IT9048365A1 - Peptidi idropaticamente complementari a sequenze aminoacidiche note covalentemente legati in maniera non lineare e procedimento per la loro sintesi - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione dal titolo:

"Peptidi idropaticamente complementari a sequenze aminoacidiche note covalentemente legati in maniera non lineare e procedimento per la loro sintesi"

La presente invenzione riguarda peptidi idropaticamente complementari a sequenze aminoacidiche note covalentemente legati in maniera non lineare e procedimento per la loro sintesi.

Più in particolare la presente invenzione si riferisce a due o più peptidi idropaticamente complementari a sequenze aminoacidiche note covalentemente legati in maniera non lineare ad un nucleo aminoacidico comprendente almeno un aminoacido con due funzioni amminiche terminali ed al relativo procedimento di sintesi, nonché all'immobilizzazione di tali molecole su supporti solidi, da utilizzare in campo diagnostico in vitro, per separazioni per cromatografia di affinità e per metodiche analitiche di determinazione di analiti peptidici in matrici complesse.

L'ipotesi che siti di interazione tra coppie di proteine interagenti siano codificati da sequenze di DNA complementari è stata formulata inizialmente da Biro (Biro, Medicai Hypothesis 7:669, 1981), e poi confermata sperimentalmente da Blalock et al. (Bost et al. PNAS 82:1372, 1985). Questi ultimi hanno rivelato una significativa complementarietà idropatica tra aminoacidi dedotti da codoni complementari (Blalock & Smith, BBRC, 121:203, 1984), letti in direzione 3'-5' o 5'-3' (Blalock & Bost, Biochem. J., 234:679, 1986). Le osservazioni iniziali sono state poi confermate sperimentalmente in numerosi altri sistemi di importanza biologica, sia permettendo il design ex novo di peptidi capaci di associare peptidi o proteine bersaglio, come nel caso di fibronectina (Brentani et al., PNAS, 85:364, 1988), insulina (Knutson, J. Biol. Chem., 263:14146, 1988), Arg8-Vasopressina (Fassina et al., Biochemistry, 28:8811, 1989), sostanza P (Bost & Blalock, Methods in Enzymology, 168:16, 1989), ribonucleasi peptide S (Shai et al., Biochemistry, 28:8804, 1989), proteina C-raf (Fassina et al., J. Biol. Chem., 264:11252, 1989), sia consentendo la predizione di siti di contatto tra proteine e i loro recettori, come nel caso di interleuchina 2, transferrina e EGF, epidermal growth factor (Bost et al., BBRC 28:1375, 1985).

Recentemente dagli autori della presente invenzione (Domande di brevetto IT N. 21396 A/89 e N. 20755 A/90) è stata messa a punto una metodologia computer assistita che permette l'ottenimento di catene peptidiche idropaticamente complementari in grado di interagire a sequenze aminoacidiche date, utilizzando unicamente informazioni di sequenza primaria di queste. I peptidi ottenuti in base a tale metodologia risultano con una più alta affinità di legame rispetto a quelli dedotti dal DNA complementare e possono essere vantaggiosamente utilizzati in metodiche diagnostiche e analitiche, spesso attuate in fase solida.

I metodi noti per l'immobilizzazione di peptidi a basso peso molecolare (M.W. 1000-4000) su supporti solidi si possono dividere essenzialmente in metodi che prevedono una interazione covalente tra peptide e supporto e altri in cui il peptide viene legato o adsorbito non covalentemente. Nel primo caso generalmente si sfrutta la reattività chimica dei gruppi amminici o carbossilici dei peptidi per reazioni di esterificazione con gruppi opportuni presenti sul supporto solido. Dato che spesso il peptide di interesse può contenere più di un gruppo reattivo (per esempio gruppi amminici o carboss ilici) l'immobilizzazione difficilmente può essere selezionata verso un gruppo particolare risultando pertanto non omogenea.e non prevedibile. Nel caso in cui il peptide abbia un unico gruppo funzionale, l'immobilizzazione risulta orientata ma la stretta vicinanza con la fase solida spesso porta a perdita parziale o totale delle capacità di riconoscimento iniziali.L 'introduzione di opportuni spaziatori tra fase solida e peptide ovvia ad alcuni di questi inconvenienti ma tale approccio aumenta considerevolmente il costo del supporto o del peptide, diminuisce considerevolmente la capacità totale, deve essere messo a punto singolarmente per ogni peptide, e introduce delle variazioni dovute a interazioni aspecifiche dello spaziatore con altre molecole. L'immobilizzazione di peptidi mediante interazioni aspecifiche a supporti solidi è altrettanto documentata in letteratura (Geerligs et al., J. Immunol. Methods, 106:239, 1988). In questo caso l'orientazione del peptide è del tutto non determinabile poiché numerosi residui vengono coinvolti nell'interazione in maniera non prevedibile.

Inoltre gli stessi autori hanno riscontrato una notevole limitazione all'uso di peptidi idropaticamente complementari, oggetto della domanda di brevetto italiana No. 20755 A/90 ,a causa della perdita o riduzione di affinità quando, usando i metodi descritti, essi vengono immobilizzati su una fase solida, sia essa un supporto solido prederivatizzato per preparare una colonna per cromatografia di affinità, oppure una piastra di plastica opportuna per la messa a punto di saggi analitici.

Recentemente, (Tarn, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5409, 1988) è stata messa a punto una tecnica di produzione di anticorpi antipeptidici utilizzando come antigeni dei peptidi multipli covalentemente legati ad un nucleo polilisinico octadentato. La molecola risultante 'risulta avere una aumentata attività immunogenica, di molto superiore a quella degli stessi peptidi lineari.

Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente trovato come l'immobilizzazione covalente o non covalente su supporti solidi di peptidi idropaticamente complementari a peptidi noti, sintetizzati in forma non lineare e multipla secondo un procedimento analogo a quello utilizzato da Tarn (v. sopra) per la produzione di peptidi multipli antigenici, permetta di ovviare a molti degli inconvenienti descritti precedentemente. Infatti durante il procedimento di immobilizzazione solo alcune delle catene peptidiche della molecola multimerica sono statisticamente coinvolte nell'interazione con la fase solida, mentre le altre risultano pienamente accessibili e propriamente orientate per effettuare il riconoscimento con sequenze peptidiche idropaticamente complementari. E' possibile pertanto utilizzare l'affinità di peptidi idropaticamente complementari in saggi diagnostici e in metodologie analitiche e preparative che utilizzano ripartizioni cromatografiche per affinità e, in generale, nel campo dell'immobilizzazione dei ligandi peptidici.

Formano pertanto oggetto della presente invenzione peptidi non lineari idropaticamente complementari a proteine, peptidi o porzioni di dssicui sia nota almeno una parte della sequenza aminoacidica, comprendenti:

un nucleo aminoacidico con almeno un aminoacido con almeno due funzioni aminiche terminali e una sequenza aminoacidica lineare idropaticamente complementare alla porzione di sequenza aminoacidi'ca nota, legata, con legame carbossiaminico a ciascuna di detta funzione aminica terminale.

Il nucleo aminoacidico secondo la presente invenzione ha la seguente formula

dove X è un aminoacido con almeno due residui funzionali aminici, Y è un aminoacido scelto tra il gruppo di alanina, glieina o arginina; m è un numero compreso tra 0 e 1; n1 , n2, n3 e n4 sono numeri compresi tra 0 e 10 e dove i legami sono legami carbamidici.

Preferenzialmente le porzioni aminioacidiche lineari idropaticamente complementari sono formate da un numero di aminoacidi compreso tra 10 e 20.

In una forma preferita di attuazione della invenzione gli aminoacidi con almeno due funzioni aminiche terminali sono scelti tra lisina e ornitina .

L'uso di- molecole oggetto della presente invenzione in metodiche di ripartizione in fase solida evita l'uso di spaziatori introdotti sinteticamente per rendere più accessibili peptidi di basso peso molecolare all'interazione con macromolecole proteiche ad alto peso molecolare. Infatti le catene legate direttamente al supporto solido funzionano da spaziatori interni, essendo composti di una serie poliatomica lineare di (3n) atomi, dove n rappresenta il numero di residui aminoacidici facente parte dell'unità peptidica del multimero. Inoltre non vengono introdotte interazioni aspecifiche spesso associate all'uso di spaziatori alifatici di 6-12 atomi di carbonio.

Sempre secondo la presente invenzione il peptide multimerico è direttamente immobilizzato senza previe manipolazioni su supporti preattivati ottenibili commercialmente ovviando così all'esigenza di utilizzare metodi di immobilizzazione laboriosi, costosi e che spesso conducono a basse rese del prodotto finale.

A titolo di esempio illustrativo ma non limitativo la presente invenzione verrà ora descritta in relazione alla sintesi di peptidi idropaticamente complementari (indicati con Δ ) a porzioni di sequenza di aminoacidi di due proteine: la "Big Endotelina" (Big ET, Itoh et al. Febs. Lett 231, 440) dall'aminoacido 16 a 29 e il "Tumor Necrosis Factor1' (TNF(X , Beutler and Cerami Ann. Rev . Immunolog. 7, 625, 1989) dal1'amminoacido 144 a 157, covalentemente legati in maniera non lineare ad un nucleo di lisina così da formare una molecola octodentata; al loro uso per la preparazione di colonne cromatografiche di affinità e alla relativa purif icazione del peptide Big ET e della proteina TNF ; all'immobilizzazione delle stesse molecole su supporto solido per la determinazione quantitativa di Big ET e TNF OC .

In quanto segue si farà riferimento alle seguenti figure in cui:

la figura 1A rappresenta la struttura del nucleo polilisinico usato per la sintesi di 8Δ ΕΤ[16-29[;

la figura 1B rappresenta la struttura del peptide non lineare 8Δ ΕΤ[Ί6-29];

la figura 1C rappresenta la struttura del peptide ET[16-29];

la figura 1D rappresenta la struttura del peptlde non lineare 8ET[l6-29];

la figura 2 illustra la diversa capacità delle colonne preparate con Λ ΕΤ[Ί6-29] e 8A ET[16-29] ;

la figura 3A illustra la purificazione del derivato biotinilato di ΕΤ[1-32] su una colonna di affinità preparata con il peptide 8Δ ΕΤ[Ί6-29];

la figura 3B illustra un'analisi mediante RP-HPLC del prodotto biotin ET[1-32] purificato mediante cromatografia di affinità;

la figura 4 illustra il legame del derivato biotinilato di ΕΤ[1-32'] a microcontenitori di plastica derivatizzati con 8Α ΕΤ[Ί6-29];

la figura 5 illustra la specificità della interazione tra ΕΤ[Ί-32] e 8Δ ΕΤ[Ί6-29] immobilizzato su microcontenitori di plastica;

la figura 6 illustra le diverse affinità dei peptidi ET[16-29] (A) e 8ET[16-29] (B) verso 8Δ ΕΤ[1629] ;

la figura 7A illustra la struttura del nucleo poli1isinico usato per la sintesi di 8Δ TNF [144-157];

la figura 7B illustra la struttura del peptide 8Δ TNF [144-157] ;

la figura 8A rappresenta il legame di TNFα ad una colonna di affinità preparata con il peptide 8Δ TNF [144-157];

la figura 8B rappresenta un'analisi mediante RP-HPLC del TNFα purificato mediante cromatografia di affinità; e

la figura 9 illustra la specificità della interazione tra TNFOC e 8Λ TNF [144-157] immobilizzato su microcontenitori di plastica.

La presente invenzione è stata utilizzata per la sintesi di sequenze di peptidi non lineari complementari idropaticamente al sito 16-29 di Big Endotelìna {Yanagisawa et al., Nature 332, 411 (1988)) [1-38] , e al sito 144-157 del TNFα (Bentler e Cerami, Ann. Rev. Immunol., 7:625, 1989) ottenendo una loro migliore utilizzazione per l'immobilizzazione su fasi solide. I peptidi possono essere sintetizzati in base a tecniche note per gli esperti del settore, in soluzione o per sintesi in fase solida, a partire da un nucleo polilisinico formato dall'unione covalente di sette residui di lisina come illustrato in figura 1A. Il peptide 8Δ ΕΤ[1629] , la cui struttura viene indicata in figura 18, è stato sintetizzato mediante sintesi in fase solida con metodologia Fmoc, (Dryland and Shepperd, TH 44, 859 (1988) usando come sistema solvente N-metilpirrolidone/diclorometano, utilizzando un sintetizzatore automatico Applied Biosystem 431A e seguendo le indicazioni del costruttore. In maniera analoga è stato sintetizzato il peptide non lineare 8Δ TNF [144-157], la cui sequenza è rappresentata in Fig. 7B. I metodi di sintesi e purificazione di peptidi sono ben documentati in letteratura, e sono noti ad esperti del settore. Il peptide 8Α ΕΤ[Ί6-29] è stato usato per preparare una colonna di affinità per la purificazione di Big ET da miscele contenenti 20 differenti peptidi ciascuno in concentrazione 1 mg/ml. Come viene indicato negli esempi seguenti, colonne di affinità preparate con il peptide 8Λ ΕΤ[16-29] dimostrano capacità maggiore, cioè riescono a purificare maggiori quantità di Big ET rispetto a colonne preparate immobilizzando in quantità equimolari il peptide Δ ΕΤ[16-29] (RKFLAGLRARRLKF) che rappresenta l'unità peptidica ripetuta 8 volte in 8Δ ΕΤ[Ί6-29] . La maggior capacità ottenuta immobilizzando 8A ET[l6-29] deriva dal fatto che solo alcune delle otto catene peptidiche prendono parte all'interazione covalente con la fase solida, mentre le altre risultano libere di interagire non covalentemente con la Big ET. Nel caso invece della ‘colonna preparata con Δ ΕΤ[Ί6-29], il peptide risulta legato alla fase solida mediante o il gruppo otamminico N-terminale, o tramite i gruppi ε amminici delle lisine presenti in posizione 2 e 13 nella sequenza del peptide. In entrambi i casi il peptide risulta non omogeneamente immobilizzato, e comunque la stretta vicinanza con la fase solida può portare a sensibili diminuzioni nella capacità di riconoscimento per la Big ET. Tali effetti sono difatti comuni anche per altri sistemi di affinità e comunque ampiamente documentati in letteratura. L'utilità della presente invenzione si può apprezzare ulteriormente, come descritto negli esempi seguenti, nel caso della messa a punto di metodologie analitiche per la quantificazione di Big ET.

In una particolare utilizzazione della presente invenzione, il peptide 8Δ ET[l6-29] può essere immobilizzato non covalentemente su appositi micro contenitori di plastica che vengono successivamente trattati con appropriate soluzioni proteiche per eliminare la presenza di eventuali siti di interazione aspecifici, e poi lavati con opportune soluzioni. Big Endotelina [1-38] o [16-29] marcate con opportuni reagenti possono poi venir aggiunte ad ogni microcontenitore, lasciando poi incubare per far avvenire l'interazione. I contenitori possono essere poi lavati per rimuovere l'eccesso di Big Endotelina [1-38] o [16-29] che non ha reagito, e poi esaminati per determinare la quantità di Big ET o del suo derivato [16-29] che ha reagito. In letteratura sono ampiamente descritti sia i metodi di marcatura, che possono essere condotti mediante l'introduzione di radioisotopi, enzimi, composti fluorescenti o cromofori, o biotina, sia i metodi di determinazione di tali composti marcati, e sono noti agli esperti del settore. L'intensità dell'interazione non specifica può essere determinata incubando Big Endotelina [1-38] marcata in presenza di eccesso di Big ET non marcata. L'affinità della Big Endotelina [1-38] per il peptide 8A ET[l6-29] immobilizzato nei microcontenitori può essere determinata incubando varie concentrazioni di Big Endotelina [1-38] marcata in assenza e in presenza di un eccesso di Big ET non marcata e analizzando i dati secondo il metodo di Scatchard. La specificità dell'interazione tra i peptidi oggetto della presente invenzione può essere determinata incubando nei microcontenitori derivatizzati con 8Δ ET[l6-29] con diversi peptidi e proteine marcati in presenza o assenza di materiale non marcato. Indicazioni addizionali sulla specificità possono essere ottenute incubando i frammenti 16-21 o 22-32 della Big Endotelina [Ί-38] che possiedono affinità molto bassa verso il peptide 8Λ ΕΤ[16-29]· Analogamente al caso del peptide 8Δ ΕΤ [16-29], i peptide 8Δ.TNF [144-157] è stato immobilizzato sia su un supporto solido per la preparazione di colonne di affinità per la purificazione di TNFot , sia su micropiastre per la messa a punto di un saggio per la quantificazione di TNFα .

L'utilità della presente invenzione risulta inoltre evidente, come illustrato negli esempi 5, 7 e 8, nel caso in cui la macromolecola di interesse da purificare od analizzare contenga più di un sito con la stessa sequenza complementare idropaticamente al ligando multimerico immobilizzato. In questo caso la polivalenza del ligando multimerico viene caratterizzata da un aumento dell'affinità di legame per la molecola di interesse. Una situazione generale di applicazione del presente metodo può verificarsi nel caso di proteine formate da diverse subunità tutte uguali come sequenza aminoacidica e struttura. Un peptide complementare idropaticamente ad un sito esposto di tali proteine può essere sintetizzato secondo il metodo oggetto della presente invenzione in forma octamerica, immobilizzato su una fase solida, e usato per purificare o quantificare la proteina oligomerica di interesse. La presenza di più siti di legame infatti potenzia l'affinità in maniera esponenziale, come nel caso ampiamente descritto in letteratura degli anticorpi bivalenti. L'osservato aumento dell'affinità di legame dei peptidi complementari multimerici chiaramente non trova solo applicazioni nel settore delle purificazioni mediante cromatografia di affinità o nel campo della messa a punto di tecnologie analitiche. Difatti, come risulta evidente ad ogni esperto del settore, la possibilità di creare molecole sintetiche in grado di associare a macromolecole proteiche (proteine, recettori, anticorpi, etc.) con alta affinità (cioè con bassi valori di costante di dissociazione) trova enorme utilizzo nel campo farmacologico, per la progettazione di nuovi farmaci di sintesi ad attività mirata verso una particolare macromolecola con importanti funzioni biologiche. Un particolare vantaggio nell'uso di questi composti multimericirispetto all'uso dei peptidi singoli, risiede, oltre nell'aumentata affinità, nella maggiore stabilità nei confronti dell'azione di enzimi proteolitici normalmente presenti nei fluidi biologici. Difatti, l'alto peso molecolare risultante dall'unione di molte unità peptidiche conferisce al composto una maggiore inaccessibilità sterica nei riguardi del sito attivo di proteolisi degli enzimi. Risulta inoltre evidente agli esperti del settore che è possibile variare, a seconda dei casi e delle specifiche applicazioni, sia il numero di unità peptidiche legate al nucleo polilisinico, sia introdurre altri residui per spaziare ulteriormente le catene peptidiche, senza per questo allontanarsi dagli scopi contenuti nella presente invenzione.

ESEMPIO 1

Sintesi in fase solida di 8A ET[l6-29]

La sequenza del peptide idropaticamente complementare alla sequenza 16-29 della Big Endotelina umana [1-38] (HLDIIWVNTPEHIV) è stata ottenuta in base al metodo AMINOMAT descritto precedentemente dagli stessi autori (Domanda di brevetto IT N. 20]55 A/90), e denominata ΑΕΤ/Ί6-29] (RKFLAGLRARRLKF). Il peptide ΔΕΤ["16-29] è stato poi sintetizzato mediante sintesi in fase solida con metodologia Fmoc utilizzando tecniche standard di accoppiamento dei singoli aminoacidi mediante formazione di esteri attivi con dicicloesil carbodiimmide/idrossibenzotriazolo DCC/HOBt. Analogamente è stata sintetizzata la sequenza 16-29 della Big Endotelina. I peptidi dopo la sintesi, sono stati deprotetti e sbloccati dal supporto solido secondo procedure standard, e purificato ad omogeneità cromatografica mediante RP-HPLC. Il nucleo polilisinico octadentato usato per la sintesi del peptide multiplo 8Δ ΕΤ"[16-29] (Figura 1A) è stato prodotto mediante accoppiamenti successivi in tre cicli aiα Fmoc-Lisina([-Fmoc) sul supporto solido iniziale (resina Fmoc-Glicina-HMP). Sul nucleo polilisinico iniziale è stata poi sintetizzata la sequenza Δ ET[16-29] (Figura 1B), come descritto precedentemente. Il peptide multiplo, dopo la deprotezione e lo sblocco dalla resina, è stato purificato da contaminanti a basso peso molecolare mediante dialisi contro acido acetico 0.1 M per 2 giorni. Alla fine il dializzato è stato congelato e liofilizzato. Seguendo lo stesso schema sono stati anche preparati i peptidi ET[6-29] e 8ET[16-29,], la cui struttura viene rispettivamente riportata in figura 1C e D.

ESEMPIO 2

Preparazione di fasi solide per cromatografia di affinità

I peptidi & ET[16-29J e 8ΔΕΤ[Ί6-29] sono stati immobilizzati su un supporto preattivato mediante l'introduzione di gruppi epossido (EUPERGIT) C30 N), utilizzando lo stesso rapporto peptide/supporto . I peptidi 8Δ ET[l6-29] (2 mg) e Δ ΕΤ[16-29] (2 mg) sono stati sciolti separatamente in 10 mi di 0.1 M NaH2C03, 0.5 M NaCI, pH 8.5 e aggiunti separatamente a due aliquote di 1 gr di EUPERGIT C30 N. Le miscele sono state incubate per 24 ore sotto agitazione a temperatura ambiente. L'incorporazione dei peptidi alla resina è stata seguita mediante RP-HPLC, e dopo 24 ore circa 1’803⁄4 del peptide inizialmente presente nelle due preparazioni e risultato covalentemente legato al supporto. Tale percentuale di incorporazione è stata poi anche confermata da analisi aminoacidiche condotte su quantità pesate delle due resine derivatizzate .

I due supporti peptide derivatizzati sono stati usati per riempire due colonne in vetro per cromatograf ia di affinità (80x6.6 mm I.D., volume totale 2.3 ml), che sono state equilibrate con 0.1 M TRIS*HC1 pH 6.8 ad un flusso di 1 ml/min. L'eluente è stato monitorato in continuo mediante determinazioni di assorbimento ottico a 280 nm. Per determinare la capacità delle colonne sono state effettuate iniezioni di 500 microlitri di ΕΤ[.Ί6-29] sciolta in concentrazione 1 mg/ml nel tampone di eluizione. Nelle stesse condizioni di eluizione, la colonna preparata con il peptide 8Δ ΕΤ[Ί6-29] (Figura 2A) trattiene completamente il materiale iniettato, mentre la colonna preparata con A E1[Ì6-29] ne trattiene solo il 50% (Figura 28).

ESEMPIO 3

Preparazione e purificazione di Biotin ΕΤ/Ί-32]

La marcatura di ΕΤ[1-32] per la messa a punto dei saggi analitici su microcontenitori di plastica è stata condotta derivaiizzando il peptide con biotina secondo la seguente procedura:

1 2.5 mg di ΕΤ/Ί-32] sono stati sciolti in 1 mi di 20 mM Na Ac pH 6.0, e 400 μl di una soluzione 2 mg/ml di biotin aminocaproate-N-idrossisuccinimmide estere in etanolo:acqua 1:1 sono stati aggiunti. La miscela è stata incubata sotto agitazione per 5 ore a temperatura ambiente.

2 La miscela di reazione è stata poi diluita 1:1 con TRIS 50 mM pH 6.8, e 1 mi è stato poi iniettato sulla colonna di affinità preparata con il peptide 8Λ ΕΤ[Ί6-29] ed equilibrata con 50 mM TRIS pH 6.8 ad un flusso di 1 ml/min. L'effluente è stato monitorato registrando l'assorbimento ottico a 280 nm. Dopo la completa eluizione del materiale non trattenuto, costituito dall'eccesso di reagente e da sottoprodotti di reazione, l'eluente è stato cambiato a 0.1 M HAc pH 3.0, come riportato in Figura 3B. Il prodotto purificato, denominato BiotinEt[1-32] è stato liofilizzato e usato direttamente per gli scopi successivi.

ESEMPIO 4

Interazione di Biotin-ET[1-3g] a micropiastre sensibilizzate con 8Δ ΕΤΔΙ6-29]

Alcune piastre da 96 pozzetti di polistirene (NUNC) sono state sensibilizzate con 100 pl/pozzetto di soluzioni di 8Δ 6-29] in tampone sodio carbonato 0.1 M pH 9.6 a varie concentrazioni (2.0, 0.5, 0.2, 0.1, 0.0 μg/m1), per una notte a 4°C. Le piastre sono state quindi lavate 3 volte con una soluzione di sodio cloruro 0.15 M, sodio fosfato 0.5 M pH ].3 (PBS), mediante ripetute operazioni di riempimento e svuotamento. Al termine ciascun pozzetto è stato riempito con 200 μl di una soluzione di albumina di siero bovino (BSA) al 3% in PBS ed incubate per 2 ore a temperatura ambiente. Le piastre sono state nuovamente lavate 3 volte con PBS e ciascun pozzetto è stato riempito con 100 μl di una soluzione di Biotin-ET[l-32] a varie concentrazioni (0.2, 0.1, 0.05, 0.0 μg/ml) in PBS diluito 1:1 con acqua distillata contenente BSA allo 0.5% (PBS-B) ed incubate per 2 ore a temperatura ambiente. Al termine le piastre sono state nuovamente lavate con PBS (8 volte) e riempite con 100 μl/ροzzetto di una soluzione di streptavidina-perossidasi (Sigma Chem. Co.) diluita 1:1000 con PBS-B contenente tween 20 allo 0.05%. Dopo un'ora di incubazione a 3]°C le piastre sono state lavate con PBS per 8 volte e riempite con 100 μl/pozzetto di una soluzione di o-fenilendiammina 1 mg/ml in tampone sodio citrato 0.1 M pH 5, contenente perossido di idrogeno 5 mM. La reazione cromogena è stata sviluppata per 30 minuti a 3]°C e bloccata mediante l'aggiunta di 25 μl di acido solforico 4.5 M. La densità ottica di ciascun pozzetto è quindi stata misurata mediante un lettore di micropiastre (Model 3550 Microplate Reader, Biorad). I risultati ottenuti, riportati in Figura 3, hanno indicato l'effettivo legame di Biotin-ET[1-32] ai pozzetti sensibilizzati con 8Δ ET[16-29.] . Il legame, come attesto, è risultato essere dipendente dalle concentrazioni sia di Biotin-ET[l-32] sia di 8ΔΕΤ[Ί629/. In particolare l 'uso di 8ΔΕΤ[Ί6-29] 0.5 mg/ml nella fase di sensibilizzazione delle piastre e Biotin-ET[1-32] 0.2 ug/ml sembrano essere sufficienti per generare un segnale misurabile per Io sviluppo di un test competitivo con ET [1-32]-

ESEMPIO 5

Test di legame competitivo per ET/l-32]

Al fine di valutare la specificità del legame di Biotin-ET[1-32] ai pozzetti sensibilizzati con 8ΔΕΤ[16-29], descritto nell'esempio 4, è stato eseguito un test di competizione di legame di Biotin-ET[1-32] con ET[1-32] e con due peptidi di controllo negativo C1 e C2 ai pozzetti rivestiti con 8ΔΕΤ/16-23⁄4]. L'esperimento è stato eseguito seguendo la procedura descritta nell 'esempio 4 con concentrazioni fisse di 8Δ ET/16-29] (0.5 pg/ml) e Biotin-ET/1-32/ (0.2 pg/ml) ed in presenza di varie concentrazioni di peptidi competitori comprese tra 1 e 1000 μg/ml nella fase di legame. I risultati ottenuti , riportati in Figura 5, indicano l'effettiva competizione del legame tra Biotin-ET[1-32] e 8ΔET/16-29] con [1/1-32] a concentrazioni comprese tra 5 e 250 pg/ml , ma non con C1 e C2. Ciò suggerisce che l'interazione tra i peptidi complementari osservata è specifica. La specificità dell 'interazione è stata ulteriormente confermata mediante esperimenti di competizione con ET[l6-29]- In questo caso non è stata osservata una apprezzabile competizione di legame alle concentrazioni testate. Ciò è facilmente interpretabile in termini di drastica riduzione di affinità dovuta alla mancanza di 11 residui nella regione idropaticamente complementare, necessari per stabilizzare l’interazione. In accordo con questa ipotesi si è osservato che il peptide E T[16-29], contenente l'intera regione complementare è invece in grado di competere. In conclusione il legale Biotin-ΕΤ[Ί -32[8Λ ΕΤ[Ί6-29.7 osservato sulle piastre di polistirene è specifico e dipendente dalle regioni idropaticamente complementari dei due peptidi, e sfruttabile per il dosaggio di molecole contenenti dette regioni come ad esempio la Big-Endotelina e la prò-Endotelina .

ESEMPIO 6

Determinazione della affinità relativa di ET[16-29.] e 8ET[16-32] verso 8Δ ET è-29J

La colonna contenente il peptide 8Λ ΕΤ[16-29], preparata come descritto nell'esempio 2, è stata equilibrata con 1 M NH4Ac pH 5.] ad un flusso di 1.0 ml/min. Sotto queste condizioni di alta forza ionica, le interazioni tra peptidi complementari risultano notevolmente ridotte, come descritto in letteratura (Fassina et al., J. Biol. Chem.

264:11252, 1989), ed è possibile osservare anziché un completo adsorbimento solo un ritardo del volume di eluizione del composto interagente rispetto al volume morto della colonna. Dal volume di eluizione, è possibile calcolare la costante di dissociazione dell'interazione Km/p, in base all'equazione:

dove V è il volume di eluizione, V0 il volume morto della colonna, M la capacità della colonna e P la quantità di componente eluito (Fassina & Chaiken, Adv. in Chromatogr., 2]:24], 198]). In queste condizioni, il peptide ΕΤ[Ί6-29] subisce un ritardo di eluizione pari a 3 mi (Figura 6A) , mentre il peptide 8ΕΤ[Ί6-29] non viene eluito nemmeno dopo 100 minuti ed è richiesto un cambio di eluente ad HAc 0.1 M per la sua completa eluizione (Figura 6B). La costante di dissociazione del peptide ΕΤ[Ί6-29_] risulta quindi almeno 50 volte superiore rispetto a quella ottenuta con il peptide 8ΔΕΤ[Ί6-29]. Questo significa che la multivalenza nell'interazione tra 8ΛΕΤ[Γ16-29] e 8ET['l6-29] potenzia quasi di 2 ordini di grandezza l'associazione.

ESEMPIO ]

Design e sintesi in fase solida di 8A-TNF ["144-15], La sequenza del peptide idropaticamente complementare alla sequenza 144-15] del Tumor Necrosis Factor (TNFα ) /FAESGQVYFGIIAL/ è stata ottenuta in base al metodo AMINOMAT descritto precedentemente {Domande,di brevetto IT 21396 A/89 e N.20]55A/90) e denominato Δ TNF [144-15]]

[DYLAGFKAHGKKYRJ. Il peptide 8Δ TNF [144-157] è stato poi sintetizzato mediante sintesi in fase solida con metodologia Fmoc a partire da un nucleo polilisinico octadentato provvisto di spaziatori glicinici ed argininici come illustrato in Figura 7A. Similmente a quanto descritto precedentemente, il peptide 8Δ.TNF ["144-15]] (Figura ]B) è stato deprotetto, sbloccato dalla resina, e purificato mediante dialisi contro acido acetico 0,1 M per due giorni. Alla fine il dializzato è stato congelato e liofilizzato. Il peptide 8Δ TNF ["144-15]7 (5 mg) è stato poi immobilizzato su un supporto preattivato (1 gr) con gruppi epossidici (EUPERGIT C30 N), utilizzando le stesse condizioni riportate precedentemente. Il supporto peptide derivatizzato è stato poi usato per riempire una colonna in vetro per cromatografia di affinità (80 x 6.6 mm I.D., volume totale 2.3 mi), che è stata poi equilibrata con 0.1 M TRIS HC1 pH 6.8 ad un flusso di 2.0 ml/min. Per determinare la capacità di riconoscimento della colonna verso il TNF sono state effettuate iniezioni di 100 microlitri di TNFα in concentrazione 0.5 mg/ml sciolto nel tampone di eluizione. Dopo circa 10 minuti il tampone è stato cambiato ad acido acetico 0.1 M per consentire l'eluizione del materiale adsorbito (Figura 8A). Il materiale eluito con acido acetico è stato poi analizzato mediante RP-HPLC per confermare l'avvenuto riconoscimento tra TNFα e 8Δ TNF [144-15]] (Figura 8B}.

ESEMPIO 8

Interazione di Biotin TNF a micropiastre sensibilizzate con 8A TNF [144-157]

A ciascun pozzetto di piastre in PVC (96 pozzetti) sono stati aggiunti 50 pi di una soluzione di 8A TNF [144-15]], 0.04 mg/ml, in tampone sodio bicarbonato 0.1 M pH 9.6. Le piastre sono state incubate per 1 ora a temperatura ambiente e lavate tre volte con PBS. Ogni pozzetto è stato quindi riempito con 200 μl di una soluzione di albumina di siero bovino (BSA) al 3% in tampone sodio fosfato 0.025 M, pH 6.5, contenente NaCl 0.0]5 M (PBS). Dopo un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente le piastre sono state lavate con PBS e riempite con miscele di TNF/TNF-Biotina a varie diluizioni in PBS-BSA 1% w/v, contenente Tween 20, 0.05% v/v, 10 KIU/ml Aprotinina, PMSF 10 uM, EDTA 10 μΜ, (PBS-TAPE) in presenza ed in assenza di 1% siero normale di capra. Le piastre sono state nuovamente incubate per 1 ora a temperatura ambiente e lavate con PBS. Ogni pozzetto è stato quindi riempito con 100 μΐ di una soluzione di streptavidina-perossidasi (Sigma) diluita 1:2000 con PBS-TAPE ed incubata per 1 ora a temperatura ambiente. Al termine le piastre sono state lavate, riempite con una soluzione di cromogeno ABTS (KPL) (100 μΐ/pozzetto) ed incubate 30' a temperatura ambiente. L'assorbenza a 405 nm di ogni pozzetto è stata misurata mediante un lettore di micropiastre (BioRad Model 25550 EIA Reader). Come viene riportato in Figura 8, il legame tra 8Δ TNF [144-157] immobilizzato ai pozzetti e TNF α-Biotina risulta specifico e competibile da TNFO-sia in presenza che in assenza di siero normale di capra.

La presente invenzione è stata descritta con riferimento specifico ad alcune sue forme preferite di realizzazione, ma è da intendersi che variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.

Claims (22)

1. RIVENDICAZIONI 1. Peptidi non lineari idropaticamente complementari a peptidi o porzioni di proteine con sequenza aminoacidica nota caratterizzati dal fatto di comprendere un nucleo aminoacidico comprendente almeno un aminoacido con almeno due funzioni aminiche terminali una sequenza aminoacidica lineare idropaticamente complementare a detta sequenza aminoacidica nota legata, con legame carbamidico , a ciascuna di detta funzione aminica terminale.
2. 2. Peptidi non lineari secondo la rivendicazione 1 in cui detta sequenza aminoacidica idropaticamente complementare è di un numero di aminoacidi compreso tra 10 e 20.
3. 3. Peptidi non lineari secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto nucleo aminoacidico centrale ha seguente formula: (segue formula)

   dove X è un aminoacido con almeno due residui funzionali aminici; Y è un amino acido scelto tra il gruppo di alanina, glieina o arginine; m è un numero comrpeso tra 0 e 1; n1, n2, n3, n4 sono numeri compresi tra 0 e 10 e dove i legami sono legami carbamidici.
4. 4. Peptidi non lineari' secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto aminoacido con almeno due funzioni aminiche terminali (X) è lisina.
5. 5. Peptidi non lineari secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui detto aminoacido con almeno due funzioni aminiche terminali (Y) è ornitina.
6. 6. Peptidi non lineari secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detta sequenza aminoacidica è idropaticamente complementare ad una porzione della Big endotelina. ].
7. Peptidi non lineari secondo la rivendicazione 6 in cui detta sequenza è idropaticamente complementare alla porzione delia Big Endotelina dall 'aminoacido 16 a 29.
8. 8. Peptidi non lineari secondo la rivendicazione 7 in cui detta sequenza ha la seguente formu la:
9. 9. Peptidi non lineari secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui detta sequenza aminoacidica è idropaticamente complementare ad una porzione del TNFoC -
10. 10. Peptidi non lineari secondo la rivendicazione 9 in cui detta sequenza è idropaticamente complementare alla porzione 144-15] del TNF α .
11. 11. Peptidi non lineari secondo la rivendicazione 10 in cui detta sequenza ha la seguente formu1a :
12. 12. Procedimento per la sintesi di peptidi non lineari secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente le fasi di: immobilizzare in fase solida il residuo carbossilico di un aminoacido - far formare un legame carbamidico tra il residuo aminico di detto aminoacido ed il residuo carbossilico di un aminoacido con almeno due funzioni aminiche terminali - aggiungere a ciascuna di dette funzioni aminiche terminali un amino acido anch'esso con almeno due funzioni aminiche terminali - ripetere questa fase da 0 a 2 volte sintetizzare peptidi lineari covalentemente legati a ciascuna di dette funzioni aminiche termina1i .
13. 13. Procedimento secondo la rivendicazione 12 in cui agli aminoacidi con almeno due funzioni aminiche terminali sono interposti aminoacidi scelti tra glieina, alanina o arginine che agiscono da spaziatori.
14. 14. Procedimento secondo la rivendicazione 12 in cui detti peptidi sono idropaticamente complementari ad almeno una porzione della Big Endote-1ina.
15. 15. Procedimento secondo la rivendicazione 12 in cui detti peptidi sono idropaticamente complementari ad almeno una porzione del TNF OC.
16. 16. Procedimento per la preparazione di colonne per cromatografia di affinità utilizzando peptidi non lineari secondo una delle rivendicazioni da 1 a 11 comprendente le fasi di - immobilizzare il supporto derivatizzato su una colonna cromatografica ed equilibrarla con un tampone salino - iniettare in colonna una quantità compatibile con la capacità della colonna di un composto crudo contenente la proteina o il peptide da purificare - lavare la colonna con un tampone di eluizione sino a scomparsa di materiale estraneo ed eluire detta proteina o detto peptide legato alla colonna mediante un campio di eluente in modo da sfavorire il legame.
17. 17. Procedimento secondo la rivendicazione 16 in cui detta proteina da purificare è la Big Endotelina .
18. 18. Procedimento secondo la rivendicazione 16 in cui detta proteina da purificare è il Tumor Necrosis Factor (TNF 0( ).
19. 19. Procedimento per la misurazione di peptidi o proteine di origine sia naturale che ricombinante in campioni, comprendente: - trattare un contenitore compartimentalizzato con peptidi non lineari secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11 - marcare un'aliquota purificata del peptide o la proteina da misurare - incubare detto peptide o proteina marcata in detto contenitore - incubare il campione contenente detto peptide o proteina da misurare in detto contenitore - rivelare la presenza di detto peptide o proteina da misurare in detto campione mediante determinazioni differenziali.
20. 20. Procedimento secondo la rivendicazione 19 in cui detta marcatura avviene o con radioisotopi, o per via enzimatica o con un gruppo fluorescente o cromoforo o con biotina.
21. 21. Procedimento secondo le rivendicazioni 18 o 19 in cui detta proteina da misura è la Big Endotelina.
22. 22. Procedimento secondo le rivendicazioni 18 o 19 in cui detta proteina è il Tumor Necrosis Factor {TNF α ).