ITFI20080247A1 - Impiego di lattobacilli inibenti batteri coliformi gasogeni isolati da lattanti affetti da coliche gassose. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Background dell'invenzione

Le coliche infantili rappresentano uno dei più frequenti disturbi nei primi tre mesi di vita, con un'incidenza variabile dal 5% al 40%i; possono essere descritte come sindrome clinica caratterizzata da improvvise crisi di pianto parossistico e inconsolabile che durano circa 2-20 minuti, accompagnate da agitazione e arrossamento del volto in un lattante che si presenta altrimenti in buone condizioni di salute. Durante la crisi di pianto il bambino può presentarsi con le gambe flesse sull'addome o iperestese, i pugni chiusi, gli occhi serrati o sbarrati, la fronte corrugata,congestione al volto. Numerosi possono essere i sintomi di accompagnamento, tra cui distensione addominale, meteorismo e flatulenza2. Normalmente le crisi, spontanee e imprevedibili,iniziano alla stessa ora ogni giorno e sono più frequenti nel tardo pomeriggio e nelle prime ore della notte. Vi sono controversie anche nel decidere quale sia la migliore definizione da dare a questa condizione. Un preciso inquadramento nosografico del disturbo à ̈ stato fornito da Wessel nel 1954 con la "regola del tre" secondo cui sarebbe affetto da coliche un lattante soggetto a parossismi di irritabilità con agitazione o pianto della durata di più di tre ore al giorno, con frequenza pari ad almeno tre giorni alla settimana, per più di tre settimane consecutive3. Le coliche compaiono prima della sesta settimana di vita nel 90% dei lattanti e si risolvono spontaneamente entro i quattro mesi nella maggior parte dei casii. E' possibile riscontrare quadri clinici di severità variabile: le coliche possono, infatti, essere distinte in lievi, moderate o severe, sebbene non vi siano tuttora delle linee guida per

l'entità .

L'eziologia delle coliche infantili non à ̈ ancor

completamente chiarita5 ed à ̈ verosimilmente da considerare multifattoriale . Dai dati ad oggi disponibili si ritiene che i principali fattori eziologici siano da dividersi in tre gruppi di disordine: psicosociale, gastrointestinale e di sviluppo neurologico.

I fattori psicosociali riguardano in particolare quegli effetti comportamentali del lattante alterati da un'atipica cura parentale o da problemi nell'interazione prole-genitori. I disordini gastrointestinali sono soprattutto causati da tecniche improprie di alimentazione del lattante come, alimentazione artificiale in bottiglia e/o in posizione orizzontale, che ostacola la suzione, quindi dalla mancanza del classico "ruttino". Per questi motivi l'allattamento materno nei primi sei mesi di vita à ̈ considerato essere un fattore sostanziale di riduzione del rischio di insorgenza delle coliche, che nei lattanti non allattati al seno, à ̈ di 1.86 volte più alto rispetto ai primi6. Lothe et al.7 specificano che le contrazioni dolorose tipiche delle coliche derivano da un'allergia al latte vaccino o da intolleranza al lattosio, tuttavia, dati recenti sostengono che forme di ipersensibilità al cibo sono responsabili dello sviluppo delle coliche solo in una minoranza di casi; tale tesi à ̈ supportata da prove fatte su un gruppo di lattanti cui veniva somministrato esclusivamente latte ipoallergenico nel trattamento del disturbo8.

Lattanti con coliche sono considerati essere a maggiore rischio di sviluppo di allergie; eppure, ricerche recenti hanno mostrato che markers di atopia, variabilità e picchi nelle manifestazioni di disturbi quali riniti allergiche, asma o episodi di ansimazioni, sono risultati comparabili negli infanti con le coliche e senza9. Anche il malassorbimento del lattosio, à ̈ valutato tra i fattori di disordine gastrointestinale probabilmente coinvolti nell'insorgenza delle coliche infantiliio,1 .

Da studi fatti per valutare l'esistenza di differenze nei livelli di ormoni gastrointestinali (GIT) tra i lattanti con le coliche e i controlli sani, à ̈ risultato che la motilina, peptide intestinale vasoattivo, à ̈ presente con livelli decisamente più elevati nei primi rispetto al gruppo di controllo. Tale differenza si nota sin dal primo giorno di vita dell'infante che in seguito svilupperà il disturbo e suggerisce il definirsi di un'anormale fisiologia dei GIT collegata all'insorgenza delle colichei2.

Disordini dello sviluppo neurologico potrebbero essere causa di un'eccessiva attività peristaltica intestinale che a sua volta genererebbe crampi addominali favorendo la comparsa delle coliche infantili. La tesi à ̈ supportata dal fatto che la somministrazione di agenti anticolinergici al lattante diminuisce i sintomi delle colichen. Inoltre, il fatto che la quasi totalità dei soggetti con coliche gassose aumenta la gravità di tutte le sintomatologie collegate al disturbo durante i primi 4 mesi di vita, da sostegno alla teoria che considera il disordine dello sviluppo neurologico una concausa del manifestarsi del disagio nell'infante1 .

Negli ultimi anni sono aumentati i dati a favore di un coinvolgimento della flora batterica intestinale nella patogenesi delle coliche: recenti ricerche sperimentali suggeriscono che l'alterazione dell'ambiente microbico nei bambini affetti da coliche potrebbe determinare una disregolazione della funzione motoria intestinale e un aumento della produzione di gas, che, risolvendosi in flatulenza eccessiva, rappresenta uno dei sintomi classici del disturbo15. Diversi studi sostengono tale teoria, infatti, à ̈ ben documentato che lattanti affetti da coliche gassose siano più frequentemente colonizzati da Clostridium difficile, un microrganismo gas-produttore, rispetto ai lattanti sanii6. Una differenza, questa, che persiste lungo tutti i tre mesi nei quali il disturbo si manifesta in tutta la sua gravità, quindi scompare. In merito all'eccessiva produzione di gas, ancora poco si conosce, soprattutto circa la potenziale e diretta responsabilità di un definito microbiota nell'accumulo intestinale di gas, mentre sembra più chiaro, che la natura e la qualità della dieta del lattante, capace di influire a sua volta sulla composizione di quello, possa valere, limitandola, sulla produzione di gas. Difatti, diversi studi hanno ipotizzato che quantità straordinarie di gas siano prodotte dalla fermentazione, mediata dai batteri intestinali, dei carboidrati indigeriti. Recentemente à ̈ stato dimostrato che quantità significativamente inferiori di metano rispetto ai controlli, sono prodotte dai campioni fecali di lattanti con coliche e ciò potrebbe essere conseguenza di un'inabilità della flora batterica a convertire H2 in CH4con conseguente accumulo gastrointestinale di H217. Inoltre, dati ulteriori, sono a favore di una tesi per cui bambini con coliche producono maggiori quantità di H2 rispetto ai controlli quando e se allattati al seno materno ed à ̈ presumibile che ciò derivi da una forma di intolleranza al lattosio o da malassorbimento dello stesso18 (lΉ 2, à ̈ infatti prodotto del metabolismo intestinale del lattosio).

Di particolare interesse à ̈ poi la differenza nella produzione di gas sulfurei tossici come H2S e CH3SH, per il ruolo che questi avrebbero in certi disordini intestinali non trascurabili. Tuttavia, sebbene sia ormai opinione generale che la produzione di gas da parte dei batteri fermentanti del colon favorisca l'insorgenza delle coliche e diversi siano le strategie suggerite per ridurne la formazione intraluminale, tali opinioni restano ancora meramente speculative e non sono ancora state supportate da lavori scientifici ben impostati. Scopo del presente brevetto à ̈ dimostrare come taluni fermenti lattici ed in particolare ceppi riferibili alla specie Lactobacillus delbrueckii, siano in grado di inibire lo sviluppo di batteri coliformi produttori di gas per fermentazione dei carboidrati ed in particolare del lattosio e quindi essere potenzialmente idonei, se usato come probiotici, per il trattamento delle coliche gassose dei lattanti .

Esiste già uno studio pilota che associa all'eccessivo sviluppo dei batteri del piccolo intestino i sintomi propri delle coliche infantili19. Recentemente, l'esame di colture fecali ottenute da lattanti con e senza coliche, insieme all'evidenza degli effetti benefici che la somministrazione di certe specie di batteri lattici ha nella cura delle coliche infantili, ha avanzato la possibilità che questi disturbi possano risultare dalla particolare ed aberrante composizione del microbiota intestinale19,20.

Il microbiota intestinale rappresenta un complesso e ben strutturato ecosistema, la cui natura e composizione, ancora oggi, non si può dire del tutto definita. Si tratta di un consorzio di microrganismi presenti nel lume intestinale, i quali se convivono in un determinato equilibrio contribuiscono allo stato di salute dell'ospite e pertanto l'alterazione di una qualunque delle sue componenti può generare patologie di varia entità. Il colon à ̈ sede della maggiore proliferazione microbica: si contano circa 10<12>cellule batteriche per grammo di contenuto fecale, suddivise in più di 500 specie, di cui fino ad ora meno della metà sono state descritte e coltivate21. La colonizzazione del canale digerente à ̈ un processo piuttosto complesso, caratterizzato dallo sviluppo successivo di molte specie di microrganismi. Inizia subito dopo la nascita e nei primi giorni di vita, quando il neonato viene a contatto con i microrganismi dell'apparato genito-urinario della madre e con quelli presenti nel latte materno o artificiale. I primi microrganismi che occupano il tratto digerente consistono in stafilococchi, streptococchi, enterococchi ed Enterobacteriacae, ossia batteri aerobi o anaerobi facoltativi, che attraverso il consumo di ossigeno, creano un ambiente adeguatamente ridotto favorevole alla proliferazione di batteri anaerobi stretti, come Bacteroides e Bifidobacterium 22. La micropopolazione batterica dei neonati allattati al seno materno à ̈ composta per l'85% da

bifidobatteri , il cui numero aumenta durante la prima settimana concomitantemente ad una riduzione nel numero delle Enterobacteriacee 23. Nei neonati allattati artificialmente, che mostrano rispetto ai primi una più alta frequenza di infezioni intestinali, à ̈ presente invece una maggiore diversificazione dei gruppi microbici, essendovi oltre ai bifidobatteri, Bacteroides, fusobatteri, clostridi, forme cocciche ecc. (Ogawa et al.1992). Da questo momento in poi, la descrizione di come si componga la popolazione batterica nel colon del neonato, presenta numerose discordanze in letteratura, probabilmente dovute alle differenze individuali, alimentari e ambientali, che si traducono in diversità microbiologiche a livello del microbiota.

L'iniziale colonizzazione à ̈ quindi estremamente importante per la composizione del microbiota intestinale dell'adulto, descritto come uno dei più complessi ecosistemi batterici noti. In un ecosistema gastrointestinale stabile, tutti i diversi habitats e nicchie accolgono una micropopolazione specifica, che si adatta alle condizioni locali.

Recentemente, per valutare il ruolo dei batteri coliformi produttori di gas nell'eziologia delle coliche infantili, à ̈ stato condotto, presso il Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell'Università di Bologna e il Dipartimento Pediatrico dell'Ospedale Regina Margherita di Torino, uno studio prospettico randomizzato nel quale sono stati reclutati 49 lattanti affetti da coliche infantili e 35 lattanti sani, adeguati all'età gestazionale, di età compresa tra 20 e 90 giorni, alimentati esclusivamente al seno e in assenza di malattie a carico dell'apparato gastroenterico24. Campioni fecali sono stati raccolti da entrambi i gruppi di lattanti a tempi prestabiliti ed esaminati entro le 48 ore successive. Lo studio, ha avuto lo scopo di stabilire se nei due gruppi di lattanti esistevano differenze quali / quantitative significative in riferimento alla presenza di batteri coliformi gasogeni. Tipici generi inclusi nel gruppo dei coliformi sono: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia coli, Klebsiella ed altri gruppi minori. L'identificazione delle specie più rappresentative isolate dai campioni fecali, à ̈ stata effettuata a livello molecolare mediante tecniche di PCR (Polymerase Chain Reaction) e Ribotipizzazione in automatico. E' stata infine esaminata la capacità delle colonie microbiche isolate di produrre gas mediante fermentazione del lattosio e di altri zuccheri.

L'identificazione molecolare e fenotipica delle varie specie di coliformi ha mostrato un differente pattern di colonizzazione nei due gruppi, con e senza coliche, ed in particolare, la concentrazione della specie Escherichia coli à ̈ risultata significativamente più alta nel gruppo di lattanti con coliche [(6.04 Log10versus 4.47 Log10)CFUg-1di feci]. È quindi probabile che proprio l'anomala concentrazione di questa specie possa concorrere allo sviluppo del disturbo, tuttavia, resta ancora da chiarire quale sia il ruolo da assegnare ad Escherichia coli nell'ambito di tale patologia. Non à ̈ irragionevole associare l'abbondanza di specie di coliformi nei lattanti affetti dalla patologia, osservata in questo nostro studio, con la diminuzione di qualche altra specie (sconosciuta) di batterio benefico per l'ospite. Situazione questa, che potrebbe avere diverse conseguenze e di varia entità, sullo stato di salute dell'ospite. Può tradursi, per esempio, in ridotta induzione delle cellule T reg (cellule linfocitarie regolatorie del sistema immunitario) da parte dei batteri benefici dell'intestino e quindi in una disregolazione immunitaria. Oltretutto, Escherichia coli e altre specie di coliformi da noi isolate, possono influenzare la produzione di citochine attraverso le cellule che presentano 1'antigene, e pertanto, alterare la differenziazione delle cellule T25.

Tutte queste attività, possono riflettersi sulla permeabilità della barriera intestinale, facilitando la penetrazione degli antigeni innocui e quindi la sensibilizzazione agli stessi26. Sono sempre più numerosi gli studi che sostengono l'esistenza di un legame fra le coliche gassose dei lattanti e fenomeni come ipersensibilità ed allergie alimentari, immaturità delle funzioni e della dismotilità intestinale. Talvolta le coliche sono la prima manifestazione di un disagio atopico.

Approssimativamente il 25% dei lattanti esibenti i sintomi più o meno gravi delle coliche gassose hanno coliche dipendenti da un'intolleranza alle proteine del latte vaccino27,28,29. Alterazioni del microbiota intestinale potrebbero anche essere correlate ad altre forme di atopia che si manifesterebbero più tardi, nella vita adulta del bambino, come l'eczema atopico. Tuttavia, molti studi occorrono ancora per provare se quelle alterazioni possano pure essere ricollegabili a fenomeni come asma,rinocongiuntiviti e allergie alimentari persistenti .

In un recente lavoro sull'impiego dei probiotici nel trattamento delle coliche dei lattanti nutriti al seno, à ̈ stato trovato che un lattobacillo, Lactobacillus reuteri, può realmente essere efficace nel ridurre in modo significativo non soltanto la durata, ma anche l'intensità e la frequenza delle crisi di piantosi.

D'altra parte, à ̈ stato dimostrato, che lattanti con coliche sono meno frequentemente colonizzati da lattobacilli e da bifidobatteri rispetto a quelli sani, mentre presentano una concentrazione più elevata di batteri Gram-negativi anaerobÃŒ32. Un altro studio ha invece analizzato i patterns di lattobacilli presenti nell'intestino dei due gruppi di lattanti messi a confronto verificando che: Lactobacillus lactis e Lactobacillus brevis, produttori di alcol etilico e CO2, sono presenti solo nei lattanti con coliche infantili, mentre Lactobacillus acidophilus à ̈ presente solo nei lattanti sani33. Questa diversità di ceppi potrebbe essere responsabile, fra le altre cose, dell'aumento del meteorismo e della flatulenza tipici di tale patologia. In presenza di una flora microbica aberrante, si verificano, dunque interazioni inappropriate tra i patogeni intestinali e i recettori toll-like (TLRs), espressi sulla superficie delle cellule intestinali che presentano l'antigene34.

I risultati ottenuti avvalorano l'ipotesi secondo cui il dismicrobismo intestinale sarebbe implicato nella patogenesi delle coliche, sebbene il meccanismo d'azione non sia ancora completamente chiarito. Pertanto à ̈ stata valutata la possibilità di agire sui sintomi delle coliche infantili attraverso la modulazione del microbiota intestinale in senso benefico per l'ospite, che à ̈ diventata realtà con l'impiego dei probiotici35.

Si definisce probiotico un supplemento dietetico a base di microrganismi vivi che, assunto in quantità adeguata, conferisce un effetto benefico all'organismo ospite, migliorando l'equilibrio microbico intestinale (Guarner e Schaafsma, 1998). E' implicito nella definizione stessa che il consumo di probiotici può agire sulla composizione del microbiota intestinale. I probiotici pertanto, in tal senso, possono rappresentare una nuova importante strategia terapeutica. Negli ultimi anni sono stati condotti numerosi studi sull'efficacia di questi agenti microbici e i risultati ottenuti sono incoraggianti. L'impatto sull'ecosistema intestinale à ̈ ben documentato e dovrebbe tradursi in tutti, o in buona parte, dei seguenti effetti benefici verso l'ospite: stabilizzazione e modulazione della composizione della micropopolazione intestinale (diminuzione del numero di batteri putrefattivi quali clostridi, bacteroides e coliformi e di quelli ureolitici); aumento della resistenza alle malattie infettive, in particolare dell'intestino; diminuzione dei disturbi e della durata dei fenomeni diarroici; diminuzione della pressione del sangue; riduzione della concentrazione di colesterolo sierico; riduzione dei sintomi dell'intolleranza al lattosio ed alleviamento della costipazione; diminuzione dei fenomeni allergici; stimolazione della fagocitosi mediata dai leucociti del sangue periferico; modulazione dell'espressione dei geni delle citochine e della risposta infiammatoria intestinale; regressione dei tumori e riduzione nella produzione di carcinogeni o di co-carcinogeni .

Oggi, la ricerca mette a disposizione microrganismi ad attività probiotica in grado di svolgere un'azione competitiva nei confronti dei patogeni intestinali e di esplicare in particolare evidenti attività immunomodulanti. Le specie più comunemente utilizzate e studiate appartengono ai generi Lactobacillus e Bifìdobacterium, che sono in grado di sopravvivere al passaggio attraverso il tratto digestivo e di proliferare nell'intestino36.

Le interazioni funzionali fra probiotici da una parte ed epitelio intestinale, sistema immune mucosale e sistema immune sistemico dall'altra, sono alla base dei meccanismi diretti ed indiretti degli effetti benefici di questi batteri. Fra gli effetti extraintestinali meglio documentati vi à ̈ l'incremento della funzione di barriera intestinale e la modificazione della risposta immune. Quest'ultima dipende in larga parte dal sito di interazione tra il probiotico e gli effettori della risposta immunitaria, topograficamente collocati nel tratto intestinale37. Esistono evidenze, in vitro ed in vivo, di effetti diversi che ceppi probiotici avrebbero sui meccanismi specifici della risposta immune, dalle quali si desume che non tutti i probiotici avrebbero lo stesso interlocutore iniziale (cellule immunitarie, enteroliti) . Infatti, à ̈ ormai dato acquisito che tali effetti siano ceppo-specifici e non specie-specifici ed inoltre, che, l'impiego combinato di più ceppi, comune nella preparazione di preparati alimentari probiotici, può portare a seconda dei casi sia ad un'azione sinergica che ad una antagonistica. Il target di un certo probiotico può pertanto essere determinante per il suo effetto immunomodulante, che si esplica sia su meccanismi sistemici che su quelli extrasistemici. In altri termini questi microrganismi possono influenzare l'incidenza delle infezioni stimolando l'immunità innata oppure intensificando i meccanismi dell'immunità cellulare o umorale38.

L'imprinting immunologico si realizza nei primi giorni di vita, quando nei neonati vi à ̈ una fisiologica prevalenza delle citochine Th2, compatibile con uno stato

inf iammatorioallergico . Batteri autoctoni intestinali come sono i lattobacilli ed i bifidobatteri, modulano la risposta immunitaria verso un profilo Thl, contro-regolando la risposta IgE mediata e stimolando la produzione di IgA secretorìe39. In particolare Christensen et al. Dimostrarono che co-culture di differenti batteri lattici probiotici esercitano effetti immunomodulanti sulla capacità delle cellule dendritiche (DCs) di promuovere la risposta

infiammatoria a livello dei fattori Thl/Th2/Th3/Trl/Treg e delle citochine proifiammatorie come 11-6, 11-10, 11-12 e TNF-CUo.

Pertanto, l'imprinting microbiologico post natale condiziona le prime fasi dello sviluppo del sistema immunologico e ne à ̈ successivamente controllato con un meccanismo omeostatico4i.

Le terapie antibiotiche e gli eventi infettivi inducono modificazioni rapide del microbiota intestinale, mentre le condizioni igieniche e l'alimentazione inducono modificazioni lente. In particolare l'introduzione diretta con la dieta di ceppi probiotici come sono le miscele di lattobacilli, può essere impiegata come fine approccio terapeutico e alternativo per controbilanciare un ambiente intestinale proinfiammatorio .

I lattobacilli sono un gruppo di batteri Gram-positivi, anaerobi facoltativi, non patogeni che producono acido lattico come primo prodotto del metabolismo, rappresentano un costituente fondamentale del microbiota intestinale e svolgono un ruolo predominante nello sviluppo del sistema immunitario nei primi mesi di vita. Una grande varietà di ceppi di differenti specie di batteri lattici sono ampiamente usati in preparati probiotici, in particolare Lactobacillus rhamnosus (LGG) e Lactobacillus reuteri.

Quest'ultimo à ̈ stato tra i primi agenti microbici ad essere sperimentato nel trattamento delle coliche infantili. L. reuteri e' una specie indigena del tratto gastrointestinale dell'uomo, influenza positivamente la colonizzazione intestinale ed à ̈ stato rinvenuto nei prelievi bioptici a livello di stomaco, duodeno e ileo, in cui svolge un'attività immunomodulatoria42,<i3. Questo lattobacillo presenta numerose caratteristiche, fra cui la capacità di aderire alla mucosa del tratto gastrointestinale per creare un biofilm protettivo; di produrre sostanze con attività antimicrobica mediante le quali inibisce la crescita di microrganismi patogeni; di convertire il glicerolo in reuterina (una sostanza antimicrobica a largo spettro di azione ma che lascia inalterata la normale microflora dell'ospite); di modulare la risposta immunitaria attraverso le cellule CD4+T-helper nell'ileo; di mantenere l'equilibrio tra linfociti Thl/Th2 e la produzione di citochine; infine, di aumentare il numero delle cellule che producono le IgA nella mucosa intestinale44. Lactobacillus reuteri può essere pertanto considerato una valida alternativa alle altre opzioni terapeutiche, in particolare antibiotiche, nel trattamento delle coliche

infantili45. Ulteriori studi sono però richiesti per valutare il ruolo di altri microrganismi probiotici e per individuare ceppi anche più efficaci nella risoluzione dell'evento patologico .

Attualmente, non ci sono cure specifiche per i bambini affetti da coliche gassose.

Il paradigma di cura predominante consiste nella combinazione di metodi farmacologici e non-farmacologici per individuare la strategia ottimale nel ridurre dei sintomi del disturbo e per riequilibrare i parametri compromessi. La manipolazione della dieta del lattante e delle tecniche di alimentazione come l'uso di latte ipoallergenico, preparati di soia privi di lattosio e/o precoce alimentazione del bambino con alimenti solidi, sono interventi terapeutici tipici; tuttavia, non si sono visti ancora risultati realmente efficaci, se non su basse percentuali (25%) dei bambini trattati1. Il trattamento farmacologico alternativo, consiste invece nella prescrizione di sostanze appartenenti alla categoria degli alcaloidi (belladonna) o degli oppiacei (antidolorifici di varia natura) che possono però favorire effetti indesiderati come depressione respiratoria e costipazione. Farmaci anticolinergici, con effetti simili a quelli delle atropine come l'isociamina (LEVISINE®, o GASTROSED®) e la diciclomina, dilatano le pupille, causano tachicardia, diminuiscono la produzione di saliva, causano spasmi dei tratti gastrointestinale, urinario e respiratorio. Tuttavia gli anticolinergici risultano essere gli unici farmaci che abbiano mostrato di ridurre con reale efficacia i sintomi più critici delle coliche gassose; sfortunatamente, più del 5% dei lattanti trattati ha evoluto effetti collaterali come difficoltà respiratorie, fenomeni di apnea, asfissia e ipotonia muscolare46,47. Infine, sono risultati efficaci nella cura delle coliche quei farmaci non prescrivibili ad azione sedativa ed analgesica come il BENADRYL®. Ciò nonostante, il loro uso à ̈ fortemente limitato nel trattamento delle coliche causa dei pesanti effetti collaterali che potrebbero generarsi, soprattutto laddove vi sono già deficienze respiratorie48 .

Detto questo, resta che il più sicuro ed efficace prodotto ad oggi noto nel trattamento delle coliche gassose, à ̈ il simeticone o il dimeticone; una sostanza non assorbibile dal tratto gastroenterico che riduce la flatulenza ed il meteorismo delle coliche gassose associando a tale beneficio la mancata segnalazione di anomalie nei lattanti ai quali il prodotto à ̈ stato somministrato nel lungo periodo di commercializzazione, insieme all'assenza di azione teratogena sugli animali di laboratorio. Il simeticone, quindi, à ̈ frequentemente raccomandato nella cura delle coliche gassose, sebbene esistano studi tesi a confutarne l'efficacia reale in vivo sui bambini con coliche rispetto al placebo-49,5o.

Da quanto detto risulta chiaro che una reale, unanimemente riconosciuta e non confutata strategia di trattamento delle coliche gassose non sia ancora stata individuata e che al momento, l'unica "cura" realmente prescritta sia aspettare che il bambino superi i suoi primi 3 o 4 mesi di vita, per uscire naturalmente dalla fase critica del disturbo. E' chiaro altresì quanto necessario sia individuare metodi che possano vantare un profilo di efficacia e sicurezza nel trattamento delle coliche infantili.

Scopo dell'Invenzione

La presente invenzione riguarda l'uso di una formula addizionata con 2 ceppi diversi di microrganismi ad attività probiotica appartenenti al genere Lactobacillus, selezionati e valutati per l'efficacia dell'azione antiossidante oppure antibatterica e/o competitiva che esibiscono, quest'ultima, nei confronti di specie di batteri coliformi isolati da lattanti affetti da coliche gassose. Decine di ceppi di batteri coliformi, produttori di gas per fermentazione degli zuccheri ed in particolare del lattosio, sono stati isolati da feci di lattanti affetti da coliche gassose per valutare in vitro l'inibizione del loro sviluppo da parte dei lattobacilli presi in considerazione. In base ai nostri dati preliminari, che sono oggetto di una pubblicazione in corso di stampa, l'uso di questa formula probiotica sembrerebbe efficace nella prevenzione dalle infezioni batteriche e nel contenimento dei sintomi gastrointestinali critici del disturbo in esame.

Descrizione dettagliata della parte sperimentale

Isolamento dei ceppi e condizioni colturali Allo scopo di quantificare e di esaminare la presenza di coliformi, campioni fecali sono stati raccolti da 49 lattanti affetti da coliche gassose, nutriti esclusivamente al seno, comparse 6 ± 1 giorni prima dell'arruolamento. L'isolamento dei ceppi à ̈ stato effettuato su piastre selettive di MacConkey Agar (DIFCO n. 0075.17.1), il terreno generalmente impiegato per l'isolamento e la quantificazione dei bacilli enterici (denominati "coliformi ") dopo averli posti nelle condizioni ideali di sviluppo: 37°C in atmosfera controllata.

Dopo 12 ore di incubazione le colonie che compaiono su piastra vengono contate e sono osservate accuratamente tutte le differenze morfologiche fra le colonie stesse. I risultati numerici sono riportati come Logiodi unità formanti colonia (CFU) per grammo di feci. Ogni colonia isolata viene quindi singolarmente ripresa ed inoculata in tubo liquido di LB (Luria-Bertani) per ottenere delle colture pure.

Identificazione delle colonie di coliformi

In totale sono state analizzate ai fini dell'isolamento delle specie più rappresentative del genere dei coliformi, 20 colture fecali, ottenute da feci di lattanti affetti da coliche gassose.

Il riconoscimento specie-specifico delle colonie à ̈ stato effettuato usando due differenti procedure di identificazione molecolare: la PCR primers specifica e l'analisi di Ribotipizzazione eseguita in automatico. La combinazione dei risultati ottenuti da entrambi i metodi, ha permesso di identificare con un elevato grado di accuratezza i ceppi isolati nonché di definire quali specie siano le più rappresentative della popolazione di coliformi che colonizza l'intestino dei lattanti affetti dalle coliche.

Infine ogni specie batterica à ̈ stata quantificata calcolando la percentuale con la quale, questa, rappresenta l'intera popolazione di coliformi isolata,

a. Ribotipizzazione in automatico

La ribotipizzazione ceppo specifica eseguita in automatico prevede l'uso di uno strumento estremamente sofisticato:

RiboPrinter Microbial Characterization System (Qualicon Ine., Wilmington, DE, USA). Le colonie batteriche isolate su piastra sono prese singolarmente, dopo una fase di step termico e attraverso l'uso di enzimi litici viene ottenuto il rilascio del DNA che viene olivato dall'endonucleasi di restrizione EcoRl infine i frammenti di DNA, separati mediante elettroforesi su gel, sono analizzati con la tecnica del Southern Blotting modificata. L'analisi di ibridizzazione si traduce in un'immagine di bande separate chemio luminescenti che lo strumento trasforma in un dato elettronico, o Riboprinter pattern, che cattura e conserva in memoria. L'identificazione finale deriva dal confronto del nostro Riboprinter pattern con quanti sono immagazzinati nel database Dupont dello strumento. I profili con una similarità almeno uguale al 93%, come calcolato attraverso un appropriato algoritmo, sono combinati per formare un Ribogroup dinamico che riflette le relazioni o identità genetiche fra le colonie isolate,

b. PCR primers specifica

Al fine dell'identificazione molecolare dei batteri con formi sono stati amplificati i frammenti di DNA ribosomiale compresi fra gli spaziatori di trascrizione interni delle regioni 16S e 23S. Le colonie pure ed isolate su piastra sono state piccate singolarmente e risospese in acqua distillata sterile quindi sono state sate a 95°C per 5 min così da permettere il rilascio del DNA. Le reazioni di amplificazione sono state ottenute usando i primers universali 16S-for 5'-GCTGGATCACCTCCTTTC-3' ) and 23S-rev (5'-AGTGCCAAGGCATCCACC-3' ). Le reazioni di amplificazione sono state eseguite in un Biometra Thermal Cycler T Gradient (Biometra, Gottingen, Germany) impostando un programma di termocilco specifico.

Gli amplificati sono stati separati mediante elettroforesi su gel; i frammenti approssimativamente di 400 bp sono stati purificati usando un QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Germany), infine entrambi i frammenti di DNA amplificati con i primer 16S e 23S sono stati sottoposti all'analisi di sequenziamento in automatico.

Produzione di gas da parte dei batteri coliformi La capacità di produrre gas mediata da tutti i batteri coliformi isolati à ̈ stata valutata inoculando ogni singolo ceppo in un terreno liquido LB broth e/o in Lauryl sulphate tryptose (LST) broth, contenenti 10 g/L di lattosio come unica fonte di carbonio. 24-48 h successive l'inoculo e dopo incubazione a 35°C, le colture batteriche sono state esaminate per la presenza di bolle di gas nel terreno liquido in accordo con Jiang T et al.51. La presenza di gas indicava una reazione positiva al test.

Selezione random dei batteri lattici e condizioni di coltura I ceppi di batteri lattici dei quali à ̈ stata testata l'attività antimicrobica vs batteri coliformi dei lattanti, sono indicati nella tabella n°2. 30 ceppi, rappresentativi delle diverse specie di batteri lattici, sono stati scelti in modo random. I lattobacilli impiegati in questo studio provengono dalle collezioni dell'ATCC e della DSMZ (American Type Culture Collection, Rockville, Md., and Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany, rispettivamente) oppure dalla collezione

dell'existituto di Microbiologia Agraria dell'Università di Bologna (collezione V. Scardovi).

La tassonomia del ceppo di Lactobacìllus plantarum DSMZ 22107, inserito in questo studio per la sua nota attività antiossidante53, à ̈ stata confermata a livello di specie mediante ribotipizzazione in automaticos2,53, mentre il ceppo selezionato dallo screening, Lactobacìllus delbruekii proviene dalla collezione tedesca DSMZ (DSMZ 22106 o ATCC 9649) .

L. piantarum DSMZ 22107 à ̈ un potenziale ceppo probiotico poiché mostra un'attività antiossidante netta associata ad un'ottima vitalità, testata in vitro, in succo gastrico e bile, che sottintende tolleranza al transito intestinale53. L. delbruekii DSMZ 22106 à ̈ stato invece selezionato perché presentava, fra tutti i lattobacilli testati, la più efficace attività antimicrobica vs i coliformi isolati dai lattanti affetti da coliche.

Tutti i lattobacilli impiegati nello studio in esame, sono stati coltivati a 37°C per 24h in Lactobacilli MRS broth -Difco Laboratories, Sparks, Maryland, USA- (MRS) contenente 0.5 g/L di cisteina come agente riducente.

Saggi per valutare le proprietà antimiorobiche

La valutazione delle proprietà antimicrobiche à ̈ stata esaminata utilizzando due strategie: l'inibizione dello sviluppo batterico su piastra ovvero metodo di diffusione di Kirby-Bauer (1940) ed allestendo co-colture del batterio lattico selezionato con uno o più batteri coliformi provenienti dai lattanti affetti da coliche gassose.

Attività antimiorobica su piastra

Lo scopo di questo metodo à ̈ esaminare l'effetto inibente, dei ceppi di lattobacilli in esame, sulla crescita in vitro dei batteri coliformi isolati dai lattanti. I ceppi di Lattobacilli sono stati fatti crescere in coltura anaerobica su mezzo liquido di MRS a 37°C per 48 ore. Le cellule, raccolte per centrifugazione dalla coltura sviluppata, sono state risospese in soluzione salina fino ad ottenere una concentrazione di 10<4>e 10<6>cellule/ml, determinandola mediante misura della densità ottica a 660 nm. Il surnatante invece, separato dalla biomassa, à ̈ stato neutralizzato a pH 7,0. La sospensione cellulare contenete il batterio coliforme in esame ad una concentrazione di 10<3>e 10<6>cellule/ml à ̈ stata distribuita su mezzo solido di LB (Luria Bertani) agar (0.7%); successivamente sono stati posti sul terreno due dischetti (diametro 6 rara) imbibiti, uno, della sospensione cellulare del lattobacillo in esame e l'altro del surnatante relativo. Il controllo à ̈ stato allestito nello stesso modo ma ponendo sul terreno due dischetti sterili non imbibiti.

Dopo incubazione a 37°C per 18 ore, Ã ̈ stata misurata l'area d'inibizione dello pseudo-patogeno che compariva intorno ai dischetti.

Attività antimicrobica in co-colture liquide L'antagonismo esercitato dai Lattobacilli sullo sviluppo dei batteri coliformi à ̈ stato confermato co-incubando in terreno liquido ogni potenziale inibitore probiotico con i più rappresentativi coliformi isolati dai lattanti. L'inoculo della co-coltura à ̈ stato ottenuto facendo sviluppare separatamente il probiotico ed i coliformi in condizioni ottimali. Le cellule batteriche, dalle 2 colture sviluppate, sono state raccolte per centrifugazione e risospese ciascuna nel corrispettivo terreno fresco per evitare che in cocoltura ci fossero condizionamenti sullo sviluppo dovuti a variazioni indesiderate del pH oppure a riduzione dei nutriliti. Un terreno liquido di LB modificato (Luria Bertani con aggiunta di estratto di lievito 31, pH 7) à ̈ stato inoculato con 10<s>cfu/ml totali di Lattobacillo e con una uguale concentrazione di una sospensione batterica nota di coliformi. Il controllo à ̈ stato allestito nello stesso modo sostituendo l'inoculo del probiotico con quello del solo terreno fresco privo di cellule.

Le co-colture ed i controlli così preparati sono stati incubati a 37°C in microaerofilia controllata e do

à ̈ stata valutata l'attività antagonistica svolta dai probiotici determinando l'inibizione della crescita dei batteri coliformi. Questa à ̈ stata calcolata sottraendo il numero dei batteri coliformi che risultavano dal tubo di coincubazione al numero dei batteri coliformi provenienti dal tubo di controllo, inoculato solo con i batteri coliformi. Le cfu/ml della popolazione batterica vitale cresciuta sono state misurate distribuendo aliquote note delle co-colture e dei controlli su terreni selettivi sia per i lattobacilli (Lattobacilli MRS agar) che per i coliformi (Mak-Conckey agar) (Annuk 2003), infine à ̈ stata controllata la variazione del pH dopo 24 ore di co-incubazione.

I risultati sulle concentrazioni batteriche dei lattobacilli e dei coliformi sono stati espressi il Logiodi cfu/ml.

Gli esempi che seguono sono forniti a scopo illustrativo e non sono intesi a limitare in alcun modo la portata

dell 'invenzione.

Esempio 1

Il ceppo scelto Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 à ̈ stato messo in coltura anaerobica in mezzo liquido a 37°C per 48 ore. Una coltura sviluppata over night del batterio coliforme Escherichia coli sp. ceppo a isolata dal lattante 15 (vedi tabella n°3) che presenta la sintomatologia delle coliche infantili clinicamente diagnosticata à ̈ stata trattata come nel saggio di analisi di attività antimicrobica su piastra precedentemente descritto. Una sospensione avente la concentrazione di IO<3>- IO<6>cellule/ml di batterio coliforme à ̈ stata distribuita su mezzo solido di LB, in seguito sono stati adagiati sul terreno due dischetti imbibiti, l'uno (dischetto B, figura n°l) con la sospensione di cellule raccolte di Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 e l'altro con il rispettivo surnatante neutralizzato (dischetto A, figura n°l). La piastra così preparata à ̈ stata fatta riposare a 4°C per almeno un ora. Dopo incubazione a 37°C per 18 ore, à ̈ stata misurata l'area d'inibizione dello sviluppo del ceppo a di Escherichia coli sp . che si era sviluppata intorno ai due dischetti .

Risultato: un alone di inibizione della crescita del ceppo in esame di Escherichia coli isolato dal lattante 15 affetto da coliche infantili, era visibile solo attorno al dischetto che era stato imbibito con la sospensione di cellule di Lactohacillus delbruekii DSMZ 22106 mentre nessun area di inibizione compariva attorno al dischetto imbibito con il surnatante corrispettivo del lattobacillo.

L'alone di inibizione della crescita del batterio coliforme à ̈ stato misurato e questo risultava avere un raggio di 13 mm (figura n°1).

Figura n° 1: dischetto A = caricato con surnatante; dischetto B = caricato con una

sospensione di 10/l0<6>cellule intere

Esempio 2

E' stata valutata l'attività antimicrobica manifestata dal lattobacillo probiotico Lactohacillus delbruekii DSMZ 22106 vs il ceppo b di Klebsiella pneumoniae isolato dal lattante 12 affetto da coliche infantili (tabella n°3). Ai fini della prova, i due ceppi batterici sono stati trattati come riportato nell'esempio 1.

Risultato: E' stata misurata l'area di inibizione dello sviluppo del ceppo a di Klebsiella pneumonìae isolato dal lattante 12 con coliche infantili, che compariva attorno al dischetto che era stato imbibito con la sospensione di cellule di lactobaclllus delbruekil DSMZ 22106. Anche in questo caso nessun attività antagonistica risultava dal dischetto imbibito con il solo surnatante privo di cellule proveniente dalla coltura del lattobacillo .

L'alone di inibizione, valutato, risultava avere un raggio di 12.5 mm come si vede dalla figura n° 2.

Figura 2: dischetto A caricato con surnatante

dischetto B caricato con una sospensione di

10/10<6>cellule intere

Esempio 3

E' stata valutata l'attività antimicrobica manifestata dal lattobacillo probiotico Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 vs tutti i ceppi di Escherichia coli, Klebsiella pneumonìae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae ed infine di Enterococcus faecalis isolati dai lattanti affetti da coliche infantili e dai controlli sani.

Ai fini della prova, il ceppo di batterio lattico probiotico e i batteri coliformi isolati dai lattanti sono stati trattati come riportato nell'esempio 1.

Risultato: in generale, il ceppo di Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 esaminato ha sempre rivelato un'attività inibente contro tutti i coliformi testati. Una piastra di controllo à ̈ stata allestita ponendo sul terreno di LB agar due dischetti analoghi sterili ma non imbibiti né con la sospensione cellulare né con il solo brodo di coltura. Tale controllo non ha mai mostrato alcun effetto inibitorio sullo sviluppo dei ceppi di coliformi esaminati.

Tutti i risultati ottenuti dalle prove di valutazione dell'attività antagonistica su piastra, manifestata dal lattobacillo in esame ed espressi come misura media dei raggi delle aree di inibizione, sono riportati nella tabella n°l.

Attività antagonistica mostrata da lactobaeillus delbruekii DSMZ 22106 su piastra ed espressa come misura

del raggio medio dell'area di inibizione

alone di inibizione

batteri coliformi isolati (raggio medio dell'area ±SD) Escherichia coli 10,23 ±1,29 Klebsiella pneumonite 9,83 ±1,04 Klebsiella oxytoca 9,75 ±1,06 Enterobacter aerogenes 10,25 ±0,35 Enterobacter cloacae 10,25 ±0,35 Enterococcus faecalis 10,16 ±0,76

Tabella n’1: attività antagonistica mostrata su piastra da Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 vs i coliformi isolati dai lattanti con coliche gassose. L'inibizione della crescita dei patogeni à ̈ espressa come misura del raggio dell'alone di inibizione che si sviluppa intorno ai dischetti imbibiti con le cellule intere del lattobacillo selezionato.

Esempio 4

E' stata valutata l'attività antimicrobica manifestata pure dal ceppo di lattobacillo probiotico selezionato Lactobacillus plantarum DSMZ 22107 vs tutti i ceppi di Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes , Enterobacter cloacae ed infine di Enterococcus faecalis isolati dai lattante affetti da coliche infantili e dai controlli sani. Ai fini della prova, il ceppo di batterio lattico probiotico e i batteri coliformi isolati dai lattanti sono stati trattati come riportato nell'esempio 1.

Risultato: in generale, il ceppo di Lactobacillus plantarum DSMZ 22107 esaminato non ha mai mostrato effetti inibitori sui coliformi esaminati.

Esempio 5

E' stata valutata l'attività antimicrobica manifestata insieme dai due ceppi di batteri lattici probiotici, oggetto dalla presente invenzione, Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 e L. plantarum DSMZ 22107, vs tutti i ceppi di batteri coliformi isolati: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca , Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae ed infine di Enterococcus faecalis provenienti dai lattanti affetti da coliche infantili. Ai fini della prova, i due ceppi di batteri lattici probiotici sono stati fatti sviluppare separatamente come descritto nell'esempio 1, allo stesso modo ogni batterio coliforme veniva trattato come riportato nell'esempio 1. Una sospensione avente la concentrazione di IO<3>- IO<6>cellule/ml di batterio coliforme veniva distribuita su mezzo solido di LB. In seguito venivano adagiati sul terreno due dischetti imbibiti, l'uno con una sospensione a concentrazione nota di cellule raccolte dalla coltura di Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 più una sospensione avente un'analoga concentrazione di cellule raccolte dalla coltura di L. plantarum DSMZ 22107, l'altro con una miscela formata dai due surnatanti privi di cellule e neutralizzati provenienti dalle colture dei due batteri lattici. La piastra cosi preparata era fatta riposare a 4°C per almeno un'ora. Dopo incubazione a 37°C per 18 ore, si misurava l'area d'inibizione della crescita del coliforme in esame che si sviluppava eventualmente attorno ai due dischetti .

Risultato: dalle prove di attività antibatterica eseguite in sinergia si evinceva che l'area di inibizione dello sviluppo di ogni ceppo di coliforme isolato dai lattanti con coliche gassose, compariva sempre solamente intorno al dischetto che era stato imbibito con le due sospensioni di cellule di L. delbruekii DSMZ 22106 e di L. plantarum DSMZ 22107 mentre nessun alone di inibizione compariva intorno al dischetto imbibito con i rispettivi surnatanti, provenienti dalle colture dei due batteri lattici. Infine si misurava l'alone di inibizione che proveniva dalle cellule intere e questo risultava avere un valore di raggio medio paragonabile alle misure che risultavano dalla sola attività antagonistica manifestata L. delbruekii DSMZ 22106 (tabella n° 1).

Esempio 6

In provetta l'attività antagonistica di Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 à ̈ stata valutata inoculando un terreno di LB modificato, già descritto nel paragrafo che riferisce sul metodo di valutazione dell'attività antimicrobica in co-coltura liquida, con IO<5>cfu/ml totali di lattobacillo e con un'uguale concentrazione di cellule di Escherichia coli ceppo a, isolato dal lattante 15 affetto da coliche gassose (tabella n°3). Un secondo tubo di LB modificato à ̈ stato inoculato con sole cellule di batterio coliforme. La co-coltura ed il controllo sono stati incubati a 37°C in microaerofilia e dopo 8-10 ore à ̈ stata valutata l'attività antagonistica manifestata dal batterio lattico contro il ceppo di Escherichia coli.

Per misurare lo sviluppo di Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 e del ceppo di Escherichia coli che risultava sia dalle prove di co-incubazione che dal controllo, le cfu/ml dei due ceppi batterici sono state valutate, sia al tempo 0 dell'inoculo che al tempo 24 ore, distribuendo aliquote di brodo dalla co coltura e dal controllo sia su MRS agar addizionato con 0,2% di vancomicina (selettivo per il batterio lattico) che su Mak-Conckey agar (selettivo per Escherichia coli), infine à ̈ stata riportata la variazione del pH dopo 24 ore nel tubo coincubato e nel controllo.

Risultati: al tO (tempo dell'inoculo) sono state co-inoculate 2,7*10<5>cellule di Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 insieme a 5,0*10<5>cellule di Escherichia coli. Il pH iniziale era di 6,8. Dopo 24 ore (124) dal conteggio su piastre selettive risultavano 7,0*10<9>cfu/ml di Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 e 5,0*10<5>cfu/ml di Escherichia coli mentre il pH scendeva a 4,3. Nel tubo di controllo sono state inoculate al tO solo 4,5*10<5>cfu/ml di Escherichia coli,1' inoculo del batterio lattico à ̈ stato sostituito aggiungendo al tubo un uguale volume di solo terreno fresco privo di cellule. Dopo le 24 ore di incubazione risultavano 1,0*10<9>cfu/ml di Escherichia coli inoculato. Il pH del terreno pari a 6.8 restava tale anche dopo 24 ore.

Esempio 7

Come nell'esempio 7, ma si valutava l'attività antimicrobica espressa da una combinazione dei due ceppi di Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 e di Lactobacillus plantarum DSMZ 22107 quando co-incubati con i ceppi di coliformi più rappresentativi di ogni specie isolata ed identificata dai lattanti. L'attività antagonistica in "sinergia" dei due batteri lattici veniva valutata inoculando il terreno di LB modificato, con IO<2>cfu/ml totali di L. delbruekii DSMZ 22106 e con IO<2>cellule di L. plantarum DSMZ 22107 infine con un'uguale concentrazione (IO<4>) di cellule del batterio coliforme in esame. Un secondo tubo di LB modificato veniva inoculato con le sole cellule di entrambi i batteri lattici. La co-coltura ed il controllo così allestiti, venivano incubati a 37°C in microaerofilia e dopo 8-10 ore era valutata l'eventuale attività antagonistica risultante. Per misurare lo sviluppo di batteri lattici e dei coliformi che risultava sia dalle prove di co-incubazione che dal controllo, le cfu/ml di ogni batterio era valutata, sia al tempo 0 dell'inoculo che dopo 24 ore, come riportato nell'esempio 7. Erano calcolate le cfu/ml totali di batteri lattici insieme alle cfu/ml del coliforme in esame, infine si riportava la variazione del pH dopo 24 ore nel tubo co-incubato e nel controllo .

Risultati: A prescindere dalla specie e dal lattante da cui erano stati isolati, la concentrazione dei batteri coliformi in co-coltura con i due lattobacilli probiotici veniva abbattuta di almeno 4 unità logaritmiche decimali (da E10<9>a E10<5>) rispetto al tubo controllo. Il pH misurato sempre, prima e dopo le 24 ore di incubazione, variava di un valore almeno pari a 3,3±0,4 quando i tubi erano co-incubati con entrambi i due batteri lattici e con il ceppo di batterio coliforme, mentre nei tubi di controllo il pH rimaneva sempre invariato .

Applicabilità industriale della presente invenzione

I nostri risultati hanno dimostrato che il ceppo di L. delbruekii DSMZ 22106 ha un'attività antibatterica netta vs le specie di Escherichia coli, Klebsiella pneumonìae, Klebsìella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae ed infine di Enterococcus faecalis isolati dai lattanti affetti da coliche gassose ed appartenenti al genere dei batteri coliformi, coinvolti com'à ̈ noto, nella fermentazione del lattosio e nella produzione di gas intestinale, ritenuto una concausa importante nel disturbo delle coliche infantili. La riduzione della carica intestinale dei batteri coliformi à ̈ considerata essenziale per mantenere un equilibrio stabile nella flora intestinale umana e animale, ne beneficia in tal modo lo stato di salute dell'uomo .

L'alta attività antagonistica esibita dal batterio lattico selezionato, verificata per mezzo delle prove effettuate su piastra e dalle prove di co-incubazione con i coliformi, potrebbe essere associata, fra l'altro, all'elevata produzione di acidi organici (Mishra and Lambert 1996;

Ouwehand 1998), tesi questa, avvalorata dall' effettivo calo dei valori di pH, registrato dopo 24 ore, nei tubi coincubati. Alla luce di questi risultati e di quanto à ̈ già noto in merito alle proprietà antiossidanti di Lactobacillus plantarum DSMZ 22107, à ̈ evidente che una formulazione che contenga entrambi i batteri lattici e che quindi associ le proprietà antimicrobiche vs i coliformi gasogeni, le proprietà antiossidanti e l'ottima capacità di colonizzare il tratto gastrointestinale, sia di significativo impatto nel trattamento delle coliche gassose dei neonati. E' pertanto ragionevole pensare che un preparato siffatto, da impiegare in forma di probiotico ovvero di supplemento alimentare microbico possa sostituire l'uso di antibiotici convenzionali nella protezione dalle infezioni, nella riduzione della severità nonché nel trattamento delle coliche gassose nei lattanti che ne sono affetti.

Infine à ̈ stato anche osservato che galatto-oligosaccaridi e frutto-oligosaccaridi sono i prebiotici più appropriati, poiché sono i carboidrati verso cui sono più nette le preferenze dei due batteri lattici in esame, in formulazioni di prodotti sinbiotici.

Il presente brevetto à ̈ stato descritto in un modo indicativo, ed à ̈ necessario specificare, a fin di chiarezza, che la natura del presente documento si presta a molte modifiche. Pertanto variazioni del presente sono possibili ed auspicabili al fine di migliorare i metodi attuali di trattamento delle coliche gassose infantili. Con ciò si intende che, tale invenzione può essere utilizzata, ma in campi di applicazione diversi da quelli specificamente descritti .

Allegato al documento

Tabella n°2.

Specie Origine Lactobacillus acidophilus ATCC 11975, MB 252, MB 35B, MB 359, M 253, MB

422, MB 423, MB 424, MB 425, MB 442, MB

443

Lactobacillus curvatus MB 67, MB 68,

lactobacillus cassi ATCC 393, MB 50, FV 13, Lactobacillus delbrueckii MB 453

subsp . Bulgaricus

Lactobacillus delbrueckii DSMZ 22106

subsp . Delbrueckii

Lactobacillus delbrueckii MB 438

subsp . Lactis

Lactobacillus salivarius MB 437

subsp . Salicinius

Lactobacillus salivarius MB 436

subsp. Salivarius

Lactobacillus gasseri MB 335

Lactobacillus helveticus S 36.2, S 40.B,

Lactobacillus plantanzm MB 395, MB 345

Tabella n°2: Elenco dei batteri lattici saggiati per le loro proprietà antagonistiche vs i batteri coliformi gasogeni isolati dai lattanti affetti da coliche gassose.

Coliformi totali N° di colonie Fattore di Specie identificate (CFO g-ifeci)* morfologicamente diluizione

w diverse su piastra su piastra

T o x IO" 2 a. IO<"6>a. E. coli

b. IO<"6>b. E. coli

T o X 10" 2 a. IO<-">* a. K. pneumoniae b. IO<"4>b. E. coli

l.o x 10' 2 a. IO<"6>a. E. coli

b. IO<"6>b. K.oxytoca

T o x 10" 2 a. 10<">“ a. E. coli

h. IO<'7>b. E. coli

T.o X 10' 1 a. 10<">' a. E. faecalis T.O X 10<J>1 a. 10<'J>a. E. coli

T.o x io' 2 a. 10<">' a. E. coli

b. IO<"7>b. K. pneumoniae 3.7 x 10' 2 a. IO<"7>a. E. coli

b. 10<"s>b. E. coli

3.4 x 10<y>2 a. 10<">" a. E. coli

b. 10<"s>b. E. coli

4.3 x 10" 2 a. 10<"y>a. E. coli

b. 10<"s>b. K.oxytoca

T.ixio<6>2 a. IO<"6>a. E. coli

b. IO<"5>b. Enterobacter cloacae 8.1 x 10° 2 a. 10<"e>a. K.oxytoca

b. 10<"s>b. E. faecalis T.O x 10<J>1 a. 10<"J>a. E. coli

T.5 x 10" 4 a. 10<"B>a. K. oxytoca

b. IO<"6>b. E. aerogenes e. IO<"6>c. E. coli

d. IO<"5>d. E. coli

T o x IO<3>1 a. IO<"3>a. E. coli

T a * io" 2 a. 10<">“ a. E. coli

b. IO<"7>b. E. coli

T.7 x io- 4 a. 10" a. E. coli

b. IO<"5>b. K. oxytoca

c. 10<"s>c. K. pneumoniae d. 10<"s>d. K. oxytoca T.o x io<a>1 a. IO<"4>a. K. oxytoca T.o X 10* 1 a. 10<'>* a. K. pneumoniae T .6 x IO<6>1 a. 10<'>" a. K. oxytoca

'3. Quantificazione di coliformi totali nei campioni fecali di 20

affetti da coliche gassose durante il manifestarsi del disturbo.

totale di coliformi à ̈ stato determinato contando le colonie cresciute di MacConkey agar, mentre le concentrazioni delle specie sono state

il metodo della PCR-fingerprinting specie specifica e mediante

.

Bibliografia

1. Lucassen PLBJ, et al. Systematic review of thà ̈ occurrence of infantile colie in thà ̈ community. 2001, Arch Dls Child. 84: 398-403.

2. Canivet C, et al. Infantile colie - less common than previously estimateci? 1996, Acta Paediatr. 85: 454-8.

3. Wessel MA, et al. Paroximal fussing in infancy, sometimes called "colie". 1954, Pediatrics. 14: 421-35.

4. Hide DW, et al. Prevalence of infant colie. 1982, Arch Dis Child. 57: 559-60.

5. Lobo ML, et al. Current beliefs and management strategies for treating infant colie. 2004, J Pediatr Health Care. 18: 15-22.

6. Saavedra MA, et al. Infantile colie incidence and associate risk factors: a cohort study. 2003, Pediatr (Rio J). 79(2): 115-122.

7. Lothe L, et al. Cow's milk whey protein elicits symptoms of infantile colie in colicky formula-fed infants: a double-blind cross over study. 1989, Pediatrics. 83: 262-66.

8. Buchanan P. Effectiveness of treatment for infantile colie.

Trial of treatment for infantile colie. Trial of hypoallergenic milk is not supported by strong enough evidence. 1998, BMJ.

317(7170): 1451-1452.

9. Castro-Rodriguez JA, et al. Relationship between infantile colie and Asthma/atopy: A prospective study in an unselected population. 2001, Pediatrics. 108(4): 878-882.

10. Hyams J, et al. Colonie hydrogen production in infants with eolie. 1989, J Pediatr. 115: 592-94.

11. Belson A, et al. Colonie hydrogen elimination and methane production in infants with and without infantile colie syndrome. 2003, Dig Dis Sci. 48(9): 1762-1766.

12. Lothe L, et al. Motilin and infantile colie: A prospective study. 1990, Acta Pediatr Scand. 79(4): 410-416.

13. Lucassen PL, et al. Review: some behavioural interventions, drugs, and dietary changes reduce infantile colie. 1998, BMJ. 316: 1563-9.

14. Barr RG, et al. Colie and crying syndromes in infants. 1998, Pediatrics. 102(5 suppl E): 1282-6.

15. Gupta SK. Is colie a gastrointestinal disorder? 2002, Curr Opin Pediatr. 14: 588-92.

16. Lehtonen L, et al. Intestinal microflora in colicky and non colicky infants: bacterial cultures and gas-liquid chromatography.

1994, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 19: 310-4.

17. Jang T, et al. Gas production by feces of infants. 2001, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 32: 534-41.

18. Miller JJ, et al. Breath hydrogen exeretion in infants with colie. 1989, Arch Dis Child. 64: 725-9.

19. Hochman JA, et al. The role of small bowel bacterial overgrowth in infantile colie. 2005, J Pediatr. 147: 410-11.

20. Karlsson H, et al. Innate immune response of human neonatal cells to bacteria from thà ̈ normal gastrointestinal flora. 2002, Infact Immun. 70: 6688-96.

21. Shell MA, et al. The genome sequence of Bifidobacterium longum reflects its adaptation to thà ̈ human gastrointestinal tract. 2002, Microbiology. 99: 14422-14427.

22. Long SS, et al. Development of anaerobio faecal flora in healthy newborn infants. 1977, J. Pediatr. 91: 298-301.

23. Hopkins MJ, et al. Age and disease related changes in intestinal bacterial population assessed by celi culture, 16S rRNA abundance, and community cellular fatty acid profiles. 2001, GUT. 48: 198-205.

24. Savino F, et al. Overgrowth of coliforms bacteria in colicky infants. In corso di stampa.

25. Karlsson H, et al. Innate immune response of human neonatal cells to bacteria from thà ̈ normal gastrointestinal flora. 2002, Infect Immun. 70: 6688-96.

26. Linneberg A, et al. IgG antibodies against microorganisms and atopic disease in Danish adults: thà ̈ Copenhagen Allergy Study.

2003, J Allergy Clin Immunol. Ili: 847-53.

27. Hill DJ, Hosking CS. Infantile colie and food

hypersensitivity. 2000, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 30: S67-76.

28. Kalliomaki M, et al. Extent of fussing and colie type crying preceding atopic disease. 2001, Arch Dis Child. 84: 349-50.

29. Iacono G, et al. Severe infantile colie and food intolerance: a long-term prospective study. 1991, J Pediatr Gastroenterol Nutr.

12: 332-5.

30. Fenderà J, et al. Gut microbiota composition and development of atopic manifestations in infancy: thà ̈ KOALA Birth Cohort Study.

2007, Gut. 56: 661-7.

31. Savino F, et al. Lactobacillus reuteri (American Type Culture Collection Strain 55730) versus simethicone in thà ̈ treatment of infantile colie: a prospective randomized study. 2007, Pedlatrics.

119: 124-30.

32. Savino F, et al. Intestinal microflora in breastfed colicky and non-colicky infants. 2004, Acta Peediatr. 93: 825-9.

33. Savino F, et al. Bacterial counts of intestinal Lactobacillus species in infants with colie. 2005, Pediatr Allergy Immunol. 16: 72-5.

34. Shi HN, et al. Bacterial colonization and thà ̈ development of intestinal defences. 2004, Can J Gastroenterol. 18(8): 493-500. 35. Neu J. Probiotics: protecting thà ̈ intestinal ecosystem? 2005, J Pediatr. 147: 143-6.

36. Weizman Z, et al. Effect of a probiotic infant formula on infection in child care centers: comparison of two probiotic agents. 2005, Pediatrics. 115: 5-9.

37. Chermesh I, et al. Probiotics and gastrointestinal tract:

Where are we in 2005? 2006, World J gastoenterol. 12: 853-7.

38. Mack DR, et al. Role of probiotics in thà ̈ modulation of intestinal infections and inflammation. 2004, Curr Opin Gastroenterol. 20: 22-6.

39. Kalliomaki M, et al. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled trial. 2001, Lancet. 357: 1076-9.

40. Christensehn HR, et al. Lactobacilli differentially modulate expression of cytokines and maturation surface merkers in murine dendritic cells. 2002, J Immunol. 168(1): 171-178.

41. Neish AS. The gut microflora and intestinal epithelial cells: a continuing dialogue. 2002, Microbes Infect. 4: 309-17.

42. Connolly E, et al. Safety of D - lactic acid producing bacteria in thà ̈human infant. 2005, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 41: 489-92.

43. Abrahamsson TR, et al. Probiotics in prevention of IgEassociated eczema: a double-bind, randomized, placebo-controlled

trial. 2007, J Allergy Clin Immunol. In corso di stampa.

44. Valeur N, et al. Colonization and immunomodulation by LactoJbacillus reuteri ATCC 55730 in thà ̈ human gastrointestinal tract.

2004, Appi Environ Microbici. 70: 1176-81.

45. Savino F, et al. Lactobacillus reuteri ATCC 55730 versus Simethicone in thà ̈ treatment of infantile colie: a prospective randomized study. 2007, Pediatrics. 119: 124-30.

46. Williams J, et al. Dicyclomine: worrying symptoms associated with its use in some small babies. 1984, BMJ. 288 (6421):901.

47. Myers JH, et al. Anticholinergic poisoning in colicky infante treated with hyoscyamine sulfate. 1997, Am J Emerg Med. 15: 532-5. 48. Balon AJ. Management of infantile colie. 1997, Amer Pham Physician. 55: 235-242.

49. Metcalf TJ, et al. Simethicone in thà ̈ Treatment of Infant Colie: A Randomized, Placebo-Controlled, Multicenter Trial. 1994, Pediatrics. 94(1): 29-34.

50. Sferra TJ, et al. Gastrointestinal gas formation and infantile eolie. 1996, Pediatr Clin North Am. 43(2): 489-510.

51. Jiang T, et al. Gas production by feces of infants. 2001, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 32: 534-41.

52. Messi P, et al. Detection and preliminary characterization of a bacteriocin (plantaricin 35d) produced by a Lactobacillus plantarum strain. 2001, Int Journal of Food Micr. 64: 193-198.

53. Zanoni S, et al. Growth kinetics on oligo- and polysaccharides and promising features of three antioxidative potential probiotic strains. 2008, J Appi Microbiol. 105: 1266-1276(11).

54. Annuk H, et al. Characterization of intestinal

putative probiotic candidates. 2003, Journal J Appi

94: 403-412.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI Il presente brevetto rivendica l'uso di: I. Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 e Lactobacillus plantarum DSMZ 22107 come agenti batterici aventi proprietà antiossidanti e antimicrobiche vs lo sviluppo di batteri coliformi isolati dal microbiota intestinale di lattanti affetti da coliche gassose o di altra origine oppure vs altri organismi patogeni. II. Un preparato farmaceutico, veterinario o di altro uso alimentare, indicato come supplemento alimentare microbico ovvero come preparato nutraceutico che contenga quantità effettive di microrganismi scelti dal gruppo di probiotici che consistono di Lactobacillus delbruekii e Lactobacillus plantarum o loro combinazioni. III. Una composizione con le caratteristiche rivendicate al punto II, in cui i detti microrganismi separati dal mezzo di coltura siano sottoposti a una operazione di liofilizzazione o essiccamento per ottenere una biomassa liofilizzata o essiccata da usare in preparati alimentari in qualità di prodotto nutraceutico. IV. Una composizione con le caratteristiche delle rivendicazioni II e III, nella quale detti lattobacilli siano ad una concentrazione compresa fra lo 0.1% ed il 20% in peso. V. Una composizione con le caratteristiche nei punti II, II e IV in cui la concentrazione di detti lattobacilli sia compresa fra 1*10<6>e 1*10<9>unità formanti colonie per grammo. VI. Una composizione con le caratteristiche rivendicate dal punto II al punto V con l'addizione di ulteriori supplementi alimentari probiotici e prebiotici, ove questi siano indicati o suggeriti dal presente documento. VII. Una composizione in accordo con ciascuno dei punti rivendicati da II a VI, in cui detto preparato sia in forma di soluzione liquida per somministrazione orale o parenterale. VIII. Una composizione in accordo con ciascuno dei punti rivendicati da II a VI, in cui detto preparato sia in forma di pastiglie liofilizzate o essiccate per somministrazione orale. IX. Una composizione in accordo con ciascuno dei punti rivendicati da II a VI, in cui detto preparato sia in forma di soluzione spray per somministrazione orale o intranasale . X. Una composizione in accordo con quanto rivendicato dal punto II al punto precedente in cui detto preparato sia destinato in qualità di prodotto probiotico alla riduzione dell'incidenza, della severità a al trattamento in generale delle coliche gassose oppure dei disordini in generale gastrointestinali dei lattanti. XI. Un preparato con le caratteristiche rivendicate al punto X che sia destinato alla riduzione dell'incidenza, della severità e al trattamento dei disordini gastrointestinali in generale dei mammiferi, compreso l'uomo. XII. Una composizione in accordo con quanto rivendicato dal punto II al punto precedente in cui detto preparato sia indicato come prodotto probiotico ad attività benefica sull'ospite perché antiossidante. XIII. Un preparato con le caratteristiche del punto X destinato a modificare con effetti benefici il microbiota intestinale dei mammiferi in generale, compreso l'uomo. XIV. Un preparato con le caratteristiche rivendicate al punto X destinato al trattamento dei seguenti fenomeni patologici: diarrea, coliche, indigestione e iperacidità gastrica, sindrome da colon irritabile, flatulenza associate a tutte le situazioni precedenti; patologie da ulcere peptiche o associate all'esofago, allo stomaco o al duodeno; indigestione, flatulenza, dispepsia di origine sconosciuta includendo cancro allo stomaco, malattie infiltranti lo stomaco come linfomi, morbo di Crohn, granuloma eosinofilo, tubercolosi, sifilide e sarcoidosi; lesioni addominali, pancreatite cronica, malattie biliari, sindrome di Zollinger-Ellison, chinetosi e otite media; che si manifestino nei mammiferi in generale, compreso l'uomo. XV. Un medicai device con le caratteristiche rivendicate al punto XIII che sia destinato al trattamento delle coliche gassose dei lattanti e che preveda nella sua composizione la presenza delle specie di Lactobacillus delbruekii o Lactobacillus plantarum o loro combinazioni o sospensioni degli stessi preparati a base di olio di oliva o di mais o combinazione di questi o altri olii. XVI. Un metodo per la riduzione dell'incidenza o per il trattamento delle infezioni che causano disordini intestinali nei lattanti, che preveda la somministrazione orale o enterica di quantità effettive di Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 e di Lactobacillus plantarum DSMZ 22107 o di loro combinazioni. XVII. Un metodo per la riduzione dell'incidenza o per il trattamento delle infezioni che causano disordini intestinali nei mammiferi, compreso l'uomo e che abbia le caratteristiche già rivendicate al punto XV. XVIII. Un metodo per la riduzione dell'incidenza o per il trattamento delle infezioni causate da batteri coliformi nei mammiferi, compreso l'uomo e che abbia le caratteristiche già rivendicate al punto XV.