pH 8.0) 내로 완충액 교환되고 0.22 μm 필터를 통해 여과되었다. 제조된 표본은 이후, 120 cm/시간의 유속에서 결합 완충액으로 평형화된 Q 빠른 유동 수지 (GE Lifesciences) 위에 부하되었다. 칼럼 크기는 표본 내에 모든 MAb에 결합하는 충분한 능력을 갖도록 선택되었다. 칼럼은 이후, 280 nm에서 흡광도가 없는 안정된 기준선이 획득될 때까지, 결합 완충액으로 세척되었다. 항체는 20 칼럼 용적 (CV)에서 10 mM 내지 500 mM 염화나트륨의 구배를 개시함으로써 용리되었다. 피크 분획물은 280 nm (A280)에서 흡광도 치수에 근거하여 수집되었다. 단위체의 백분율은 Agilent HPLC 1100 시스템 (Agilent, Santa Clara, CA )을 이용하여, SWXL 가드 칼럼, 6.0 x 40 mm (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA)와 함께 TSK 겔 G3000SWXL, 7.8 x 300 mm에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 사정되었다. 95%를 초과하는 단위체 함량을 갖는 분획물은 모아지고, TFF 시스템을 이용하여 PBS (pH 7.4)로 완충액 교환되고, 그리고 0.2 μm 필터 막을 통해 여과함으로써 살균되었다. 정제된 항체의 IgG 농도는 1.47의 흡광 계수를 이용하여 A280에 의해 결정되었다. 대안적 방법, 예를 들면, 세라믹 수산화인회석 (CHT)이 우수한 선택성을 갖는 항체를 연마하는데 또한 이용되었다. 40 μm 입자 크기를 갖는 유형 II CHT 수지 (Bio-Rad Laboratories)는 IEX 크로마토그래피에 대해 설명된 바와 유사한 프로토콜로 이용되었다. CHT에 대한 결합 완충액은 20 mM 인산나트륨, pH 7.0에 상응하고, 그리고 항체는 20 CV에서 20-160 mM 인산나트륨의 구배로 용리되었다.
실시예 2 항-CD123 항체의 V L 및 V H 영역의 클로닝 및 염기서열결정
V L 및 V H 영역의 클로닝
전체 세포 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라서 RNeasy 키트 (Qiagen)를 이용하여 CD123 하이브리도마의 5 x 106 세포로부터 준비되었다. cDNA는 차후에, SuperScript II cDNA 합성 키트 (Invitrogen)를 이용하여 전체 RNA로부터 합성되었다.
하이브리도마 세포로부터 유래된 항체 가변 영역 cDNAs를 증폭하기 위한 PCR 절차는 Wang et al. ((2000) J Immunol Methods. 233:167-77) 및 Co et al.( (1992) J Immunol. 148:1149-54)에서 설명된 방법에 근거되었다. VL 및 VH 서열은 5' 단부에서 축중성 프라이머 및 3' 단부에서 각각, 뮤린 카파 또는 IgG1 불변 영역 특이적 프라이머에 의해 증폭되었다. 정제된 앰플리콘은 염기서열결정을 위해 Beckman Coulter Genomics에 보내졌다.
VL 및 VH cDNA 서열을 클로닝하는데 이용된 축중성 프라이머가 5' 단부를 변경하기 때문에, 완전한 cDNA 서열을 실증하기 위한 추가 염기서열결정 노력이 필요하였다. 예비적 서열은 항체 서열이 유래된 뮤린 생식계열 서열을 확인하기 위해, NCBI IgBlast 사이트의 검색 조회 내로 입력되었다. PCR 프라이머는 이후, 이러한 새로운 PCR 반응이 PCR 프라이머에 의해 변경되지 않은 완전한 가변 영역 cDNA 서열을 산출하도록, 뮤린 항체의 생식계열 연결된 리더 서열에 어닐링하도록 설계되었다.
서열 확증을 위한 질량 결정
각각의 항-CD123 항체에 대해 획득된 가변 영역 cDNA 서열은 전장 항체 cDNA 서열을 획득하기 위해 생식계열 불변 영역 서열과 합동되었다. 이후, 중쇄와 경쇄의 분자량이 cDNA 서열의 번역으로부터 계산되고, 그리고 정제된 뮤린 항-CD123 항체의 LC/MS 분석에 의해 획득된 분자량과 비교되었다. 각각의 경쇄와 중쇄에 대한 관찰된 분자량은 기댓값과 정합하였다.
실시예 3 항체 인간화
재조합 항체 발현
뮤린 CD123 항체에 대한 확증된 가변 영역 아미노산 서열은 코돈 최적화되고, 합성되고, 그리고 CD123 항체의 키메라 버전을 구축하기 위해 Blue Heron Biotechnology에 의한 인간 항체 불변 영역과 인프레임으로 클로닝되었다. 키메라 CD123 항체에 대해 이용된 벡터, 불변 영역 및 클로닝 계획은 아래에 설명된 인간화 CD123 항체에 대해 이용된 것들과 동일하였다. 키메라 항체 chCD123-6은 각각, 중쇄와 경쇄에 대한 인간 IgG1 및 카파 불변 서열과 함께, 각각 서열 번호: 28 및 29의 생쥐 가변 영역으로 구성된다. 경쇄 가변 영역은 pAbKZeo 플라스미드의 EcoRI 및 BsiWI 부위 내로 클로닝되었고, 그리고 중쇄 가변 영역은 pAbG1Neo 플라스미드의 HindIII 및 Apa1 부위 내로 클로닝되었다. 이들 발현 구조체는 진탕 플라스크에서 변형된 PEI 절차를 이용하여, 현탁액 적응된 HEK-293T 세포를 이용하여 유착성 HEK-293T 세포에서 일시적으로 생산되었다. PEI 일시적인 형질감염물은 HEK-293T 세포가 Freestyle 293 (Invitrogen)에서 성장되고, 그리고 배양 용적이 PEI-DNA 복합체의 첨가 후 희석되지 않은 상태로 남겨졌다는 점을 제외하고, 기존 문헌에서 설명된 바와 같이 (Durocher et al., Nucleic Acids Res. 30(2):E9 (2002)) 수행되었다. 형질감염물은 1 주 동안 배양되었고, 그리고 이후, 투명해진 상층액은 표준 단백질 A 크로마토그래피, 그 이후에 연마 크로마토그래피 절차에 의해 정제되었다.
항체 인간화
뮤린 CD123-6 항체는 Jones et al., Nature 321: 604-608, 1986, Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988, U.S. 특허 번호 5,225,539, 그리고 U.S. 특허 번호 5,585,089에서 설명된 바와 실제적으로 동일한 상보성 결정 영역 (CDR) 합체 절차를 이용하여 인간화되었다. CDR 합체는 일반적으로, 부모 항체의 특이적 항원-결합 성질에 결정적인 생쥐 CDR 잔기를 보존하면서, 생쥐 항체의 Fv 프레임워크 영역 (FRs)을 인간 항체 Fv 프레임워크 영역으로 대체하는 것으로 구성된다. Kabat 넘버링 기법 및 Kabat CDR 정의에 따른 CD123-6 항체의 예시적인 CDRs는 아래 표 A에서 지시된 바와 같다.
Figure 112018009762973-pct00691
CDR-합체 과정은 적절한 인간 수용자 프레임워크, 전형적으로, 부모 뮤린 항체에 가장 높은 서열 상동성을 공유하는 인간 항체 유전자로부터 유래된 것들을 선별함으로써 시작된다. 뮤린 CD123-6 항체에 가장 높은 상동성을 갖는 인간 면역글로불린 생식계열 경쇄와 중쇄 서열은 Ehrenmann et al., Nucleic Acids Res. 38: D301-307 (2010)에서 설명된 바와 같이, International ImMunoGeneTics information system®의 상호작용 도구, DomainGapAlign (IMGT (http 칼럼 이중 슬래시 imgt 점 cines 점 fr 슬래시)을 활용하여 확인되었다. CD123-6 항체의 VL 및 VH 도메인에 대한 수용자 프레임워크로서 선별된 인간 생식계열 서열은 각각, IGKV1-16*01 및 IGHV1-46*03이었다.
본래 muCD123-6 VL 서열, 상응하는 인간 생식계열 서열 IGKV1-16*01, 그리고 상응하는 huCD123-6VLGv1 및 huCD123-6VLGv4 서열의 유관한 부분 사이에서 서열 정렬은 아래에 도시된다.
본래 muCD123-6 VH 서열, 상응하는 인간 생식계열 서열 IGHV1-46*03, 그리고 상응하는 huCD123-6VHGv1, huCD123-6VHGv6 및 huCD123-6VHGv7 서열의 유관한 부분 사이에서 서열 정렬은 아래에 도시된다.
인간화 DNA 구조체가 합성되고, 발현되고, 그리고 재조합 항체가 부모 항체와 비교하여 차후 CD123 결합 분석을 위해 앞서 설명된 바와 같이 정제되었다.
프레임워크 잔기 역시 항원 결합에 구조적으로 기여할 수 있고, 그리고 항원 결합 친화성을 최대로 보존하기 위해 복귀 돌연변이로서 재도입될 수 있다는 것은 충분히 확립되어 있다. Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224: 487-499 (1992). 버니어 구역 잔기로서 지칭되는, CDRs 바로 아래에 잔기의 플랫폼은 항체의 특이성 및 친화성을 주동하는 CDR 루프의 입체형태를 보존하는데 도움을 줄 수 있다. 따라서 버니어 구역 잔기의 하나 또는 그 이상의 복귀 돌연변이를 내포하는 변이체가 만들어졌고, 그리고 차후에, 항원 결합뿐만 아니라 기능적 IL3 저해 활성에 대해 평가되었다. 시험된 버니어 구역 잔기 복귀 돌연변이는 VL 내에 3개의 잔기 (FW-L2에서 위치 46 및 FW-L3에서 위치 69, 71), 그리고 VH 내에 8개의 잔기 (FW-H1에서 위치 2, 28, FW-H2에서 위치 48 및 FW-H3에서 위치 67, 69, 71, 73, 78)를 포함하였다. 버전 4.6에 의해 구현되거나 또는 본원에서 "Gv4.6" (VL Gv4 및 VH Gv6)으로서 지칭된 바와 같은, 그리고 버전 4.7에 의해 구현되거나 또는 본원에서 "Gv4.7" (VL Gv4 및 VH Gv7)로서 지칭된 바와 같은, 버니어 구역 복귀 돌연변이를 갖는 여러 CDR-합체된 CD123-6 항체가 TF-1 세포에 대한 IL3 저해 활성을 전시하였다 (도면 1).
설명된 CDR-합체된 CD123-6 항체의 특정한 프레임워크 잔기 용법은 아래의 표 B 및 C에서 제공된다.
Figure 112018009762973-pct00695
Figure 112018009762973-pct00696
추가적으로, CDRs 범위에 들어가는 리신을 접합하는 충격에 관한 우려를 최소화하기 위해, 뮤린 CD123-6 항체 CDR-L1에서 리신 24가 CDR 합체 동안 아르기닌으로 대체되었다 (상기 표 A를 참조한다).
CD123-6 항체는 또한, Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973, 1994 및 Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904, 1996에서 이전에 설명된 방법에 따른 가변 도메인 표면치환에 의해 인간화되었다. 표면치환은 일반적으로, 경쇄와 중쇄 둘 모두에서 가변 영역 프레임워크 표면 잔기를 확인하고 이들을 인간 등가물로 대체하는 것을 수반한다. 뮤린 CDRs 및 매몰된 프레임워크 잔기는 표면치환된 항체에서 보존된다. CD123-6 항체의 예시적인 CDRs는 표 D에서 지시된 바와 같이 규정된다.
Figure 112018009762973-pct00697
CDRs 범위에 들어가는 리신을 접합하는 충격에 관한 우려를 최소화하기 위해, 뮤린 CD123-6 항체 경쇄 CDR-L1의 리신 24가 아르기닌으로 대체되었다. 유사하게, 뮤린 CD123-6 항체 중쇄 CDR-H2의 리신 52 및 59가 표면치환된 버전 1.0을 위해 아르기닌으로 대체되었다. AbM 중쇄 CDR-H2 정의가 표면치환에 이용되었고, 따라서 표에서는 이들뿐만 아니라 CD123-6 항체의 뮤린 및 인간 버전 둘 모두에 대한 예시적인 Kabat 규정된 중쇄 CDR-H2 서열을 제공한다.
표면 잔기 위치는 30% 또는 그 이상의 상대적 접근성을 갖는 임의의 위치로서 규정되었다 (Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235: 959-973, 1994). 계산된 표면 잔기는 이후, 최대 상동성 인간 표면 서열을 확인하기 위해, 인간 생식계열 표면 서열에 맞추어 정렬되었다. CD123-6 항체의 경쇄 가변 도메인에 대한 대체 표면으로서 이용된 인간 생식계열 서열은 IGKV1-16*01이었고, 반면 IGHV1-69*10은 중쇄 가변 도메인에 대한 대체 표면으로서 이용되었다. 특정한 프레임워크 표면 잔기 변화는 아래의 표 E 및 F에서 제공된다.
Figure 112018009762973-pct00698
Figure 112018009762973-pct00699
Figure 112018009762973-pct00700
아래의 서열 정렬은 뮤린 대응물과 함께, 가벼운 (VL) 및 무거운 (VH) 사슬 둘 모두의 CD123-6 항체 가변 도메인에 대한 표면치환된 서열을 보여준다. 표면치환된 huCD123-6 VL 서열의 경우 서열 번호: 41, 그리고 표면치환된 huCD123-6 VH 서열의 경우 서열 번호: 39 및 40을 참조한다.
실시예 4 IL3-매개된 신호전달 및 증식을 저해하는 항-CD123 항체에 대한 스크린
IL3-매개된 신호전달 및 증식을 저해하는 항-CD123 항체의 능력은 다음의 성장 인자, IL-3 또는 GM-CSF중에서 한 가지의 존재에서만 증식할 수 있는 적백혈병 세포주 TF-1을 이용하여 시험관내에서 조사되었다. TF-1 세포는 GM-CSF (2 ng/mL)로 보충된 완전한 RPMI 배지 (RPMI-1640, 10% 소 태아 혈청 및 50 μg/mL 젠타마이신 황산염; 모든 시약은 Invitrogen으로부터 구입되었다)에서 배양되었다. 증식 검정을 설정하기에 앞서, 이들 세포는 세척되고 그리고 이후, 성장 인자가 하룻밤 동안 절식되었다. 세포 표면 상에서 Fc 수용체를 차단하기 위해, 배양 배지는 100 nM chKTI 항체 (동일한 아이소타입의 비결합 항체)로 보충되었다. TF-1 세포는 10 μg/mL의 항-CD123 항체의 존재 또는 부재에서 완전한 RPMI 배지에서 웰마다 6,000 세포로 도말되었다. 성장 인자, IL-3 (1 ng/mL) 또는 GM-CSF (2 ng/mL)가 세포 증식을 개시하기 위해 세포에 첨가되었다. 세포는 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 3 일 동안 37℃에서 배양되었다. 각 웰에서 생존가능 세포의 상대적 숫자는 비색 WST-8 검정 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, US)에 의해 결정되었다. WST-8은 생존가능 세포에서 탈수소효소에 의해 오렌지 포르마잔 산물로 환원되는데, 이것은 조직 배양 배지에서 가용성이다. 생산된 포르마잔의 양은 생존가능 세포의 숫자에 직접적으로 비례한다. WST-8가 최종 부피의 10%로 웰 내로 첨가되었고, 그리고 평판은 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 추가 2-6 시간 동안 37℃에서 배양되었다. 이후, 흡광도가 평판-판독기 분광광도계에서 이중 파장 방식 450 nm / 650 nm에서 계측되었고, 그리고 650 nm에서 흡광도 (세포에 의한 비특이적 광 산란)가 450 nm에서 흡광도로부터 감산되었다. 각 웰에서 상대적 세포 수는 먼저 배지 배경 흡광도를 교정하고, 그리고 이후, 항체로 처리된 각 표본의 값을 처리되지 않은 세포 (대조)를 포함하는 웰의 평균 값으로 나눔으로써 계산되었다.
전형적인 검정으로부터 결과는 도면 2a 및 2b에서 제공된다. 이전에 보고된 데이터 (Sun et al. 1996)와 일관되게, 7G3 항체는 IL-3 의존성 증식을 실제적으로 저해하지만, 6H6 또는 9F5 항체는 그렇지 않았다. 예상치 않게, 본 연구에서 산출된 여러 항-CD123 항체는 TF-1 세포의 IL-3 의존성 증식을 7G3보다 훨씬 유의미하게 저해할 수 있었다 (도면 2a). 가령, 항체 3, 6 및 14는 TF-1 세포의 숫자를 대조 (항체의 부재에서 성장된 TF-1 세포)에서 숫자의 5% 이하까지 감소시켰고, 반면 7G3 항체는 세포의 숫자를 대조에서 숫자의 15%까지 감소시켰다. 대조적으로, 다른 항-CD123 항체 (가령, 항체 2, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 16, 18, 20, 21 및 22)로 처리는 세포 증식에 대한 단지 최소 효과만을 갖거나 또는 어떤 효과도 없었다.
항체 3, 6, 14 및 7G3에 의한 TF-1 세포 증식의 저해는 IL-3 의존성이었는데, 그 이유는 이들 세포가 다른 성장 인자 GM-CSF의 존재에서 성장될 때, 이들 항체가 저해 효과를 나타내지 않았기 때문이다 (도면 2b).
그 다음, IL3-의존성 증식을 저해하는데 필요한, 항체 3, 6, 14 (각각, muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14로 개칭됨) 및 7G3의 농도가 결정되었다. TF-1 세포는 100 μL 배양 배지에서 웰마다 6,000 세포로 도말되었다. 이들 항체는 6-배 희석 계열을 이용하여 배양 배지 내로 희석되었고, 그리고 50 μL의 희석된 물질이 웰마다 첨가되었다. 이후, IL3이 최종 농도 1 ng/mL에서 세포에 첨가되었다. 최종 항체 농도는 전형적으로, 6 x 10-8 M 내지 8 x 10-12 M 범위에서 변하였다. 세포는 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 3 일 동안 37℃에서 배양되었다. 각 웰에서 상대적 세포 수는 앞서 설명된 바와 같이 WST-8 검정에 의해 결정되었다. 상대적 세포 수 값은 항체 농도에 대하여 플롯팅되고 도면 3에서 제시되었다. muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 및 7G3은 TF-1 세포의 IL-3 의존성 증식을 실제적으로 및 용량 의존성 방식으로 저해하고, 반면 대조 비기능적 항-CD123 항체는 이런 효과를 나타내지 못한다는 것은 분명하다. 가령, 7G3으로 처리는 상대적 세포 수를 시험된 가장 높은 항체 농도에서 0.33 nM의 IC50 값으로 18%까지 감소시켰다. muCD123-3으로 처리는 상대적 세포 수를 시험된 가장 높은 항체 농도에서 0.26 nM의 IC50 값으로 2%까지 감소시켰다. 유사하게, muCD123-14 또는 muCD123-6로 처리는 상대적 세포 수를 시험된 가장 높은 항체 농도에서 각각, 0.08 nM 또는 0.05 nM의 IC50 값으로 1% 이하까지 감소시켰다. 이런 이유로, muCD123-3, muCD123-6 및 muCD123-14는 TF-1 세포의 IL-3 의존성 증식을 7G3 항체보다 훨씬 높은 정도까지 저해한다.
실시예 5 뮤린 항-CD123 항체의 결합 친화성
결합 친화성은 정제된 항체를 이용한 유세포분석법에 의해 시험되었다. CD123-발현 TF-1 및 HNT-34 세포에 muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 및 7G3의 결합을 도해하는 FACS 히스토그램은 각각, 도면 4a 및 4b에서 도시된다. TF-1 세포 (표본당 5x104 세포)는 200 μL FACS 완충액 (2% 정상적인 염소 혈청으로 보충된 DMEM 배지)에서 변하는 농도의 뮤린 항체와 함께 배양되었다. 이들 세포는 이후, 펠렛화되고, 2회 세척되고, 그리고 100 μL의 피코에리트린 (PE)-접합된 염소 항생쥐 IgG-항체 (Jackson Laboratory)와 함께 1 시간 동안 배양되었다. 이들 세포는 다시 한 번 펠렛화되고, FACS 완충액으로 세척되고, 그리고 1% 포름알데히드를 내포하는 200 μL의 PBS에서 재현탁되었다. 표본은 HTS 다중웰 샘플러가 있는 FACSCalibur 유세포분석기, 또는 FACS 어레이 유세포분석기를 이용하여 획득되고 CellQuest Pro를 이용하여 분석되었다 (이들 모두 BD Biosciences, San Diego, US로부터). 각 표본에서, FL2에 대한 기하평균 형광 강도가 계산되고 반-로그 플롯에서 항체 농도에 대하여 플롯팅되었다. 용량 반응 곡선은 비선형 회귀에 의해 산출되었고, 그리고 각 항체의 겉보기 해리 상수 (Kd)에 상응하는 각 곡선의 EC50 값은 GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA)를 이용하여 계산되었다. 강한 결합이 시험된 모든 항체에 대해 관찰되었고, 그리고 Kd 값은 muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 및 7G3 항체에 대해 각각, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.3 nM 및 0.9 nM에 상응한다 (도면 4a). 따라서 이러한 실험에서, 주제 뮤린 CD123 항체에 의한 결합은 7G3 항체에 의한 결합보다 최소한 3-9 배 우수하다.
유사하게, 다른 CD123-양성 급성 골수성 백혈병 세포주, HNT-34가 앞서 설명된 동일한 유세포분석법 검정에 이용될 때 강한 결합이 또한 관찰되었다. 앞서 설명된 바와 같이 계산된 Kd 값은 muCD123-3, muCD123-6, muCD123-14 및 7G3에 대해 각각, 0.2 nM, 0.07 nM, 0.5 nM 및 2 nM이었다 (도면 4b). 따라서 이러한 실험에서, 주제 뮤린 CD123 항체에 의한 결합은 7G3 항체에 의한 결합보다 최소한 4-28 배 우수하였다.
이들 데이터는 muCD123-3, muCD123-6 및 muCD123-14가 CD123-양성 AML 세포에 대해 7G3 항체보다 더욱 낮은 Kd (이것은 더욱 높은 친화성을 나타낸다)를 갖는다는 것을 증명한다.
실시예 6 키메라 항-CD123 항체의 결합 친화성
키메라 항체 chCD123-3, chCD123-6 및 chCD123-14는 키메라 아이소타입 대조 IgG (chKTI)와 비교하여, HNT-34 세포에 대한 그들의 결합 친화성에 대해 검정되었다. 유세포분석법 결합 검정이 이차성 PE-접합된 염소-항인간 항체를 이용하여 실시예 5에서 설명된 바와 같이 실행되고 분석되었다. 도면 5a는 각 항체에 대한 용량 반응 곡선을 묘사한다. 각 항체의 겉보기 해리 상수 (Kd)에 대한 값은 GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA)를 이용하여 계산되었다. 결과의 데이터는 키메라화가 이들 항체의 결합 친화성에 단지 중간 정도로만 영향을 주었다는 것을 보여준다. chCD123-3, chCD123-6 및 chCD123-14에 대한 Kd 값은 각각, 0.1 nM, 0.04 nM 및 0.2 nM이었다. 이들 값은 실시예 5에서 보고된 그들의 뮤린 대응물에 대한 값과 기껏해야 2.5 배 상이하였다. 예상한 대로, chKTI 항체는 시험된 농도에서 이들 세포에 결합하지 않았다 (도면 5a).
AML 세포에 chCD123-3, chCD123-6 및 chCD123-14의 높은 친화성은 다른 CD123-양성 급성 골수성 백혈병 세포주, MOLM-13을 이용하여 확증되었다. 유세포분석법 결합 검정이 앞서 설명된 바와 같이 실행되고 분석되었다. 도면 5b는 각 항체에 대한 용량 반응 곡선을 묘사한다. chCD123-3, chCD123-6 및 chCD123-14의 겉보기 해리 상수 (Kd)에 대한 값은 각각, 0.2 nM, 0.08 nM 및 0.2 nM이었다. 키메라 아이소타입 대조 IgG (chKTI 항체)의 경우에 시험된 가장 높은 농도 (10 nM)에서 단지 최저한의 결합만 관찰되었다.
따라서, chCD123-3, chCD123-6 및 chCD123-14는 그들의 뮤린 대응물의 높은 친화성을 유지한다.
키메라 항체의 기능적 활성
chCD123-3, chCD123-6 및 chCD123-14, 그리고 음성 대조로서 이용된 비기능적 항-CD123 항체는 TF-1 세포의 IL3-의존성 증식을 저해하는 그들의 능력에 대해 검정되었다. 이들 검정은 실시예 4에서 설명된 바와 같이 실행되고 분석되었다. chCD123-3, chCD123-6 및 chCD123-14으로 처리는 상대적 세포 수를 각각, 0.1 nM, 0.03 및 0.05 nM의 IC50 값으로 용량 의존성 방식으로 감소시켰다 (도면 6). 대조 비기능적 항체는 세포 성장에 영향을 주지 않았다. 이런 이유로, chCD123-3, chCD123-6 및 chCD123-14는 그들의 뮤린 대응물의 기능적 활성을 유지하였다.
실시예 7 인간화 항-CD123 항체의 결합 친화성
HNT-34 세포에 대한 예시적인 인간화 항-CD123 항체, huCD123-6Gv4.7S2 및 huCD123-6Gv4.7S3의 결합 친화성은 그들의 뮤린 및 키메라 대응물, 각각 muCD123-6 및 chCD123-6과 비교되었다. 7G3 항체 및 키메라 아이소타입 대조 IgG (chKTI)는 병렬적으로 시험되었다. 유세포분석법 결합 검정이 실시예 5에서 설명된 바와 같이 실행되고 분석되었다. 도면 7a는 각 항체에 대한 용량 반응 곡선을 묘사한다. 이들 데이터는 인간화가 항체의 결합 친화성에 영향을 주지 않았다는 것을 보여주는데, 그 이유는 huCD123-6Gv4.7S2, huCD123-6Gv4.7S3, chCD123-6 및 muCD123-6에 대한 Kd가 대략 0.06 nM이기 때문이다. 7G3 항체에 대한 겉보기 Kd는 훨씬 높은 거의 2 nM이었다. chKTI 항체는 시험된 농도에서 이들 세포에 결합하지 않았다. 이런 이유로, 양쪽 huCD123-6Gv4.7 클론은 뮤린 및 키메라 대응물의 높은 친화성을 유지하고, 그리고 CD123-발현 세포에 대해 7G3 항체보다 더욱 높은 (가령, 최소한 약 30-배 높은) 친화성을 갖는다.
유사하게, 예시적인 인간화 huCD123-6Gv4.7 항체의 ADC 접합체의 결합 친화성은 접합되지 않은 huCD123-6Gv4.7의 것과 비교하여, HNT-34 세포를 이용하여 검정되었다. 유세포분석법 결합 검정이 이차성 PE-접합된 염소-항인간 항체를 이용하여 실시예 5에서 설명된 바와 같이 실행되고 분석되었다. 도면 7b 및 7c는 각 항체 및 상응하는 접합체에 대한 용량 반응 곡선을 묘사한다. 결과의 데이터는 접합이 이들 항체의 결합 친화성에 단지 중간 정도로만 영향을 주었다는 것을 보여준다.
인간화 항-CD123 항체의 기능적 활성
예시적인 인간화 항-CD123 항체, huCD123-6Gv4.7S2 및 huCD123-6Gv4.7S3의 기능적 활성 (TF-1 세포의 IL3-의존성 증식을 저해하는 능력)은 그들의 키메라 대응물, chCD123-6 항체와 비교되었다. 7G3 항체는 병렬적으로 시험되었다. 이들 검정은 실시예 4에서 설명된 바와 같이 실행되고 분석되었다.
huCD123-6Gv4.7S2, huCD123-6Gv4.7S3 및 chCD123-6으로 처리는 IL-3 의존성 증식을 유사하게 저해하였다: 증식은 1 nM에서 0.02 nM의 IC50으로 완전하게 저해되었다 (도면 8a). 하지만, 7G3으로 처리는 이들 세포의 증식에 대한 이런 심대한 효과를 갖지 않았다: 상기 항체의 IC50은 0.2 nM이었고, 그리고 이것은 세포 증식을 완전하게 저해할 수 없었고 단지 세포 수를 가장 높은 농도 (10 nM)에서 18%까지 감소시킬 뿐이었다.
huCD123-6Gv4.7S2, huCD123-6Gv4.7S3, chCD123-6 및 7G3에 의한 TF-1 세포 증식의 저해는 IL-3 의존성이었는데, 그 이유는 이들 세포가 다른 성장 인자 GM-CSF의 존재에서 성장될 때, 이들 항체가 저해 효과를 나타내지 않았기 때문이다 (도면 8b).
이런 이유로, huCD123-6Gv4.7은 이의 뮤린 및 키메라 대응물의 기능적 활성을 유지하고, 그리고 IL-3 의존성 증식을 저해하는데 있어서 7G3 항체보다 훨씬 높은 활성을 갖는다.
실시예 8 에피토프 지도화
CD123 항원, IL-3 수용체 사슬 α (IL-3Rα)는 IL-3 결합에 관련된 306-아미노산 세포외 도메인, 20-아미노산 막경유 도메인, 그리고 52개 아미노산의 짧은 세포질 꼬리를 내포하는 378개 아미노산으로 구성된다. 세포외 도메인은 성숙 단백질 (가령, 신호 펩티드 개열 후)의 위치 19에서 트레오닌으로부터 위치 100에서 세린까지의 영역을 포함하는 N 말단 도메인 (NTD), 그리고 2개의 구별된 접힘 도메인: 도메인 2 (아미노산 101-204) 및 도메인 3 (아미노산 205-306)으로 구성된 사이토킨 인식 모티프 (CRM)로 더욱 나눠질 수 있다. 본원에서 설명된 일정한 항-CD123 항체에 대한 에피토프는 IL-3Rα의 세포외 도메인, 그리고 IL-3Rα 위상을 보존하고 신호전달에 필수적인 공통 β-아단위를 공유하는 과립구 대식세포 집락 자극 인자 수용체 α 사슬 (GMRα)의 조합을 활용하여 키메라 단백질을 가공함으로써 지도화되었다.
IL-3Rα 변이체 클로닝 및 발현
CD123 / IL-3Rα의 세포외 도메인 (잔기 1-306)은 히스티딘 태깅된 단백질로서 발현되었다. 상기 단백질 서열은 Life Technologies에 의해 코돈 최적화되고 합성되고, 그리고 EcoRI 및 HindIII 제한 부위를 활용하여 pABLT 포유류 발현 벡터 내에 10-히스티딘 태그와 인프레임으로 클로닝되었다. 성숙 단백질의 위치 25에서 세린으로부터 위치 114에서 세린까지의 N 말단 도메인, 그리고 위치 115에서 글리신 내지 위치 325에서 발린을 포함하는 CRM 도메인을 또한 포함하는 대조 GMRα 단백질의 세포외 도메인 (잔기 1-325)이 유사하게 합성되고 클로닝되었다. 이후, IL3Rα/GMRα 키메라 수용체 단백질 발현 벡터가 IL-3Rα 분자의 N 말단 도메인 (잔기 1-100) 또는 CRM 도메인 (잔기 101-306)을 GMRα 분자의 상응하는 서열로 대체하는 제한 절단에 의해 작제되었다. 도면 9a에서 예시된 바와 같이, IL3Rα (1-100)는 GMRα 잔기 115-325에 융합된 IL3Rα 잔기 1-100을 인코딩하고, 그리고 IL3Rα (101-306)는 IL3Rα 잔기 101-306에 융합된 GMRα 잔기 1-114를 인코딩한다.
IL3-Rα, GMRα, 그리고 2개의 키메라 IL-3Rα His-태깅된 단백질, IL3-Rα (1-100) 및 IL3-Rα (101-306)는 HEK 293T 세포의 일시적인 형질감염을 통해 발현되고, 그리고 제조업체의 사용설명서에 따라서 Ni 세파로오스 엑셀 크로마토그래피 (GE healthcare)를 이용하여, 형질감염된 세포의 상층액으로부터 정제되었다.
다양한 IL3Ra 구조체에 항체 결합
키메라 및 인간화 항-IL3Rα 항체는 앞서 설명된 IL-3Rα 단백질에 결합에 대해 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 형식에서 시험되었다. 간단히 말하면, Ni 세파로오스 엑셀 크로마토그래피에 의해 정제된 각 His-태깅된 IL-3Rα 단백질은 50 mM 중탄산나트륨 완충액 pH 9.6에서 1 ng/mL로 희석되고, 그리고 100 μL가 각 웰에 첨가되었다. 4℃에서 16 시간 배양 후, 평판은 0.1% Tween-20을 포함하는 Tris-완충된 식염수 (TBST)로 세척되고, 이후 200 μL 차단 완충액 (1% BSA를 포함하는 TBS)으로 차단되었다. 그 다음, 차단 완충액에서 계열 희석된 100 μL의 일차 항체가 ELISA 웰에 이중으로 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 평판은 이후, 100 μL의 항인간 IgG (H+L)-HRP (Jackson Immunoresearch)를 각 웰에 첨가하기 전에, TBST로 3 회 세척되었다. 다시 한 번, 평판은 실온에서 1 시간 동안 배양되고, 그 이후에 TBST로 3회 세척되었다. 최종적으로, 100 μL의 TMB 한 가지 성분 HRP 마이크로웰 기질 (Surmodics)이 각 웰에 첨가되고 5 분 동안 배양되었다. 반응은 100 μL 정지 용액 (Surmodics)을 첨가함으로써 중지되고, 그리고 흡광도가 450 nm에서 판독되었다.
키메라 IL-3Rα 단백질에 CD123 항체의 결합은 야생형 IL-3Rα와 비교하여 평가되었다. 도면 9b는 huCD123-6 항체가 유사한 나노몰 이하 친화성으로 IL-3Rα 및 IL-3Rα (101-306) 둘 모두에 결합한다는 것을 증명한다. 반대로, huCD123-6 항체는 GMRα 구조체에 결합하지 않고, 그리고 키메라 단백질 IL-3Rα (1-100) 구조체에 대한 결합은 거의 제거된다. 이들 결과는 huCD123-6 항체가 CRM 도메인에 일차적으로 결합하고, IL-3Rα의 N 말단 도메인으로부터 기여는 아마도 최소에 불과하다는 것을 지시한다. 유사하게, chCD123-3 항체는 비록 야생형 IL-3Rα와 비교하여 감소된 결합 친화성일지라도, IL-3Rα CRM 도메인에 일차적으로 결합한다 (도면 9c). 키메라 수용체 단백질 IL-3Rα (101-306)에 대한 결합 친화성에서 감소는 CD123-3 항체 결합에서 IL-3Rα의 N 말단 도메인의 가능한 관여를 암시한다. chCD123-14 항체는 하지만, 키메라 수용체 IL-3Rα (101-306)를 인식하지 않는다 (도면 9d); 오히려, 이것은 IL-3Rα 및 IL-3Rα (1-101) 둘 모두에 동등한 친화성으로 결합한다. 이들 결과는 chCD123-14 항체가 IL-3Rα의 N 말단 도메인에 배타적으로 결합한다는 것을 증명한다. 대조적으로, 7G3 항체 또한, 2개의 다른 상업적으로 가용한 항체, 6H6 및 9F5와 함께, IL-3Rα N 말단 도메인 및 야생형 IL-3Rα 구조체에 결합하지만, IL3Rα의 CRM 도메인을 인식하지 않는다 (각각, 도면 9e, 9f 및 9g). 요약하면, 이들 데이터는 CD123-6 및 CD123-3 항체의 에피토프가 IL-3Rα의 CRM 도메인 내에 일차적으로 위치되고, 그리고 IL-3Rα의 N 말단 도메인에 국한되는 7G3 항체 에피토프와 상이하다는 것을 증명한다. CD123-14 항체 또한 IL-3Rα의 N 말단 도메인 내에 국한된 에피토프에 결합한다.
실시예 9 huCD123-6 항체의 리신-연결된 DM1 및 IGN 접합체의 제조
a. huCD123Gv4.7S3-술포-SPDB-D1의 제조
15 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산) pH 8.5 완충액 및 15% v/v DMA (N,N 디메틸아세트아미드) 보조용매에서 링커에 의해 2.0 mg/mL CD123-6G4.7S3 항체 및 3.5 몰 당량의 술포-SPDB-D1 원지 혼합물을 내포하는 반응물은 25℃에서 3-4 시간 동안 접합하도록 허용되었다. 상기 원지 혼합물은 20 mM N,N 디이소프로필에틸 아민 (DIPEA)의 존재에서 25℃에서 5 시간 동안 DMA에서 3.0 mM 술포-SPDB 링커를 3.9 mM의 술폰화된 화합물 D1과 반응시킴으로써 제조되었다.
반응후, 접합체는 정제되고, 그리고 NAP 탈염 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 이용하여 20 mM 히스티딘, 50 mM 염화나트륨, 8.5% w/v 수크로오스, 0.01% Tween-20, 50 μM 아황산수소나트륨 pH 6.2 조제 완충액 내로 완충액 교환되었다. 투석은 Slide-a-Lyzer 투석 카세트 (ThermoScientific 10,000 MWCO)를 활용하여 실온에서 4 시간 동안, 그리고 이후, 4℃에서 하룻밤 동안 동일한 완충액에서 수행되었다.
정제된 접합체는 1.2 mg/mL의 최종 단백질 농도 및 항체마다 연결된 화합물 D1의 평균 2.9 분자 (몰 흡광 계수 ε330 nm= 15,484 cm-1M-1, 그리고 화합물 D1의 경우 ε280 nm= 30,115 cm-1M-1 및 huCD123-6G4.7S3 항체의 경우 ε280 nm= 207,360 cm-1M-1를 이용한 UV Vis에 의해); 94.3% 단위체 (크기 배제 크로마토그래피에 의해); 그리고 <2% 접합되지 않은 화합물 D1 (UPLC 이중 칼럼, 역상 HPLC 분석)을 갖는 것으로 밝혀졌다.
b. huCD123-6Gv4.7S3-D2의 제조
15 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산) pH 8.5 완충액 및 10% v/v DMA (N,N-디메틸아세트아미드) 보조용매에서 2.0 mg/mL huCD123-6Gv4.7S3 항체 및 5.0 몰 당량의 화합물 D2 (25 ℃에서 4 시간 동안 90:10 DMA:50 mM 숙신산염 pH 5.5에서 5-배 과잉의 아황산수소나트륨으로 사전 처리된)를 내포하는 반응물은 25℃에서 4 시간 동안 배양되었다.
반응후, 접합체는 정제되고, 그리고 NAP 탈염 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 이용하여 20 mM 히스티딘, 50 mM 염화나트륨, 8.5% w/v 수크로오스, 0.01% Tween-20, 50 μM 아황산수소나트륨 pH 6.2 조제 완충액 내로 완충액 교환되었다. 투석은 Slide-a-Lyzer 투석 카세트 (ThermoScientific 10,000 MWCO)를 활용하여 실온에서 4 시간 동안, 그리고 이후, 4℃에서 하룻밤 동안 동일한 완충액에서 수행되었다.
정제된 접합체는 1.2 mg/mL의 최종 단백질 농도 및 항체마다 연결된 화합물 D2의 평균 2.9 분자 (몰 흡광 계수 ε330 nm= 15,484 cm-1M-1, 그리고 화합물 D2의 경우 ε280 nm= 30,115 cm-1M-1 및 huCD123-6Gv4.7S3 항체의 경우 ε280 nm= 207,360 cm-1M-1을 이용한 UV Vis에 의해); 99.3% 단위체 (크기 배제 크로마토그래피에 의해); 그리고 <2% 접합되지 않은 화합물 D2 (UPLC 이중 칼럼, 역상 HPLC 분석)를 갖는 것으로 밝혀졌다.
c. huCD123-6Gv1.1-술포-SPDB-DGN462의 제조
NHS-술포-SPDB-sDGN462는 25℃에서 15 분 동안 반응하지 않은 IGN 티올을 퀀칭하기 위한 0.9 mM MPA(3-말레이미도프로피온산)를 첨가하기 전 20 분 동안, 10 mM DIPEA (N,N-디이소프로필에틸아민)를 내포하는 DMA에서 1.5 mM 술포-SPDB 링커, 1.95 mM 술폰화된 DGN462 (sDGN462)를 배양함으로써 원지에서 형성되었다. 15 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산) pH 8.5 완충액 및 15% v/v DMA 보조용매에서 2.5 mg/mL huCD123-6Gv1.1 항체 및 7.5 몰 당량의 결과의 NHS-술포-SPDB-DGN462를 내포하는 반응물은 25℃에서 하룻밤 동안 배양되었다.
반응후, 접합체는 NAP 탈염 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 이용하여 20 mM 히스티딘, 50 mM NaCl, 8.5% 수크로오스, 0.01% Tween-20, 50 μM 아황산수소나트륨 pH 6.2 조제 완충액 내로 정제되었다. 투석은 Slide-a-Lyzer 투석 카세트 (ThermoScientific 10,000 MWCO)를 활용하여 4℃에서 하룻밤 동안 동일한 완충액에서 수행되었다.
정제된 접합체는 0.95 mg/mL의 최종 항체 농도 및 항체마다 연결된 평균 2.8 DGN462 분자 (몰 흡광 계수 ε330 nm= 15,484 cm-1M-1, 그리고 DGN462의 경우 ε280 nm= 30,115 cm-1M-1 및 huCD123-6Gv1.1 항체의 경우 ε280 nm=207,360 cm-1M-1을 이용한 UV-Vis에 의해); 99.5% 단위체 (크기 배제 크로마토그래피에 의해); 그리고 0.6% 접합되지 않은 DGN462 (아세톤 침전, 역상 HPLC 분석에 의해)를 갖는 것으로 밝혀졌다.
d. huCD123-6Gv1.1-D3의 제조
15 mM HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산) pH 8.5 완충액 및 10% v/v DMA (N,N-디메틸아세트아미드) 보조용매에서 2.0 mg/mL huCD123-6Gv1.1 항체 및 3.5 몰 당량 D3 (25℃에서 4 시간 동안 90:10 DMA:50 mM 숙신산염 pH 5.5에서 5-배 과잉의 아황산수소나트륨으로 사전 처리된)을 내포하는 반응물은 25℃에서 4 시간 동안 배양되었다. 반응후, 접합체는 정제되고, 그리고 NAP 탈염 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 이용하여 20 mM 히스티딘, 50 mM 염화나트륨, 8.5% w/v 수크로오스, 0.01% Tween-20, 50 μM 아황산수소나트륨 pH 6.2 조제 완충액 내로 완충액 교환되었다. 투석은 Slide-a-Lyzer 투석 카세트 (ThermoScientific 10,000 MWCO)를 활용하여 실온에서 4 시간 동안, 그리고 이후, 4℃에서 하룻밤 동안 동일한 완충액에서 수행되었다.
정제된 접합체는 0.9 mg/mL의 최종 단백질 농도 및 항체마다 연결된 평균 3.4 D3 분자 (몰 흡광 계수 ε330 nm= 15,484 cm-1M-1, 그리고 D3의 경우 ε280 nm= 30,115 cm-1M-1 및 huCD123-6Gv1.1 항체의 경우 ε280 nm= 207,360 cm-1M-1을 이용한 UV-Vis에 의해); 96% 단위체 (크기 배제 크로마토그래피에 의해); 및 <1% 접합되지 않은 D3 (이중 칼럼, 역상 HPLC 분석)을 갖는 것으로 밝혀졌다.
(D3)
e. huCD123-6Rv1.1-CX1-1-메이탄시노이드 접합체의 제조
인간화 항-CD123 항체 (표면치환된 huCD123-6Rv1.1)는 트리글리실, CX1-1 링커를 통해, 리신 잔기에서 메이탄시노이드 유상하중과 접합되었다. 20 mM N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA)을 내포하는 N,N-디메틸아세트아미드 (DMA)에서 5 mM 트리글리실, CX1-1 이종이중기능성 링커 (N-히드록시숙신이미드 및 말레이미드 기를 보유) 및 6.5 mM DM1 메이탄시노이드를 내포하는 혼합물은 실온에서 약 20 분 동안 배양되었다. 반응하지 않은 DM1은 항체에 비하여 과잉의 약 7.6x 또는 15x CX1-1-DM1 부가물에서 약 8% DMA를 내포하는 140 mM EPPS 완충액, pH 8 내에 4 mg/mL에서 인간화 항-CD123 항체 (huCD123-6Rv1.1)에 반응 혼합물을 첨가하기 전에, 실온에서 약 20 분 동안 2 mM 말레이미도프로피온산 (MPA)으로 퀀칭되었다. 접합 반응 혼합물은 25℃에서 하룻밤 동안 배양되고, 그 후에 접합체는 정제되고, 그리고 NAP 탈염 칼럼 (Illustra, Sephadex G-25, GE Healthcare)을 이용하여 250 mM 글리신, 0.5% 수크로오스, 0.01% Tween 20을 내포하는 10 mM 숙신산염 완충액, pH 5.5 내로 완충액 교환되었다. 투석은 Slide-a-Lyzer 투석 카세트 (Thermo Scientific; 10,000 분자량 컷오프 막)를 활용하여 4℃에서 하룻밤 동안 전술한 숙신산염 완충액에서 수행되었다.
정제된 접합체는 각각, 항체마다 연결된 평균 4.3 및 6.7 메이탄시노이드 분자 (ε252 nm= 26350 cm-1 M-1, 그리고 DM1의 경우 ε280 nm= 5456 cm-1 M-1 및 huCD123 항체의 경우 ε280 nm= 207076 cm-1 M-1의 몰 흡광 계수를 이용한 UV/Vis 분광분석법 및 크기-배제 HPLC에 의해), 98% 단위체 (크기 배제 크로마토그래피에 의해), 그리고 2.1 mg/mL 및 1.2 mg/mL의 최종 단백질 농도를 내포하는 것으로 밝혀졌다. 정제된 접합체에서 접합되지 않은 메이탄시노이드의 수준은 HPLC에 의해 낮은 (<1%) 것으로 추정되었다. 탈당화된 접합체의 질량 분광분석법은 연결된 메이탄시노이드 종류를 지시하였다.
실시예 10 시험관내 세포독성 검정
세포 표면 상에서 CD123을 발현하는 세포를 사멸시키는 huCD123-6의 항체-약물 접합체 (ADC)의 능력은 시험관내 세포독성 검정을 이용하여 계측되었다. 이들 세포주는 세포 공급업체 (ATCC 또는 DSMZ)에 의해 권장된 바와 같이 배양 배지에서 배양되었다. 100 μL의 배양 배지에서 2,000 내지 10,000 세포가 편평 바닥 96-웰 평판의 각 웰에 첨가되었다. 세포 표면 상에서 Fc 수용체를 차단하기 위해, 배양 배지는 100 nM chKTI 항체 (동일한 아이소타입의 항체)로 보충되었다. 접합체는 3-배 희석 계열을 이용하여 배양 배지 내로 희석되었고, 그리고 100 μL가 웰마다 첨가되었다. CD123-독립된 세포독성의 기여를 결정하기 위해, CD123 블록 (가령, 100 nM의 chCD123-6 항체)이 접합체에 앞서 일부 웰에 첨가되었다. 세포 및 배지를 내포하지만 접합체를 결여하는 대조 웰뿐만 아니라 배지 단독을 내포하는 웰이 각 검정 평판 내에 포함되었다. 검정은 각 데이터 포인트에 대해 삼중으로 수행되었다. 평판은 가습된 6% CO2 인큐베이터에서 4 내지 7 일 동안 37℃에서 배양되었다. 이후, 각 웰에서 생존가능 세포의 상대적 숫자는 실시예 4에서 설명된 바와 같이 WST-8 기초된 세포 계수 Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD)을 이용하여 결정되었다. 각 웰에서 세포의 겉보기 생존 분율은 먼저 배지 배경 흡광도를 교정하고, 그리고 이후, 각 값을 대조 웰 (비처리된 세포)에서 값의 평균으로 나눔으로써 계산되었다. 세포의 생존 분율은 반-로그 플롯에서 접합체 농도에 대하여 플롯팅되었다.
전형적인 세포독성 검정으로부터 결과는 도면 10에서 도시된다. AML 세포주 OCI-AML4는 배양 배지에서 성장 인자 없이 증식할 수 있다. 이들 세포는 메이탄시노이드 접합체 huCD123-6Rv1.1-CX1-1-DM1로 처리되었다. 상기 처리는 0.07 nM의 IC50 값으로 용량 의존성 세포 사멸을 유발하였다. 이러한 사멸이 CD123 발현에 기인하는 지를 사정하기 위해, 항원이 과잉의 접합되지 않은 chCD123-6 항체 (500 nM)에 의해 차단되고, 그리고 접합체의 효능이 이들 세포에서 시험되었다. 추후 처리는 3 nM보다 낮은 농도에서 세포의 생존력에 영향을 주지 않았고, 그리고 10 nM (시험된 가장 높은 농도)에서 세포 생존력에 대한 단지 중간 정도의 효과만을 나타냈다. 따라서, huCD123-6Rv1.1-CX1-1-DM1 접합체는 OCI-AML4 세포에 대한 높은 CD123-의존성 세포독성을 보여준다.
리신을 통해 다른 세포독성 작용제 (DGN462, D3, D1 및 D2)와 연결된 huCD123-6 항체의 접합체의 세포독성 또한 시험관내에서 시험되었다. 상이한 기원 (AML, B-ALL, CML 및 NHL)의 15가지 CD123-양성 세포주가 본 연구에서 이용되었다 (바로 아래 표). 대다수의 세포주는 최소한 하나의 부정적인 예후 인자 (가령, P-당단백질의 과다발현, EVI1의 과다발현, p53 변경, DNMT3A 돌연변이, FLT3 내부 탠덤 중복)을 갖는 악성을 보유하는 환자로부터 유래되었다. 이들 접합체는 pM 아래 내지 낮은 nM 범위에서 변하는 IC50 값으로 이들 세포주에 대한 고효능을 보여주었다 (바로 아래 표, 도면 11a).
상이한 기원의 CD123-양성 세포주에 대한 다양한 리신-연결된 huCD123-6-IGN 접합체의 시험관내 세포독성
Figure 112018009762973-pct00703
상기 데이터는 B-ALL 세포주 (KOPN8 및 JM-1)가 IGN 화합물에 매우 민감하다는 것을 암시하는 것으로 보인다. 이러한 발견을 더욱 검증하기 위해, 리신 또는 시스테인을 통해 D1 또는 D2와 연결된 huCD123-6Gv4.7 항체의 접합체의 세포독성이 동일한 B-ALL 세포주, KOPN8 및 JM-1, 플러스 추가 B-ALL 세포주 "380 세포"를 이용하여 시험되었다. 이들 B-ALL 세포주에 결합하지 않는 항체 - KTI -와의 접합체를 이용하는 음성 대조가 검정에 포함되었다. 도면 11b에서 결과는 상기 발견을 확증하였다.
상기 표는 또한, huCD123-IGN 화합물이 다양한 AML 세포주에 대항하여 고도로 활성이라는 것을 보여준다. Lys- 및 Cys-연결된 IGN 화합물을 이용한 대표적인 데이터는 도면 11c에서 도시된다. 도면 11c에서 도시된 데이터와 일치되게, Cys-연결된 접합체 (huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5)의 세포독성에 대한 추가 데이터 (아래의 표 및 도면 21에서 도시됨)는 상기 접합체가 불량한 예후 인자를 갖는 것들을 비롯한 다양한 CD123-양성 AML 세포주에 대항하여 고도로 강력하다는 것을 증명한다.
Figure 112018009762973-pct00704
흥미롭게도, 예비적 데이터는 Cys-연결된 D5 접합체가 심지어 Lys-연결된 D2 또는 Lys-연결된 D1의 강력한 접합체와 비교할 때에도 AML 선조체 세포에 대해 특히 강력한 것으로 보인다는 것을 암시한다. 도면 11d을 참조하는데, 여기서 9개의 AML 환자 표본이 본 발명의 다양한 IGN 접합체의 효능을 시험하는데 이용되었다.
추가 시험관내 세포독성 연구는 Cys-연결된 D5 접합체가 비선택된 AML 환자 표본에서 밀로타르그보다 74 배 높은 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 도면 18을 참조한다.
이에 더하여, 도면 11e 및 도면 19는 Cys-연결된 huCD123 D5 접합체가 AML 선조체를 사멸시키는데 필요한 농도보다 >100-배 높은 농도에서 정상적인 혈액 세포를 사멸시킨다는 것을 보여준다. 대조적으로, 밀로타르그 (겜투주맙 오조가미신)는 정상적인 선조체 세포 및 AML 선조체 세포 사이에 세포독성에서 단지 10 배수적 차이로, 이런 우선적 사멸 효과를 전시하지 않는다. 도면 19에서, 추가 AML 환자 표본이 시험되었다. 이에 더하여, D5', DNA 교차연결제의 huCD123 접합체 또한 시험되었고, 그리고 이것은 정상적인 선조체 세포 및 AML 선조체 세포 사이에 세포독성에서 단지 6 배수적 차이만을 전시한다 (도면 19를 참조한다).
실시예 11 원발성 AML 환자 표본에 대한 리신-연결된 IGN 접합체의 시험관내 효능
원발성 AML 세포를 사멸시키는 다양한 리신-연결된 huCD123-6-IGN 접합체의 능력은 집락 형성 단위 (CFU) 검정을 이용하여 계측되었다. AML을 앓는 환자로부터 동결된 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 골수 단핵 세포 (BMMC)는 Conversant Biologics Inc. (Huntsville, AL) 및 AllCells, LLC (Alameda, CA)로부터 구입되었다. 이들 세포는 공급업체에 의해 권장된 바와 같이 해동되고, 세척되고, 그리고 RPMI 배양 배지 (RPMI-1640, 10% 소 태아 혈청, 50 ng/mL SCF 및 50 (ng/mL) FLT3L)에서 재현탁되었다. 세포 표면 상에서 Fc 수용체를 차단하기 위해, 배양 배지는 100 nM chKTI 항체 (동일한 아이소타입의 항체)로 보충되었다. 150 μL의 배양 배지에서 200,000 세포가 편평 바닥 96-웰 평판의 각 웰에 첨가되었다. 접합체는 10-배 희석 계열을 이용하여 배지 내로 희석되었고, 그리고 50 μL가 웰마다 첨가되었다. 대조 웰은 세포 및 배지를 내포하지만 접합체를 결여하였다. 평판은 가습된 6% CO2 인큐베이터에서 18 시간 동안 37℃에서 배양되었다. 이후, 세포는 EPO가 없는 2.2 mL의 MethocultTM H4534 (StemCell Technologies, Vancouver, BC)를 내포하는 튜브로 이전되고 혼합되고, 그리고 혼합물은 6-웰 평판으로 이전되었다. 평판은 집락이 형성될 때까지 (통상적으로 10 내지 16 일) 가습된 6% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 배양되고 계수되었다. 집락 형성의 퍼센트 저해는 접합체-처리된 표본에서 수치를 비처리된 대조에서 수치와 비교함으로써 결정되었다. 퍼센트 집락 저해는 접합체 농도에 대하여 플롯팅되었고, 그리고 집락 형성의 90%를 저해하는 접합체 농도 (IC90)가 결과의 곡선으로부터 결정되었다.
하나의 원발성 환자 표본에 대한 전형적인 CFU 검정으로부터 결과는 도면 12a에서 제공된다. huCD123-6-IGN 접합체는 huCD123-6Gv1.1-sSPDB-DGN462, huCD123-6Gv1.1-D3, huCD123-6Gv1.1-sSPDB-D1 및 huCD123-6Gv1.1-D2 각각에 대해 0.1 nM, 0.01 nM, 0.03 nM 및 0,012 nM의 IC90 값으로 용량 의존성 세포독성을 보여주었다. 도면 12b는 접합체로 처리된 모든 AML 환자 표본에 대한 IC90 값을 보여준다. 각 접합체에 대한 중앙 IC90 값은 실선으로서 표시되고, 그리고 huCD123-6Gv1.1-sSPDB-DGN462, huCD123-6Gv1.1-D3, huCD123-6Gv1.1-sSPDB-D1 및 huCD123-6Gv1.1-D2 각각에 대해 2 nM, 0.1 nM, 0.03 nM 및 0.02 nM에 동등하다. 따라서, 이들 리신-연결된 huCD123-6-IGN 접합체는 AML 환자로부터 표본에 대한 고효능을 보여주었다.
실시예 12 huCD123-6 항체의 Ser 부위 특이적 접합체의 제조
a) N 말단 항체 접합 - 2-단계 접근법
huCD123-6Gv4.6/7S3 항체 (huCD123-6Gv4 LCVR (서열 번호: 37, 가공된 N 말단 Ser 포함) 및 HCVR Gv6/7 (서열 번호: 34)을 갖는) ([1], 도면 15에서 보여지는 바와 같은 반응식 1에서; PBS에서 3mg/mL, pH7.4)는 5 mM 수성 나트륨 과옥소산염으로 처리되었다 (50 당량, 25℃, 30 분). 혼합물은 이후, NAP 탈염 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 통해 아세트산나트륨 완충액, pH5.0 내로 완충액 교환되었다.
결과의 용액은 10% v/v 보조용매에 4-아미노펜에틸 알코올 (DMA [N,N-디메틸아세트아미드]에서 100 mM)로 처리되었다. 이종이중기능성 링커1 (반응식 1에서 [3]; 5 당량)이 차후에 도입되었고, 그리고 반응 용기는 밀봉되고 37℃에서 24 시간 동안 배양되었다.
혼합물은 이후, NAP 탈염 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 통해 HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산), pH8.5 완충액 내로 완충액 교환되었다. 용액은 이후, DMA (N,N-디메틸아세트아미드) 보조용매 (10% v/v)로 조정되고, 그리고 술폰화된 DGN462 (sDGN462) ([5], 반응식 1; 유리 티올; 5 당량)로 25℃에서 6 시간 동안 처리되었다.
결과의 접합체는 NAP 여과 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 이용하여, 250 mM 글리신, 10 mM 히스티딘, 1% 수크로오스, 0.01% Tween-20, 50 μM 아황산수소나트륨 조제 완충액, pH 6.2 내로 완충액 교환되었다. 투석은 Slide-a-Lyzer 투석 카세트 (ThermoScientific 10,000 MWCO)를 활용하여 25℃에서 4 시간 동안 동일한 완충액에서 수행되었다.
정제된 접합체 ([6], 반응식 1)는 항체마다 연결된 2개 DGN462 분자의 균일한 평균 (Q-ToF 질량 분광분석법을 통해), >98% 단위체 (크기 배제 크로마토그래피를 통해), <2% 유리 약물 (아세톤 침전된 역상 HPLC 분석을 통해), 그리고 0.18 mg/mL의 최종 단백질 농도 (huCD123-6Gv4.6/7S3 항체의 경우 몰 흡광 계수 ε280 = 213320 M-1cm-1을 이용한 UV-Vis를 통해)를 갖는 것으로 밝혀졌다.
b) N 말단 항체 접합 - IGN 직접적인 연결
중쇄 상에서 N 말단 세린으로 가공된, 가공된 N 말단 Ser-내포 huCD123-6Gv4.7S2 항체 (huCD123-6Gv4.7S2, 이것은 중쇄 서열 서열 번호: 53 (여기서 Xaa는 Val이다) 및 경쇄 서열 서열 번호: 51을 포함한다) (반응식 2에서 [1], 도면 16; PBS, pH7.4에서 3mg/mL)는 25℃에서 30 분 동안 5 mM 수성 나트륨 과옥소산염 (50 몰 당량)으로 처리되었다. 혼합물은 이후, NAP 탈염 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 통해 아세트산나트륨 완충액, pH5.0 내로 완충액 교환되었다.
결과의 용액은 10% v/v 보조용매에 p-페닐렌디아민 (DMA [N,N-디메틸아세트아미드]에서 100 mM)로 처리되었다. 이후, 원지 술폰화된-D8 (또는 sD8) ([3], 반응식 2; 5 몰 당량)이 차후에 도입되었고, 그리고 반응 용기는 밀봉되고 37℃에서 24 시간 동안 배양되었다.
혼합물은 이후, NAP 탈염 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 통해 250 mM 글리신, 10 mM 히스티딘, 1% 수크로오스 완충액, pH 6.2 내로 완충액 교환되었다. 투석은 Slide-a-Lyzer 투석 카세트 (ThermoScientific 10,000 MWCO)를 활용하여 25℃에서 4 시간 동안 동일한 완충액에서 수행되었다.
정제된 접합체 ([4], 반응식 2)는 항체마다 연결된 2개 D8 분자의 균일한 평균 (Q-ToF 질량 분광분석법을 통해), >96% 단위체 (크기 배제 크로마토그래피를 통해), <3% 유리 약물 (HISEP 역상 HPLC 분석을 통해), 그리고 1.4 mg/mL의 최종 단백질 농도 (huCD123-6Gv4.7S2 항체의 경우 몰 흡광 계수 ε280 = 213320 M-1cm-1을 이용한 UV-Vis를 통해)를 갖는 것으로 밝혀졌다.
앞서 설명된 원지 술폰화된-D8 (또는 sD8)은 다음의 절차에 따라 제조되었다: 동결건조된, 백색 고체로서 D8 시약은 10-20 mM 스톡 농도 용액으로 DMA (N,N-디메틸아세트아미드)에서 용해되었다. 신선한 아황산수소나트륨 (물에서 500 mM 용액, 5 몰 당량)이 첨가되었고, 그리고 결과의 용액은 4℃에서 15 시간 유지 단계에 앞서 25℃에서 4-6 시간 동안 반응되었다. 신선한 아황산수소나트륨의 추가 분취량 (물에서 500 mM 용액, 2 몰 당량)이 도입되었고, 그리고 추가 이용 때까지 -80℃에서 보관 전에 25℃에서 4 시간 동안 반응하도록 허용되었다.
c) N 말단 항체 접합 - CD123-6Gv4.7에 대한 2-단계 프로토콜
경쇄 상에서 N 말단 세린으로 가공된 huCD123-6Gv4.7S3 항체 (상기 참조) (huCD123-6Gv4.7S3) (반응식 3에서 [1], 도면 17; PBS, pH7.4에서 3mg/mL)는 25℃에서 30 분 동안 5 mM 수성 나트륨 과옥소산염 (50 몰 당량)으로 처리되었다. 혼합물은 이후, NAP 탈염 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 통해 아세트산나트륨 완충액, pH5.0 내로 완충액 교환되었다.
결과의 용액은 10% v/v 보조용매에 4-아미노펜에틸 알코올 (DMA [N,N-디메틸아세트아미드]에서 100 mM)로 처리되었다. 이종이중기능성 링커1 ([3], 반응식 3; 5 몰 당량)이 차후에 도입되었고, 그리고 반응 용기는 밀봉되고 37℃에서 24 시간 동안 배양되었다.
혼합물은 이후, NAP 탈염 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 통해 HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산), pH8.5 완충액 내로 완충액 교환되었다. 용액은 이후, DMA (N,N-디메틸아세트아미드) 보조용매 (10% v/v)로 조정되고, 그리고 술폰화된-D1 (또는 sD1) ([5], 반응식 3; 유리 티올; 5 몰 당량)로 25℃에서 6 시간 동안 처리되었다.
결과의 접합체는 NAP 여과 칼럼 (Illustra Sephadex G-25 DNA 등급, GE Healthcare)을 이용하여, 250 mM 글리신, 10 mM 히스티딘, 1% 수크로오스, 0.01% Tween-20, 50 μM 아황산수소나트륨 조제 완충액, pH 6.2 내로 완충액 교환되었다. 투석은 Slide-a-Lyzer 투석 카세트 (ThermoScientific 10,000 MWCO)를 활용하여 25℃에서 4 시간 동안 동일한 완충액에서 수행되었다.
정제된 접합체 ([6], 반응식 3)는 항체마다 연결된 D1의 평균 2.0 분자 (Q-ToF 질량 분광분석법을 통해), >96% 단위체 (크기 배제 크로마토그래피를 통해), <3% 유리 약물 (아세톤 침전된 역상 HPLC 분석을 통해), 그리고 0.4 mg/mL의 최종 단백질 농도 (huCD123-6Gv4.7S3 항체의 경우 몰 흡광 계수 ε280 = 213320 M-1cm-1을 이용한 UV-Vis를 통해)를 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 13 huCD123-6 항체의 부위 특이적 접합체의 시험관내 세포독성
세포 표면 상에 CD123을 발현하는 세포를 사멸시키는, huCD123-6의 다양한 IGN 화합물과의 부위 특이적 접합체 (huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5 및 huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8)의 능력은 시험관내 세포독성 검정을 이용하여, 정합 항체 및 유상하중을 내포하는 리신-연결된 접합체 (huCD123-6Gv4.6-D2 및 huCD123-6Rv1.1-D2)의 것과 비교되었다. 세포독성 검정은 실시예 10에서 설명된 바와 같이 실행되고 분석되었다.
huCD123-6Gv4.6-CysMab-D5 접합체 (여기서 huCD123-6Gv4.6-CysMab는 서열 번호: 54의 Ig 중쇄 서열 및 서열 번호: 51의 경쇄 서열을 갖는다)는 복수 세포주에 대해 리신-연결된 huCD123-6Gv4.6-D2 접합체 (여기서 huCD123-6Gv4.6 항체는 서열 번호: 50의 Ig 중쇄 서열 및 서열 번호: 51의 경쇄 서열을 갖는다)와 최소한 동일한 활성을 가졌다. AML 세포주 EOL-1, B-ALL 세포주 KOPN-8 및 CML 세포주 MOLM-1을 이용한 세포독성 검정의 여러 실례는 각각, 도면 13a-13c에서 도시된다. 양쪽 접합체는 EOL-1 세포, KOPN-8 세포 및 MOLM-1 세포 각각에 대해 거의 0.002 nM, 0.005 nM 및 0.02 nM의 IC50 값으로 이들 세포를 용량 의존성 방식으로 사멸시켰다. 사멸은 CD123-의존성이었는데, 그 이유는 CD123 항원이 접합되지 않은 chCD123-6 항체에 의해 차단될 때, 이들 접합체가 이들 세포에 대한 독성에서 최소한 100 배 덜하였기 때문이다.
huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8 접합체 (여기서 표면치환된 huCD123-6Rv1.1S2 항체는 N 말단 잔기가 Ser이라는 점을 제외하고 서열 번호: 60의 Ig 중쇄 서열 및 서열 번호: 61의 경쇄 서열을 갖는다)는 표적 (CD123) 결합을 유지하였고, 그리고 복수 세포주에 대해 리신-연결된 huCD123-6Rv1.1-D2 접합체 (여기서 표면치환된 huCD123-6Rv1.1 항체는 서열 번호: 60의 Ig 중쇄 서열 및 서열 번호: 61의 경쇄 서열을 갖는다)와 최소한 동일한 활성이었다. AML 세포주 SHI-1 및 HNT-34뿐만 아니라 CML 세포주 MOLM-1을 이용한 세포독성 검정의 여러 실례는 각각, 도면 14a-14c에서 도시된다. 양쪽 접합체는 SHI-1 세포, HNT-34 세포 및 MOLM-1 세포 각각에 대해 거의 0.01 nM, 0.002 nM 및 0.03 nM의 IC50 값으로 이들 세포를 용량 의존성 방식으로 사멸시켰다. 사멸은 CD123-의존성이었는데, 그 이유는 CD123 항원이 접합되지 않은 huCD123-6 항체에 의해 차단될 때, 이들 접합체가 이들 세포에 대한 독성에서 최소한 100 배 덜하였기 때문이다.
다른 실험에서, huCD123 항체를 포함하는 Ser-연결된 DGN462 화합물은 더욱 높은 DAR을 포함하는 리신 연결된 버전보다 3-배 높은 항원 특이적 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다 (데이터 제시되지 않음).
실시예 14 MV4-11 AML 피하 생쥐 모형에서 CD123-IGN 접합체를 이용한 생체내 효력 연구
피하 이식된 종양 세포는 생체내에서 신규하고 가능성 있는 항암제를 시험하는 편의한 수단을 대표한다. 넓은 범위의 종양 유전자형 및 표현형을 커버하는, 고형 종양 및 백혈병 둘 모두로부터 유래된 매우 다양한 인간 및 뮤린 세포주가 뮤린 숙주에서 성장하도록 개조되었고, 그리고 따라서, 적절한 종양 모형에서 주제 치료적 작용제의 시험을 허용한다.
아래의 프로토콜에서 개설된 바와 같은 피하 급성 골수성 백혈병 모형 (AML)이 생체내에서 종양 부담을 감소시키는 능력에 대한 주제 CD123 항체 약물 접합체 (ADCs)의 효력을 시험하는데 이용된다. 구체적으로, 암컷 SCID 생쥐는 각각, 약 1 x 107 MV4-11 세포, 인간 AML 세포주가 오른쪽 옆구리에 피하 접종된다. 접종후 14 일자에, 생쥐는 종양 체적에 근거된 군으로 무작위로 나눠지고, 그리고 MV4-11 세포 상에서 Fc 수용체를 차단하기 위해 복강내 주사에 의해 400 mg/kg의 인간 IgG로 처리된다. 주제 항-D123 ADCs 또는 비표적화 항체 대조 (chKTI-리신 연결된-D1, chKTI-리신 연결된 D2, 그리고 huKTI-CysMab 연결된 D2 여기서 huKTI 항체는 서열 번호: 54의 마지막 잔기로부터 5번째에 상응하는 위치에서 가공된 Cys를 갖는다)가 접종후 15 일자에, 1 또는 3 μg/kg의 용량에서 1회 정맥내 투여된다. 생쥐는 접종후 20 일자에 100 mg/kg의 인간 IgG로 다시 한 번 처리된다. 동물은 매일 모니터링되고, 그리고 종양 체적은 주 2회 계측된다. 처리군 및 대조군은 개별 용량과 함께 아래에 열거된다.
Figure 112018009762973-pct00705
본 연구에서 이용된 huCD123 항체는 인간화 huCD123-6Gv4.7 항체인데, 이것은 Lys 연쇄를 통해, 또는 본원에서 전술한 바와 같은 가공된 Cys-연쇄를 통해 D1 또는 D2에 연결된다. Lys-연결된 키메라 KTi 항체-기초된 IGN 접합체 및 Cys-연결된 인간 KTi 항체-기초된 IGN 접합체 또한, 대조로서 포함된다. 후자 KTi CysMab 항체는 서열 번호: 54의 마지막 잔기로부터 5번째에 상응하는 위치에서 중쇄 CH3 도메인 내에 가공된 Cys를 갖는다.
예비적 데이터는 Lys- 및 Cys-연결된 IGN 화합물이 생체내 생쥐 모형에서 MV4-11 이종이식 종양에 대항하여 고도로 활성이라는 것을 보여준다 (도면 20을 참조한다).
실시예 15. huCD123-6 항체의 Cys 부위 특이적 접합체 huCD123-6Gv1.1S2-CysMab-D7 의 제조
huCD123-6Gv1.1S2-CysMab는 서열 번호: 33의 LCVR 서열 및 서열 번호: 48의 HC 서열 (첫 번째 잔기가 Ser이라는 점을 제외하고)을 포함하고, 그리고 서열 번호: 54 또는 56의 마지막 잔기로부터 5번째에 상응하는 가공된 Cys를 포함하는 CDR 합체된 인간화 항체이다.
환원된 상태에서 2개의 비대칭 시스테인 잔기를 보유하는 이러한 huCD123 항체는 표준 절차를 이용하여 제조되었다. PBS 5 mM EDTA pH 6.0에서 2% v/v DMA 및 38% v/v 프로필렌 글리콜의 최종 용매 조성을 갖는 반응 혼합물을 제공하기 위해, 인산염 완충된 식염수 (PBS), 5 mM N,N,N',N'-에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) pH 6.0에서 이러한 중간물질의 용액에 N,N-디메틸아세트아미드 (DMA), 프로필렌 글리콜, 그리고 DMA에서 원액으로서 10 몰 당량의 D7이 첨가되었다. 반응은 25℃에서 24 시간 동안 진행하도록 허용되었다.
접합체는 Sephadex G25 탈염 칼럼을 이용하여 20 mM 히스티딘, 50 mM 염화나트륨, 8.5% 수크로오스, 0.01% Tween-20, 50 μM 아황산수소나트륨 pH 6.2 조제 완충액 내로 정제되고, 10 kDa 분자량 컷오프를 갖는 막을 통한 한외여과에 의해 농축되고, 그리고 0.22 μm 주입기 필터를 통해 여과되었다. 접합체는 이후, 10 kDa 분자량 컷오프를 갖는 막을 이용하여 동일한 완충액에 대해 투석되었다.
상기 접합체는 UV-Vis에 의한 2 몰 D7/몰 항체; SEC에 의한 97.2% 단위체; 및 SEC/역상 HPLC에 의한 1.9% 접합되지 않은 D7을 갖는 것으로 밝혀졌다. 탈당화된 접합체의 LC-MS는 도시되지 않는다.
huCD123-6Gv4.7-CysMab-D5
huCD123-6Gv4.7-CysMab는 서열 번호: 34의 LCVR 서열 (여기서 Xaa는 Val이다) 및 서열 번호: 35의 HCVR 서열을 포함하고, 그리고 서열 번호: 54 또는 56의 마지막 잔기로부터 5번째에 상응하는 가공된 Cys를 포함하는 CDR 합체된 인간화 항체이다.
환원된 상태에서 2개의 비대칭 시스테인 잔기를 보유하는 이러한 huCD123 항체는 표준 절차를 이용하여 제조되었다. PBS 5 mM EDTA pH 6.0에서 2% v/v DMA 및 38% v/v 프로필렌 글리콜의 최종 용매 조성을 갖는 반응 혼합물을 제공하기 위해, 인산염 완충된 식염수 (PBS), 5 mM N,N,N',N'-에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) pH 6.0에서 이러한 중간물질의 용액에 N,N-디메틸아세트아미드 (DMA), 프로필렌 글리콜, 그리고 DMA에서 원액으로서 10 몰 당량의 D5가 첨가되었다. 반응은 25℃에서 24 시간 동안 진행하도록 허용되었다.
접합체는 Sephadex G25 탈염 칼럼을 이용하여 20 mM 히스티딘, 50 mM 염화나트륨, 8.5% 수크로오스, 0.01% Tween-20, 50 μM 아황산수소나트륨 pH 6.2 조제 완충액 내로 정제되고, 10 kDa 분자량 컷오프를 갖는 막을 통한 한외여과에 의해 농축되고, 그리고 0.22 μm 주입기 필터를 통해 여과되었다. 접합체는 이후, 10 kDa 분자량 컷오프를 갖는 막을 이용하여 동일한 완충액에 대해 투석되었다.
상기 접합체는 UV-Vis에 의한 2 몰 D5/몰 항체 및 SEC에 의한 94.8% 단위체를 갖는 것으로 밝혀졌다. 탈당화된 접합체의 LC-MS는 도시되지 않는다
huCD123-6Gv4.7-CysMab-D4
환원된 상태에서 2개의 비대칭 시스테인 잔기를 보유하는 상기 huCD123 항체는 표준 절차를 이용하여 제조되었다. PBS 5 mM EDTA pH 6.0에서 2% v/v DMA 및 38% v/v 프로필렌 글리콜의 최종 용매 조성을 갖는 반응 혼합물을 제공하기 위해, 인산염 완충된 식염수 (PBS), 5 mM N,N,N',N'-에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) pH 6.0에서 이러한 중간물질의 용액에 N,N-디메틸아세트아미드 (DMA), 프로필렌 글리콜, 그리고 DMA에서 원액으로서 5 몰 당량의 D4가 첨가되었다. 반응은 25℃에서 6 시간 동안 진행하도록 허용되었다.
접합체는 Sephadex G25 탈염 칼럼을 이용하여 20 mM 히스티딘, 50 mM 염화나트륨, 8.5% 수크로오스, 0.01% Tween-20, 50 μM 아황산수소나트륨 pH 6.2 조제 완충액 내로 정제되고, 10 kDa 분자량 컷오프를 갖는 막을 통한 한외여과에 의해 농축되고, 그리고 0.22 μm 주입기 필터를 통해 여과되었다. 접합체는 이후, 10 kDa 분자량 컷오프를 갖는 막을 이용하여 동일한 완충액에 대해 투석되었다.
상기 접합체는 UV-Vis에 의한 1.8 몰 D4/몰 항체 및 SEC에 의한 97.4% 단위체를 갖는 것으로 밝혀졌다. 탈당화된 접합체의 LC-MS는 도시되지 않는다.
실시예 16. 화합물 D1의 합성
화합물 1a :
무수성 디메틸포름아미드 (16.48 mL) 및 무수성 테트라히드로푸란 (16.48 ml)에서 (5-아미노-1,3-페닐렌)디메탄올 (1.01 g, 6.59 mmol)의 교반된 용액에 4-메틸-4-(메틸디술파닐)펜탄산 (1.281 g, 6.59 mmol), N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카보디이미드 염산염 (2.53 g, 13.19 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (0.081 g, 0.659 mmol)이 첨가되었다. 결과의 혼합물은 실온에서 18 시간 동안 교반되었다. 반응물은 포화된 염화암모늄 용액으로 퀀칭되고 에틸 아세트산염 (3x 50 mL)으로 추출되었다. 유기 추출물은 물 및 염수로 세척되고, 이후 무수성 황산나트륨 위에서 건조되었다. 용액은 여과되고 진공에서 농축되고, 그리고 결과의 잔류물은 실리카 겔 크로마토그래피 (에틸 아세트산염/헥산)에 의해 정제되어 화합물 1a가 백색 고체 (0.70 g, 32% 수율)로서 획득되었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6: δ 9.90 (s, 1H), 7.43 (s, 2H), 6.93 (s, 1H), 5.16 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 4.44 (d, 4H, J = 5.7 Hz), 2.43 (s, 3H), 2.41-2.38 (m, 2H), 1.92-1.88 (m, 2H), 1.29 (s, 6H). MS (m/z), 발견됨 330.0 (M + 1)+.
화합물 1b :
무수성 디클로로메탄 (6.65 mL)에서 화합물 1a (219 mg, 0.665 mmol)의 냉각된 (-10 ℃) 용액에 트리에틸아민 (463 μl, 3.32 mmol)이 첨가되고, 그 이후에 메탄술폰산 무수물 (298 mg, 1.662 mmol)이 방울방울 첨가되었다. 혼합물은 -10 ℃에서 2 시간 동안 교반되고, 이후 혼합물은 얼음물로 퀀칭되고 차가운 에틸 아세트산염 (2 x 30 mL)으로 추출되었다. 유기 추출물은 얼음물로 세척되고, 무수성 황산나트륨으로 건조되고, 여과되고, 그리고 감소된 압력 하에 농축되어 미가공 디메실레이트가 획득되었다.
미가공 디메실레이트 (227 mg, 0.467 mmol) 및 IGN (또는 인돌리노벤조디아제핀) 단위체 A (303 mg, 1.028 mmol)는 무수성 DMF (3.11 mL)에서 용해되었다. 탄산칼륨 (161 mg, 1.169 mmol)이 첨가되었고, 그리고 혼합물은 실온에서 18 시간 동안 교반되었다. 탈이온수가 첨가되었고, 그리고 결과의 침전물은 여과되고 물로 헹굼되었다. 고체는 디클로로메탄에서 재용해되고 물로 세척되었다. 유기 층은 무수성 황산마그네슘으로 건조되고, 여과되고, 농축되었다. 미가공 잔류물은 실리카 겔 크로마토그래피 (메탄올/디클로로메탄)에 의해 정제되어 화합물 1b (227 mg, 36% 수율)이 제공되었다. MS (m/z), 발견됨 882.5 (M + 1)+.
화합물 1c :
무수성 1,2-디클로로에탄 (3.346 mL)에서 화합물 1b (227 mg, 0.167 mmol)의 현탁액에 트리아세톡시붕수소화나트륨 (37.3 mg, 0.167 mmol)이 첨가되었다. 혼합물은 실온에서 1 시간 동안 교반되었고, 여기에서 이것은 포화된 염화암모늄 용액으로 퀀칭되었다. 혼합물은 디클로로메탄으로 추출되고 염수로 세척되었다. 유기 층은 무수성 황산마그네슘으로 건조되고, 여과되고, 농축되었다. 미가공 잔류물은 RP-HPLC (C18, 물/아세토니트릴)에 의해 정제되었다. 원하는 산물을 내포하는 분획물은 디클로로메탄으로 추출되고, 무수성 황산마그네슘으로 건조되고, 여과되고, 농축되어 화합물 1c (35 mg, 19% 수율)가 제공되었다. MS (m/z), 발견됨 884.3 (M + 1)+.
화합물 1d :
아세토니트릴 (921 μL) 및 메탄올 (658 μL)에서 화합물 1c (18 mg, 0.017 mmol)의 용액에 인산나트륨 완충액 (132 μL, 0.75 M, pH 6.5)에서 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염 (17.51 mg, 0.060 mmol) (포화된 중탄산나트륨 용액 (0.2 mL)으로 중화됨)이 첨가되었다. 혼합물은 실온에서 3.5 시간 동안 교반되고, 이후 디클로로메탄 및 탈이온수로 희석되었다. 유기 층은 분리되고, 염수로 세척되고, 무수성 황산나트륨으로 건조되고, 여과되고, 그리고 감소된 압력 하에 농축되어 미가공 티올이 획득되었다. MS (m/z), 발견됨 838.3 (M + 1)+.
미가공 티올 (15.5 mg, 0.018 mmol)은 2-프로판올 (1.23 mL)에서 용해되었다. 탈이온수 (617 μL) 및 아황산수소나트륨 (5.77 mg, 0.055 mmol)이 첨가되었고, 그리고 혼합물은 실온에서 5 시간 동안 교반되었다. 반응물은 아세톤/드라이아이스 용액조에서 동결되고, 동결건조되고, RP-HPLC (C18, 탈이온수/아세토니트릴)에 의해 정제되었다. 원하는 산물을 내포하는 분획물은 동결되고 동결건조되어 화합물 (12S,12aS)-9-((3-(4-메르캅토-4-메틸펜탄아미도)-5-((((R)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)벤질)옥시)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-12-술폰산 (화합물 술폰화된-D1 (sD1)) (6.6 mg, 39% 수율)이 제공되었다. MS (m/z), 발견됨 918.2 (M - 1)-.
실시예 17. 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((R)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-디히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸) 페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-6-옥소헥사노에이트, 화합물 D2의 합성
단계 1: (S)-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)프로판산 (5 g, 22.40 mmol) 및 (S)-tert-부틸2-아미노프로파노에이트 염산염 (4.48 g, 24.64 mmol)은 무수성 DMF (44.8 mL)에서 용해되었다. EDCㆍHCl (4.72 g, 24.64 mmol), HOBt (3.43 g, 22.40 mmol), 그리고 DIPEA (9.75 mL, 56.0 mmol)가 첨가되었다. 반응물은 아르곤 하에, 실온에서, 하룻밤 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 디클로로메탄으로 희석되고, 그리고 이후, 포화된 염화암모늄, 포화된 중탄산나트륨, 물 및 염수로 세척되었다. 유기 층은 황산나트륨 위에서 건조되고 농축되었다. 원유는 실리카 겔 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세트산염)를 통해 정제되어 화합물 2a (6.7 g, 85% 수율)가 산출되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.38-7.31 (m, 5H), 6.53-6.42 (m, 1H), 5.42-5.33 (m, 1H), 5.14 (s, 2H), 4.48-4.41 (m, 1H), 4.32-4.20 (m, 1H), 1.49 (s, 9H), 1.42 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 1.38 (d, 3H, J = 7.2 Hz).
단계 2: 화합물 2a (6.7 g, 19.12 mmol)는 메탄올 (60.7 mL) 및 물 (3.03 mL)에서 용해되었다. 용액은 5 분 동안 아르곤으로 일소되었다. 탄소상 팔라듐 (습성, 10%) (1.017 g, 0.956 mmol)이 천천히 첨가되었다. 반응물은 수소 공기 하에 하룻밤 동안 교반되었다. 용액은 셀라이트를 통해 여과되고, 메탄올로 헹굼되고, 농축되었다. 이것은 메탄올 및 아세토니트릴과 공비되었고, 그리고 결과의 오일은 높은 진공 상에 직접적으로 배치되어 화합물 2b (4.02 g, 97% 수율)가 제공되었고, 이것은 다음 단계에서 직접적으로 이용되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.78-7.63 (m, 1H), 4.49-4.42 (m, 1H), 3.55-3.50 (m, 1H), 1.73 (s, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.39 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.36 (d, 3H, J = 6.8 Hz).
단계 3: 화합물 2b (4.02 g, 18.59 mmol) 및 모노 메틸아디페이트 (3.03 mL, 20.45 mmol)가 무수성 DMF (62.0 mL)에서 용해되었다. EDCㆍHCl (3.92 g, 20.45 mmol), HOBt (2.85 g, 18.59 mmol) 및 DIPEA (6.49 mL, 37.2 mmol)가 첨가되었다. 혼합물은 실온에서 하룻밤 동안 교반되었다. 반응물은 디클로로메탄/메탄올 (150 mL, 5:1)로 희석되고 포화된 염화암모늄, 포화된 중탄산나트륨 및 염수로 세척되었다. 이것은 황산나트륨 위에서 건조되고, 여과되고, 박탈되었다. 화합물은 아세토니트릴 (5x)과 공비되고, 이후 35 ℃에서 높은 진공 상에서 펌핑되어 화합물 2c (6.66 g, 100% 수율)가 제공되었다. 미가공 물질은 정제 없이 다음 단계에 이용되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.75 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 6.44 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 4.52-4.44 (m, 1H), 4.43-4.36 (m, 1H), 3.65 (s, 3H), 2.35-2.29 (m, 2H), 2.25-2.18 (m, 2H), 1.71-1.60 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.36 (t, 6H, J = 6.0 Hz).
단계 4: 화합물 2c (5.91 g, 16.5 mmol)는 실온에서 3 시간 동안 TFA (28.6 mL, 372 mmol) 및 탈이온수 (1.5 mL)에서 교반되었다. 반응 혼합물은 아세토니트릴로 농축되고 높은 진공 상에 배치되어 미가공 화합물 2d가 점착성 고체 (5.88 g, 100% 수율)로서 제공되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.21 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 6.81 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 4.69-4.60 (m, 1H), 4.59-4.51 (m, 1H), 3.69 (s, 3H), 2.40-2.33 (m, 2H), 2.31-2.24 (m, 2H), 1.72-1.63 (m, 4H), 1.51-1.45 (m, 3H), 1.42-1.37 (m, 3H).
단계 5: 화합물 2d (5.6 g, 18.52 mmol)는 무수성 디클로로메탄 (118 mL) 및 무수성 메탄올 (58.8 mL)에서 용해되었다. (5-아미노-1,3-페닐렌)디메탄올 (2.70 g, 17.64 mmol) 및 EEDQ (8.72 g, 35.3 mmol)가 첨가되었고, 그리고 반응물은 실온에서 하룻밤 동안 교반되었다. 상기 용매가 박탈되었고, 그리고 에틸 아세트산염이 첨가되었다. 결과의 슬러리는 여과되고, 에틸 아세트산염으로 세척되고, 진공/N2 하에 건조되어 화합물 2e (2.79 g, 36% 수율)가 제공되었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.82 (s, 1H), 8.05, (d, 1H, J = 9.2 Hz), 8.01 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 7.46 (s, 2H), 6.95 (3, 1H), 5.21-5.12 (m, 2H), 4.47-4.42 (m, 4H), 4.40-4.33 (m, 1H), 4.33-4.24 (m, 1H), 3.58 (s, 3H), 2.33-2.26 (m, 2H), 2.16-2.09 (m, 2H), 1.54-1.46 (m, 4H), 1.30 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.22 (d, 3H, J = 4.4 Hz).
단계 6: 화합물 2e (0.52 g, 1.189 mmol) 및 사브롬화탄소 (1.183 g, 3.57 mmol)가 무수성 DMF (11.89 mL)에서 용해되었다. 트리페닐포스핀 (0.935 g, 3.57 mmol)이 첨가되었고, 그리고 반응물은 아르곤 하에 4 시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 DCM/MeOH (10:1)로 희석되고, 물 및 염수로 세척되고, 황산나트륨 위에서 건조되고, 여과되고, 농축되었다. 미가공 물질은 실리카 겔 크로마토그래피 (DCM/MeOH)에 의해 정제되어 화합물 2f (262 mg, 39% 수율)가 제공되었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.01 (s, 1H), 8.11 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 8.03 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.67 (s, 2H), 7.21 (s, 1H), 4.70-4.64 (m, 4H), 4.40-4.32 (m, 1H), 4.31-4.23 (m, 1H), 3.58 (s, 3H), 2.34-2.26 (m, 2H), 2.18-2.10 (m, 2H), 1.55-1.45 (m, 4H), 1.31 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.21 (d, 3H, J = 7.2 Hz).
단계 7: 이브롬염 화합물 2f 및 IGN 단위체 화합물 I-1은 DMF에서 용해되었다. 탄산칼륨이 첨가되고 실온에서 하룻밤 동안 교반되었다. 산물을 침전시키기 위해 물이 반응 혼합물에 첨가되었다. 슬러리는 실온에서 5 분 동안 교반되고, 그리고 이후, 여과되고 진공/N2 하에 1 시간 동안 건조되었다. 미가공 물질은 실리카 겔 크로마토그래피 (디클로로메탄/메탄올)에 의해 정제되어 화합물 2g (336 mg, 74% 수율)가 제공되었다. LCMS = 5.91 분 (15 분 방법). MS (m/z): 990.6 (M + 1)+.
단계 8: 디이민 화합물 2g는 1,2-디클로로에탄에서 용해되었다. NaBH(OAc)3이 반응 혼합물에 첨가되고 실온에서 1 시간 동안 교반되었다. 반응물은 CH2Cl2로 희석되고 포화된 수성 NH4Cl 용액으로 퀀칭되었다. 층은 분리되고, 염수로 세척되고, Na2SO4 위에서 건조되고, 농축되었다. 미가공 물질은 RPHPLC (C18 칼럼, 아세토니트릴/물)를 통해 정제되어 화합물 2h (85.5 mg, 25% 수율)가 제공되었다. LCMS =6.64 분 (15 분 방법). MS (m/z): 992.6 (M + 1)+.
단계 9: 메틸에스테르 화합물 2h는 1,2-디클로로에탄에서 용해되었다. 트리메틸스탄난올이 반응 혼합물에 첨가되고 80 ℃에서 하룻밤 동안 가열되었다. 반응 혼합물은 실온으로 냉각되고 물로 희석되었다. 수성 층은 1 M HCl로 pH ~ 4까지 산성화되었다. 혼합물은 CH2Cl2/MeOH (10:1, 3 x 20 mL)로 추출되었다. 합동된 유기 층은 염수로 세척되고, Na2SO4 위에서 건조되고, 농축되었다. 미가공 물질은 실리카 플러그에 통과되어 화합물 2i (48.8 mg, 80% 수율)가 제공되었다. LCMS = 5.89 분 (15 분 방법). MS (m/z): 978.6 (M + 1)+.
단계 10: EDCㆍHCl이 실온에서 CH2Cl2에서 산 화합물 2i 및 N-히드록시숙신아미드의 교반된 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 2 시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 CH2Cl2로 희석되고 물 (1 x 15 mL) 및 염수 (1 x 15 mL)로 세척되었다. 유기 층은 Na2SO4 위에서 건조되고, 여과되고, 농축되었다. 미가공 물질은 RPHPLC (C18 칼럼, 아세토니트릴/물)를 통해 정제되어 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((R)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-디히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸) 페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노) -1-옥소프로판-2-일)아미노)-6-옥소헥사노에이트, 화합물 D2 (8.2 mg, 30% 수율)가 제공되었다. LCMS = 6.64 분 (15 분 방법). MS (m/z): 1075.4 (M + 1)+.
실시예 18. N-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸)-11-(3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-디히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)-13,13-디메틸-2,5,8-트리옥사-14,15-디티아-11-아자노나데칸-19-아미드, 화합물 D6의 합성
단계 1: 무수성 디클로로메탄 (0.5 mL)에서 유리 티올 DGN462 (40 mg, 0.042 mmol) 및 NHS 4-(2-피리딜디티오)부타네이트 (35 mg, 80% 순도, 0.085 mmol)의 용액에 무수성 디이소프로필에틸아민 (0.015 mL, 0.085 mmol)이 첨가되고 실온에서 16 시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 포화된 염화암모늄으로 퀀칭되고 디클로로메탄으로 희석되었다. 획득된 혼합물은 분별 깔때기에서 분리되었다. 유기 층은 염수로 세척되고, 무수성 황산나트륨 위에서 건조되고, 여과되고, 감소된 압력 하에 박탈되었다. 잔류물은 준분취 역상 HPLC (C18 칼럼, CH3CN/H2O)에 의해 정제되었다. 순수한 산물을 내포하는 분획물은 합동되고, 동결되고, 동결건조되어 원하는 NHS 에스테르, 화합물 6a (29.7 mg, 60% 수율)가 제공되었다. LCMS = 9.1 분 (15 분 방법). MS (m/z): 1157.3 (M + 1)+.
단계 2: 무수성 디클로로메탄 (0.3 mL)에서 NHS 에스테르, 화합물 6a (12.3 mg, 0.011 mmol) 및 N-(2-아미노에틸)말레이미드 염산염 (2.0 mg, 0.011 mmol)의 용액에 DIPEA (0.0022 mL, 0.013 mmol)가 첨가되었다. 혼합물은 실온에서 3 시간 동안 교반되고, 이후 이것은 감소된 압력 하에 박탈되었다. 잔류물은 준분취 역상 HPLC (C18 칼럼, CH3CN/H2O)에 의해 정제되었다. 순수한 산물을 내포하는 분획물은 합동되고, 동결되고, 동결건조되어 원하는 말레이미드, 화합물 D6 (10 mg, 80% 수율)이 제공되었다. LCMS = 8.3 분 (15 분 방법). MS (m/z): 1181.8 (M + 1)+.
실시예 19. N1-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸)-N6-((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-디히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아디파미드, 화합물 D5의 합성
NHS 에스테르, 화합물 5a (8.2 mg, 7.6 μmol) 및 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온 염산염 (2.2 mg, 0.011 mmol)은 실온에서 무수성 디클로로메탄 (305 μL) 에서 용해되었다. DIPEA (2.66 μL, 0.015mmol)가 첨가되었고, 그리고 반응물은 3.5 시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 농축되고 RPHPLC (C18 칼럼, CH3CN/H2O, 구배, 35% 내지 55%)에 의해 정제되었다. 원하는 산물 분획물은 동결되고 동결건조되어 말레이미드, 화합물 D5가 고체 백색 분말 (5.3 mg, 58% 수율)로서 제공되었다. LCMS = 5.11 분 (8 분 방법). MS (m/z): 1100.6 (M + 1)+.
실시예 20. 1-((2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸)아미노)-4-((5-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-디히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)아미노)-2-메틸-5-옥소펜탄-2-일)디술파닐)-1-옥소부탄-2-술폰산, 화합물 D4의 합성
무수성 디클로로메탄 (2.10 mL)에서 유리 티올, D1 (88 mg, 0.105 mmol) 및 1-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-1-옥소-4-(피리딘-2-일디술파닐)부탄-2-술폰산 (술포-SPDB) (64.0 mg, 0.158 mmol)의 현탁액에 실온에서 질소 하에 DIPEA (55.0 μL, 0.315 mmol)가 첨가되었다. 혼합물은 16 시간 동안 교반되고, 그리고 이후, 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온 염산염 (55.6 mg, 0.315 mmol), 무수성 디클로로메탄 (1.0 mL) 및 DIPEA (0.055 mL, 0.315 mmol)가 첨가되었다. 혼합물은 실온에서 추가 5 시간 동안 교반되고, 여기에서 반응물은 진공에서 농축되었다. 결과의 잔류물은 RP-HPLC (C18, CH3CN/H2O)에 의해 정제되었다. 원하는 산물을 내포하는 분획물은 동결되고 동결건조되어 말레이미드, D4 (20 mg, 16% 수율)가 백색 고체로서 제공되었다. LCMS = 4.92 분 (8 분 방법). MS (m/z): 1158.6 (M + 1)+.
실시예 21. N-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸)-11-(3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-디히드로-6H-벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)-2,5,8-트리옥사-11-아자펜타데칸-15-아미드, 화합물 D7의 합성
무수성 디클로로메탄 (200 μL)에서 NHS 에스테르, 7a (5 mg, 4.82 μmol) 및 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온 염산염 (1.7 mg, 9.64 μmol)의 용액에 질소 하에 DIPEA (1.512 μL, 8.68 μmol)가 첨가되었다. 혼합물은 실온에서 4 시간 동안 교반되고, 그리고 이후, 진공에서 농축되었다. 결과의 잔류물은 RP-HPLC (C18, CH3CN / H2O)에 의해 정제되었다. 원하는 산물을 내포하는 분획물은 동결되고 동결건조되어 말레이미드, 화합물 D7 (3.5 mg, 68% 수율)이 제공되었다. LCMS = 4.61 분 (15 분 방법). MS (m/z): 1062.8 (M + 1)+.
실시예 22. 화합물 D8의 합성
단계 1: Tert-부틸 히드록시카바메이트 (1.490 g, 11.19 mmol)가 무수성 DMF (22.38 mL)에서 용해되었다. 2-(3-브로모프로필)이소인돌린-1,3-디온 (3g, 11.19 mmol) 및 탄산칼륨 (3.09 g, 22.38 mmol)이 첨가되었고, 그리고 반응물은 실온에서 하룻밤 동안 교반되었다. 이것은 차가운 물로 희석되고 EtOAc로 추출되었다. 유기 층은 염수로 세척되고 황산나트륨 위에서 건조되고, 그리고 미가공 잔류물은 실리카 겔 섬광 크로마토그래피 (EtOAc/Hex, 구배, 0% 내지 45%)에 의해 정제되어 화합물 8a가 점착성 고체 (2.41g, 67% 수율)로서 획득되었다. LCMS = 4.99 분 (8 분 방법). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.86-7.83 (m, 2H), 7.73-7.77 (m, 2H), 7.28 (bs, 1H), 3.92 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.82 (t, 2H, 6.9Hz), 2.05-1.98 (m, 2H), 1.47 (s, 9H).
단계 2: 화합물 8a (2.41g, 7.52 mmol)는 무수성 DCM (18.81 mL)에서 용해되고 얼음 용액조에서 0℃로 냉각되었다. DCM (9.40 ml) 및 TFA (9.40 ml)의 새로 혼합된 용액이 첨가되었고, 그리고 얼음 용액조가 제거되었다. 반응물은 실온에서 1 시간 동안 교반되고, DCM으로 희석되고, 포화된 중탄산나트륨으로 세척되었다. 유기 층은 염수로 세척되고, 건조되고, 여과되고, 농축되어 화합물 8b (1.32g, 80% 수율)가 제공되었다. 미가공 물질은 추가 정제 없이 이용되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.85-7.82 (m, 2H), 7.72-7.69 (m, 2H), 3.78 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.72 (t, 2H, 6.0Hz), 1.99-1.93 (m, 2H).
단계 3: 화합물 8b (100mg, 0.454 mmol)는 무수성 DCM (4.5 mL) TEA (127 μl, 0.908 mmol)에서 용해되었고, 그리고 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 (2-(트리메틸실릴)에틸) 탄산염 (177 mg, 0.681 mmol)이 첨가되었고, 그리고 반응물은 실온에서 하룻밤 동안 교반되었다. 반응물은 DCM으로 희석되고, 염수로 세척되고, 건조되고, 여과되고, 증발되었다. 미가공 잔류물은 실리카 겔 섬광 크로마토그래피 (EtOAc/Hex, 구배, 0% 내지 40%)에 의해 정제되어 화합물 8c (148mg, 89% 수율)가 획득되었다. LCMS = 5.91 분 (8 분 방법). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.86-7.83 (m, 2H), 7.73-7.69 (m, 2H), 7.39 (bs, 1H), 4.26-4.20 (m, 2H), 3.94 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.83 (t, 2H, 6.9Hz), 2.06-1.98 (m, 2H), 1.05-0.98 (m, 2H), 0.04 (s, 9H).
단계 4: 화합물 8c (148mg, 0.406 mmol)는 에탄올 (2.7mL)에서 용해되고 완전하게 가용성일 때까지 교반되었다. 히드라진 (63.7 μl, 2.030 mmol)이 첨가되었고, 그리고 반응물은 1 시간에 백색 침전물의 신속한 형성 때까지 실온에서 교반되었다. 반응물은 셀라이트를 통해 여과되고 추가 에탄올로 헹굼되었다. 여과액은 증발되고 실리카 겔 섬광 크로마토그래피 (A= MeOH, B= EtOAc 구배, 100% 내지 10%)에 의해 정제되었다. 산물 분획물은 질량에 의해 검출되고 증발되어 화합물 8d가 점착성 고체 (67.5mg, 71% 수율)로서 제공되었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.27-4.21 (m, 2H), 3.98 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 2.92-2.87 (m, 2H), 1.85-1.77 (m, 2H), 1.06-0.99 (m, 2H), 0.04 (s, 9H).
단계 5: 실시예 17에서 앞서 설명된 화합물 2i (30mg, 0.031 mmol)는 무수성 DCM (613 μl)에서 현탁되었다. 용액이 투명해질 때까지 무수성 DMF가 방울방울 첨가되었다. 화합물 8d (21.57 mg, 0.092 mmol), EDCㆍHCl (29.4 mg, 0.153 mmol), 그리고 DMAP (0.749 mg, 6.13 μmol)가 첨가되었고, 그리고 반응물은 실온에서 1 시간 동안 교반되었다. 이것은 DCM/MeOH 10:1로 희석되고, 그리고 이후, 물로 세척되었다. 수성 층은 DCM/MeOH 10:1로 추출되었고, 그리고 합동된 유기 층은 건조되고 농축되어 화합물 8e (49mg)가 제공되었고, 이것은 추가 정제 없이 이용되었다. LCMS = 5.94 분 (8 분 방법). MS (m/z): 1194.4 (M + 1)+.
단계 6: 화합물 8e (49mg, 0.041 mmol)는 THF (820 μl)에서 용해되었고, 그리고 반응물은 얼음 용액조에서 0℃로 냉각되었다. TBAF (205 μl, 0.205 mmol)가 첨가되었고, 그리고 반응물은 얼음 용액조가 제거되기 전 15 분 동안 교반되었다. 이것은 완결 때까지 실온에서 교반되었다. 반응물은 0℃로 냉각되고, 포화된 염화암모늄으로 퀀칭되고, DCM/MeOH 10:1로 추출되었다. 유기 층은 염수로 세척되고, 황산나트륨으로 건조되고, 증발되었다. 미가공 물질은 RPHPLC (C18 칼럼, 아세토니트릴/물)를 통해 정제되어 화합물 D8 (17.6 mg, 2 단계에 걸쳐 54% 수율)이 제공되었다. LCMS =5.1 분 (8 분 방법). MS (m/z): 1050.4 (M + 1)+.
실시예 23. 화합물 D9의 합성
단계 1: 화합물 9a (17mg, 0.016 mmol)는 DCM (328 μl)에서 용해되었다. 화합물 8d (5.76 mg, 0.025 mmol) 및 DIPEA (5.71 μl, 0.033 mmol)가 실온에서 첨가되었고, 그리고 반응물은 완결 때까지 교반되었다. 이것은 10:1 DCM:MeOH로 희석되고 염수로 세척되었다. 유기 층은 건조되고 농축되어 화합물 9b가 제공되었고, 이것은 직접적으로 이용되었다.
단계 2: 화합물 D9는 실시예 23에서 화합물 D8와 유사하게 제조되었다. 미가공 물질은 RPHPLC (C18 칼럼, 아세토니트릴/물)를 통해 정제되어 화합물 D9 (5 mg, 2 단계에 걸쳐 31% 수율)이 제공되었다. LCMS = 5.68 분 (8 분 방법). MS (m/z): 1012.5 (M + 1)+.
실시예 24. Kasumi-3-Luc-mCh-Puro 파종성모형에서 huCD123-CysMab-D5의 생체내 효능
생체내에서 파종성 종양 부담을 감소시키는 능력에 대한 huCD123-CysMab-D5의 효력을 시험하기 위해, 루시페라아제-발현 파종성 종양 모형이 아래의 프로토콜에서 설명된 바와 같이, 라이브 동물 영상화와 조합으로 이용되었다.
암컷 NSG 생쥐 (Jackson Labs)는 각각, 루시페라아제 및 mCherry를 발현하도록 가공된 5x106 Kasumi-3-Luc-mCh-Puro 세포, 인간 AML 세포주 (Molecular Imaging, Ann Arbor, MI에서)가 꼬리 정맥에서 정맥내 (IV) 주사되었다. Kasumi-3 세포에 의한 루시페라아제 발현은 종양 부담이 라이브 동물 영상장치를 이용하여 정량되도록 허용하는데, 이것은 주사된 루시페라아제 기질, D-루시페린에 생체내 노출 시에 루시페라아제에 의해 생산된 생물발광 신호를 검출한다. 접종후 6 일자에, 이들 생쥐는 영상화되고 생물발광 영상화 (BLI)에 근거하여 연구 군으로 무작위화되었다. 접합체의 각 투여에 앞서 24 시간에, 이들 생쥐는 Kasumi-3 AML 세포 상에서 Fc 수용체를 차단하여 접합체의 비특이적 흡수를 예방하기 위해 400 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체가 복강내 (IP) 주사되었다. KASUMI-3 접종후 7 및 41 일자에, 이들 생쥐는 편측 꼬리 정맥에서 운반제, 10 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.80 mg/kg) huCD123-CysMab-D5, 3 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.240 mg/kg) huCD123-CysMab-D5 또는 10 μg/kg의 비표적화된 KTI-CysMab-D5 대조 접합체의 단일 IV 주사를 제공받았다. 접합체 투여후 5 및 10 일자에, 이들 생쥐는 AML 종양 세포 상에서 Fc 수용체의 지속된 차단을 담보하기 위해 100 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체의 IP 주사를 제공받았다.
생쥐는 Kasumi-3 접종후 11, 13, 17, 20, 24, 27, 31, 38, 41, 45, 52, 59, 66, 73 및 80 일자에 영상화되었다. 생체내 생물발광 영상화는 IVIS 50 광학적 영상화 (Xenogen, Alameda, CA)를 이용하여 Molecular Imaging (Ann Arbor, MI)에서 수행되었다. 동물은 ~1-2% 이소플루란 가스 마취 하에 한 번에 3회 영상화되었다. 각 생쥐는 150 mg/kg D-루시페린 (루시페라아제 기질)이 IP 주사되고, 그리고 주사 후 10 분에 복와위, 이후 앙와위에서 영상화되었다. CCD 칩의 크고 작은 비닝이 이용되었고, 그리고 이미지에서 각 생쥐에서 식별가능한 종양으로부터 최소한 수백 개 수치를 획득하고 CCD 칩의 포화를 방지하기 위해 노출 시간이 조정되었다 (2 초 내지 2 분). 이미지는 Matlab R2015a를 이용하여 분석되었다. 맞춤 스크립트가 전신 고정된-용적 ROIs를 각 개별 동물에 대한 복와위와 양와위 이미지 상에 배치하고, 그리고 동물 식별에 근거하여 표지화되었다. 전체 플럭스 (광양자/초)가 계산되고, 그리고 군 간에 분석을 용이하게 하기 위해 모든 ROIs에 대해 이출되었다. 전신 종양 부담을 추정하기 위해 복와위와 양와위 ROIs가 함께 합계되었다.
%T/C는 아래와 같이 계산되었다 = [(T, 처리군의 중앙 BLI)/ (C, 대조군의 중앙 BLI)] x 100%. NCI 표준에 따르면, T/C ≤ 42%는 항종양 활성의 최소 수준이고, 반면 > 42%의 T/C 값은 비활성이고, 그리고 <10 %의 T/C 값은 고도로 활성인 것으로 고려된다.
% 종양 부담 지연 (%TBD)은 아래와 같이 계산되었다: %TBD = (T-C)/C x 100%, 여기서 T-C, 여기서 T는 지정된 BLI 신호를 달성하기 위한 처리군에 대한 시간 (일자에서)이고, 그리고 C는 대조군에 대한 시간 (일자에서)이다. %ILS에 적용된 동일한 메트릭스를 조정하여, 우리는 %TBD > 25를 최소한으로 활성으로서, %TBD > 40을 활성으로서, 그리고 %TBD > 50을 고도로 활성으로서 고려한다.
생쥐는 주 2회 계량되고, 그리고 연구의 지속 기간 내내 임상적 징후에 대해 모니터링되었다. 안락사 규준에 도달하는 임의의 생쥐는 안락사되었다. 자발적 사망은 그들이 발견될 때 기록되었다. 연구는 종양 세포 접종후 115 일자에 종결되었다.
예비적 실험은 어느 한쪽 용량의 huCD123-CysMab-D5로 처리는 시간의 추이에서 종양 부담의 초기 퇴행을 유발하고 27 일자에 최저점에 도달하지만, 운반제- 및 KTI-CysMab-D5 -처리군에서는 이러한 기간 동안 종양 부담이 꾸준히 증가했다는 것을 보여준다. 가령, 도면 22를 참조한다. 이들 예비적 실험에 대해 계산된 종양 성장 저해 (T/C 값)는 10 μg/kg 및 3 μg/kg의 huCD123-CysMab-D5가 각각, 0.20 및 0.25의 %T/C 값으로 27 일자에 고도로 활성이라는 것을 보여주었다. % 종양 부담 지연 (%TBD)은 또한, 운반제-처리군의 45 일자에 BLI 신호를 지정된 BLI로서 이용하여 계산되었다. 이러한 계량에 따라, 양쪽 용량의 huCD123-CysMab-D5는 고도로 활성이고, 10 μg/kg의 KTI-CysMab-D5 대조 접합체에서 목격된 0% TBD와 대조적으로 > 75% (10 μg/kg huCD123-CysMab-D5) 및 > 65% (3 μg/kg huCD123-CysMab-D5)의 %TBD를 유발하였다. 이에 더하여, 3 μg/kg 및 10 μg/kg 용량 둘 모두에서 huCD123-CysMab-D5로 처리는 대조와 비교하여 P53 돌연변이된 및 다제 내성 AML을 앓는 6/6 생쥐에서 생존을 연장하였다 (도면 23을 참조한다).
연구의 종결점에서 4가지 연구 군 각각에 대한 생존은 도면 31에서 제공되고 아래의 표에서 요약된다. 운반제로 처리된 생쥐는 70 일의 중앙 생존을 가졌다. 대조적으로, 10 μg/kg (D5에 의해, huCD123에 의해 0.80 mg/kg)의 huCD123-CysMab-D5로 처리된 생쥐는 115 일의 중앙 생존을 갖고, 64% ILS (고도로 활성)를 유발하였다. 유사하게, 3 μg/kg (D5에 의해, huCD123에 의해 0.240 mg/kg)의 huCD123-CysMab-D5로 처리된 생쥐는 105 일의 중앙 생존 시간을 갖고, 50% ILS (고도로 활성)를 유발하였다. 10 μg/kg (D5에 의해)의 huKTI-CysMab-D5 비표적화된 대조 접합체로 처리된 생쥐는 65.5 일의 중앙 생존을 갖고, 0% ILS (비활성)를 산출하였는데, 이것은 huCD123-CysMab-D5로 획득된 높은 활성이 CD123-의존성이라는 것을 지시한다.
Figure 112018009762973-pct00732
N = 6의 경우에, 중앙 생존 (일자)는 3번째 및 4번째 생쥐가 상실될 때 일자의 평균이다. 중앙 생존 값을 이용하여, % ILS (증가된 수명)는 아래와 같이 계산된다: %ILS = (T-C)/C x 100%, 여기서 T는 처리군의 중앙 생존 (일자에서)이고, 그리고 C는 대조군의 중앙 생존 (일자에서)이다. 파종성 모형에 대한 NCI 표준은 아래와 같다: ILS ≥ 25%는 최소한으로 활성이고, ILS > 40%는 활성이고, 그리고 ILS ≥ 50%는 고도로 활성이다.
실시예 25 . huCD123-CysMab-D5 접합체는 S-시기에서 DNA 손상 선도 세포 주기 정지 및 MV4-11 세포의 아폽토시스-매개된 세포 사멸을 유도한다
huCD123-CysMab-D5-매개된 세포 사멸의 기전을 평가하기 위해, CD123-발현 MV4-11 AML 세포는 1 시간 동안 10 nM의 huCD123-CysMab-D5로 처리되고, 그 이후에 37℃에서 48 시간 동안 접합체-없는 배양 배지에서 추가 배양되었다. 처리되지 않은 MV4-11 세포는 대조로서 이용되었다. 이들 세포는 수확되고, 그리고 세포 주기의 상이한 시기에서 세포 (프로피디움 요오드화물), DNA 손상을 갖는 세포 (pH2AX), 아폽토시스를 갖는 세포 (아넥신-V 및 개열된 카스파제-3) 및 천공된 원형질막을 갖는 세포 (TO-PRO-3)의 숫자를 정량하기 위한 다양한 시약으로 염색되었다. 도면 24에서 증명된 바와 같이, huCD123-CysMab-D5와 함께 MV4-11 세포의 배양은 DNA 손상, 세포 주기의 S-시기에서 정지, 그리고 아폽토시스-매개된 세포 사멸을 야기한다.
실시예 26: Molm-13 파종성 모형에서 huCD123-CysMab-D5의 생체내 효력
모든 파종성 모형에 대한 데이터 수집 및 분석: 생쥐는 주 2회 계량되고, 그리고 연구의 지속 기간 내내 임상적 징후에 대해 모니터링되었다. 계측된 종결점은 생존이었다. 동물은 뒷다리 마비가 나타나거나, 체중이 처리전 체중의 >20% 감소하거나, 가시적인 종양이 나타나거나, 또는 괴로움의 임의의 징후가 가시적일 때 안락사되었다. 자발적 사망은 그들이 발견될 때 기록되었다. 파종성 모형의 경우에, 종양 성장 지연은 T-C로서 계산되는데, 여기서 T는 처리군의 중앙 생존 시간 (일자에서)이고, 그리고 C는 운반제 대조군의 중앙 생존 시간 (일자에서)이다. 파종성 모형에 대한 퍼센트 증가된 수명 (%ILS)은 아래의 공식을 이용하여 계산된다: %ILS = (T-C) / C x 100%. 항종양 활성은 파종성 모형에 대한 NCI 표준에 따라 평가되었다: ILS ≥ 25%는 최소 활성이고, ILS > 40%는 활성이고, 그리고 ILS ≥ 50%는 고도로 활성이다.
생체내에서 종양 부담을 감소시키는 능력에 대한 huCD123-CysMab-D5의 효력을 시험하기 위해, 파종성 종양 모형이 아래의 프로토콜에서 설명된 바와 같이 이용되었다.
암컷 무흉선 누드 생쥐는 각각, 100 μl의 혈청 없는 배지에서 10x106 Molm-13 세포, 인간 AML 세포주가 편측 꼬리 정맥에서 정맥내 주사되었다. 접종후 7 일자에, 생쥐는 연구 군으로 무작위화되었다. 접합체 투여에 앞서 24 시간에, 생쥐는 Molm-13 AML 세포 상에서 Fc 수용체를 차단하여 접합체의 비특이적 흡수를 예방하기 위해 400 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체가 복강내 주사되었다. Molm-13 접종후 7 일자에, 생쥐는 편측 꼬리 정맥에서 운반제, 0.1 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.008 mg/kg) huCD123-CysMab-D5, 0.3 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.024 mg/kg) huCD123-CysMab-D5, 1 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.08 mg/kg) huCD123-CysMab-D5, 1 μg/kg (D5에 의해; huKTI에 의해 0.08 mg/kg) huKTI-CysMab-D5 대조 접합체, 0.1 μg/kg (D2에 의해; huCD123에 의해 0.0059 mg/kg) huCD123-리신 연결된-D2, 0.3 μg/kg (D2에 의해; huCD123에 의해 0.018 mg/kg) huCD123-리신 연결된-D2, 1 μg/kg (D2에 의해; huCD123에 의해 0.059 mg/kg) huCD123-리신 연결된-D2 또는 1 μg/kg (D2에 의해; chKTI에 의해 0.059 mg/kg) chKTI-리신 연결된-D2 대조 접합체의 단일 정맥내 주사를 제공받았다. 접합체 투여후 4 및 9 일자에, 생쥐는 AML 종양 세포 상에서 Fc 수용체의 지속된 차단을 담보하기 위해 100 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체의 복강내 주사를 제공받았다. 결과는 아래의 표 및 도면 25에서 요약된다.
huCD123-CysMab-D5 접합체는 시험된 3가지 용량 모두에서 고도로 활성이었고 > 262.5 일의 %ILS를 각각 산출하였다. 대조적으로, 1 μg/kg (D5에 의해) 용량의 비표적화된 huKTI-CysMab-D5 대조 접합체는 비활성이었고 0% ILS를 산출하였다. 이것은 huCD123-CysMab-D5의 CD123-의존성 활성을 증명한다. 유사하게, huCD123-리신 연결된-D2는 시험된 3가지 용량 모두에서 고도로 활성이었고 > 59의 %ILS를 각각 산출하였다. 하지만, 1 μg/kg (D2에 의해) 용량의 chKTI-리신 연결된-D2 비표적화된 대조 접합체 또한 비활성이었고 11% ILS를 산출하였는데, 이것은 huCD123-리신 연결된-D2의 CD123-의존성 활성을 증명한다. huCD123-CysMab-D5 및 huCD123-리신 연결된-D2 사이에 한 가지 명백한 차이는 시험된 가장 낮은 용량인 0.1 μg/kg 용량의 각 CD123-표적화된 접합체로 획득된 %ILS를 비교할 때 목격될 수 있다. 0.1 μg/kg의 huCD123-CysMab-D5로 획득된 % ILS는 262.5 일이고, 반면 0.1 μg/kg 용량의 huCD123-리신 연결된-D2로 획득된 것은 59 일인데, 이것은 이러한 모형에서 huCD123-CysMab-D5의 우월성을 지시한다.
Figure 112018009762973-pct00733
실시예 27. EOL -1 피하 모형에서 huCD123 - CysMab - D5 의 생체내 효력
모든 피하 모형에 대한 데이터 수집 및 분석: 생쥐는 주 2회 계량되고, 그리고 연구의 지속 기간 내내 임상적 징후에 대해 모니터링되었다. 동물은 뒷다리 마비가 나타나거나, 체중이 처리전 체중의 >20% 감소하거나, 종양 궤양형성이 발생하거나, 또는 괴로움의 임의의 징후가 가시적일 때 안락사되었다. 종양 체적은 캘리퍼스를 이용하여 3차원에서 주 1회 내지 2회 계측되었다. 종양 체적은 공식 V = 길이 x 너비 x 높이 x 1/2 (Tomayko and Reynolds, Cancer Chemother. Pharmacol. 24: 148-54 (1989))를 이용하여 mm3에서 표시되었다. 활성은 Bissery et al., Cancer Res. 51: 4845-52 (1991)에서 설명된 바와 같이 사정되었다. 종양 성장 저해 (T/C 값) 또한, 아래의 공식을 이용하여 사정되었다: T/C (%) = (처리된 개체의 중앙 종양 체적 / 대조의 중앙 종양 체적) x 100%. 종양 체적은 운반제 대조의 종양 체적이 미리 결정된 크기에 도달할 때, 처리된 (T) 군 및 운반제 대조 (C) 군에 대해 동시에 결정되었다 (Bissery et al., Cancer Res. 51: 4845-52 (1991). 종양-없는 생쥐 (0 mm3)를 비롯하여, 각 처리군의 일일 중앙 종양 체적이 결정되었다. NCI 표준에 따르면, T/C ≤ 42%는 항종양 활성의 최소 수준이다. T/C < 10%은 높은 항종양 활성 수준인 것으로 고려된다.
생체내에서 종양 부담을 감소시키는 능력에 대한 huCD123-CysMab-D5의 효력을 시험하기 위해, 피하 종양 모형에서 3가지 연구가 아래의 프로토콜에서 설명된 바와 같이 이용되었다.
첫 번째 연구에서, 암컷 무흉선 누드 생쥐는 각각, 100 μl 혈청 없는 배지/매트리겔에서 10x106 EOL-1 세포, 인간 AML 세포주가 오른쪽 옆구리에서 피하 접종되었다. EOL-1 접종후 6 일자에, 생쥐는 연구 군으로 무작위화되었다. 접합체 투여에 앞서 24 시간에, 생쥐는 EOL-1 AML 세포 상에서 Fc 수용체를 차단하여 접합체의 비특이적 흡수를 예방하기 위해 400 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체가 복강내 주사되었다. EOL-1 접종후 7 일자에, 생쥐는 편측 꼬리 정맥에서 운반제, 1 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.08 mg/kg) huCD123-CysMab-D5, 3 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.24 mg/kg) huCD123-CysMab-D5, 1 μg/kg (D2에 의해; huCD123에 의해 0.050 mg/kg) huCD123-리신 연결된-D2, 3 μg/kg (D2에 의해, huCD123에 의해 0.151 mg/kg) huCD123-리신 연결된-D2, 1 μg/kg (D5에 의해; huKTI에 의해 0.08 mg/kg) huKTI-CysMab-D5 대조 접합체, 3 μg/kg (D5에 의해; huKTI에 의해 0.24 mg/kg) huKTI-CysMab-D5 대조 접합체, 1 μg/kg (D2에 의해; chKTI에 의해 0.050 mg/kg) chKTI-리신 연결된-D2 또는 3 μg/kg (D2에 의해; chKTI에 의해 0.151 mg/kg) chKTI-리신 연결된-D2 대조 접합체의 단일 정맥내 주사를 제공받았다. 접합체 투여후 4 및 9 일자에, 생쥐는 AML 종양 세포 상에서 Fc 수용체의 지속된 차단을 담보하기 위해 100 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체의 복강내 주사를 제공받았다. 결과는 아래의 표 및 도면 26에서 대표된다.
1 μg/kg (D5에 의해) 및 3 μg/kg 용량의 huCD123-CysMab-D5는 각각, 활성 및 고도로 활성이었고 13% (3/6 CRs) 및 2% T/C (5/6 CRs)를 각각 산출하였다. 대조적으로, 1 μg/kg (D5에 의해) 및 3 μg/kg 용량의 huKTI-CysMab-D5 비표적화된 대조 접합체는 ≥ 73의 % T/C로 비활성이었는데, 이것은 huCD123-CysMab-D5의 활성이 CD123-의존성이라는 것을 증명하였다. 1 μg/kg (D2에 의해) 및 3 μg/kg 용량의 huCD123-리신 연결된-D2는 각각, 활성 및 고도로 활성이었고 30% (1/6 CRs) 및 1% (6/6 CRs)를 각각 산출하였다. 대조적으로, 1 μg/kg (D2에 의해) 및 3 μg/kg 용량의 chKTI-리신 연결된-D2 비표적화된 대조 접합체는 둘 모두 비활성이었고 75% T/C (0/6 CRs) 및 81% T/C (0/6 CRs)를 각각 산출하였다. 이것은 huCD123-리신 연결된-D2의 활성이 CD123-의존성이었다는 것을 증명한다. 이들 두 CD123-표적화 접합체 사이에 차이는 1 μg/kg (D5에 의해)의 huCD123-CysMab-D5를 1 μg/kg (D2에 의해)의 huCD123-리신 연결된-D2와 비교할 때, 전자가 13% T/C 및 3/6 CRs를 유발하고 후자가 30% T/C 및 단지 1/6 CR만을 유발한다는 점에서 명확해지고, 이러한 모형에서 huCD123-CysMab-D5의 명확한 우월성을 증명한다.
Figure 112018009762973-pct00734
두 번째 연구에서, 암컷 무흉선 누드 생쥐는 각각, 100 μl 혈청 없는 배지/매트리겔에서 10x106 EOL-1 세포, 인간 AML 세포주가 오른쪽 옆구리에서 피하 접종되었다. EOL-1 접종후 6 일자에, 생쥐는 연구 군으로 무작위화되었다. 접합체 투여에 앞서 24 시간에, 생쥐는 EOL-1 AML 세포 상에서 Fc 수용체를 차단하여 접합체의 비특이적 흡수를 예방하기 위해 400 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체가 복강내 주사되었다. EOL-1 접종후 7 일자에, 생쥐는 편측 꼬리 정맥에서 운반제, 0.5 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.04 mg/kg) huCD123-CysMab-D5 또는 1 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.08 mg/kg) huCD123-CysMab-D5의 단일 정맥내 주사를 제공받았다. 접합체 투여후 4 및 9 일자에, 생쥐는 AML 종양 세포 상에서 Fc 수용체의 지속된 차단을 담보하기 위해 100 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체의 복강내 주사를 제공받았다. 결과는 아래의 표 및 도면 27에서 대표된다.
0.5 μg/kg (D5에 의해) 용량의 huCD123-CysMab-D5는 활성이었고 11% T/C 및 3/6 CRs를 산출하였다. 유사하게, 1 μg/kg 용량의 huCD123-CysMab-D5는 고도로 활성이었고 3% T/C 및 6/6 CRs를 산출하였다.
Figure 112018009762973-pct00735
세 번째 연구에서, 암컷 무흉선 누드 생쥐는 각각, 100 μl 혈청 없는 배지/매트리겔에서 10x106 EOL-1 세포, 인간 AML 세포주가 오른쪽 옆구리에서 피하 접종되었다. EOL-1 접종후 6 일자에, 생쥐는 연구 군으로 무작위화되었다. 접합체 투여에 앞서 24 시간에, 생쥐는 EOL-1 AML 세포 상에서 Fc 수용체를 차단하여 접합체의 비특이적 흡수를 예방하기 위해 400 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체가 복강내 주사되었다. EOL-1 접종후 7 일자에, 생쥐는 편측 꼬리 정맥에서 운반제, 3 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.24 mg/kg) huCD123-CysMab-D5, 3 μg/kg (D5에 의해) FGN849 (유상하중의 유리 약물 형태), 0.24 mg/kg 비접합된 (나신) huCD123 항체, 또는 3 μg/kg (D5에 의해; huKTI에 의해 0.24 mg/kg) huKTI-CysMab-D5 대조 접합체의 단일 정맥내 주사를 제공받았다. 시타라빈으로 처리된 생쥐는 EOL-1 접종후 7, 8, 9, 10 및 11 일자에 단일 복강내 주사를 제공받았고, 그리고 아자시티딘으로 처리된 생쥐는 EOL-1 접종후 7, 10, 13, 16 및 19 일자에 단일 복강내 주사를 제공받았다. 접합체 투여후 4 및 9 일자에, 생쥐는 AML 종양 세포 상에서 Fc 수용체의 지속된 차단을 담보하기 위해 100 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체의 복강내 주사를 제공받았다. 결과는 아래의 표 및 도면 28에서 대표된다.
시험된 모든 물품 중에서, 단지 3 μg/kg (D5에 의해) 용량의 huCD123-CysMab-D5만 69% T/C 및 0/8 CRs를 산출한 3 μg/kg (D5에 의해) 용량의 huKTI-CysMab-D5 비표적 대조 접합체와 대조적으로, 활성을 보였고 고도로 활성 1 %T/C 및 8/8 CRs를 산출하였다. 3 μg/kg (D5에 의해) 용량의 접합되지 않은 유리 약물, FGN849 또한 92 % T/C 및 0/8 CRs로 비활성이었다. 유사하게, huCD123-CysMab-D5의 항체 용량과 정합하는 0.24 mg/kg 용량의 접합되지 않은 ("나신") huCD123 항체는 60% T/C 및 0/8 CRs로 비활성이었다. 5 일 동안 하루 75 mg/kg의 용량에서 투여된 시타라빈은 84% T/C 및 0/8 CRs로 비활성이었다. 5회 투약을 위해 3 일마다 1회 3.75 mg/kg의 용량에서 투여된 아자시티딘은 59% T/C 및 0/8 CRs로 비활성이었다.
Figure 112018009762973-pct00736
실시예 28. MV4-11 파종성 모형에서 huCD123-CysMab-D5 및 huCD123-SeriMab-sD1의 생체내 효력
생체내에서 종양 부담을 감소시키는 능력에 대한 huCD123-CysMab-D5 및 huCD123-SeriMab-sD1의 효력을 시험하기 위해, 파종성 종양 모형이 아래의 프로토콜에서 설명된 바와 같이 이용되었다.
암컷 NOD SCID 생쥐는 MV4-11 세포의 이식을 향상시키기 위해 골수를 부분적으로 제거하는 150 mg/kg 시클로포스파미드로 사전 처리되었다. 시클로포스파미드 (Baxter, 로트 #4E011, Exp 05.2017)가 0.9% NaCl로 재구성되고, 그리고 0 일자에 MV4-11 세포 접종에 앞서 -3 및 -2 일자에 생쥐에 복강내 투여되었다. 앞서 설명된 바와 같은 시클로포스파미드 처리 이후에, 생쥐는 각각, 100 μl의 혈청 없는 배지에서 3x106 MV4-11 세포, 인간 AML 세포주가 편측 꼬리 정맥에서 정맥내 주사되었다. MV4-11 접종후 7 일자에, 생쥐는 연구 군으로 무작위화되었다. 접합체 투여에 앞서 24 시간에, 생쥐는 MV4-11 AML 세포 상에서 Fc 수용체를 차단하여 접합체의 비특이적 흡수를 예방하기 위해 400 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체가 복강내 주사되었다. MV4-11 접종후 7 일자에, 생쥐는 편측 꼬리 정맥에서 운반제, 1 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.08 mg/kg) huCD123-CysMab-D5, 3 μg/kg (D5에 의해; 0.24 mg/kg huCD123) huCD123-CysMab-D5, 1 μg/kg (D1에 의해; huCD123에 의해 0.054 mg/kg) huCD123-SeriMab-sD1, 3 μg/kg (D1에 의해; huCD123에 의해 0.163 mg/kg) huCD123-SeriMab-sD1, 1 μg/kg (D5에 의해; huKTI에 의해 0.08 mg/kg) huKTI-CysMab-D5 대조 접합체, 3 μg/kg (D5에 의해; huKTI에 의해 0.24 mg/kg) huKTI-CysMab-D5 대조 접합체, 1 μg/kg (D1에 의해; chKTI에 의해 0.07 mg/kg) chKTI-SeriMab-sD1 대조 접합체 또는 3 μg/kg (D1에 의해; chKTI에 의해 0.21 mg/kg) chKTI-SeriMab-sD1 대조 접합체의 단일 정맥내 주사를 제공받았다. 결과는 아래의 표 및 도면 29에서 요약된다.
1 μg/kg 및 3 μg/kg (D5에 의해) 용량의 huCD123-CysMab-D5 둘 모두 고도로 활성이었고 ≥ 70의 %ILS를 각각 산출하였다. 대조적으로, 1 μg/kg 용량 (D5에 의해)의 huKTI-CysMab-D5 비표적화된 대조 접합체는 최소한으로 활성이었고 28% ILS를 산출하였다. 3 μg/kg 용량의 huKTI-CysMab-D5는 0% ILS로 비활성이었는데, 이것은 huCD123-CysMab-D5의 CD123-의존성 활성을 증명하였다. 1 μg/kg 및 3 μg/kg (sD1에 의해) 용량의 huCD123-SeriMab-sD1은 둘 모두 고도로 활성이었고 ≥ 101의 %ILS를 각각 산출하였다. 하지만, 비표적화된 chKTI-SeriMab-sD1 대조 접합체의 활성이 조사될 때, 높은 정도의 비특이적, 비-CD123-표적화된 활성이 65% ILS (고도로 활성)를 산출하는 3 μg/kg 용량 (sD1에 의해)으로부터 명백하다. 이것은 3 μg/kg (sD1에 의해) 용량의 CD123-표적화 huCD123-SeriMab-sD1의 높은 활성 중에서 일부가 아마도, CD123을 표적화하는 것을 수반하지 않는 비특이적 약물 흡수 기전에 기인한다는 것을 지시한다. 대조적으로, 1 μg/kg (sD1에 의해) 용량의 chKTI-SeriMab-sD1 대조 접합체는 15의 %ILS로 비활성인데, 이것은 3 μg/kg 용량의 chKTI-SeriMab-sD1의 비특이적 활성이 용량 의존성이고, 그리고 1 μg/kg (sD1에 의해) 용량의 huCD123-SeriMab-sD1의 높은 활성이 실제로 CD123-의존성이라는 것을 증명한다.
Figure 112018009762973-pct00737
실시예 29. MV4 -11 피하 모형에서 huCD123 - CysMab - D5 및 huCD123 - SeriMab -sD1의 생체내 효력
생체내에서 종양 부담을 감소시키는 능력에 대한 huCD123-CysMab-D5 및 huCD123-SeriMab-sD1의 효력을 시험하기 위해, 피하 종양 모형이 아래의 프로토콜에서 설명된 바와 같이 이용되었다.
암컷 CB.17 SCID 생쥐는 각각, 100 μl 혈청 없는 배지/매트리겔에서 10x106 MV4-11 세포, 인간 AML 세포주가 오른쪽 옆구리에서 피하 접종되었다. MV4-11 접종후 14 일자에, 생쥐는 연구 군으로 무작위화되었다. 접합체 투여에 앞서 24 시간에, 생쥐는 MV4-11 AML 세포 상에서 Fc 수용체를 차단하여 접합체의 비특이적 흡수를 예방하기 위해 400 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체가 복강내 주사되었다. MV4-11 접종후 15 일자에, 생쥐는 편측 꼬리 정맥에서 운반제, 0.3 μg/kg (D1에 의해; huCD123에 의해 0.016 mg/kg) huCD123-SeriMab-sD1, 1 μg/kg (D1에 의해; huCD123에 의해 0.054 mg/kg) huCD123-SeriMab-sD1, 3 μg/kg (D1에 의해; huCD123에 의해 0.16 mg/kg) huCD123-SeriMab-sD1, 0.3 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.024 mg/kg) huCD123-CysMab-D5, 1 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.08 mg/kg) huCD123-CysMab-D5, 3 μg/kg (D5에 의해; huCD123에 의해 0.24 mg/kg) huCD123-CysMab-D5, 0.3 μg/kg (D1에 의해; chKTI에 의해 0.021 mg/kg) chKTI-SeriMab-sD1 대조 접합체, 1 μg/kg (D1에 의해; chKTI에 의해 0.07 mg/kg) chKTI-SeriMab-sD1 대조 접합체, 3 μg/kg (D1에 의해; chKTI에 의해 0.21 mg/kg) chKTI-SeriMab-sD1 대조 접합체, 0.3 μg/kg (D5에 의해; huKTI에 의해 0.024 mg/kg) huKTI-CysMab-D5 대조 접합체, 1 μg/kg (D5에 의해; huKTI에 의해 0.08 mg/kg) huKTI-CysMab-D5 대조 접합체 또는 3 μg/kg (D5에 의해; huKTI에 의해 0.24 mg/kg) huKTI-CysMab-D5 대조 접합체의 단일 정맥내 주사를 제공받았다. MV4-11 접종후 20 일자에, 생쥐는 AML 종양 세포 상에서 Fc 수용체의 지속된 차단을 담보하기 위해 100 mg/kg의 비표적화된 chKTI 항체가 복강내 주사되었다. 결과는 아래의 표 및 도면 30에서 대표된다.
1 μg/kg 및 3 μg/kg (sD1에 의해) 용량의 huCD123-SeriMab-sD1은 둘 모두 고도로 활성이었고 0 및 6/6 CRs의 %T/C를 각각 산출하였다. 시험된 가장 낮은 huCD123-SeriMab-sD1 용량, 0.3 μg/kg (sD1에 의해)은 43 및 0/6 CRs의 %T/C로 비활성이었다. 하지만, 비표적화된 chKTI-SeriMab-sD1 대조 접합체의 활성이 조사될 때, 높은 정도의 비특이적, 비-CD123-표적화된 활성이 6 %T/C (고도로 활성) 및 3/6 CRs를 산출하는 3 μg/kg 용량 (sD1에 의해)으로부터 명백하다. 이것은 3 μg/kg (sD1에 의해) 용량의 CD123-표적화 huCD123-SeriMab-sD1의 높은 활성 중에서 일부가 아마도, CD123을 표적화하는 것을 수반하지 않는 비특이적 약물 흡수 기전에 기인한다는 것을 지시한다. 대조적으로, 1 μg/kg (sD1에 의해) 및 0.3 μg/kg 용량의 chKTI-SeriMab-sD1 대조 접합체 둘 모두 비활성이었고 73% T/C 및 83% T/C를 각각 산출하였는데, 이것은 3 μg/kg 용량 (sD1에 의해)의 chKTI-SeriMab-sD1의 높은 비특이적 활성이 용량 의존성이고, 그리고 1 μg/kg (sD1에 의해) 용량의 huCD123-SeriMab-sD1의 높은 활성이 실제로 CD123-의존성이라는 것을 증명한다.
1 μg/kg 및 3 μg/kg (D5에 의해) 용량의 huCD123-CysMab-D5는 둘 모두 고도로 활성이었고 0% T/C, 그리고 5/6 및 6/6 CRs를 각각 산출하였다. 시험된 가장 낮은 용량, 0.3 μg/kg (D5에 의해) 용량의 huCD123-CysMab-D5는 69% T/C 및 0/6 CRs로 비활성이었다. 대조적으로, 3가지 용량 (D5에 의해)의 huKTI-CysMab-D5 비표적화된 대조 접합체 모두 비활성이었고 ≥ 43% T/C 및 0/6 CRs를 각각 산출하였다; 이것은 huCD123-CysMab-D5의 CD123-의존성 활성을 증명하였다.
Figure 112018009762973-pct00738
실시예 30. 생쥐에서 huCD123-IGN 접합체의 생체내 내약성
생체내에서 huCD123-CysMab-D5 및 다른 huCD123-IGN 접합체의 내약성을 시험하기 위해, 생쥐 모형이 아래의 프로토콜에서 설명된 바와 같이 이용되었다.
암컷 CD-1 생쥐는 편측 꼬리 정맥 내로 운반제, 150 μg/kg (D5에 의해, huCD123에 의해 12 mg/kg)의 huCD123-CysMab-D5, 125 μg/kg (D5에 의해, huCD123에 의해 10 mg/kg)의 huCD123-CysMab-D5, 100 μg/kg (D5에 의해, huCD123에 의해 8 mg/kg)의 huCD123-CysMab-D5, 150 μg/kg (sD1에 의해, huCD123에 의해 14.3 mg/kg)의 huCD123-SeriMab-sD1 또는 125 μg/kg (sD1에 의해, huCD123에 의해 11.9)의 huCD123-SeriMab-sD1의 단일 정맥내 주사를 제공받았다. huCD123 항체는 생쥐 CD123와 교차반응하지 않는데, 이것은 이러한 생체내 생쥐 모형을 유일한 부정확한 독성의 지표로 만든다. 생쥐는 33 일 동안 매일 관찰되고, 그리고 체중이 결정되었다. 동물이 20%보다 큰 체중 감소를 경험하거나 또는 빈사 상태가 되면, 이들 동물은 안락사되었다. 체중 감소 이외에, 임의의 치료에서 연구의 경과 동안 어떤 다른 임상적 결과도 관찰되지 않았다.
암컷 CD-1 생쥐는 편측 꼬리 정맥 내로 운반제, 75 μg/kg (D2에 의해, huCD123에 의해 4.4 mg/kg)의 huCD123-리신 연결된-D2, 100 μg/kg (D2에 의해, huCD123에 의해 5.9 mg/kg)의 huCD123-리신 연결된-D2 또는 125 μg/kg (D2에 의해, huCD123에 의해 7.4 mg/kg)의 huCD123-리신 연결된-D2의 단일 정맥내 주사를 제공받았다. huCD123 항체는 생쥐 CD123와 교차반응하지 않는데, 이것은 이러한 생체내 생쥐 모형을 유일한 부정확한 독성의 지표로 만든다. 생쥐는 22 일 동안 매일 관찰되고, 그리고 체중이 결정되었다. 동물이 20%보다 큰 체중 감소를 경험하거나 또는 빈사 상태가 되면, 이들 동물은 안락사되었다.
결과는 아래의 표 및 도면 32와 33에서 요약된다.
huCD123-CysMab-D5는 150 μg/kg (D5에 의해, huCD123에 의해 12 mg/kg)에서 용인되지 않았다. 체중에서 평균 변화의 최저점은 11% 감소로 12 일자에 일어났다. 8마리 생쥐 중에서 1마리가 > 20% 체중 감소로 인해 12 일자에 안락사되었다. huCD123-CysMab-D5는 125 μg/kg (D5에 의해, huCD123에 의해 10 mg/kg)에서 충분히 용인되지 않았다. 체중에서 평균 변화의 최저점은 8.6% 감소로 10 일자에 일어났다. 8마리 생쥐 중에서 1마리가 체중 감소로 인해 9 일자에 안락사되었다. huCD123-CysMab-D5는 100 μg/kg (D5에 의해, huCD123에 의해 8 mg/kg)에서 용인되지 않았다. 체중에서 평균 변화의 최저점은 7% 감소로 6 일자에 일어났다. 이러한 처리군에서 어떤 생쥐도 체중 감소로 인해 안락사되지 않았다.
huCD123-SeriMab-sD1은 150 μg/kg (huCD123에 의해 14.3 mg/kg)에서 용인되지 않았다. 체중에서 평균 변화의 최저점은 17.3% 감소로 10 일자에 일어났다. 8마리 생쥐 중에서 2마리가 체중 감소로 인해 10 일자에 안락사되었다. huCD123-SeriMab-sD1은 125 μg/kg (sD1에 의해, huCD123에 의해 11.9 mg/kg)에서 충분히 용인되지 않았다. 체중에서 평균 변화의 최저점은 6.7% 감소로 10 일자에 일어났다. 8마리 생쥐 중에서 1마리가 체중 감소로 인해 12 일자에 안락사되었다.
huCD123-리신 연결된-D2는 75 μg/kg (D2에 의해, huCD123에 의해 4.4 mg/kg)에서 용인되었다. 체중에서 평균 변화의 최저점은 6% 감소로 5 일자에 일어났다. 이러한 처리군에서 어떤 생쥐도 체중 감소로 인해 안락사되지 않았다. huCD133-리신 연결된-D2는 100 μg/kg (D2에 의해, huCD123에 의해 5.9 mg/kg)에서 용인되었다. 체중에서 평균 변화의 최저점은 8% 감소로 7 일자에 일어났다. 이러한 처리군에서 어떤 생쥐도 체중 감소로 인해 안락사되지 않았다. huCD123-리신 연결된-D2는 125 μg/kg (D2에 의해, huCD123에 의해 7.4 mg/kg)에서 용인되지 않았다. 체중에서 평균 변화의 최저점은 17% 감소로 9 일자에 일어났다 (N = 6일 때). 본래 8마리 중에서 아래의 숫자의 생쥐가 > 20% 체중 감소로 인해 지시된 일자에 안락사되었다: 8 일자에 1마리, 9 일자에 1마리, 10 일자에 2마리, 11 일자에 1마리 및 13 일자에 1마리.
Figure 112018009762973-pct00739
SEQUENCE LISTING <110> IMMUNOGEN, INC. <120> ANTI-CD123 ANTIBODIES AND CONJUGATES AND DERIVATIVES THEREOF <130> 121162-02820 <150> 62/346,730 <151> 2016-06-07 <150> 62/338,203 <151> 2016-05-18 <150> 62/186,161 <151> 2015-06-29 <160> 97 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Ser Tyr Val Met His 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Tyr Ile Lys Pro Tyr Lys Asp Gly Thr Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 Tyr Ile Lys Pro Tyr Lys Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Glu Gly Glu Asn Gly Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 5 Ser Ser Ile Met His 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 6 Tyr Ile Lys Pro Tyr 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Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 87 Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Ile Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 50 55 60 <210> 88 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 88 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 50 55 60 <210> 89 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 89 Gln Phe Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 50 55 60 <210> 90 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 90 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Lys Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 50 55 60 <210> 91 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 91 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala 50 55 60 <210> 92 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 92 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 1 5 10 15 Thr Ala Asn Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 20 25 30 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp 35 40 45 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 50 55 60 <210> 93 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 93 Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 1 5 10 15 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 20 25 30 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp 35 40 45 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 50 55 60 <210> 94 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 94 Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser 1 5 10 15 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 20 25 30 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp 35 40 45 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 50 55 60 <210> 95 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synethetic Peptide <400> 95 Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Thr Ser 1 5 10 15 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 20 25 30 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp 35 40 45 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 50 55 60 <210> 96 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 96 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 1 5 10 15 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 20 25 30 Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 <210> 97 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 97 Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 1 5 10 15 Thr Ala Asn Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 20 25 30 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Asn Asp Tyr Tyr Asp Thr Met Asp 35 40 45 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 50 55 60

Claims (145)

  1. 다음을 포함하는 항-CD123 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (i) (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 번호: 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL);
    (ii) (a) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 번호: 6, 7, 8, 9 또는 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 19, 20 또는 72의 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 번호: 21 또는 71의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (iii) (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 번호: 13 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및 서열 번호: 15 또는 70의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL).
  2. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    a) 서열 번호: 34에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
  3. 제2항에 있어서, 서열 번호: 34의 N 말단으로부터 두 번째 잔기, Xaa는 Phe이거나, 또는 서열 번호: 34의 N 말단으로부터 두 번째 잔기, Xaa는 Val인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    a) 서열 번호: 34에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    b) 서열 번호: 37에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
  5. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    a) 서열 번호: 54에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역; 및
    b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
  6. 제5항에 있어서, 서열 번호: 54의 N 말단으로부터 두 번째 잔기, Xaa는 Phe이거나, 또는 서열 번호: 54의 N 말단으로부터 두 번째 잔기, Xaa는 Val인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    a) 서열 번호: 1에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 2 또는 3에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 4에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH); 및
    b) 서열 번호: 16에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 17에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 18에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL).
  8. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    a) 서열 번호: 5에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 6, 7, 8, 9 또는 10에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 11에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH); 및
    b) 서열 번호: 19 또는 20에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 21에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 22에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL).
  9. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    a) 서열 번호: 12에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 13 또는 14에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 15에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    b) 서열 번호: 23에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 24에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 25에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
  10. 제1항에 있어서, 서열 번호: 5에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 8에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 11에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호: 20에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 21에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 22에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 서열 번호: 34의 VH 서열 및 서열 번호: 35의 VL 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항에 있어서, 항체가 서열 번호: 54에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 및 서열 번호: 51에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 서열 번호: 54의 N 말단으로부터 두 번째 잔기, Xaa는 Val인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 VH 및 VL 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제13항 중에서 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 VH 및 VL 서열을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 세포.
  16. 제1항 내지 제13항 중에서 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 VH 및 VL 서열을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법에 있어서,
    (a) 상기 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드를 생산하는 세포를 배양하고;
    (b) 상기 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드를 상기 배양된 세포로부터 단리하는 것
    을 포함하는 방법.
  17. 다음의 화학식을 갖는 면역접합체:
    ,
    , 또는
    ,
    여기서:
    CBA는 서열 번호: 34에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 리신 잔기를 통해 CyL1, CyL2 또는 CyL3에 공유 연결되고;
    WL은 1 내지 20의 정수이고;
    CyL1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:,
    , 또는

    또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
    N 및 C 사이의 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이고;
    W'는 -NRe'이고,
    Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
    n은 2 내지 6의 정수이고;
    Rk는 -H 또는 -Me이고;
    Rx3은 (C1-C6)알킬이고;
    L'은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)- (B1'); 또는
    -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1- (B3');
    R5는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
    Ra 및 Rb는 각 경우에, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화가능 기 Q이고;
    m은 1 내지 6의 정수이고;
    Zs1은 다음의 화학식 중 한 가지에서 선택되고:
    (b1); (b2); (b3);
    (b4); (b5),
    (b6),
    (b7); (b8); (b9); 및
    (b10),
    여기서:
    q는 1 내지 5의 정수이고;
    M은 H+ 또는 양이온이고;
    CyL2는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    ; 또는
    ;
    또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
    N 및 C 사이의 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이고;
    Rx1 및 Rx2는 독립적으로 (C1-C6)알킬이고;
    Re는 -H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    W'는 -NRe'이고,
    Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
    n은 2 내지 6의 정수이고;
    Rk는 -H 또는 -Me이고;
    Zs1은 다음의 화학식 중 한 가지에서 선택되고:
    (b1); (b2); (b3);
    (b4); (b5),
    (b6),
    (b7); (b8); (b9); 및
    (b10),
    여기서:
    q는 1 내지 5의 정수이고;
    M은 -H+ 또는 양이온이고;
    CyL3은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    ,
    m'은 1 또는 2이고;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    Zs1은 다음의 화학식 중 한 가지에서 선택되고:
    (b1); (b2); (b3);
    (b4); (b5),
    (b6),
    (b7); (b8); 및 (b9),
    여기서:
    q는 1 내지 5의 정수이고;
    M은 H+ 또는 양이온이다.
  18. 다음의 화학식을 갖는 면역접합체:
    ;
    ;
    ; 또는
    ;
    여기서:
    CBA는 JCB' 기에 공유 연결된, 서열 번호: 34에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 37에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    WS는 1, 2, 3, 또는 4이고;
    JCB'는 서열 번호: 34에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 37에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 N 말단 상의 2-히드록시에틸아민 모이어티의 산화로부터 유래된 알데히드 기 및 Cys1, Cys2, Cys3 또는 Cys4 상의 알데히드 반응성 기를 반응시킴으로써 형성된 모이어티이고, 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    ; ; ; ; ; 또는 ,
    여기서 s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고; s2는 Cys1, Cys2, Cys3 또는 Cys4에 공유 연결된 부위이고;
    Cys1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    , 또는
    ;
    또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
    N 및 C 사이의 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이고, M은 H+ 또는 양이온이고;
    R5는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
    Zd1은 부재하거나, -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
    R9는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    Ra 및 Rb는 각 경우에, 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화가능 기 Q이고;
    r 및 r'는 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;
    W'는 -NRe'이고,
    Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
    n은 2 내지 6의 정수이고;
    Rk는 -H 또는 -Me이고;
    Rx3은 (C1-C6)알킬이고;
    L은 -NR9-(CRaRb)r"이거나 또는 부재하고;
    r"은 0 내지 6의 정수이고;
    Cys2는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    ; 또는
    ;
    또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
    N 및 C 사이의 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이고;
    M은 H+ 또는 양이온이고;
    Rx1은 (C1-C6)알킬이고;
    Re는 -H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    W'는 -NRe'이고,
    Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
    n은 2 내지 6의 정수이고;
    Rk는 -H 또는 -Me이고;
    Rx2는 (C1-C6)알킬이고;
    L1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:

    여기서:
    s3은 기 JCB'에 공유 연결된 부위이고;
    s4는 Cys2 상의 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
    Za2는 부재하거나, -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
    R9는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    Q는 H, 하전된 치환체 또는 이온화가능 기이고;
    Ra1, Ra2, Ra3, Ra4는 각 경우에, 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    q1 및 r1은 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고, 단서로서 q1 및 r1은 둘 모두 0은 아니고;
    Cys3은 다음의 화학식에 의해 대표되고:

    여기서:
    m'은 1 또는 2이고;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    L1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:

    여기서:
    s3은 기 JCB'에 공유 연결된 부위이고;
    s4는 Cys3 상의 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
    Za2는 부재하거나, -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
    R9는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    Q는 H, 하전된 치환체 또는 이온화가능 기이고;
    Ra1, Ra2, Ra3, Ra4는 각 경우에, 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    q1 및 r1은 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이고, 단서로서 q1 및 r1은 둘 모두 0은 아니고;
    Cys4는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    ,
    L1'은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    ; 또는
    ,
    여기서:
    s3은 JCB' 기에 공유 연결된 부위이고;
    s4는 Cys4 상의 -NMe- 기에 공유 연결된 부위이고;
    Zb1 및 Zb2는 둘 모두 부재하거나, 또는 Zb1 및 Zb2 중에서 하나는 부재하고 다른 하나는 -CH2-O- 또는 -O-CH2-이고;
    Zb1' 및 Zb2'는 각각 독립적으로 부재하거나, -CH2-O-, -O-CH2-, -NR9-C(=O)-CH2-, 또는 -CH2-C(=O)-NR9-이고;
    R9는 H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    n1 및 m1은 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;
    E1 및 E2 중에서 하나는 -C(=O)-이고 다른 하나는 -NR9-이거나; 또는 E1 및 E2 중에서 하나는 -C(=O)- 또는 -NR9-이고 다른 하나는 부재하고;
    P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
    Rb1, Rb2, Rb3, Rb4, Rb5 및 Rb6은 각 경우에, 각각 독립적으로 H 또는 (C1-C3)알킬이다.
  19. 다음의 화학식에 의해 대표되는 면역접합체:
    ;
    ; 또는
    ;
    여기서:
    CBA는 시스테인 잔기를 통해 CyC1, CyC2 또는 CyC3에 공유 연결된, 서열 번호: 54에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역 및 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    WC는 1 또는 2이고;
    CyC1은 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    ; 또는
    ,
    또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
    N 및 C 사이의 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이고, M은 H+ 또는 양이온이고;
    R5는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    P는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
    Ra 및 Rb는 각 경우에, 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화가능 기 Q이고;
    W'는 -NRe'이고,
    Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
    n은 2 내지 6의 정수이고;
    Rk는 -H 또는 -Me이고;
    Rx3은 (C1-C6)알킬이고;
    LC는 에 의해 대표되고, s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고, s2는 CyC1 상의 -C(=O)- 기에 공유 연결된 부위이고; 여기서:
    R19 및 R20은 각 경우에, 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    m"은 1 및 10 사이의 정수이고;
    Rh는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    CyC2는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    , 또는
    ,
    또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서:
    N 및 C 사이의 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 이것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이고, M은 H+ 또는 양이온이고;
    Rx1은 (C1-C6)알킬이고;
    Re는 -H 또는 (C1-C6)알킬이고;
    W'는 -NRe'이고;
    Re'는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
    n은 2 내지 6의 정수이고;
    Rk는 -H 또는 -Me이고;
    Rx2는 (C1-C6)알킬이고;
    LC'는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    ;
    ;
    여기서:
    s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고, s2는 CyC2 상의 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
    Z는 -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
    Q는 -H, 하전된 치환체 또는 이온화가능 기이고;
    R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 및 R22는 각 경우에, 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    q 및 r은 각 경우에, 독립적으로 0 및 10 사이의 정수이고;
    m 및 n은 각각 독립적으로 0 및 10 사이의 정수이고;
    Rh는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    P'는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
    CyC3은 다음의 화학식에 의해 대표되고:

    여기서:
    m'은 1 또는 2이고;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    LC'는 다음의 화학식에 의해 대표되고:
    ;
    ;
    여기서:
    s1은 CBA에 공유 연결된 부위이고; s2는 CyC3 상의 -S- 기에 공유 연결된 부위이고;
    Z는 -C(=O)-NR9-, 또는 -NR9-C(=O)-이고;
    Q는 H, 하전된 치환체, 또는 이온화가능 기이고;
    R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 및 R22는 각 경우에, 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    q 및 r은 각 경우에, 독립적으로 0 및 10 사이의 정수이고;
    m 및 n은 각각 독립적으로 0 및 10 사이의 정수이고;
    Rh는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    P'는 아미노산 잔기, 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이다.
  20. 제19항에 있어서, 다음의 화학식에 의해 대표되는 면역접합체:

    또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 CyC1은 다음의 화학식에 의해 대표된다:
    .
  21. 제20항에 있어서,
    Ra 및 Rb는 둘 모두 H이고;
    R5는 H 또는 Me이고;
    P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 내포하는 펩티드이고;
    -LC-는 다음의 화학식에 의해 대표되는 것인
    ,
    면역접합체.
  22. 제19항에 있어서, 다음의 화학식에 의해 대표되는 면역접합체:
    ; 또는
    ;
    또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 N 및 C 사이의 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고, 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -OH 또는 -SO3M이다.
  23. 다음의 화학식에 의해 대표되는 면역접합체:

    또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 여기서 N 및 C 사이의 이중 라인 은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단서로서 이것이 이중 결합일 때, X는 부재하고 Y는 -H이고, 이것이 단일 결합일 때, X는 -H이고 Y는 -SO3M이고 M은 H+, Na+ 또는 K+이고; CBA는 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다:
    a) 서열 번호: 5에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 8에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 11에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    b) 서열 번호: 20에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열 번호: 21에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열 번호: 22에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
  24. 제23항에 있어서, CBA가 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 면역접합체:
    a) 서열 번호: 34에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역; 및
    b) 서열 번호: 35에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
  25. 제24항에 있어서,
    (i) 서열 번호: 34의 N 말단으로부터 두 번째 잔기, Xaa가 Phe이거나; 또는
    (ii) 서열 번호: 34의 N 말단으로부터 두 번째 잔기, Xaa가 Val인 면역접합체.
  26. 제23항에 있어서, CBA가 다음을 포함하는 항체인 면역접합체:
    a) 서열 번호: 54에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄; 및
    b) 서열 번호: 51에서 진술된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄.
  27. 제26항에 있어서, 서열 번호: 54의 N 말단으로부터 두 번째 잔기, Xaa가 Val인 면역접합체.
  28. 제1항 내지 제13항 중에서 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 VH 및 VL 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암 또는 세포-증식성 장애를 앓는 개체를 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 제약학적 조성물에 있어서, 암 또는 세포-증식성 장애의 세포는 CD123을 발현하는 것인 제약학적 조성물.
  29. CD123을 발현하는 세포의 성장을 저해하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법에 있어서, 상기 세포를 제1항 내지 제13항 중에서 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 VH 및 VL 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 세포는 종양 세포, 백혈병 세포 또는 림프종 세포인 방법.
  31. 제1항 내지 제13항 중에서 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 VH 및 VL 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 암 또는 세포-증식성 장애를 앓는 개체를 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 제약학적 조성물에 있어서, 암 또는 세포-증식성 장애의 세포는 CD123을 발현하는 것인 제약학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 암은 백혈병 또는 림프종인 제약학적 조성물.
  33. 제31항에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 및 만성 림프성 백혈병 (CLL)으로 구성된 군에서 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  34. 제31항에 있어서, 상기 세포-증식성 장애는 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), B-세포 계통 급성 림프모구성 백혈병 (B-ALL), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 모양 세포성 백혈병 (HCL), 골수형성이상 증후군, 기본 형질세포양 DC 신생물 (BPDCN) 백혈병, 비호지킨 림프종 (NHL), 외투 세포 림프종, 및 호지킨 백혈병 (HL)으로 구성된 군에서 선택되는 것인 제약학적 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 세포-증식성 장애는 기본 형질세포양 DC 신생물 (BPDCN) 백혈병인 제약학적 조성물.
  36. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항의 면역접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 암 또는 세포-증식성 장애를 앓는 개체를 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 제약학적 조성물에 있어서, 암 또는 세포-증식성 장애의 세포는 CD123을 발현하는 것인 제약학적 조성물.
  37. CD123을 발현하는 세포를 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항의 면역접합체 또는 상기 면역접합체를 포함하는 제약학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, CD123을 발현하는 세포의 성장을 저해하는 시험관내 또는 생체외 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 세포가 종양 세포, 백혈병 세포 또는 림프종 세포인 방법.
  39. 암 또는 세포-증식성 장애를 갖는 대상체의 치료 방법에 사용하기 위한 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 면역접합체를 포함하는 제약학적 조성물이며, 여기서 암 또는 세포-증식성 장애의 세포는 CD123을 발현하는 것인 제약학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 암이 백혈병 또는 림프종인 제약학적 조성물.
  41. 제39항에 있어서, 상기 암이 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 및 만성 림프성 백혈병 (CLL)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약학적 조성물.
  42. 제39항에 있어서, 상기 세포-증식성 장애가
    급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), B-세포 계통 급성 림프모구성 백혈병 (B-ALL), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 모양 세포성 백혈병 (HCL), 골수형성이상 증후군, 기본 형질세포양 DC 신생물 (BPDCN) 백혈병, 비호지킨 림프종 (NHL), 외투 세포 림프종, 및 호지킨 백혈병 (HL)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약학적 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 세포-증식성 장애가 기본 형질세포양 DC 신생물 (BPDCN) 백혈병인 제약학적 조성물.
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