IT9022512A1 - ENZYMATIC PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF 7B- (4CARBOXYANAMIDE) CEPHALOSPORANIC ACID. - Google Patents
ENZYMATIC PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF 7B- (4CARBOXYANAMIDE) CEPHALOSPORANIC ACID. Download PDFInfo
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: Description of the industrial invention entitled:
PROCEDIMENTO ENZIMATICO PER LA PRODUZIONE DI ACIDI 7β-(4-CARBOSSIBUTANAMIDO) CEFALOSPORANICI. ENZYMATIC PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF 7β- (4-CARBOXYBUTANAMIDE) CEPHALOSPORANIC ACIDS.
COMPENDIO DELL'INVENZIONE SUMMARY OF THE INVENTION
La presente invenzione riguarda un procedimento per la preparazione di acidi 7β-(4-carbossibutanamido) cefalosporanici (di seguito indicati con la denominazione comune di acidi glutàril-7-amminocefalosporanici) mediante deamminazione ossidativa enzimatica della Cefalosporina C (Cef C) o suoi derivati. Più in particolare il procedimento si riferisce alla trasformazione della Cefalosporina C o suoi derivati e sali nei corrispondenti acidi glutaril-7-amminocefalosporanici mediante un enzima immobilizzato costituito da D-amminoacido ossidasi (DAO;EC-1.4.3.3) legata su matrici solide, ottenuto da colture di Rhodotorula gracilis ATCC 26217. The present invention relates to a process for the preparation of 7β- (4-carboxybutanamido) cephalosporanic acids (hereinafter referred to as glutàril-7-aminocephalosporanic acids) by enzymatic oxidative deammination of Cephalosporin C (Cef C) or its derivatives. More specifically, the process refers to the transformation of Cephalosporin C or its derivatives and salts into the corresponding glutaryl-7-aminocephalosporanic acids by means of an immobilized enzyme consisting of D-amino acid oxidase (DAO; EC-1.4.3.3) bound on solid matrices, obtained from cultures of Rhodotorula gracilis ATCC 26217.
Il processo può essere così schematicamente rappresentato: The process can be schematically represented as follows:
dove R è -OCOCH3, -H, -OH, -OCONH2 where R is -OCOCH3, -H, -OH, -OCONH2
L’acido glutaril-7-amminocefalosporanico (R=-OCOCH3), come è noto. può essere idrolizzato con processi enzimatici in presenza di acilasi, nell'acido 7-amminocefalosporanico (7-ACA) , importante intermedio per la produzione degli antibiotici della famiglia delle Cefalosporine. Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid (R = -OCOCH3), as it is known. it can be hydrolyzed with enzymatic processes in the presence of acylase, in 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA), an important intermediate for the production of antibiotics of the Cephalosporin family.
Nel procedimento enzimatico di deamminazione ossidativa della Cefalosporine C è noto da tempo l'impiègo della .D-amminoacido ossidasi (DAO;EC-1.4.3.3) ottenuta da colture di vari microorganismi come: Trigonopsis variabilis. Aspergillus. Penicillium, Neurospora. Pseudomonas, Cephalosporlum, secondo quanto descritto nei brevetti BE 736934, DT 2219454, FR 2133927. JP 125696 e JP 128295-DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE The use of D-amino acid oxidase (DAO; EC-1.4.3.3) obtained from cultures of various microorganisms such as: Trigonopsis variabilis has been known for some time in the enzymatic process of oxidative deamination of Cephalosporin C. Aspergillus. Penicillium, Neurospora. Pseudomonas, Cephalosporlum, as described in patents BE 736934, DT 2219454, FR 2133927. JP 125696 and JP 128295-DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Il procedimento secondo la presente invenzione rappresenta un progresso tecnico innovativo rispetto ai procedimenti noti in quanto utilizza un enzima DAO ad alta specificità verso la Cefalosporina C o suoi derivati. Tale enzima viene prodotto da colture di Rhodotorula gracilis ATCC 26217 e si differenzia da quelli ottenuti dai microorganismi della tecnica nota sia per le proprietà chimico-fisiche della proteina enzimatica che per il legame con il gruppo prostetico flavinadenindinucleotide (FAD). Una importante innovazione rispetto alla tecnica nota è rappresentato dal fatto che l'enzima DAO non viene utilizzato sotto forma di massa cellulare o di soluzioni acquose, ma viene purificato e trasformato in una forma immobilizzata insolubile in ambiente acquoso, particolarmente idonea per la conversione industriale della Cefalosporina C in acido glutaril-7-amminocefalosporanico. The process according to the present invention represents an innovative technical progress with respect to the known processes since it uses a DAO enzyme with high specificity towards Cephalosporin C or its derivatives. This enzyme is produced from cultures of Rhodotorula gracilis ATCC 26217 and differs from those obtained from microorganisms of the known art both for the chemical-physical properties of the enzymatic protein and for the binding with the prosthetic group flavinadenindinucleotide (FAD). An important innovation with respect to the prior art is represented by the fact that the DAO enzyme is not used in the form of cell mass or aqueous solutions, but is purified and transformed into an immobilized form insoluble in aqueous environment, particularly suitable for the industrial conversion of Cephalosporin C in glutaryl-7-aminocephalosporanic acid.
La D-amminoacido ossidasi immobilizzata è molto stabile e, in virtù della sua insolubilità in acqua, presenta il vantaggio di poter essere facilmente recuperata dal mezzo di reazione e reimpiegata per un grande numero di volte, condizione questa necessaria ed indispensabile per un processo industriale. Immobilized D-amino acid oxidase is very stable and, by virtue of its insolubility in water, has the advantage of being easily recovered from the reaction medium and reused for a large number of times, a necessary and indispensable condition for an industrial process.
Altro importante vantaggio conseguito dalla presente invenzione è rappresentato dal fatto che l’enzima è immobilizzato su matrici che per la loro struttura fisica permettono non solo una semplificazione nell'uso e nel recupero del catalizzatore, ma anche di ottenere soluzioni di acidi glutaril-7-amminocefalosporanici particolarmente puri ed utilizzabili direttamente in una operazione successiva di conversione enzimatica in acidi 7-amminocefalosporanici . Another important advantage achieved by the present invention is represented by the fact that the enzyme is immobilized on matrices which, due to their physical structure, allow not only a simplification in the use and recovery of the catalyst, but also to obtain solutions of glutaryl-7- acids. particularly pure aminocephalosporans which can be used directly in a subsequent enzymatic conversion operation into 7-aminocephalosporanic acids.
Tutti questi vantaggi portano infine alla possibilità di poter effettuare il processo sia in discontinuo operando in reattore agitato con l'enzima in sospensione sia operando con colonne a letto fisso attraverso le quali viene fatta passare in continuo la soluzione della Cefalosporina C o più in generale del composto di formula (I). Finally, all these advantages lead to the possibility of being able to carry out the process both in batch by operating in a stirred reactor with the enzyme in suspension and by operating with fixed bed columns through which the solution of Cephalosporin C or more generally of the compound of formula (I).
Queste ed altre innovazioni conseguite dalla presente invenzione portano, come risultato pratico finale, all'ottenimento di conversioni e rese elevate nel processo di trasformazione della Cefalosporina C o suoi derivati in acidi glutaril-7-amminocefalosporanici , con valori intorno al 95% e pertanto più alti rispetto a quelli ottenuti nei procedimenti finora noti. These and other innovations achieved by the present invention lead, as a final practical result, to obtaining high conversions and yields in the transformation process of Cephalosporin C or its derivatives into glutaryl-7-aminocephalosporanic acids, with values around 95% and therefore more higher than those obtained in the processes known up to now.
Come già precedentemente accennato, la DAO prodotta da Rhodotorula gracilis ATCC 26217 è un enzima FAD dipendente (flavoproteina) di natura endocellulare cosi come quello ottenuto da Trigonopsis variabilis che è la fonte maggiormente citata nella letteratura tecnica. La DAO da Rhodotorula gracilis è caratterizzata tuttavia da un più stabile legame con il FAD, come risulta dal basso valore della costante di dissociazione pari a 2,2x10-8 M. As previously mentioned, the DAO produced by Rhodotorula gracilis ATCC 26217 is a FAD dependent enzyme (flavoprotein) of an endocellular nature as well as that obtained from Trigonopsis variabilis which is the most cited source in the technical literature. The DAO from Rhodotorula gracilis is however characterized by a more stable bond with the FAD, as shown by the low value of the dissociation constant equal to 2.2x10-8 M.
La DAO da Rhodotorula gracilis si differenzia in modo netto non solo per le proprietà chimico-fisiche della proteina enzimatica, ma anche per il quadro degli inibitori e per la specificità sui D-amminoacidi presi come substrato. (Pilone Simonetta M. et al., Eur. J. Biochem. l80, 199 (1989); Kubicek-Pranz E.M. et al., J. of Appi. Biochem. 2 104 (1985)). The DAO from Rhodotorula gracilis differs in a clear way not only for the chemical-physical properties of the enzymatic protein, but also for the framework of the inhibitors and for the specificity on the D-amino acids taken as substrate. (Pilone Simonetta M. et al., Eur. J. Biochem. 180, 199 (1989); Kubicek-Pranz E.M. et al., J. of Appi. Biochem. 2 104 (1985)).
In particolare la DAO da Rhodotorula gracilis ha un'ottima specificità per la Cefalosporina C con valori di Km e Vmax molto simili a quelli riscontrati per la D-alanina che è il substrato specifico per questo enzima. In particular, the DAO from Rhodotorula gracilis has an excellent specificity for Cephalosporin C with values of Km and Vmax very similar to those found for D-alanine which is the specific substrate for this enzyme.
Il presente trovato permette di ottenere da colture di Rhodotorula gracilis, attraverso un semplice metodo di frazionamento in colonna, l'enzima D-amminoacido ossidasi in forma purificata e praticamente esente da catalasi, esterasi e β-lattamasi, ossia dagli enzimi che sono normalmente presenti nelle soluzioni di DAO grezze e che risultano interferenti nel sistema di trasformazione enzimatica della Cefalosporina C ad acidi glutaril-7-amminocefalosporanici in quanto: The present invention allows to obtain from Rhodotorula gracilis cultures, through a simple method of column fractionation, the enzyme D-amino acid oxidase in a purified form and practically free from catalase, esterase and β-lactamase, i.e. from the enzymes that are normally present in raw DAO solutions and which are interfering in the enzymatic transformation system of Cephalosporin C to glutaryl-7-aminocephalosporanic acids as:
- la catalasi distrugge l'H2O2 con conseguente blocco della decarbossilazione ed arresto della reazione a chetoadipilderivati (acidi 7β-(5-carbossi-5-ossopentanamido)-cefalosporanici); - catalase destroys H2O2 with consequent blocking of decarboxylation and stopping the reaction to ketoadipilderivati (7β- (5-carboxy-5-oxopentanamido) -cephalosporanic acids);
- l'esterasi, nei composti di tipo (I) dove R = OCOCH3, porta alla formazione di desacetilderivati non voluti; . - esterase, in type (I) compounds where R = OCOCH3, leads to the formation of unwanted desacetyl derivatives; .
- la β-lattamasi idrolizza l'anello β-lattamico con distruzione della struttura cefalosporanica. - β-lactamase hydrolyzes the β-lactam ring with destruction of the cephalosporan structure.
Le soluzioni di DAO così ottenute sono quindi valide per quanto riguarda la purezza e la funzionalità catalitica ma, così come per tutte le DAO in soluzione, non sono molto stabili e, sotto questa forma, hanno scarso interesse industriale. Le forme immobilizzate ottenute secondo il trovato, presentano invece una stabilità molto elevata e sono industrialmente valide per la produzione di acidi glutaril-7-amminocefalosporanici. The DAO solutions thus obtained are therefore valid as regards purity and catalytic functionality but, as for all the DAOs in solution, they are not very stable and, in this form, have little industrial interest. The immobilized forms obtained according to the invention, on the other hand, have a very high stability and are industrially valid for the production of glutaryl-7-aminocephalosporanic acids.
Si veda a questo proposito il diagramma di stabilità della DAO immobilizzata in Fig.l e, per confronto, quello di Fig.2 relativo all'enzima in soluzione acquosa. In this regard, see the stability diagram of the immobilized DAO in Fig. 1 and, for comparison, that of Fig. 2 relating to the enzyme in aqueous solution.
Inoltre la DAO immobilizzata secondo l'invenzione mantiene una elevata attività nelle condizioni di impiego del processo di deamminazione ossidativa della Cefalosporina C per un periodo molto lungo e quindi per un grande numero di operazioni: si veda a questo proposito il diagramma di Fig.3 dove si riporta la attività (in percentuale rispetto a quelle iniziale) in funzione delle ore di impiego nel processo enzimatico a 25°C. a PH 7.5-Il procedimento oggetto della presente invenzione è essenzialmente basato sulle seguenti fasi: Furthermore, the DAO immobilized according to the invention maintains a high activity in the conditions of use of the oxidative deamination process of Cephalosporin C for a very long period and therefore for a large number of operations: see in this regard the diagram of Fig. 3 where the activity is reported (as a percentage of the initial one) as a function of the hours of use in the enzymatic process at 25 ° C. a PH 7.5 - The process object of the present invention is essentially based on the following steps:
1 - Fermentazione per la produzione delle cellule di Rhodotorula gracilis ATCC 26217-2 - Estrazione e purificazione dell'enzima D-amminoacido ossidasi da cellule di Rhodotorula gracilis. 1 - Fermentation for the production of Rhodotorula gracilis cells ATCC 26217-2 - Extraction and purification of the enzyme D-amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis cells.
3 - Immobilizzazione della D-amminoacido ossidasi su matrici solide insolubili in acqua. 3 - Immobilization of D-amino acid oxidase on solid matrices insoluble in water.
4 - Conversione della Cefalosporina C o suoi derivati e sali nei corrispondenti acidi glutaril-7-amminocefalosporanici in mezzo acquoso mediante l'enzima immobilizzato. 4 - Conversion of Cephalosporin C or its derivatives and salts into the corresponding glutaryl-7-aminocephalosporanic acids in aqueous medium by means of the immobilized enzyme.
1 - Fermentazione di Rhodotorula gracilis ATCC26217 1 - Fermentation of Rhodotorula gracilis ATCC26217
La coltura di Rhodotorula gracilis viene effettuata mediante fermentazione aerobica. Come componenti del brodo si usano quelli generalmente impiegati per la produzione di lieviti utilizzando fonti di azoto come amminoacidi nella forma D e DL, peptone, estratti di lievito, corn steep liquor, ecc.; fonti di carbonio come glucosio, saccarosio, maltosio, melasso di barbabietola e di canna da zucchero; sali minerali come cloruro di sodio, cloruro di calcio, solfato di zinco, solfato di magnesio, ecc. Rhodotorula gracilis culture is carried out by aerobic fermentation. As components of the broth are used those generally used for the production of yeasts using nitrogen sources such as amino acids in the D and DL form, peptone, yeast extracts, corn steep liquor, etc .; carbon sources such as glucose, sucrose, maltose, beet and sugar cane molasses; mineral salts such as sodium chloride, calcium chloride, zinc sulphate, magnesium sulfate, etc.
Un brodo di coltura particolarmente idoneo per la produzione delle cellule di Rhodotorula gracilis ad alto contenuto di enzima DA0 è quello di composizione compresa nei seguenti limiti : A culture broth particularly suitable for the production of Rhodotorula gracilis cells with a high content of DA0 enzyme is that of a composition comprised within the following limits:
La fermentazione viene effettuata previa sterilizzazione del brodo a 120°C portando poi a 30°C e introducendo quindi l’inoculo costituito da coltura vegetativa di Rhodotorula gracilis. La coltura è mantenuta in agitazione a 24-32°C, preferibilmente 26-30°C ed aerata mediante insufflazione bilanciata di aria ad una portata di 0,5 - 1 volumi/volume di brodo/minuto. Il pH del mezzo é mantenuto fra 4 e 6,5 preferibilmente 5 con aggiunta di basi non azotate. La durata delle- condizioni operative come composizione del mezzo di coltura, agitazione, temperatura. Fermentation is carried out after sterilizing the broth at 120 ° C, then bringing it to 30 ° C and then introducing the inoculum consisting of a vegetative culture of Rhodotorula gracilis. The culture is kept under agitation at 24-32 ° C, preferably 26-30 ° C and aerated by balanced insufflation of air at a flow rate of 0.5 - 1 volume / volume of broth / minute. The pH of the medium is maintained between 4 and 6.5, preferably 5 with the addition of non-nitrogenous bases. The duration of the operating conditions such as composition of the culture medium, stirring, temperature.
2 - Estrazione e purificazione 2 - Extraction and purification
La D-amminoacido ossidasi da Rhodotorula gracilis è un enzima endocellulare. The D-amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis is an intracellular enzyme.
Al termine della fermentazione il brodo di coltura è quindi centrifugato per la separazione ed il recupero del corpuscolato. At the end of fermentation, the culture broth is then centrifuged for the separation and recovery of the corpuscle.
La pasta cellulare è risospesa in acqua, portata a pH da 6 a 9 (preferibilmente 8) con aggiunta di NaOH e sottoposta a trattamenti di lisi con mezzi fisici (sonicazione) o trattamenti chimici (aggiunta di tensioattivi e solventi immiscibili in H2O). The cellular pulp is resuspended in water, brought to pH 6 to 9 (preferably 8) with the addition of NaOH and subjected to lysis treatments with physical means (sonication) or chemical treatments (addition of surfactants and solvents immiscible in H2O).
Una tecnica preferenziale è quella di risospendere la pasta cellulare in un mezzo tamponato a pH 8 (preferibilmente tampone fosfato con aggiunta di piccole quantità di bisolfito alcalino e di un tensioattivo cationico come cetilpiridinio cloruro) e di sottoporre la sospensione a passaggi multipli su pressa ad una pressione maggiore di 550 bar o su mulino a sfere. A preferential technique is to resuspend the cellular paste in a buffered medium at pH 8 (preferably phosphate buffer with the addition of small quantities of alkaline bisulfite and a cationic surfactant such as cetylpyridinium chloride) and to subject the suspension to multiple passages on a press to a pressure higher than 550 bar or on ball mill.
Il lisato cellulare viene quindi flocculato, chiarificato per centrifugazione, concentrato mediante ultrafiltrazione e salato con aggiunta di solfato d'ammonio. The cell lysate is then flocculated, clarified by centrifugation, concentrated by ultrafiltration and salted with the addition of ammonium sulphate.
Il precipitato per salatura, che contiene D-amminoacido ossidasi, è separato per filtrazione e risospeso in tampone a pH 8. The salt precipitate, which contains D-amino acid oxidase, is separated by filtration and resuspended in buffer at pH 8.
Si ottiene cosi una soluzione di enzima grezzo, accompagnato da piccole quantità degli enzimi interferenti: catalasi, esterasi e β-lattamasi. L'enzima grezzo viene,poi purificato con metodi noti. Una tecnica preferenziale di purificazione dell'enzima è il frazionamento cromatografico su colonna con resina a scambio ionico avente.come funzione ionizzabile il gruppo dietilamminoetile (DEAE) come ad esempio Sepharos (Pharmacia), Trisacry , Toyopearl (Toso Haas) con tampone fosfato 25 mM, pH 8. A crude enzyme solution is thus obtained, accompanied by small quantities of the interfering enzymes: catalase, esterase and β-lactamase. The crude enzyme is then purified by known methods. A preferred enzyme purification technique is column chromatographic fractionation with ion exchange resin having the diethylaminoethyl group (DEAE) as ionizable function such as Sepharos (Pharmacia), Trisacry, Toyopearl (Toso Haas) with 25 mM phosphate buffer , pH 8.
Gli enzimi interferenti, in particolare l'esterasi, sono trattenuti dalla resina della colonna mentre la DAO cosi purificata passa direttamente nel percolato. The interfering enzymes, in particular esterase, are retained by the resin of the column while the thus purified DAO passes directly into the leachate.
Si ottiene in questo modo un enzima con un'attività specifica di 15-20 U/mg di proteina, privo di attività catalitiche non volute. In this way an enzyme with a specific activity of 15-20 U / mg of protein is obtained, devoid of unwanted catalytic activity.
La DAO cosi purificata è stabile 6 giorni a 4°C,e almeno 6 mesi a -20*C. L’enzima cosi ottenuto passa direttamente al processo di immobilizzazione. The thus purified DAO is stable 6 days at 4 ° C, and at least 6 months at -20 ° C. The enzyme thus obtained passes directly to the immobilization process.
3 - Immobilizzazione della D-amminoacido ossidasi 3 - Immobilization of D-amino acid oxidase
Il metodo, secondo la presente invenzione, consiste nell 'immobilizzare la D-amminoacido ossidasi su supporti solidi, in genere resine commerciali a scambio ionico. The method, according to the present invention, consists in immobilizing the D-amino acid oxidase on solid supports, generally commercial ion exchange resins.
La tecnica di immobilizzazione degli enzimi su resine a scambio ionico è nota da tempo, ma non è mai stata descritta e sperimentata per la DAO da Rhodotorula gracilis. The technique of immobilization of enzymes on ion exchange resins has been known for some time, but has never been described and tested for DAO by Rhodotorula gracilis.
Nella presente invenzione si sono utilizzate come matrici: In the present invention the following are used as matrices:
- Resine a struttura polistirenica macroreticolare fortemente basiche e con funzione amminica quaternaria come Amberlite IRA 900 (Rohm e Haas). - Resins with strongly basic macroreticular polystyrene structure and with quaternary amino function such as Amberlite IRA 900 (Rohm and Haas).
- Resine a struttura polistirenica macroreticolare debolmente basiche con funzione amminica primaria come Duolite A 365 (Rohm e Haas). - Weakly basic macroreticular polystyrene structure resins with primary amino function such as Duolite A 365 (Rohm and Haas).
- Resine a struttura fenolformaldeide policondensata mediamente basiche con gruppi funzionali amminici secondari e terziari come Duolite A 568 o Duolite A 7 (Rohm e Haas). - Medium basic polycondensed phenolformaldehyde structure resins with secondary and tertiary amino functional groups such as Duolite A 568 or Duolite A 7 (Rohm and Haas).
Secondo, il presente trovato i suddetti tipi di resina sono tamponati a pH da 6 a 9. preferibilmente a pH 8, con tampone fosfato 0,1 M. Alla resina tamponata si aggiunge una soluzione di un agente bifunzionale adatto per la formazione di legami di reticolazione fra la proteina enzimatica e la matrice funzionalizzata. Agenti bifunzionali idonei sono le dialdeidi alifatiche come ad es. la glutaraldeide e la malonaldeide. According to the present invention, the aforesaid types of resin are buffered at pH 6 to 9. preferably at pH 8, with 0.1 M phosphate buffer. A solution of a bifunctional agent suitable for the formation of bonds is added to the buffered resin. cross-linking between the enzymatic protein and the functionalized matrix. Suitable bifunctional agents are aliphatic dialdehydes such as e.g. glutaraldehyde and malonaldehyde.
Di norma si impiega una soluzione di glutaraldeide in tampone fosfato pH 7~9, generalmente 8, ad una concentrazione di 1-42, generalmente 2%. Dopo 15-60 minuti ad una temperatura compresa fra 4°C e 30°C, preferibilmente 30 minuti a 20°C, si separa il surnatante per decantazione ed alla resina umida attivata si aggiunge la soluzione dell’enzima DAO ad un pH compreso tra 6 e 9, preferibilmente 8, in tampone fosfato 25 mM. Dopo un contatto per 2-24 ore alla temperatura di 4°-20°C, nella norma 12 ore a 4*C, la resina con l'enzima immobilizzato si separa per filtrazione. Usually a solution of glutaraldehyde in phosphate buffer pH 7 ~ 9, generally 8, at a concentration of 1-42, generally 2% is used. After 15-60 minutes at a temperature between 4 ° C and 30 ° C, preferably 30 minutes at 20 ° C, the supernatant is separated by decantation and the DAO enzyme solution at a pH of between 6 and 9, preferably 8, in 25 mM phosphate buffer. After a contact for 2-24 hours at a temperature of 4 ° -20 ° C, in the norm 12 hours at 4 * C, the resin with the immobilized enzyme separates by filtration.
E' oggetto del presente trovato anche l'immobilizzazione della DAO su: The present invention also relates to the immobilization of the DAO on:
- matrici a struttura poliacrilica ed in particolare con gruppi terminali epossidici quali Eupergit (Rohm-Pharma) ; - matrices with a polyacrylic structure and in particular with epoxy terminal groups such as Eupergit (Rohm-Pharma);
- matrici inorganiche come l'allumina porosa impregnata con un complesso costituito da polietilenimina e glutaraldeide come UOP IPS-200 (UOP-USA). - inorganic matrices such as porous alumina impregnated with a complex consisting of polyethyleneimine and glutaraldehyde such as UOP IPS-200 (UOP-USA).
In tabella 1 sono riportate le caratteristiche delle matrici usate secondo la presente invenzione, la capacità di legame e l'attività della DAO immobilizzata. Table 1 shows the characteristics of the matrices used according to the present invention, the binding capacity and the activity of the immobilized DAO.
Per ciascuna matrice sono riportate tre prove di immobilizzazione eseguite con quantità crescenti di enzima in modo da raggiungere la completa saturazione del supporto. For each matrix there are three immobilization tests carried out with increasing quantities of enzyme in order to reach complete saturation of the support.
A supporto saturo le migliori attività legate sono nell'ordine di 50-75 U/g umido. At saturated support, the best related activities are in the order of 50-75 U / g wet.
Nella norma si mettono a legare 200 U per grammo di supporto umido in modo che l'attacco sia completo, l'attività legata sia intorno a 40-50 U/g umido e la funzionalità, intesa come attività dell'enzima immobilizzato espressa in percentuale rispetto all'attività del corrispondente enzima libero, sia del 20-30%. Normally, 200 U per gram of wet support are bound so that the attack is complete, the bound activity is around 40-50 U / g wet and the functionality, understood as the immobilized enzyme activity expressed as a percentage with respect to the activity of the corresponding free enzyme, is 20-30%.
Il grande vantaggio della DAO immobilizzata è la stabilità che ne consente l'utilizzo per più di 200 ore nella conversione di composti cefalosporanici di tipo (I) in glutaril derivati di tipo (II) nel processo enzimatico a 25°C a pH 7.5 (vedi fig.3). Dosaggio dell'attività della D-amminoacido ossidasi L'attività dell'enzima D-amminoacido ossidasi è valutata misurando la quantità di H2O2 che sviluppa facendo reagire l'enzima su un substrato di D-alanina in tampone fosfato 100 mM a pH 7.5 saturo di ossigeno a 37*C. The great advantage of immobilized DAO is the stability that allows its use for more than 200 hours in the conversion of type (I) cephalosporan compounds into type (II) glutaryl derivatives in the enzymatic process at 25 ° C at pH 7.5 (see fig. 3). Determination of the activity of D-amino acid oxidase The activity of the enzyme D-amino acid oxidase is evaluated by measuring the quantity of H2O2 that it develops by reacting the enzyme on a substrate of D-alanine in 100 mM phosphate buffer at pH 7.5 saturated with oxygen at 37 * C.
L'HgOg è determinata cineticamente con un reattivo a base di perossidasi, 4-amminofenazone e 2,4-diclorofenolsolfonato secondo la reazione di Trinder modificata (J. Clin. Path. 22, 246, 1969) . Il colore rosso che si forma (Chinonimmina) è proporzionale all'acqua ossigenata che si sviluppa nel saggio ed è valutata spettrofotometricamente a 510 nm. HgOg is determined kinetically with a reagent based on peroxidase, 4-aminophenazone and 2,4-dichlorophenolsulfonate according to the modified Trinder reaction (J. Clin. Path. 22, 246, 1969). The red color that is formed (quinonymine) is proportional to the hydrogen peroxide that develops in the assay and is evaluated spectrophotometrically at 510 nm.
Una unità di D-amminoacido ossidasi è quella quantità di enzima (libero o immobilizzato) che produce nelle condizioni del metodo una μmole di per minuto. A unit of D-amino acid oxidase is that quantity of enzyme (free or immobilized) which produces under the conditions of the method one μmole of per minute.
Dosaggio proteine Protein dosage
Il contenuto proteico delle soluzioni enzimatiche è misurato spettrofotometricamente secondo il metodo di Bradford (Anal. Biochem. J2, 248, 1976) con il colorante Comassie Brillant Blue G250 contro curva standard di albumina bovina. The protein content of the enzymatic solutions is measured spectrophotometrically according to the Bradford method (Anal. Biochem. J2, 248, 1976) with Comassie Brillant Blue G250 dye against standard bovine albumin curve.
4 - Conversione enzimatica della cefalosporina C e derivati Le reazioni essenziali che intervengono nel procedimento secondo la presente invenzione sono note da tempo nella letteratura brevettuale (es. Belg.Pat.73693*0 e possono essere cosi schematizzate per il caso specifico della conversione della Cef alosporina C e suoi derivati in acidi 7-(^-carbossibutanamido)-cefalosporanici: 4 - Enzymatic conversion of cephalosporin C and derivatives The essential reactions involved in the process according to the present invention have been known for some time in the patent literature (eg Belg.Pat.73693 * 0 and can thus be schematized for the specific case of the conversion of Cef alosporin C and its derivatives in 7 - (^ - carboxybutanamido) -cephalosporanic acids:
Chetoadipil derivato Ketoadipil derivative
dove R è -H, -OH. -OC0NH2, -OCOCH3. where R is -H, -OH. -OC0NH2, -OCOCH3.
Il caso di maggior interesse è quello dei prodotti con R = -OCOCH3 cioè quello della Cefalosporina C come prodotto di partenza con formazione dell’acido glutaril-7-amminocefalosporanico (Glutaril-7-ACA). The case of greatest interest is that of products with R = -OCOCH3, that is, that of Cephalosporin C as a starting product with the formation of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid (Glutaryl-7-ACA).
Il procedimento di conversione enzimatica della Cefalosporina C (o composti I) in acidi glutaril-7-amminocefalosporanici {o composti II) comprende come stadio fondamentale la reazione di deamminazione ossidativa catalizzata dall’enzima DAO. The enzymatic conversion process of Cephalosporin C (or compounds I) into glutaryl-7-aminocephalosporanic acids (or compounds II) includes as a fundamental step the oxidative demination reaction catalyzed by the DAO enzyme.
Secondo il presente trovato una soluzione acquosa di composto cefalosporanico (I) nella concentrazione di 20-100 g/1. According to the present invention, an aqueous solution of cephalosporan compound (I) in the concentration of 20-100 g / l.
preferibilmente 20-60 g/1, è portata ad un pH compreso fra 7 e 8.5-Nel caso particolare della Cefalosporina C possono essere utilizzati indifferentemente il suo sale sodico o quello potassico cristallizzati o direttamente le loro soluzioni purificate, così come si ottengono nei processi di recupero dei brodi di fermentazione prima della fase finale di cristallizzazione. preferably 20-60 g / 1, it is brought to a pH between 7 and 8.5-In the particular case of Cephalosporin C, its crystallized sodium or potassium salt or their purified solutions directly, as obtained in the processes, can be used indifferently recovery of the fermentation broths before the final crystallization phase.
A questa soluzione è aggiunta la D-amminoacido ossidasi immobilizzata nella proporzione di 50-100 g/1. L'enzima immobilizzato è mantenuto in sospensione mediante agitazione meccanica. To this solution is added the immobilized D-amino acid oxidase in the proportion of 50-100 g / l. The immobilized enzyme is kept in suspension by mechanical stirring.
La conversione enzimatica viene effettuata in presenza di aria o di ossigeno insufflando tali gas nella soluzione acquosa attraverso un diffusore di fondo. .11 flusso di gas può variare da 0,5 a 1 volumi/vol.soluzione/minuto. The enzymatic conversion is carried out in the presence of air or oxygen by blowing these gases into the aqueous solution through a bottom diffuser. .11 gas flow can vary from 0.5 to 1 volume / solution volume / minute.
La temperatura di incubazione è mantenuta fra 20°-30°C, nella norma 25 "C. The incubation temperature is maintained between 20 ° -30 ° C, in the standard 25 "C.
Il valore ottimale di pH per la ' reazione enzimatica è dell'ordine di 8,5: tuttavia, per la instabilità dei composti cefalosporanici in ambiente alcalino, si lavora ad un pH di 7.5-Questo valore è tenuto fisso per tutto il tempo della reazione con aggiunte automatiche di reattivi basificanti, nella norma ammoniaca al 5-10%· The optimal pH value for the enzymatic reaction is of the order of 8.5: however, due to the instability of the cephalosporan compounds in an alkaline environment, one works at a pH of 7.5 - This value is kept fixed for the entire time of the reaction. with automatic additions of basifying reagents, in the standard ammonia at 5-10% ·
Il tempo occorrente per una completa trasformazione della Cefalosporina C (I) in acidi glutaril-7-amminocefalosporanici (II) è dell'ordine di 0,5-3 ore, in dipendenza delle condizioni operative e della concentrazione del substrato. The time required for a complete transformation of Cephalosporin C (I) into glutaryl-7-aminocephalosporanic acids (II) is of the order of 0.5-3 hours, depending on the operating conditions and the concentration of the substrate.
Come alternativa a questa tecnica discontinua di trasformazione nella quale l’enzima immobilizzato,viene disperso nel liquido di reazione, si può anche operare in continuo caricando l'enzima immobilizzato in colonne attraverso le quali viene fatta passare la soluzione di substrato mantenuta satura di ossigeno ed a un pH costante di 7.5· As an alternative to this discontinuous transformation technique in which the immobilized enzyme is dispersed in the reaction liquid, it is also possible to operate continuously by loading the immobilized enzyme into columns through which the substrate solution kept saturated with oxygen and at a constant pH of 7.5
Il punto fondamentale che caratterizza questa conversione enzimatica ottenuta con enzima immobilizzato da Rhodotorula gracilis è l'alta resa di trasformazione dei substrati in acidi glutaril-7-amminocefalosporanici. L'utilizzo di questo enzima immobilizzato in forma purificata e privo di catalasi permette di ridurre al minimo le perdite di del sistema. Di conseguenza, il blocco della reazione a chetoadipil derivato è limitato a circa il 5% ed il processo può decorrere a prodotto finale (glutarile) con resa intorno al 90%, senza nessun trattamento aggiuntivo. The fundamental point that characterizes this enzymatic conversion obtained with an enzyme immobilized by Rhodotorula gracilis is the high transformation yield of the substrates into glutaryl-7-aminocephalosporanic acids. The use of this immobilized enzyme in a purified and catalase-free form allows to minimize the losses of the system. Consequently, the blocking of the ketoadipil derivative reaction is limited to about 5% and the process can proceed to the final product (glutaryl) with a yield of about 90%, without any additional treatment.
Il chetoadipil derivato non trasformato in glutarile, anche se nella quantità del 5%circa rimane pur sempre un inconveniente sia come perdita di resa sia come impurezza da eliminare. The ketoadipil derivative not transformed into glutaryl, even if in the amount of about 5%, still remains a drawback both as a loss of yield and as an impurity to be eliminated.
Caratteristica operativa essenziale del procedimento secondo la presente invenzione è quella di convertire a glutarile anche questa parte di chetoadipil derivato. An essential operative characteristic of the process according to the present invention is that of converting this part of the ketoadipil derivative to glutaryl.
A tale scopo, per ogni partita di enzima immobilizzato è valutato, attraverso un'analisi HPLC, il chetoadipil derivato presente alla fine della prima conversione. Il dato analitico permette di stabilire la quantità stechiometrica di H2O2 che deve essere aggiunta dopo ogni ciclo per ottenere una teorica trasformazione a glutaril derivato. L'operazione di aggiunta dell'H2O2 è fatta direttamente sulla soluzione di reazione dopo allontanamento dell'enzima immobilizzato. For this purpose, the ketoadipil derivative present at the end of the first conversion is evaluated for each batch of immobilized enzyme. The analytical data allows to establish the stoichiometric quantity of H2O2 that must be added after each cycle to obtain a theoretical transformation to glutaryl derivative. The operation of adding the H2O2 is done directly on the reaction solution after removal of the immobilized enzyme.
Si può usare un eccesso di per ridurre il tempo di reazione: l'eccesso di va poi eliminato prima di passare allo stadio successivo con agenti riducenti idonei come acido piruvico e suoi sali o solfiti alcalini. An excess of can be used to reduce the reaction time: the excess must then be eliminated before moving on to the next stage with suitable reducing agents such as pyruvic acid and its salts or alkaline sulphites.
Dopo 10-15' tutto il chetoadipil derivato è trasformato a glutaril derivato e la resa totale passa a valori intorno al 95%. After 10-15 'all the ketoadipil derivative is transformed into glutaryl derivative and the total yield passes to values around 95%.
Dalla soluzione di fine conversione, gli acidi glutaril-7-amminocefalosporanici possono essere recuperati applicando tecniche note come estrazione con solventi dopo correzione del pH, absorbimento su resine, ecc. Dato che generalmente questi acidi vengono trasformati nei corrispondenti acidi 7-amminocefalosporanici mediante deacilazione enzimatica, è preferibile utilizzare direttamente la soluzione tal quale e senza ulteriori trattamenti in considerazione dell'elevata purezza raggiunta nel presente processo di’conversione. From the end-conversion solution, the glutaryl-7-aminocephalosporanic acids can be recovered by applying known techniques such as extraction with solvents after pH correction, absorption on resins, etc. Since these acids are generally transformed into the corresponding 7-aminocephalosporanic acids by enzymatic deacylation, it is preferable to use the solution directly as it is and without further treatments in consideration of the high purity achieved in this conversion process.
I seguenti esempi sono dati a titolo puramente illustrativo delle possibilità di attuazione del trovato. The following examples are given purely for illustrative purposes of the embodiment possibilities of the invention.
Esempio 1 Example 1
Produzione di D-amminoacido ossidasi con coltura di Rhodotorula gracilis ATCC 26217· Production of D-amino acid oxidase with culture of Rhodotorula gracilis ATCC 26217
Un fermentatore da 100 1 è caricato con 701 di brodo avente la seguente composizione: A 100 1 fermenter is loaded with 701 broth having the following composition:
Il mezzo è portato a pH 5.6 con H2S042N, sterilizzato a 120°C per 20 minuti e raffreddato a 30°C. Si inocula con una coltura vegetativa di Rhodotorula gracilis ATCC 26217 e si fermenta per 28 ore à 30°C con una agitazione di 200 rpm ed una aerazione di 0,5 l/l/min. Durante la fermentazione il pH è lasciato scendere spontaneamente fino a 5 e quindi è mantenuto costante con aggiunte automatiche di NaOH 10%. The medium is brought to pH 5.6 with H2S042N, sterilized at 120 ° C for 20 minutes and cooled to 30 ° C. It is inoculated with a vegetative culture of Rhodotorula gracilis ATCC 26217 and fermented for 28 hours at 30 ° C with a stirring of 200 rpm and an aeration of 0.5 l / l / min. During fermentation, the pH is allowed to drop spontaneously to 5 and is therefore kept constant with automatic additions of 10% NaOH.
A fine fermentazione si ottengono 721 di brodo coltura con una OD660=39 ed un'attività di D-amminoacido ossidasi di 4600 U/l. At the end of fermentation, 721 of culture broth are obtained with an OD660 = 39 and a D-amino acid oxidase activity of 4600 U / l.
Il brodo è centrifugato a 5000 g su centrifuga a camere tipo Westfalia. The broth is centrifuged at 5000 g on a Westfalia-type chamber centrifuge.
Si ottengono 3,1 Kg di pasta cellulare (umidità: 80% ca.) corrispondenti a 320.000 U di D-amminoacido ossidasi. 3.1 Kg of cellular pulp are obtained (humidity: 80% approx.) Corresponding to 320,000 U of D-amino acid oxidase.
Esempio 2 Example 2
Estrazione e purificazione di D-amminoacido ossidasi. Extraction and purification of D-amino acid oxidase.
I Kg di pasta cellulare (103-000 U di DA0) ottenuta come descritto nell'Esempio 1 è dispersa in 3 litri di tampone fosfato 25 mM pH 8 contenente 0,5 g/1 di sodio metabisolfito e 0.5 g/1 di cetilpiridinio cloruro. The kg of cellular pulp (103-000 U of DA0) obtained as described in Example 1 is dispersed in 3 liters of phosphate buffer 25 mM pH 8 containing 0.5 g / 1 of sodium metabisulfite and 0.5 g / 1 of cetylpyridinium chloride .
La sospensione è raffreddata a 4°C e passata su pressa Manton-Gaulin a 550 bar. The suspension is cooled to 4 ° C and passed on a Manton-Gaulin press at 550 bar.
L'omogeneizzato (4,31) è flocculato con aggiunta di 20 mldi polielettrolita cationico (Nymco 2045C). Il flocculato si chiarifica per filtrazione su Hyflo. Il chiarificato (4,91) è concentrato per ultrafiltrazione a 4°C su membrana polisolfonica a PM 30000. The homogenate (4.31) is flocculated with the addition of 20 ml of cationic polyelectrolyte (Nymco 2045C). The flocculate is clarified by filtration on Hyflo. The clarified (4.91) is concentrated by ultrafiltration at 4 ° C on a polysulphonic membrane at MW 30000.
Al concentrato ottenuto per ultrafiltrazione (0,750 1) si aggiungono 262 g di ammonio solfato. To the concentrate obtained by ultrafiltration (0.750 1), 262 g of ammonium sulphate are added.
II precipitato è separato dal surnatante per centrifugazione e ridisciolto in 300 mdli tampone fosfato 25 mM pH 8 contenente 0.5 g/1 di sodio metabisolfito. The precipitate is separated from the supernatant by centrifugation and redissolved in 300 ml of phosphate buffer 25 mM pH 8 containing 0.5 g / 1 of sodium metabisulphite.
La soluzione (320 mi) è diafiltrata per ultrafiltrazione su membrana polisolfonica a PM 30000. The solution (320 ml) is diafiltered by ultrafiltration on a polysulfonic membrane at MW 30000.
Il diafiltrato (340 mi) contiene la DA0 grezza in concentrazione di 224 U/ml. The diafiltrate (340 ml) contains the crude DA0 in a concentration of 224 U / ml.
La purificazione della D-amminoacido ossidasi è effettuata caricando la soluzione di enzima grezzo su una colonna di Sepharose DEAE fast flow (volume letto 800 ml, Φ 5 cm, h 40 cm) ed eluendo con lo stesso tampone potassio fosfato 25 mM pH 8. La DAO non viene trattenuta dalla resina ma solo rallentata nella sua corsa e passa nel percolato. The purification of D-amino acid oxidase is carried out by loading the crude enzyme solution on a Sepharose DEAE fast flow column (read volume 800 ml, Φ 5 cm, h 40 cm) and eluting with the same 25 mM potassium phosphate buffer pH 8. The DAO is not held back by the resin but only slowed down in its run and passes into the leachate.
Gli enzimi interferenti, in particolare l'esterasi, non vengono eluiti con tampone 25 mM pH 8 e sono spostati solo in fase di rigenerazione della colonna con NaCl 0,5 M. The interfering enzymes, in particular esterase, are not eluted with 25 mM pH 8 buffer and are only displaced in the regeneration phase of the column with 0.5 M NaCl.
La D-amminoacido ossidasi purificata si raccoglie in un volume di 1230 ml con un'attività di 52 U/ml e con un'attività specifica di 19 U/mg proteine. The purified D-amino acid oxidase collects in a volume of 1230 ml with an activity of 52 U / ml and with a specific activity of 19 U / mg protein.
La resa totale di purificazione è del 62% corrispondente a 63920 U totali. The total purification yield is 62% corresponding to total 63920 U.
La D-amminoacido ossidasi purificata è stabile almeno 6 giorni a 4"C e per almeno 6 mesi a -20°C. The purified D-amino acid oxidase is stable for at least 6 days at 4 "C and for at least 6 months at -20 ° C.
Esempio 3 Example 3
Immobilizzazione di D-amminoacido ossidasi su Duolite A 365. 35 g di resina Duolite A 365 con una granulometria di 100-200μ sono trattati con 0,51 di tampone potassio fosfato 100 mM pH 8. Dopo 15 minuti di agitazione il pH si aggiusta con aggiunte in sequenza di H3PO4 10% (6 mi). A pH costante di 8 il surnatante si - rimuove per filtrazione. Alla resina umida si aggiungono 400 mldi glutaraldeide al 2% in tampone potassio fosfato 25 mM pH 8. Si lascia sotto agitazione per 30 minuti ad temperatura di 20*-25*C e quindi si separa il surnatante per filtrazione fino a massa solida umida. Immobilization of D-amino acid oxidase on Duolite A 365. 35 g of Duolite A 365 resin with a particle size of 100-200μ are treated with 0.51 of 100 mM potassium phosphate buffer pH 8. After 15 minutes of stirring the pH is adjusted with sequentially additions of 10% H3PO4 (6 ml). At a constant pH of 8 the supernatant is - removed by filtration. 400 ml of 2% glutaraldehyde in 25 mM potassium phosphate buffer pH 8 are added to the wet resin. It is left under stirring for 30 minutes at a temperature of 20 ° -25 ° C and then the supernatant is separated by filtration to a wet solid mass.
Alla massa umida di resina attivata sono aggiunti 386 ml di soluzione di D-amminoacido ossidasi (52 U/ml; 19 U/mg proteine) purificata come da esempio 2. Il tutto si tiene sotto blanda agitazione per 12 ore a 4°C. La resa di immobilizzazione, calcolata sul titolo del surnatante esausto, è del 100%. 386 ml of D-amino acid oxidase solution (52 U / ml; 19 U / mg proteins) purified as per example 2 are added to the wet mass of activated resin. The whole is kept under gentle stirring for 12 hours at 4 ° C. The yield of immobilization, calculated on the titer of the exhausted supernatant, is 100%.
Il prodotto è filtrato e la massa umida è lavata con 0,5 M NaCl in tampone potassio fosfato 25 mM pH 8, quindi con tampone potassio fosfato 25 mM pH 7.5-Si ottengono 103 g di D-amminoacido-ossidasi immobilizzata con un'attività di 48 U/g di prodotto umido. The product is filtered and the wet mass is washed with 0.5 M NaCl in 25 mM potassium phosphate buffer pH 8, then with 25 mM potassium phosphate buffer pH 7.5-103 g of immobilized D-amino acid-oxidase are obtained 48 U / g of wet product.
Esempio 4 Example 4
Immobilizzazione di D-amminoacido ossidasi su Eupergit C. Immobilization of D-amino acid oxidase on Eupergit C.
A 120 mldi tampone potassio fosfato 1M pH 8 raffreddato a 4°C sono addizionati sotto agitazione 4,56 di Eupergit C (150μ) e di seguito 55 mdli soluzione di D-amminoacido ossidasi (58 U/ml; 17U/mg proteine) ottenuta come da Esempio 2. Il tutto si lascia in leggera agitazione per 2 ore a 4°C ed il prodotto si recupera per filtrazione. Si ottengono alla fine 15,7 g di D-amminoacido ossidasi immobilizzata su Eupergit C con un'attività di 58 U/g di prodotto umido. To 120 ml of 1M pH 8 potassium phosphate buffer cooled to 4 ° C, 4.56 of Eupergit C (150μ) are added under stirring and then 55 ml of solution of D-amino acid oxidase (58 U / ml; 17U / mg proteins) obtained as per Example 2. The whole is left under slight stirring for 2 hours at 4 ° C and the product is recovered by filtration. At the end, 15.7 g of D-amino acid oxidase immobilized on Eupergit C with an activity of 58 U / g of wet product are obtained.
Esempio 5 Example 5
Immobilizzazione di D-amminoacido ossidasi su UOP IPS-200, 80 ml di soluzione di D-amminoacido ossidasi (45 U/ml; 17U/mg proteine) purificata come da Esempio 2 sono diluiti con 80 mi di tampone potassio fosfato 1M pH 7.5· Immobilization of D-amino acid oxidase on UOP IPS-200, 80 ml of purified D-amino acid oxidase solution (45 U / ml; 17U / mg proteins) as per Example 2 are diluted with 80 ml of 1M potassium phosphate buffer pH 7.5
La soluzione a 4°C è pompata con riciclo a 600 ml/ora attraverso una colonna (ø 2 cm; h 8 cm) contenente 20 g di UOP IPS-200 per 4 ore. Dopo questo tempo il dell'attività D-amminoacido-ossidasi è immobilizzata.' The solution at 4 ° C is pumped with recycling at 600 ml / hour through a column (ø 2 cm; h 8 cm) containing 20 g of UOP IPS-200 for 4 hours. After this time the D-amino acid oxidase activity is immobilized.
Si ottengono 19 g di massa umida filtrata con.un'.attività di 21 U/g. 19 g of filtered wet mass are obtained with an activity of 21 U / g.
Esempio 6 Example 6
Trasformazione di Cefalosporina C a glutaril- 7-ACA con D-amminoacido-ossidasi immobilizzata su Duolite A 365· Transformation of Cephalosporin C to glutaryl-7-ACA with D-amino acid-oxidase immobilized on Duolite A 365
A) Conversione in discontinuo. A) Conversion into discontinuous.
66 g di Cefalosporina C sale sodico biidratò (purezza 90,9Ϊ) sono sciolti in 2 1 di tampone potassio fosfato a concentrazione 25 mM, a pH8, contenente 0.5g di sodio metabisolfito. 66 g of Cephalosporin C sodium salt dihydrated (purity 90.9Ϊ) are dissolved in 2 1 of potassium phosphate buffer at 25 mM concentration, at pH8, containing 0.5g of sodium metabisulphite.
La soluzione di Cefalosporina C è caricata in un reattore da 3 litri con 150 g umidi di D-amminoacido ossidasi immobilizzata su Duolite A 365 come visto in Esempio 3-L'incubazione è condotta a 25°C sotto leggera agitazione e con un flusso di ossigeno da diffusore di fondo pari a 1 v/v/min. Il pH è mantenuto costante a 7.5 con aggiunte automatiche di ammoniaca al 5%. The Cephalosporin C solution is loaded into a 3 liter reactor with 150 g wet of D-amino acid oxidase immobilized on Duolite A 365 as seen in Example 3-The incubation is carried out at 25 ° C under gentle stirring and with a flow of bottom diffuser oxygen equal to 1 v / v / min. The pH is kept constant at 7.5 with automatic additions of ammonia at 5%.
In 75 minuti la Cefalosporina è completamente trasformata. La. composizione percentuale dei prodotti cefalosporanici di tra¬ In 75 minutes the Cephalosporin is completely transformed. The percentage composition of the cephalosporanic products of tra¬
Per la trasformazione del chetoadipil-7-ACA residuo a glutaril --7-ACA, la soluzione ottenuta dopo incubazione è separata dalla massa di enzima immobilizzato per filtrazione. Per ogni litro di filtrato sono aggiunti, sotto agitazione, 10 mi di acqua ossigenata al 3,5%· Si lascia per 15 minuti a 25°C e quindi si aggiungono 0,5 g di sodio piruvato. For the transformation of the residual ketoadipyl-7-ACA to glutaryl -7-ACA, the solution obtained after incubation is separated from the immobilized enzyme mass by filtration. For each liter of filtrate, 10 ml of 3.5% hydrogen peroxide are added under stirring. It is left for 15 minutes at 25 ° C and then 0.5 g of sodium pyruvate are added.
La composizione percentuale a fine trattamento è: The percentage composition at the end of the treatment is:
La carica enzimatica è stata provata per 100 cicli in intervalli di 75-120 minuti. The enzymatic charge was tested for 100 cycles in intervals of 75-120 minutes.
La produttività totale è stata di 4760 g di glutaril-7-ACA pari a 31.7 g di glutaril-7-ACA per g di enzima immobilizzato. The total productivity was 4760 g of glutaryl-7-ACA equal to 31.7 g of glutaryl-7-ACA per g of immobilized enzyme.
B) Conversione in continuo su colonna. B) Continuous conversion on column.
Una soluzione di Cefalosporina C a 15 g/1 come .sale sodico ’biidrato in tampone fosfato 0,1 M pH 8, è.fatta passare alla velocità di 11/ora su cinque colonne (Φ 40 mm) contenenti 100 g (150 mlvolume apparente) ciascuna di DAO immobilizzata su Duolite A 365 (vedi Esempio 3)· A solution of Cephalosporin C at 15 g / 1 as sodium salt dihydrate in 0.1 M phosphate buffer pH 8, is passed at the rate of 11 / hour on five columns (Φ 40 mm) containing 100 g (150 ml volume apparent) each of DAO immobilized on Duolite A 365 (see Example 3)
Tutto il sistema, che opera in continuo con le colonne collegate in serie, è termostatato a 25°C e mantenuto a 3 bar con iniezioni di ossigeno dopo ogni colonna. The whole system, which operates continuously with the columns connected in series, is thermostated at 25 ° C and maintained at 3 bar with oxygen injections after each column.
All'uscita della quinta colonna la Cefalosporina C residua è intorno all'1% e la conversione a glutaril-7-ACA è pari al 92% dello stechiometrico (11,2 g/1). At the exit of the fifth column, the residual Cephalosporin C is around 1% and the conversion to glutaryl-7-ACA is equal to 92% of the stoichiometric (11.2 g / 1).
Esempio 7 Example 7
Trasformazione di Cefalosporina C a glutaril- 7~ACA con D-amminoacido ossidasi immobilizzata su Eupergit C. Transformation of Cephalosporin C to glutaryl-7 ~ ACA with D-amino acid oxidase immobilized on Eupergit C.
2 1 di soluzione di Cefalosporina C preparata come in Esempio 6 sono incubati con 150 g di D-amminoacido ossidasi immobilizzata su Eupergit C (come in Esempio 4). L'incubazione è condotta a 25°C e in corrente di ossigeno. 2 1 of solution of Cephalosporin C prepared as in Example 6 are incubated with 150 g of D-amino acid oxidase immobilized on Eupergit C (as in Example 4). The incubation is carried out at 25 ° C and in an oxygen stream.
Dopo 60 minuti a pH 7,5. la Cefalosporina C è completamente trasformata con una resa in glutaril- 7-ACA dell'91% e di chetoadipil-7-ACA del 5.8%. After 60 minutes at pH 7.5. Cephalosporin C is completely transformed with a yield of 91% glutaryl-7-ACA and 5.8% ketoadipyl-7-ACA.
La soluzione è separata dall’enzima immobilizzato per filtrazione. The solution is separated from the immobilized enzyme by filtration.
1 1 di filtrato è trattato con 10 mldi acqua ossigenata al 3,5% e, dopo 15 minuti, con 0,25 g di sodio metabisolfito. 1 1 of filtrate is treated with 10 ml of 3.5% hydrogen peroxide and, after 15 minutes, with 0.25 g of sodium metabisulphite.
La composizione finale del prodotto di trasformazione è: The final composition of the transformation product is:
La carica enzimatica è stata sperimentata per 100 cicli. La produttività totale è stata di 4700 g di glutaril-7-ACA pari a 31 s/s di enzima immobilizzato. The enzymatic charge was tested for 100 cycles. The total productivity was 4700 g of glutaryl-7-ACA equal to 31 s / s of immobilized enzyme.
Esempio 8 Example 8
Trasformazione di Cefalosporina C a glutaril-7-ACA con D-amminoacldo ossidasi immobilizzata su UOP 1PS-200. Transformation of Cephalosporin C to glutaryl-7-ACA with D-amino acid oxidase immobilized on UOP 1PS-200.
6,57 S di Cefalosporina C sale sodico biidrato (purezza 91,3%) sono sciolti in 200 mdli acqua. Alla soluzione si aggiungono 0,68 g di KH2PO4 e 0,1 g di sodio metabisolfito e si corregge il pH a 7,5 con NaOH 5%. 6.57 S of Cephalosporin C sodium salt dihydrate (purity 91.3%) are dissolved in 200 ml of water. 0.68 g of KH2PO4 and 0.1 g of sodium metabisulphite are added to the solution and the pH is corrected to 7.5 with 5% NaOH.
Questa soluzione di Cefalosporina è pompata attraverso una colonna termostatata a 25°C contenente 20 g di D-amminoacido ossidasi immobilizzata su UOP IPS-200 (Φ 3 cm; h 4 cm; volume letto 28 mi). La velocità di flusso è mantenuta a 50 ml/min. La soluzione in uscita dalla colonna, presa in un recipiente di raccolta, viene ossigenata con un diffusore di ossigeno, corretta a pH 7.5 e riciclata per un tempo di due ore. This cephalosporin solution is pumped through a column thermostated at 25 ° C containing 20 g of D-amino acid oxidase immobilized on UOP IPS-200 (Φ 3 cm; h 4 cm; volume read 28 ml). The flow rate is maintained at 50 mL / min. The solution leaving the column, taken in a collection vessel, is oxygenated with an oxygen diffuser, corrected to pH 7.5 and recycled for a period of two hours.
Dopo due ore di riciclo, la conversione della Cefalosporina C è completa. After two hours of recycling, the conversion of Cephalosporin C is complete.
La soluzione {100 ni) è trattata con 1 mldi H202 al 3.5% e, dopo 15 minuti, con 50 mg di sodio piruvato. The solution (100 ml) is treated with 1 ml of H202 at 3.5% and, after 15 minutes, with 50 mg of sodium pyruvate.
La composizione percentuale dei prodotti di trasformazione è: The percentage composition of the transformation products is:
La sperimentazione si è condotta per 60 cicli con una produzione complessiva di glutaril-7-ACA di 280g pari a 14 gjg di enzima immobilizzato. The experimentation was conducted for 60 cycles with an overall production of glutaryl-7-ACA of 280g equal to 14 days of immobilized enzyme.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT02251290A IT1252307B (en) | 1990-12-21 | 1990-12-21 | ENZYMATIC PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF 7B- (4CARBOXYANAMIDE) CEPHALOSPORANIC ACID. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT02251290A IT1252307B (en) | 1990-12-21 | 1990-12-21 | ENZYMATIC PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF 7B- (4CARBOXYANAMIDE) CEPHALOSPORANIC ACID. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| IT9022512A0 IT9022512A0 (en) | 1990-12-21 |
| IT9022512A1 true IT9022512A1 (en) | 1992-06-21 |
| IT1252307B IT1252307B (en) | 1995-06-08 |
Family
ID=11197266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT02251290A IT1252307B (en) | 1990-12-21 | 1990-12-21 | ENZYMATIC PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF 7B- (4CARBOXYANAMIDE) CEPHALOSPORANIC ACID. |
Country Status (1)
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| IT (1) | IT1252307B (en) |
-
1990
- 1990-12-21 IT IT02251290A patent/IT1252307B/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT9022512A0 (en) | 1990-12-21 |
| IT1252307B (en) | 1995-06-08 |
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