ITFI20090076A1 - Stimolazione elettrica cellulare mediata da nanotubi piezoelettrici - Google Patents

Description

STIMOLAZIONE ELETTRICA CELLULARE MEDIATA DA NANOTUBI

PIEZOELETTRICI

DESCRIZIONE

Campo tecnico dell'invenzione

L’invenzione riguarda un metodo per indurre stimolazione elettrica cellulare non invasiva, sia in vitro che in vivo, mediante l’utilizzo di nanovettori piezoelettrici. Nello specifico si tratta di nanotubi di nitruro di boro (BNNTs) in grado di convertire uno specifico stimolo esterno non invasivo (onde ultrasoniche) in impulsi elettrici in grado di stimolare le cellule.

Stato della tecnica anteriore

Elettroterapia

La stimolazione elettrica cellulare trova innumerevoli applicazioni in campo biomedico come la stimolazione cerebrale profonda, la stimolazione gastrica in seguito a gastroparesi, la stimolazione cardiaca, muscolare etc. In particolare, nei disordini neurologici la stimolazione elettrica cerebrale à ̈ spesso l’unica forma di terapia. E’ stato da tempo dimostrato che appropriate stimolazioni elettriche inducono una risposta positiva nelle cellule in coltura per quanto riguarda proliferazione, metabolismo o produzione di sostanze specifiche. Supronowicz e collaboratori dimostrano che la stimolazione elettrica in presenza di nanotubi di carbonio migliora la proliferazione e la produzione di materiale extracellulare di osteoblasti in vitro stimolati con impulsi di corrente (Supronowicz et al. (2002) Journal of Biomedical Materials Research, 59, p. 499-506). Chachques e al. (2004) International Journal of Cardiology, 95, p. 68-69 indicano come la stimolazione elettrica in vitro di cellule staminali miocardiche ne aumenti la proliferazione, lo sviluppo, l’organizzazione in miotubuli e la differenziazione.

La stimolazione cerebrale profonda à ̈ un trattamento di provata efficacia per patologie ad alto impatto come il morbo di Parkinson, il tremore cronico, la distonia ed altri disordini ipercinetici. Tutte le applicazioni cliniche accettate internazionalmente di stimolazione elettrica funzionale sono basate sulla eccitazione diretta di strutture nervose e - nel caso di funzioni muscolari - sull’attivazione indiretta del muscolo.

É stato inoltre dimostrato, in uno studio nel ratto, che l’elettrostimolazione à ̈ capace di ristabilire le proprietà elettriche ed elettrochimiche della membrana muscolare anche dopo vari gradi di degenerazione, non solo una volta, ma anche ripetutamente.

Un altro studio in ratto (Carraro et al. (2002) Basic and Applied Myology, 12, p.

53-63) ha dimostrato una bassa ma duratura capacità rigenerativa a livello cellulare (miogenesi rigenerativa) nel muscolo denervato non trattato, ed ancora un sostanziale aumento di questa attività dopo ripetute lesioni muscolari. Simili stimoli miogenici sono stati osservati in pazienti paraplegici con denervazione periferica degli arti inferiori.

Tuttavia le attuali procedure per effettuare stimolazione elettrica sono altamente invasive. La procedura per effettuare stimolazione cerebrale prevede l'inserimento di elettrodi intracerebrali e l’applicazione di un generatore di impulsi impiantabile da connettere agli elettrodi stessi. Questa stimolazione in vivo implica numerosissime controindicazioni. Fra queste vanno citate la coagulopatia incontrollabile ed il possibile rischio di generare demenza post-chirurgica con conseguenti psicopatologie. Inoltre, non à ̈ trascurabile il rischio di insorgenza di ventricolomegalia, di ematoma subdurale, subaracnoideo, intraventricolare o intracerebrale. Non da ultimo, il rischio di emorragie, anche gravi, si attesta intorno al 3-5% per ogni paziente, mentre non sono assenti casi di ictus, infezioni e lesioni celebrali. Tutti questi episodi possono portare a disabilità a lungo termine e, nei peggiori casi, a morte del paziente. Spesso, inoltre, infezioni causate dai dispositivi che non rispondono a cure antibiotiche portano alla rimozione definitiva degli elettrodi.

A causa di tutte queste complicazioni, à ̈ facile intuire come la stimolazione nervosa, benché efficace e promettente, sia ad oggi ristretta al solo trattamento di stadi avanzati delle patologie, allorché ogni altra terapia farmacologica risulti priva di qualsiasi efficacia.

Anche le sperimentazioni su tessuto muscolare hanno dimostrato che la stimolazione elettrica funzionale à ̈ uno strumento efficace e potente per mantenere, recuperare funzionalmente e ricostruire la muscolatura denervata. Tuttavia la tecnica presenta gli stessi problemi di alta invasività già rilevati nel caso della stimolazione nervosa.

L'uso di nanostrutture quali nanoparticelle, nanotubi, nanofibrille in terapia e diagnostica umana à ̈ noto.

La domanda di brevetto EP-A-1593406 (M. Pizzi et al.) descrive un dispositivo per elettrochemioterapia costituito da micro- o nano-capacitori di materiale composito piroelettrico o piezoelettrico ed un medicamento. Il dispositivo può essere iniettato in circolo e attivato dall’esterno, allo scopo di rilasciare il medicamento. Il micro/nanocapacitore à ̈ attivato mediante una fonte di vibrazioni o radiazioni elettromagnetiche. In tale documento non si fa riferimento né a stimolazione cellulare né a nanotubi né a onde ultrasoniche come fonte esterna.

La domanda di brevetto EP-A-1818046 (M. Pizzi et al.) descrive un microdispositivo costituito da un nanocapacitore di materiale ferroelettrico, piroelettrico o piezoelettrico circondato da una membrana e contenente un farmaco. Il dispositivo à ̈ iniettabile nel circolo sanguigno e dall’esterno, con opportuni stimoli, à ̈ possibile generare una differenza di potenziale che pori la membrana (elettroporazione) e rilasci il farmaco. Sia le finalità che la progettazione del dispositivo si discostano dall’oggetto della presente invenzione.

La domanda di brevetto US 2009022655 descrive nanotubi di nitruro di boro per il trattamento del cancro attraverso BNCT (Boron Neutron-Capture Therapy). Il documento descrive anche l'uso di nanotubi di carbonio come vettori di medicamenti anti-tumorale. In una forma di realizzazione dell'invenzione, i nanotubi di carbonio contenenti il medicamento sono fatti esplodere attraverso onde ultrasoniche di alta potenza. Questo documento non descrive né stimolazione cellulare né l'applicazione dell'effetto piezoelettrico dei nanotubi di nitruro di boro ivi descritti.

Lo scopo della presente invenzione à ̈ di fornire nuovi strumenti e tecniche che permettano l'applicazione della stimolazione elettrica cellulare senza incorrere nei severi effetti avversi tipici delle tecniche odierne di elettroterapia.

Sommario dell'invenzione

La presente invenzione si fonda sulla sorprendente scoperta che nanotrasduttori piezoelettrici possono essere efficacemente impiegati in un trattamento di elettroterapia completamente non-invasivo, in cui lo stimolo elettrico generato dai nanotrasduttori à ̈ provocato attraverso sollecitazione esterna al corpo del paziente (tipo-wireless) con onde ultrasoniche di idonea potenza. La presente invenzione si basa quindi sulla dimostrazione sperimentale che non solo nanotrasduttori piezoelettrici possono essere stimolati da un campo ultrasonico generato esternamente al sistema nel quale gli stessi sono stati localizzati, ma che lo stimolo elettrico prodotto dal nanotrasduttore localizzato all'interno della cellula target à ̈ sufficientemente elevato da provocare una stimolazione elettrica efficace in un sistema cellulare reale in vitro o in vivo.

Pertanto, un primo oggetto della presente invenzione sono nanotrasduttori piezoelettrici per uso in un trattamento in vivo di stimolazione cellulare attraverso stimolazione elettrica comprendente le seguenti fasi: si localizzano i nanotrasduttori in un sito bersaglio; si induce uno stimolo elettrico nello stesso sito attraverso una stimolazione esterna dei nanotrasduttori con onde ultrasoniche.

In una forma di realizzazione dell'invenzione i nanotrasduttori piezoelettrici sono resi biocompatibili mediante rivestimento con polimeri farmaceuticamente accettabili e/o funzionalizzati mediante ligandi specifici aventi affinità per il sito bersaglio e/o funzionalizzati con molecole marcatrici che ne permettano la tracciabilità.

In una specifica forma di realizzazione dell'invenzione i nanotrasduttori piezoelettrici sono nanotubi, per esempio nanotubi di nitruro di boro.

I nanotrasduttori dell'invenzione sono utilizzati in un trattamento rigenerativo o ricostruttivo di vari tessuti attraverso internalizzazione nelle cellule del tessuto e loro successiva stimolazione elettrica.

Un secondo oggetto dell'invenzione à ̈ una preparazione ad uso farmaceutico e metodo di preparazione, comprendente nanotubi piezoelettrici capaci d'essere stimolati da un campo ultrasonico remoto ed un eccipiente farmaceuticamente accettabile per uso in un trattamento di elettroterapia. In particolare una formulazione in forma liquida di sospensione/soluzione comprendente detti nanotubi in forma non aggregata ed un polimero biocompatibile come disperdente.

Un terzo oggetto dell'invenzione à ̈ rappresentato da un metodo in vitro di elettrostimolazione cellulare comprendente le seguenti fasi:

si disperdono i nanotrasduttori piezoelettrici nel mezzo di coltura o in supporti di crescita cellulare,

si incubano le cellule in detto mezzo di coltura o supporto di crescita,

si induce uno stimolo elettrico attraverso una stimolazione dei nanotrasduttori con un campo ultrasonico esterno. In una forma di realizzazione di questo oggetto i supporti di crescita sono scaffold polimerici per ingegneria tessutale o impianto o substrati di adesione cellulare.

Ulteriori oggetti dell'invenzione sono supporti (scaffold) di crescita cellulare o substrati di adesione cellulare o per uso in ingegneria tessutale, in vitro o in vivo, comprendenti i nanotrasduttori piezoelettrici come sopra descritti capaci di produrre uno stimolo elettrico a seguito di stimolazione esterna con ultrasuoni.

La soluzione proposta dall’invenzione offre il vantaggio di poter indurre una stimolazione elettriche efficace che massimizzi i benefici della stimolazione elettrica cellulare, ma che annulli o riduca drasticamente i problemi avversi e gli effetti collaterali causati dalle attuali tecnologie cliniche. Il metodo proposto riduce totalmente l’invasività delle attuali procedure di elettrostimolazione di tessuti in vivo e semplifica notevolmente ogni forma di stimolazione elettrica in vitro. Per quanto riguarda la stimolazione cellulare in vitro la soluzione proposta permette di abolire i circuiti elettrici di stimolazione, connessioni elettriche o altri dispositivi connessi alle colture agevolando così il sistema per il miglioramento delle condizioni di crescita cellulare. I nanotrasduttori possono essere dispersi nel mezzo di coltura o inglobati in strutture di supporto alla crescita cellulare (scaffold polimerici, substrati di adesione, etc.) e quindi stimolati attraverso campi ultrasonici. Inoltre, sia nelle applicazioni in vitro che in vivo le potenze in gioco possono essere modulate caso per caso per meglio adattarle alle differenti esigenze.

Descrizione delle figure.

Figura 1: la figura riporta un modello cellulare schematico che illustra la presente invenzione. Ogni cellula che ha internalizzato i BNNTs à ̈ soggetta ad uno stimolo elettrico interno come conseguenza ad uno stimolo ultrasonico esterno.

Figura 2: La figura illustra i risultati del saggio MTT dopo 24, 48, 72 h di incubazione di osteoblasti primari umani (HOBs) con 0 (controllo), 5, 10, 15 µg/ml di BNNTs (n=6). Nessuna differenza statisticamente significativa à ̈ stata osservata tra i gruppi.

Figura 3. La figura riporta i risultati di un test di internalizzazione cellulare. I BNNTs marcati con marcatori fluorescenti (quantum dots) sono stati individuati all'interno delle cellule attraverso microscopia a fluorescenza dopo 6 h di incubazione degli HOBs con CM contenente BNNTs.

Figura 4. La figura mostra micrografie TEM di sezioni citoplasmatiche di HOBs o di controlli o di HOBs trattati con BNNTs. I risultati confermano l’internalizzazione dei BNNTs e mostrano la presenza di nanoparticelle compatibili con i BNNTs nelle vescicole citoplasmatiche. L’internalizzazione dei BNNTs avviene per endocitosi.

Figura 5. la figura riporta i risultati di analisi RT-PCR e mostra l’espressione genica di HOBs trattati sia con stimolo singolo (o BNNTs o ultrasuoni) che combinato (BNNTs+US). L'espressione di Runx2 à ̈ risultata down-regolata dai BNNTs, mentre i livelli di espressione di OPN sono incrementati dagli US. L’espressione di Coll I non à ̈ variata, mentre le espressioni di AP e OCN sono sinergisticamente influenzate dai trattamenti con BNNTs che con US.

Figura 6. la figura riporta i livelli di produzione di OCN per cellula. I campioni trattati con BNNTs e con BNNTs US hanno mostrato la più alta produzione di OCN rispetto ai campioni trattati con US e rispetto ai controlli.

Figura 7. La figura riporta i risultati dell'analisi citochimica colorimetrica secondo von Kossa relativa alla produzione di sali di calcio (neri) su campioni di osteoblasti primari umani non trattati (HOBs) oppure stimolati con ultrasuoni (HOBs US), oppure trattati con nanotubi (HOBs BNNTs) oppure trattati con nanotubi e stimolati con ultrasuoni (HOBs BNNTs US). La più alta calcificazione (colorazione più scura) à ̈ stata conseguita in HOBs trattati con BNNTs e stimolati con US.

Figura 8 - La figura riporta immagini in fluorescenza di cellule di glioblastoma multiforme umano incubate per 90 min con 10 µg/ml di BNNTs fluorescenti (coniugati con quantum dots) funzionalizzati (a) o non funzionalizzati (b) con acido folico.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Nanotrasduttori

I nanotrasduttori piezoelettrici idonei per la presente invenzione sono nanostrutture in sé note, quali particelle, tubi, cilindri (rods), sfere, fibrille, filamenti aventi almeno una dimensione, preferibilmente due o tre, al di sotto di 100 nm e consistenti o comprendenti un materiale piezoelettrico. Un esempio di materiale utilizzabile à ̈ il nitruro di boro, altri esempi di materiali utilizzabili, includono, ad esempio, titanato di bario, titanato di stronzio (in generale tutte le perovskiti) e polivinildenfluoruro (PVDF). Il gruppo dei nanotubi comprende nanotubi a parete singola, a doppia parete o a parete multipla, e possono essere tanto aperti sulle due estremità che su una sola che chiusi sulle due estremità. Un esempio di tali nanotubi sono i nanotubi di nitruro di boro.

I nanotubi di nitruro di boro (BNNTs) sono strutturalmente analoghi ai più famosi nanotubi di carbonio (CNTs): atomi alterni di boro ed azoto sostituiscono completamente quelli di carbonio nella classica forma di un foglio di grafite arrotolato, senza praticamente alcun cambiamento nelle distanze inter-atomiche. I BNNTs sono prodotti attraverso un processo di atomizzazione ball-milling seguito da annealing come descritto da Chen Y. et al. (1999) Chemical Physics Letter,, 299, p. 260-264 oppure da Yu J. et al. (2005) Chemistry of Materials, 17, p. 5172-5176. Essi stanno acquistando notevole interesse nella comunità scientifica internazionale (Chopra et al. (1995) Science, 269, p. 966-967) ed hanno attratto ampia attenzione a causa delle loro uniche ed importanti proprietà fisico-chimiche, che ne rendono i candidati ideali per svariate applicazioni strutturale ed elettroniche (Terrones et al., (2007) Materials Today, 10, p.30-38.

In aggiunta ad un elevato modulo di Young (Chopra et al. (1998) Solid State Communications 105, p. 297-300), simile a quello dei CNTs, i BNNTs possiedono superiori stabilità chimiche e termiche. Confrontati con i CNTs, presentano proprietà elettriche più stabili, con un gap di banda uniforme di 5.5 eV, al contrario dei CNTs che presentano comportamenti elettrici diversificati, varianti da quelli tipici dei semiconduttori a quelli di ottimi conduttori. Il progresso verso il controllo della chiralità dei CNTs (e quindi delle loro proprietà elettriche) à ̈ infatti modesto, mentre i BNNTs presentano una struttura preferibilmente definita a “zig-zag†a causa della natura polare del legame B-N. Tutte queste proprietà rendono i BNNTs particolarmente interessanti per numerose applicazioni nanotecnologiche. I BNNTs possiedono eccellenti proprietà piezoelettriche. La piezoelettricità à ̈ la capacità di alcuni cristalli di generare una differenza di potenziale elettrico in risposta all’applicazione di stress meccanici. Modelli di calcolo ab initio sulla spontanea polarizzazione dei BNNTs e delle loro proprietà piezoelettriche hanno dimostrato come essi funzionino da eccellenti sistemi piezoelettrici con risposte superiori a quelle della maggior parte dei polimeri piezoelettrici e comparabili a quelle dei semiconduttori a base di wurtzite. Inoltre, forze di bending dei nanotubi sono state misurate direttamente al’interno di microscopi a trasmissione elettronica ad alta risoluzione (HRTEM) confermando un’eccezionale flessibilità di tali strutture (Golberg et al. (2007) Advanced Materials, 19, p. 2413–2432). Queste osservazioni sottolineano le notevoli potenzialità dei BNNTs come efficienti ed innovativi nano vettori.

Nanotrasduttori biocompatibili

La prima esigenza per applicazioni biomediche à ̈ la realizzazione di sospensioni stabili in soluzioni fisiologiche e biocompatibili di nanotrasduttori che possano essere somministrati senza causare reazioni immunitarie e che siano prontamente internalizzati nelle cellule di interesse. Un approccio molto promettente prevede l’impiego di polimeri che rivestano la nanostruttura e la rendono biocompatibile e facilmente dispersibile o quasi-solubile in mezzi acquosi. Polimeri idonei a tale scopo sono polimeri quali polisaccaridi, per esempio chitosano, poli-L-Lisina (PLL), polietilenimmina (PEI), acido polilattico, poliglicolico, poliaspertico, o loro copolimeri. Preferibilmente il polimero à ̈ un polimero cationico quale la polilisina e la polietilenimmina. Metodi di ricopertura (coating) polimerica, covalente o noncovalente, di nanotubi con polimeri carichi positivamente quali la polietilenimmina sono descritti da Ciofani et al. (2008) J. Nanosci. Nanotechnol, 8, p. 6223–6231, oppure in Ciofani et al. (2008) Biotechnology and Bioengineering, 101, p. 850-858. Metodi di ricopertura con poli-lisina sono descritti di seguito negli esempi.

L'utilizzo dei sopra indicati polimeri oltre a rendere il nanotrasduttore biocompatibile permette l'ottenimento di dispersioni omogenee, libere da aggregati e per questo facilmente internalizzabili all'interno della cellula target.

Inoltre, i nanotrasduttori secondo l'invenzione possono essere funzionalizzati con vari tipi di molecole, innanzitutto con molecole marker capaci di essere rilevate che ne garantiscano la tracciabilità fino all'interno della cellula target.

Ogni tipo di marker noto idoneo per saggi cellulari può essere utilizzato a tale scopo: per esempio sostanze fluorescenti, cromofori o isotopi radioattivi. I nanotrasduttori possono poi essere funzionalizzati con ligandi specifici per il targeting terapeutico o diagnostico a cellule di interesse. Tali ligandi possono essere anticorpi specifici o loro frammenti per esempio IgG, ligandi specifici per particolari recettori di membrana, per esempio l'acido folico, o altri noti bio-partner. Recentemente à ̈ stato dimostrato come BNNTs funzionalizzati con acido folico siano preferibilmente internalizzati da cellule di glioblastoma (Figura 8) che sovraesprimono il recettore per tale sostanza (Ciofani et al. (2009) Nanoscale Res Lett., 4, p.113-121).

La funzionalizzazione con molecole specifiche ha una particolare utilità in vivo, e consente il riconoscimento del vettore da parte delle cellule bersaglio. L’efficacia di targeting di cellule specifiche à ̈ essenziale in vivo, ad esempio nelle applicazioni di stimolazione nervosa o muscolare: per esempio una dispersione di BNNTs funzionalizzati iniettata nel circolo sanguigno si localizza nel sito ove à ̈ richiesta la stimolazione elettrica, quindi effettuata tramite l’applicazione di campi ultrasonici esterni localizzati.

Localizzazione/somministrazione dei nanotrasduttori

I nanovettori piezoelettrici secondo l'invenzione sono localizzati nel sito bersaglio (target). Questo avviene per internalizzazione dei nanotrasduttori nelle cellule del sito a seguito di somministrazione diretta nel sito bersaglio, per esempio attraverso iniezione in situ nel tessuto da trattare. Una via di somministrazione alternativa e meno invasiva à ̈ la somministrazione in circolo di nanovettori funzionalizzati con ligandi specifici che grazie alla loro affinità siano in grado di veicolare ed accumulare le nanostrutture al sito bersaglio, permettendone l'internalizzazione da parte delle cellule di interesse

Un’ulteriore possibilità di somministrazione consiste nell’incapsulamento dei BNNTs in microbolle lipidiche quali quelle impiegate come mezzo di contrasto (ad esempio il SonoVue, prodotto in uso clinico). Tali microbolle fosfolipidiche contengono esafluoruro di zolfo SF6(gas completamente innocuo e poco solubile, eliminato a livello polmonare), entrano nel circuito ematico per iniezione di una sospensione, avendo una dimensione paragonabile ai globuli rossi (2-5 µm); quindi arrivano nei capillari ma non escono dal circolo ematico. Esse possono incamerare i BNNTs e trasportarli fino al sito di interesse dove vengono fatte esplodere tramite stimolo ultrasonico e liberare quindi i BNNTs, i quali al contrario possono uscire dal microcircolo e raggiungere il sito bersaglio sotto monitorizzazione ecografica. Possono essere ulteriormente impiegate come possibili drug-carrier per chemioterapia mirata.

Esempi di tessuti suscettibili d'essere trattati in accordo con la presente invenzione sono i tessuti muscolare, nervoso, osseo, cartilagineo, miocardico, tessuti comprendenti tutte le cellule sensoriali, quali le cellule ciliate dell'orecchio interno, coni e bastoncelli della retina, cellule del gusto, del tatto e dell'olfatto, ovvero tutte quelle cellule che posseggano chemio- termo- foto- meccanorecettori e trasformano uno stimolo recepito in una differenza di polarizzazione di membrana che attiva il vicino neurone ovvero ogni altro tessuto o organo, quali tendini o legamenti, che necessiti un trattamento rigenerativo o ricostruttivo o un trattamento del dolore acuto, cronico, neuromuscolare o trattamento di cicatrizzazione di tessuti danneggiati.

Specifici tipi cellulari la cui crescita à ̈ attivata, stimolata o promossa da elettrostimolazione con nanotrasduttori piezoelettrici comprendono cellule muscolari, mioblasti, cellule neuronali, cellule muscolari cardiache, osteoblasti, osteoclasti, cellule staminali cardiache, cellule staminali in generale e cellule sensoriali precedentemente citate.

A titolo d'esempio, nel caso della stimolazione a livello del sistema nervoso, una sospensione di BNNTs può essere iniettata in situ o in circolo previa opportuna funzionalizzazione e quindi, grazie ad una stimolazione esterna, può essere ottenuta la generazione di elettricità, senza bisogno di impianti transcutanei e penetranti altamente invasivi.

Metodo in vitro e supporti di crescita cellulare

In una forma di realizzazione alternativa dell'invenzione, i nanovettori piezoelettrici sono utilizzati in un metodo in vitro di attivazione, stimolazione o promozione della crescita e/o della rigenerazione di cellule attraverso elettro stimolazione.

Per quanto riguarda la stimolazione in vitro e le applicazioni in ingegneria tessutale, la presente invenzione agevola la stimolazione cellulare e la possibilità di migliorare le condizioni dei tessuti coltivati in termini di metabolismo, proliferazione, produzione di matrice extracellulare e produzione di metaboliti. E’ provato da tempo, infatti, che la stimolazione elettrica su molte tipologie cellulari ha effetti positivi sul loro accrescimento. La soluzione rappresentata dall'invenzione permette di raggiungere questi risultati senza la necessità di circuiti elettrici di stimolazione, connessioni elettriche o altri dispositivi connessi alle colture. I nanotrasduttori proposti, inoltre, posso essere somministrati sia nel mezzo di coltura, come descritto, che inglobati in strutture di supporto alla crescita cellulare quali scaffold polimerici, o substrati di adesione o altro e quindi stimolati attraverso campi ultrasonici come sotto definiti.

Nel caso di colture in mezzo liquido, i nanotrasduttori piezoelettrici, preferibilmente resi biocompatibili e/o funzionalizzati con ligandi specifici o con molecole marcatrici come sopra descritto, sono dispersi stabilmente ed omogeneamente nel mezzo di coltura in concentrazioni che non implichino effetti tossici per la cellula coltivata. Concentrazioni comprese tra 5 e 100 Î1⁄4g/ml. Per esempio concentrazioni di 5, 10, 15, 25, 50, 75 Î1⁄4g/ml non hanno prodotto alcun effetto tossico dopo incubazione fino a 72 ore.

Saggi di fluorescenza hanno anche evidenziato che incubazioni varianti da 1 a 10 ore, per esempio 1, 3, 5, 6 ore, secondo il tipo di cellula, sono sufficienti per ottenere l'internalizzazione dei nanotrasduttori nella cellula. Un'incubazione di 6 ore si à ̈ dimostrata efficace per internalizzare nanotubi di nitruro di boro in osteoblasti umani.

Nel caso di colture su supporti solidi, per esempio polimerici, o semisolidi, per esempio gel, i nanotrasduttori piezoelettrici sono inglobati in forma omogenea nel supporto durante la preparazione dello stesso. In particolare il metodo di preparazione dei supporti prevede una fase in cui si disperdono i nanotrasduttori piezoelettrici in una soluzione o dispersione o emulsione contenente il polimero o i suoi monomeri, una fase in cui i monomeri sono polimerizzati ed una fase in cui si rimuove il mezzo liquido con ottenimento di una matrice solida o semisolida contenete i nanotrasduttori. Supporti di crescita cellulare sono in sé noti. I polimeri utilizzati per la loro preparazione sono polimeri biocompatibili e citocompatibili. In particolare i polimeri utilizzati in ingegneria tessutale per la produzione in vitro di tessuti e loro successivo impianto in vivo dovranno inoltre essere forniti delle seguenti proprietà: bioassorbibili, (o biodegradabili o bioerodibili), immunologicamente inerti, non tossici, non cancerogeni.

Polimeri noti utilizzabili per la preparazione di supporti di crescita sono, per esempio, polilattato, poliglicolato, loro copolimeri, polipirrolidone, polimeri derivati della cellulosa, dal chitosano/chitina, polilisina, polietilenimmina. Altri polimeri idonei alla preparazione dei supporti dell'invenzione sono descritti in WO-A-2001/087193, il cui contenuto à ̈ incorporato nella presente domanda. Metodo di preparazione dei supporti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13 a 15, comprendente le seguenti fasi: si disperdono i nanotrasduttori piezoelettrici in una soluzione o dispersione o emulsione contenente il polimero o i suoi monomeri,

si rimuove il mezzo liquido con ottenimento di una matrice solida o semisolida contenete i nanotrasduttori.

L'internalizzazione nella cellula target.

Sia operando in vivo che operando in vitro l'efficacia del trattamento di stimolazione cellulare dipende dal livello di internalizzazione dei nanotrasduttori piezoelettrici nella cellula di interesse. Test in fluorescenza hanno dimostrato che tempi di incubazione varianti tra 1 e 10 ore sono sufficienti per conseguire un'efficace internalizzazione dei nanotrasduttori dell'invenzione. Per esempio cellule di glioblastoma multiforme umano incubate per 90 minuti con 10 Î1⁄4g/ml di BNNTs fluorescenti funzionalizzati con acido folico hanno dimostrato alti livelli di internalizzazione (Figura 8). Anche colture di osteoblasti primari umani hanno efficacemente internalizzato nanotubi di nitruro di boro trattati con poli-L-lisina e marcati con marcatori fluorescenti dopo una incubazione di 6 ore (Figura 3).

Le onde ultrasoniche sono ampiamente utilizzate in molti settori della medicina, a causa della loro bassa invasività e della assenza praticamente totale di effetti collaterali. Fra le note applicazioni principali vanno ricordate la diagnostica (l’esame ecografico), il trattamento di dolore post-traumatico, applicazioni in medicina riabilitativa, estetica, etc.

In accordo con la presente invenzione, una volta localizzati in vivo nel sito bersaglio ed internalizzati dalle cellule di interesse, ovvero quando dispersi in mezzi di coltura o inglobati in substrati di adesione o in supporti (scaffold) polimerici di crescita cellulare, i nanotrasduttori piezoelettrici sono stimolati attraverso un campo di onde ultrasoniche, che sono infatti onde meccaniche sonore. Queste sono prodotte da un generate esterno al sistema cellulare in vitro ovvero esterno al corpo del paziente sottoposto a trattamento. Nei trattamenti in vivo il campo à ̈ normalmente localizzato in prossimità del sito bersaglio.

Per generare onde ultrasoniche idonee per la presente invenzione, può essere utilizzato un qualsiasi dispositivo commerciale che permetta la regolazione di frequenza ed intensità, quindi di potenza, del segnale. Per esempio può essere utilizzata una normale apparecchiatura con testine di stimolazione ecografica (per diagnosi) con potenza e frequenza regolabili.

A titolo meramente esemplificativo, à ̈ descritto di seguito un modello del comportamento piezoelettrico di un nanovettore (nanotubo). La piezoelettricità, come già accennato, à ̈ la combinazione del comportamento elettrico del materiale e dalla legge di Hook; tale combinazione può essere riassunta dalla seguente equazione r r r

D=eoerE+ 4 p P(1)

dove D à ̈ la polarizzazione globale del materiale, E à ̈ il campo elettrico, ε0à ̈ la costante dielettrica del vuoto, εrà ̈ la costante dielettrica relativa e P à ̈ la polarizzazione dovuta ai fenomeni piezoelettrici, espressa da<r>

P = ds<r>(2)

dove d à ̈ una matrice 3 X 6 delle costanti piezoelettriche e σ à ̈ il tensore degli sforzi semplificato a 6 componenti. In assenza di cariche all’interno del materiale, dalle Equrazioni di Maxwrell si ottie rne

ÑD=eoerÑE+4 pÑ P = 0(3)

e quindi il seguente sistema:

¶ E x 4 p ¶ P

= - x

¶ x e 0 e r ¶ x

¶ E y 4 p ¶ P

= - y

¶ y e 0 e r ¶ y (4)

¶ E z 4 p ¶ P

= - z

¶ z e 0 e r ¶ z

Assumiamo per semplicità che il nanotubo, di lunghezza l, sia soggetto per effetto di un’onda ultrasonica ad una sollecitazione σzzlungo il suo asse verticale z. L’unica componente non nulla di P sarà

Pz= dzzzszz (5)

da cui deduciamo

l

4 p 2 ¶s zz 4 p

E z<= ->d

e zzz = - s

e ò<dz>e zz<d>zzz (6)

0 r l 0

- ¶ze r

2

Integrando Ezlungo l’asse z otteniamo

l

2 4 p

<D>V<= ->òE<z>dz<= s>zzdzzzl (7)

le- 0er

2

che rappresenta la differenza di potenziale alle estremità del nanotubo generate dall’applicazione della tensione meccanica σzz. I parametri di controllo di questa tensione (nel nostro caso la sorgente di ultrasuoni, la frequenza, il numero, la durata e l’intensità degli impulsi) variano ovviamente a seconda delle applicazioni. Le condizioni ottimali per ottenere risultati efficaci per ogni sistema cellulare sono facilmente ricavabili empiricamente da qualsiasi esperto del settore.

Mentre qualsiasi frequenza compresa tra 20 kHz a 20 MHz può essere utilmente impiegata nei metodi dell'invenzione, la potenza del segnale ultrasonico deve restare al di sotto della soglia critica di danneggiamento delle cellule e dei tessuti irradiati. Tale soglia varia se il metodo à ̈ applicato in vitro o in vivo e dipende fortemente dai tempi di applicazione. I tempi di applicazione del segnale nei metodi dell'invenzione variano tra 5 e 30 secondi, ripetuti due, tre o più volte per giorno e per settimana.

Per detti tempi di applicazione, la potenza del segnale può variare nell'intervallo tra 50 mW/cm<2>e 25 W/cm<2>. Preferibilmente un trattamento in vivo implica potenze tra 100 mW/cm<2>e 10 W/cm<2>per un tempo di applicazione uguale o minore di 30 sec nel caso di massima potenza. Il trattamento in vitro permette potenze più elevate che variano tra 10 W/cm<2>e 25 W/cm<2>sempre per applicazioni tra 5 e 30 secondi ripetute come sopra indicato. Se si adotta una potenza di 20 W/cm<2>, per tempi di applicazione da 5 a 30 secondi questa svilupperà una energia pari a 100-600J/cm<2>.

L'efficacia delle tecniche di elettroterapia cellulare indotta da onde ultrasoniche può essere agevolmente valutata analizzando vari parametri cellulari, generalmente riconosciuti come indici di sviluppo, differenziazione, maturazione, o di vitalità della cellula.

Un efficace test consiste nella valutazione dei livelli di espressione cellulare di geni tipici attraverso tecniche ben note all'esperto del settore: PCR o RT-PCR o qualsiasi altro saggio noto.

Un secondo test à ̈ la determinazione, per esempio attraverso saggi enzimatici, immunoenzimatici, immunoradiometrici o colorimetrici di proteine espresse dalla cellula o di metaboliti o di ogni altra sostanza organica o inorganica prodotta dalla cellula, i cui livelli sono correlabili al grado di attivazione o di vitalità cellulare stessa.

Test elettrofisiologici usualmente impiegati per lo studio del potenziale di membrana cellulare (in regime di patch clamp, voltage clamp, current clamp, etc.) sono particolarmente utili per verificare le interferenze che le stimolazioni mediate dai nanotubi inducono sui potenziali stessi e sulla propagazione del segnale elettrico, in particolare in reti neuronali.

Le applicazioni

La stimolazione elettrica cellulare non invasiva può trovare innumerevoli applicazioni in campo biomedico, sia clinico che pre-clinico, come la stimolazione cerebrale profonda, la stimolazione gastrica in seguito a gastroparesi, la stimolazione cardiaca, muscolare. Per quanto riguarda le applicazioni cliniche la stimolazione cerebrale profonda à ̈ un trattamento di provata efficace per patologie ad alto impatto come il morbo di Parkinson, il tremore cronico, la distonia ed altri disordini ipercinetici.

La stimolazione cellulare trova inoltre ampio impiego applicazioni di medicina rigenerativa e/o ingegneria tissutale. Questa tecnica ha un elevato potenziale per essere utilizzata come un nuovo metodo per la riabilitazione di pazienti con denervazioni muscolari di varia origine. Per quanto riguarda le applicazioni in ingegneria tissutale ed in medicina rigenerativa, à ̈ da tenere in considerazione la possibilità di integrare i BNNTs in substrati o scaffold polimerici adatti per la crescita cellulare.

Inoltre tale metodo non invasivo permette di migliorare le condizioni dei tessuti coltivati in termini di metabolismo, proliferazione e produzione di matrice extracellulare.

Disclaimer

Ogni elemento specificamente identificato nella presente domanda à ̈ inteso come elemento esemplificativo e non limitativo, pertanto può essere escluso dall'ambito di protezione conferita senza alterare l'essenza dell'invenzione.

L'invenzione sarà di seguito illustrata a mezzo di esempi sperimentali.

ESEMPI

Esempio 1: Isolamento e espansione di osteoblasti umani (HOBs) Campioni di osso trabecolare, asportati dalla testa del femore di un paziente sottoposto ad un intervento di sostituzione dell’articolazione femorale, sono stati utilizzati dopo ottenimento del consenso informato. I campioni sono stati sezionati, in condizioni sterili, in pezzi più piccoli. In seguito, i frammenti di osso sono stati posti in soluzione salina sterile supplementata con antibiotici e antimicotici e lavati diverse volte allo scopo di rimuovere grasso, midollo, detriti tissutali e cellule del sangue. L’isolamento à ̈ stato effettuato in accordo al metodo stabilito (Di Silvio et al.. Human cell culture. London (UK): Kluwer Academic Publishers; 2001. p. 221-241). La migrazione cellulare dal tessuto nativo à ̈ stata osservata entro 1-2 settimane, conducendo alla formazione di uno strato osteoide intorno all’espianto. Le cellule sono state coltivate in un mezzo di coltura (CM) contenente: DMEM a bassa concentrazione di glucosio (Sigma-Aldrich, Milan, I), 10% FCS (Invitrogen), 10% L-glutammina (Sigma-Aldrich), HEPES (Sigma-Aldrich), aminoacidi non essenziali (Sigma-Aldrich), acido ascorbico (Sigma-Aldrich), antibiotici e antimicotici senza supplemento di minerali. Raggiunta la confluenza, le cellule sono state passate 1:3. Le cellule P1 sono state usate per la caratterizzazione attraverso citochimica e immunoistochimica. Gli osteoblasti umani (HOBs) P2 sono stati impiegati per gli studi con BNNTs.

Esempio 2: Preparazione e coniugazione dei BNNTs

I BNNTs forniti dalla Australian National University, Canberra, Australia, sono stati prodotti usando un metodo di “ball-milling and annealing†(Chen Y et al. (1999) Chemical Physics Letter 299, p. 260–264; Yu J et al. (2005) Chemistry of Materials 17, p. 5172-5176). I dettagli relativi alla purezza e alla composizione del campione (forniti dal fornitore) sono: resa > 80%, nitruro di boro >97 %wt, catalizzatori metallici (Fe e Cr) derivati dal processo di macinazione ~1.5 wt% ed O2adsorbito ~1.5 wt%.

Il polimero usato per la dispersione e sospensione acquosa dei BNNTs à ̈ stato poli-L-lisina (PLL) ottenuta da Fluka (81339), peso molecolare 70,000-150,000. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in soluzione tampone fosfato (PBS) come precedentemente descritto (Ciofani G. et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 101, p. 850-858 ). In breve, i campioni di BNNTs in polvere in soluzione con 0.1% PLL sono stati ultrasonicati per 12h con un sonicatore Branson 2510 (Bransonic). La potenza in uscita del sonicatore à ̈ stata fissata a 20 W per tutti gli esperimenti. Successivamente i campioni sono stati centrifugati a 1100 g per 10 minuti per rimuovere residui non dispersi e impurità.

L’eccesso di PLL à ̈ stato eliminato attraverso tre cicli di ultracentrifugazione a 30000 g per 30 min a 4°C (Allegra 64R, Beckman). La dispersione PLL-BNNT à ̈ il risultato di un rivestimento non covalente dei nanotubi con PLL. L’analisi spettrofotometrica per caratterizzare le dispersioni e quantificare le concentrazioni dei BNNTs (Ciofani et al. (2008) J. Nanosci. Nanotechnol. 8, p. 6223–6231) à ̈ stata condotta con un LIBRA S12 Spectrophotometer UV/Vis/NIR (Biochrom).

I PLL-BNNTs sono stati covalentemente marcati con quantum dots funzionalizzati con gruppi carbossilici per lo studio di localizzazione/tracciabilità cellulare. I quantum dots carbossilati sono stati forniti da Invitrogen (Qdot® 605 ITKâ„¢).

La reazione di coniugazione tra i gruppi amminici della PLL e i gruppi carbossilici dei punti quantici à ̈ stata effettuata come specificato dal fornitore. In breve, a 4 ml di PLL-BNNTs (50 Î1⁄4g/ml) sono stati aggiunti 4 Î1⁄4l di Qdots (8 Î1⁄4M) e 60 Î1⁄4l dell’attivatore 1-etil-3- (3- dimetilamino-propil9 carbodimide (10 mg/ml, EDC, 03450 from Fluka).

La soluzione à ̈ stata agitata delicatamente per 90 minuti a temperatura ambiente per ottimizzare la coniugazione e infine centrifugata (1,000 g, 10 min) per eliminare grandi aggregati. In fine à ̈ stata effettuata un’ultracentrifugazione (2 cicli a 30000 g per 30 min a 4°C) per rimuovere quantici quantum dots non legati e ottenere così la dispersione di BNNTs marcati (QD-PLL-BNNTs).

Esempio 3: Saggio MTT

Allo scopo di valutare la vitalità cellulare, à ̈ stato effettuato il saggio di proliferazione cellulare con MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, M-2128 Sigma) dopo 24, 48, 72 h di incubazione con mezzo modificato con PLL-BNNTs, contenente una concentrazione finale di BNNTs pari a 5, 10 e 15 Î1⁄4g/ml. Dopo tripsinizzazione e conta cellulare con camera di Burker, gli HOBs sono stati piastrati in piastre da 96 pozzetti. Una volta che l’adesione à ̈ stata verificata (circa 6 ore dopo la semina), le cellule sono state incubate con MTT 0.5 mg/ml per 2 ore. In seguito, 100 Î1⁄4l di dimetilsolfossido (DMSO, Sigma) sono stati aggiunti in ogni pozzetto e l’assorbanza a 550 nm à ̈ stata misurata con un VERSAMax microplate reader (Molecular Devices). Un test di riferimento (cellule coltivate in assenza di BNNTs) à ̈ stato eseguito come controllo.

Esempio 4: Tracciabilità intracellulare di BNNTs fluorescenti

I QD-PLL-BNNTs sono stati aggiunti al mezzo di coltura in rapporto 1:10 per una concentrazione finale di PLL-BNNTs pari a 5.0 Î1⁄4g/ml. Gli studi di internalizzazione cellulare sono stati eseguiti con microscopia a fluorescenza dopo 6 h di incubazione (60000 cellule in una piastra da 24 pozzetti). Il saggio di localizzazione lisosomiale à ̈ stato condotto su HOBs incubati con il colorante Lyso Tracker (Invitrogen). Questo à ̈ un colorante fluorescente acidotropico per la marcatura di organelli acidi in cellule vive. Il colorante fluorescente si accumula nei compartimenti cellulari caratterizzati da un basso pH. Per questi studi, le cellule sono state incubate 2 ore con mezzo di coltura contenente Lyso tracker in una diluizione 1:2500 dopo sei ore di esposizione a QD-PLL-BNNTs.

Esempio 5: Analisi con microscopia elettronica a trasmissione (TEM) Per l’analisi con TEM, sono utilizzati HOBs (controllo) e HOBs trattati overnight con CM contenente BNNTs alla concentrazione di 10 mg/ml (HOBs+BNNTs). Le cellule, dopo esser state rimosse dal CM, sono state centrifugate e fissate in una soluzione al 0.5% w/v gluteraldeide-4% w/v formaldeide in PBS 0.1M pH 7.2 per 2h a 4°C. Dopo lavaggio, i campioni sono stati post-fissati in 1% w/v OsO4PBS 0.1 M pH 7.2 per 1h, lavati e idratati con acetone-dimetilacetale acidificato (Fluka, Buchs, Switzerland). In fine i campioni sono inclusi in resina Epon/Durcupan in capsule BEEM #00 (Structure Probe, West Chester, USA) a 56°C per 48 h. Sezioni ultra-sottili (20– 30 nm di spessore) sono state ottenute con l’ultramicrotomo Ultrotome Nova (LKB, Bromma, Svezia) munito di una lama di diamante (Diatome, Biel/Bienne, Svizzera). Le sezioni sono state poste su 200 griglie quadrate di nickel e controcolorate con soluzione acquosa satura di uranil acetato e soluzione di citrato di piombo e successivamente osservate al microscopio elettronico a trasmissione Jeol JEM-I00SX.

Esempio 6: Somministrazione di BNNTs trasduttori di ultrasuoni (US) in stimoli elettrici

Questo studio à ̈ stato pianificato come riportato nella Tabella 1 (sotto). Gli HOBs, con o senza internalizzazione di BNNTs, sono stati esposti a ultrasuoni e confrontati ai controlli non esposti.

Tabella 1: Pianificazione degli esperimenti

HOBs HOBs HOBs HOBs (campione) (ctrl1) (ctrl2) (ctrl3) BNNTs X x - -US X - x -

La stimolazione con ultrasuoni à ̈ stata effettuata secondo lo schema: 20 W, per 5s , 3 volte al giorno per 1 settimana.

Terminata la stimolazione, i campioni, in triplicato per tutti i gruppi (300000 cellule per fiasca), sono stati impiegati per dosaggi quantitativi di DNA e biomolecole specifiche dell’osso (fosfatasi alcalina e osteocalcina), mentre un campione per ogni gruppo à ̈ stato usato per investigare l’espressione genica (geni Runx2, AP, osteopontina, Collagene I, osteocalcina) mediante RT-PCR. Altri campioni di HOBs sono stati inoltre coltivati su vetrino (20000 cellule per vetrino) per studi di citochimica (colorazione di Von Kossa per i depositi di calcio).

Esempio 7: Isolamento RNA totale e transcrittasi inversa e reazione a catena della polimerasi (RT-PCR)

L’RNA totale à ̈ stato isolato dalle cellule in coltura (1 campione per gruppo) usando il kit High Pure RNA Isolation (Roche, Mannheim, Germany) secondo le istruzioni del fornitore. L’RNA estratto à ̈ stato risospeso in acqua trattata con dietilpirocarbonato (DEPC-water) e la concentrazione di RNA à ̈ stata misurata valutando l’assorbanza a 260 nm. Quantità identiche di RNA sono state retrotrascritte in cDNA usando il kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche).

I cDNA sono stati successivamente amplificati mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). Le condizioni di PCR e i primers utilizzati per l’amplificazione di Runx2/cbfa-1, fosfatasi alcalina (AP), osteopontina (OPN), collagene tipo Iα2 (Coll-I), osteocalcina (OCN) e il gene housekeeping GAPDH sono riportati in Tabella 2. I prodotti di PCR sono stati caricati su un gel d’agarosio al 2.5% e colorati con bromuro di etidio.

Tabella 2: sequenze dei primers e condizioni per la RT-PCR

Gene Sequenza bp Cicli

25 cycles:

5’-GCCAAAAGGGTCATCATCTCTG-3’ 30 sec, 96°C Gapdh 347

5’-CATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3’ 60 sec, 58°C 30 sec, 74°C 35 cycles:

5’-GCCAAAAGGGTCATCATCTCTG-3’ 30 sec, 94°C Runx2 92

5’-CATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3’ 30 sec, 57°C 30 sec, 72°C 35 cycles:

5’-GAGATGGACAAGTTCCCCTT-3’ 45 sec, 94°C AP 518

5’-TTGAAGCTCTTCCAGGTGTC-3’ 45 sec, 54°C 45 sec, 72°C 35 cycles:

OPN 5’-GCCGAGGTGATAGTGTGGTT-3’ 101 30 sec, 94°C 5’- TGAGGTGATGTCCTCGTCTG-3’ 30 sec, 57°C 30 sec, 72°C 35 cycles:

5’-AAGGTCATGCTGGTCTTGCT-3’ 30 sec, 94°C Coll-I 114

5’-GACCCTGTTCACCTTTTCCA-3’ 30 sec, 57°C 30 sec, 72°C 35 cycles:

5’-CGCAGCCACCGAGACACCAT-3’ 45 sec, 94°C OCN 400

5’-AGGGCAAGGGGAAGAGGAAAGAAG-3’ 45 sec, 60°C 45 sec, 72°C

Esempio 8: Preparazione dei campioni cellulari per le analisi quantitative Per i seguenti saggi (contenuto di DNA e OCN), i campioni cellulari sono stati coltivati per una settimana in fiasche T25 (n=3). Entrambi i saggi sono stati condotti in cascata sugli stessi campioni. Inoltre allo scopo di tener conto dell’errore dell’operatore i singoli campioni sono stati analizzati in triplicato. In breve, il mezzo di coltura à ̈ stato rimosso con cautela dai campioni cellulari ed à ̈ stata aggiunta ddH2O; successivamente i campioni sono stati congelati a -20°C e così conservati fino a quando i saggi non sono stati effettuati. Per ottenere i lisati cellulari, i campioni sono stati sottoposti a 2 cicli di congelamento/scongelamento: congelamento overnight a -20°C, scongelamento per 10 min a 37°C in bagnetto ad acqua, e successivamente agitati per 15s per permettere la solubilizzazione di DNA e proteine.

9.Saggi preliminari

La Figura 1 mostra un modello schematizzato che riproduce l'invenzione.

9.1. Per prima cosa, gli HOBs sono stati esposti a mezzo contenente BNNTs. Dispersioni stabili di BNNTs nel mezzo di coltura sono state ottenute utilizzando PLL come agente di dispersione. PLL à ̈ un polimero citocompatibile con gruppi amminici terminali positivi. Dopo 24, 48, 72 h di incubazione con differenti concentrazioni di PLL-BNNTs (5, 10 and 15 Î1⁄4g/ml), la vitalità degli HOBs non era diversa rispetto ai controlli (Figura 2). Gli HOBs non hanno mostrato una diminuzione statisticamente significativa dell’attività metabolica in seguito ad incubazione con PLL-BNNTs alle concentrazioni usate (in tutti i casi p > 0.05 rispetto ai controlli). Gli esperimenti successivi sono stati condotti utilizzando la dose di 10 Î1⁄4g/ml.

9.2. Il saggio di fluorescenza con BNNTs fluorescenti ha evidenziato che l’internalizzazione dei BNNTs negli osteoblasti umani avviene dopo 6 ore di incubazione delle cellule con mezzo contenente BNNTs (Figura 3).

9.3. L’internalizzazione dei BNNTs da parte dei HOBs à ̈ stata confermata anche mediante TEM. L’analisi con TEM ha evidenziato che nanoparticelle non organiche aventi forme e dimensione compatibile con i detti BNNTs, possono essere rilevate in vescicole citoplasmatiche solamente in campioni di cellule trattate (Figura 4). L’internalizzazione avviene per endocitosi.

10. Effetto dei nanotrasduttori e US in colture di HOBs

10.1 Contenuto di DNA

Il contenuto di DNA doppio filamento (ds-DNA) nei lisati cellulari à ̈ stato misurato usando il PicoGreen kit (Molecular Probes, Eugene, OR). Il colorante PicoGreen si lega al ds-DNA e l’intensità di fluorescenza risultante à ̈ direttamente proporzionale alla concentrazione di ds-DNA presente in soluzione. Campioni di riferimento contenenti concentrazioni di DNA in ddH2O nell’intervallo 0-6 mg/ml sono stati preparati e 50 ml del campione di riferimento o del campione da misurare sono stati caricati per la quantificazione in una piastra da 96 pozzetti. Soluzioni tampone e soluzione del colorante PicoGreen, preparate secondo le istruzioni del fornitore, sono state aggiunte in quantità di 100 e 150 ml/pozzetto rispettivamente. Dopo 10 min di incubazione al buio a temperatura ambiente, l’intensità di fluorescenza à ̈ stata misurata al lettore di piastra (Victor<3>, PerkinElmer Inc., MA, USA) usando come lunghezza d’onda di eccitazione 485 nm e come lunghezza di emissione 535 nm. Il numero di cellule à ̈ stato calcolato considerando la seguente relazione: 1 cellula diploide umana=7.18 pg DNA.

10.2. Produzione di osteocalcina (OCN)

L’osteocalcina (acido γ-carbossiglutammico) à ̈ una proteina altamente specifica dell’osso, sintetizzata dagli osteoblasti, che può essere considerata un marker di attività metabolica specifico di queste cellule. OCN à ̈ stata dosata negli stessi lisati impiegati per valutare l’attività dell’ALP e il contenuto di DNA, usando un ELISA immunoenzimatico N-MID Osteocalcin kit (Cobas, Roche, Indianapolis, IN, USA), in accordo con le indicazioni del produttore.

10.3. Analisi citochimica per la matrice di calcio

La maturazione degli HOBs à ̈ stata investigata attraverso colorazione di Von Kossa, dimostrando il deposito di una matrice di idrossiapatite. Gli HOBs cresciuti su vetrini sono stati fissati con formalina all’1% (Bio-Optica) per 10 min a 4ËšC e colorati per 15 min con 1% di nitrato d’argento (Fluka, Millwaukee, WI, USA and Sigma). La colorazione à ̈ stata sviluppata incubando le cellule con pirogallolo 0.5% (Fluka) e quindi agitandole 5 volte con 5% di sodio tiosolfato (Fulka) per 5 min. Infine, le cellule sono state controcolorate con 0,1% del colorante nuclear fast red (Fluka). I campioni sono stati disidratati e montati con DPX (Fluka). Il deposito di minerale à ̈ stato valutato come granuli neri usando microscopia a luce ottica.

10.4. Metodo di Analisi statistica

La valutazione dei dati à ̈ stata eseguita attraverso analisi di varianza (ANOVA) seguita da Student's t-test per la valutazione di significanza, posta al 5%. Il test MTT à ̈ stato ripetuto sei volte; tutti gli altri test tre volte. In ogni test ogni esperimento à ̈ stato ripetuto indipendentemente tre volte. I risultati sono riportati come valore medio ± SEM.

10.5. Risultati

Le cellule HOBs sono state trattate a stimolazione combinata con BNNTs e US per una settimana come sopra indicato.

L’espressione dei geni che indicano la maturazione degli HOBs, precisamente di differenziazione precoce (Runx2, Coll I, AP e OPN) e tardiva (OPN, OCN) à ̈ stata investigata mediante RT-PCR. OPN ha un’ espressione bimodale, che può essere precoce nella fase proliferativa e tardiva durante l’inizio della mineralizzazione. I risultati sono riportati in Figura 5. L'amplificazione per RT-PCR ha evidenziato l'effetto della elettrostimolazione sulla differenziazione degli HOBs a seguito di trattamento singolo (BNNTs o US) o combinato (BNNTs e US). In particolare, Runx2 à ̈ risultato depresso dai BNNTs, mentre I livelli di espressione di OPN sono stimolati dagli US. L’espressione di Coll I à ̈ invariata, mentre le espressione di AP e OCN sono sinergisticamente influenzate dai trattamenti combinati con BNNTs e US. In particolare AP à ̈ depresso più dagli US che dai BNNTs, e il trattamento combinato (BNNTs+US) ne riduce ulteriormente l’espressione. Inversamente, l'espressione di OCN à ̈ stimolata da entrambi i trattamenti singoli, ma raggiunge i livelli massimi a seguito del trattamento combinato (BNNTs+US).

Inoltre, la sintesi di OCN, proteina altamente specifica dello stato tradivo degli osteoblasti, successiva all’attivazione del gene OCN, à ̈ stata quantificata (Figura 6). La sintesi di OCN negli HOBs à ̈ aumentata da un singolo trattamento con US (lievemente) e da un singolo trattamento con BNNTs (altamente). Tuttavia la produzione di OCN in cellule a seguito di trattamento combinato con BNNTs e US à ̈ stata massima ed ha evidenziato un effetto sinergistico.

Infine, l’analisi citochimica con colorazione di von Kossa su vetrino ha rivelato la più alta sintesi di depositi di calcio (colorazione nera) in campioni soggetti al trattamento combinato (Figura 7). Il deposito della matrice di calcio avviene negli osteoblasti maturi come fase tardiva di maturazione.

Conclusioni

I nostri notevoli risultati evidenziano che questo trattamento combinato influenza il sistema cellulare in una maniera specifica che non à ̈ semplicemente dovuta alla somma dei singoli stimoli. In particolare, nei campioni trattati con BNNTs+US, à ̈ stata osservata downregolazione di geni precoci (Runx2, AP) e up-regolazione di geni tardivi (OPN and OCN). OCN à ̈ un marker altamente specifico della fase tardiva dell’osteogenesi che indica differenziazione degli osteoblasti maturi e mineralizzazione in corso. L’attuale produzione di OCN à ̈ stata quantizzata ed à ̈ risultata essere di 27 fg/cellula. Infine, l’induzione del deposito di calcio à ̈ stata dimostrata attraverso citochimica. Quindi possiamo concludere che i BNNTs agiscono come nanotrasduttori intracellulari promuovendo la maturazione degli osteoblasti in vitro in seguito a stimolazione ultrasonica.

Claims (21)

1. RIVENDICAZIONI 1. Nanotrasduttori piezoelettrici per uso in un trattamento in vivo di stimolazione cellulare attraverso stimolazione elettrica comprendente le seguenti fasi: si localizzano i nanotrasduttori in un sito bersaglio; si induce uno stimolo elettrico nello stesso sito attraverso una stimolazione esterna dei nanotrasduttori con onde ultrasoniche.
2. 2. Nanotrasduttori piezoelettrici secondo la rivendicazione 1 in cui i nanotrasduttori sono resi biocompatibili mediante rivestimento con polimeri farmaceuticamente accettabile.
3. 3. Nanotrasduttori piezoelettrici secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 e 2 in cui i nanotrasduttori sono funzionalizzati con ligandi specifici aventi affinità per il sito bersaglio e/o con molecole marcatrici che ne permettano la tracciabilità.
4. 4. Nanotrasduttori piezoelettrici secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui il nanotrasduttore piezoelettrico à ̈ un nanotubo di nitruro di boro.
5. 5. Nanotrasduttori piezoelettrici secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4 in cui i nanotrasduttori sono dispersi in forma non aggregata in una sospensione stabile.
6. 6. Nanotrasduttori piezoelettrici secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in cui detto trattamento à ̈ un trattamento rigenerativo o ricostruttivo di tessuti o trattamento del dolore o trattamento di cicatrizzazione di tessuti danneggiati.
7. 7. Nanotrasduttori piezoelettrici secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui la localizzazione del nanotrasduttore avviene per internalizzazione cellulare.
8. 8. Nanotrasduttori piezoelettrici secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, in cui il sito bersaglio comprende cellule muscolari, mioblasti, cellule neuronali, cellule muscolari cardiache, osteoblasti, osteoclasti, cellule staminali, cellule sensoriali quali cellule ciliate dell'orecchio interno, coni e bastoncelli della retina, cellule del gusto, del tatto e dell'olfatto.
9. 9. Preparazione farmaceutica comprendente nanotubi piezoelettrici capaci d'essere stimolati da un campo ultrasonico remoto ed un eccipiente farmaceuticamente accettabile per uso in un trattamento di elettroterapia.
10. 10. Preparazione farmaceutica secondo la rivendicazione 9 in forma liquida comprendente detti nanotubi dispersi in forma non aggregata ed un polimero biocompatibile come disperdente.
11. 11. Preparazione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 o 10 comprendente i nanotubi piezoelettrici incapsulati in microbolle lipidiche o fosfolipidiche contenenti un gas innocuo.
12. 12. Preparazione farmaceutica secondo le rivendicazioni 9 o 11, in cui i nanotubi sono resi biocompatibili mediante rivestimento con polimeri farmaceuticamente accettabile e/o funzionalizzati con ligandi specifici aventi affinità per un sito bersaglio e/o con molecole marcatrici che ne permettano la tracciabilità.
13. 13. Preparazione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 a 12, in cui i nanotubi sono nanotubi di nitruro di boro.
14. 14. Supporto (scaffold) polimerico o ceramico di crescita cellulare o di ingegneria tessutale, in vitro o in vivo, comprendente nanotrasduttori piezoelettrici capaci di produrre uno stimolo elettrico a seguito di stimolazione esterna con ultrasuoni.
15. 15. Supporto secondo la rivendicazione 14, in cui i nanotrasduttori sono resi biocompatibili mediante rivestimento con polimeri biologicamente accettabile e/o funzionalizzati con ligandi specifici e/o con molecole marcatrici che ne permettano la tracciabilità.
16. 16. Supporto (scaffold) secondo la rivendicazione 14 o 15, in cui i trasduttori piezoelettrici sono nanotubi di nitruro di boro.
17. 17. Metodo di preparazione dei supporti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 14 a 16, comprendente le seguenti fasi: si disperdono i nanotrasduttori piezoelettrici in una soluzione o dispersione o emulsione contenente il polimero o i suoi monomeri, si rimuove il mezzo liquido con ottenimento di una matrice solida o semisolida contenete i nanotrasduttori.
18. 18. Metodo in vitro di stimolazione cellulare attraverso stimolazione elettrica comprendente le seguenti fasi: si disperdono i nanotrasduttori piezoelettrici nel mezzo di coltura o in supporti di crescita cellulare, si incubano le cellule in detto mezzo coltura o supporto di crescita, si induce uno stimolo elettrico attraverso una stimolazione dei nanotrasduttori con un campo ultrasonico esterno al mezzo di coltura o supporto di crescita.
19. 19. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui i supporti di crescita sono scaffold polimerici o ceramici per ingegneria tessutale o impianto o substrati di adesione.
20. 20. Metodo secondo la rivendicazione una qualsiasi delle rivendicazioni 18 o 19, in cui i nanotrasduttori sono resi biocompatibili mediante rivestimento con polimeri farmaceuticamente accettabile e/o funzionalizzati con ligandi specifici aventi affinità per la cellula bersaglio e/o con molecole marcatrici che ne permettano la tracciabilità.
21. 21. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 18 a 20, in cui il trasduttore à ̈ un nanotubo di nitruro di boro.