IT9021557A1 - Processo per la separazione enzimatica degli isomeri ottici di alfa-alogeno alcoli secondari. - Google Patents
Processo per la separazione enzimatica degli isomeri ottici di alfa-alogeno alcoli secondari. Download PDFInfo
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale
La presente invenzione si riferisce a un processo per la separazione enzimatica stereoselettiva o asimmetrica degli isomeri ottici di alfa-alogeno alcoli racemi.
Più in particolare, il trovato si riferisce ad un processo biotecnologico per la separazione o la risoluzione enzimatica di miscele raceme degli isomeri ottici degli alcoli secondari alfa-alogenati di formula (I)
dove R rappresenta un atomo di un alogeno, preferibilmente cloro o bromo,e rappresenta un gruppo di formula (II):
in cui n rappresenta 0 oppure 1; Ar rappresenta un gruppo scelto tra un gruppo fenilico, un gruppo fenilico mono- o bisostìtuito con atomi di alogeno, preferibilmente cloro oppure bromo, oppure con alchili o alchenili C1-C10, cicloalchili C3-C6, fenili, alcossili C1-C6, eterocicli (piridinici, triazolici), nitro, -NHCOCH3, -CH2CONH2, e un gruppo naftilico, mediante esterificazione asimmetrica stereoselettiva con composti acilanti (anidridi di acidi alifatici) operando in presenza di particolari enzimi.
Gli isomeri ottici così ottenuti costituiscono degli utili intermedi per la preparazione, per esempio, di epossidi otticamente attivi ovvero di intermedi per la preparazione, a titolo di esempio, di farmaci, per esempio β-bloccanti, e fitofarmaci.
Infatti, detti alcoli, nella forma di enantiomeri puri, possono essere usati come intermedi nella sintesi di epossidi otticamente attivi, come ad esempio:
oppure possono essere utilizzati come intermedi nella sintesi di propanolammine otticamente attive, impiegate come farmaci ad azione fl-bloccante, come ad esempio L'S-propranololo:
Risulta pertanto evidente l'interesse da parte del preparatore di poter disporre di un metodo efficace per la separazione delle forme otticamente attive dei composti racemi di formula (I).
Sono noti procedimenti diretti alla preparazione selettiva sintetica di 2-alo-1-ariletanoli otticamente attivi. E' stato descritto {J. Org. Chem. 1983, 48, 1784) un metodo che prevede la riduzione stereoselettiva di 2-alo-arilchetoni utilizzando β-3-pinanoil-9-borabiciclo(3.3.1)-nonano.
Tale processo richiede l'uso di reagenti chimici costosi in forte eccesso, pertanto non assicura sufficienti vantaggi dal punto di vista dell'applicazione industriale.
Sono noti altresì metodi di riduzione microbiologica di 2-alo-arilchetoni (EP 0198440), ma tali processi non sono adatti per produzioni di tipo industriale a causa della bassa produttività e della difficoltà di recupero e purificazione dei prodotti.
E' stato anche proposto {Agric. Biol. Chem. 50, 2369, 1986) un processo per la preparazione di 2-alo-1-fenil etanolo otticamente attivo, mediante idrolisi enzimatica stereoselettiva di un corrispondente estere racemo. Tale processo implica un ulteriore stadio preparativo di acilazione chimica del 2-alo-1-fenil etanolo, con il relativo abbassamento delle rese.
Scopo della presente invenzione è pertanto quello di provvedere un processo pe la separazione o risoluzione degli isomeri ottici dei composti racemi di formula (I) in maniera semplice, efficace, ed economica e con un elevato grado di purezza ottica.
E' stato ora trovato che questo scopo viene ottenuto con un processo biotecnologico di esterificazione stereoselettiva o asimmetrica enzimatica dei composti di formula (I), a partire dai loro racemi, mediante l'impiego di particolari composti acilanti ed in presenza di enzimi muniti di attività selettiva, in seguito meglio definiti.
In pratica, si usano enzimi appartenenti alla classe delle Lipasi, in grado di catalizzare la reazione di esterificazione stereoselettivamente sulla forma {S) degli alcoli di formula (I), lasciando sostanzialmente inalterata la forma (R).
Costituisce pertanto l'oggetto della presente invenzione un processo per la separazione enzimatica di miscele raceme degli isomeri ottici degli alfa-alogeno alcoli di formula (I):
dove R ed R hanno il significato precedentemente definito, il quale processo è caratterizzato dal fatto che si fa reagire detta miscela racema con una anidride di un acido alifatico saturo avente formula (III):
in cui R2 rappresenta un gruppo alchilico C1-C6- lineare o ramificato, a temperature comprese tra 0 e 50°C, preferibilmente tra 20 e 30°C circa, in presenza di un enzima, libero o immobilizzato, capace di provocare selettivamente la reazione di esterificazione dell'isomero (S), lasciando sostanzialmente invariato l'isomero (R) della miscela di partenza racema, che vengono indi separati.
L'estere prodotto nella forma (S) e l'alcol nella forma (R) possono essere separati operando sostanzialmente secondo tecniche convenzionali.
In modo più esplicito, secondo una rappresentazione schematica del processo oggetto della presente invenzione, la miscela racema degli alcoli di formula (I) viene fatta reagire, in presenza di un enzima, appartenente alla classe delle Lipa si, in solvente organico, con una anidride di formula (III) secondo la reazione:
dove i simboli R, R1 , R2 hanno i significati precedentemente definiti.
Sorprendentemente, l'impiego di altri composti acilanti, diversi dalle anidridi di formula (III), non ha condotto all'ottenimento di risultati accettabili sotto l'aspetto industriale (disattivazione dell'enzima e tempi di reazione più lunghi).
Le anidridi preferite sono l'anidride acetica e l'anidride propionica. Si opera in un solvente organico, preferibilmente scelto fra gli idrocarburi aromatici e gli idrocarburi alitatici alogenati, ad esempio benzene, toluene, cloruro di metilene ecc.
Gli alcoli di formula (I) racemi, composti di partenza, e le anidridi (III) sono di per sè noti e/o possono essere sintetizzati conformemente a tecniche convenzionali.
Nella reazione si impiegano rapporti molari tra l'anidride (III) e il substrato alcolico (I) compresi fra 0,6:1 e 5:1, preferibilmente tra 0,8:1 e 1,5:1 circa, e l'enzima viene impiegato secondo un rapporto in peso enzima/substrato di formula (I) compreso tra 1:1 e 1:100 circa, preferibilmente tra 0,5:1 e 1:20 circa.
Il valore della concentrazione molare dell'alcol racemo di formula (I) nella miscela di reazione può essere compreso tra circa 0,01 M e 2 M, preferibilmente è compreso tra 0,05 M e 1 M a seconda del composto racemo di formula (I) impiegato.
Il processo di esterificazione viene effettuato agitando vigorosamente la miscela di reazione costituita dal reagente (I), dal reagente (III), dal solvente e dall'enzima, libero o supportato, come in seguito precisato, a temperature comprese fra 0 e 50°C, preferibilmente tra 20 e 30°C circa.
A secondo dei parametri adottati, nell'ambito dei suddetti intervalli, la reazione può essere conclusa in un tempo compreso tra 30 minuti e 60 ore normalmente sono sufficienti da 6 a 8 ore circa.
Al termine della reazione si procede alla filtrazione della fase solida, costituita essenzialmente dall'enzima, che può essere recuperato e riutilizzato senza sostanziali perdite di attività.
Dal filtrato, dopo aver eliminato l'eccesso di anidride (III) con una soluzione acquosa di carbonato alcalino, vengono separati l'alcol (I) nella forma (R) e l'estere (IV) nella forma (S), impiegando metodi tradizionali quali cromatografia su colonna e distillazione frazionata.
La purezza ottica degli alcoli di formula (I), ottenuti come sopra descritto, è stata determianta utilizzando tecniche NMR note in presenza di complessi di Europio o di derivati dell'acido di Mosher.
La configurazione assoluta di tali alcoli è stata determinata mediante confronto con i dati di letteratura .
Gli enzimi impiegati secondo l'invenzione appartengono alla classe delle Lipasi di origine microbica. Si sono dimostrati attivi in modo particolare quelli in seguito definiti:
ENZIMA ORIGINE PRODUTTORE LPL Pseudomonas aeruqinosa Amano Pharm.Co.(Japan) Lipasi P Pseudomonas fluorescens "
Lipasi CES Pseudomonas sp. ''
Lipasi Cromobacterium Tojobo (Japan)
Secondo la presente invenzione gli enzimi possono essere impiegati liberi o immobilizzati su opportuni supporti, per aumentare la loro attività, stabilità e agevolarne il recupero e riutilizzo.
Particolarmente adatti allo scopo si sono dimostrati supporti porosi con elevata area superficiale, come ad esempio la Celite, il vetro poroso, la silice, etc.
L'immobilzzazione può essere facilmente effettuata facendo assorbire una soluzione acquosa tamponata dell'enzima sul supporto e portandolo quindi a secchezza.
Il processo, grazie alle sue semplici e blande condizioni operative, si presenta come particolarmente vantaggioso. Un particolare aspetto di alto interesse è costituito dalla possibilità di operare secondo un processo monostadio che conduce alla diretta separazione degli enantiomeri dei composti di formula (I) con elevati rendimenti e grado di purezza, dell'ordine del 95% o superiore.
L'abbreviazione e.e. sta per "eccesso enantiomerico".
La presente invenzione verrà ora illustrata dagli esempi seguenti, dati per altro a titolo illustrativo e non limitativo.
ESEMPIO 1
Immobilizzazione dell'enzima
A 5 g di Celite 577 (Johns-Manville LTD, Richmond, Surrey) sono aggiunti 1,5 g di enzima Lipasi P (da Pseudomonas fluorescens, Amano Pharm. Co., LTD, 30 unità per mg) sciolti in 4 mi di soluzione tampone fosfato -Na/K 0,1 M a pH = 7.
La miscela così ottenuta viene mescolata in modo da ottenere una distribuzione uniforme dell'enzima e quindi seccata all'aria a 25°C per 24 ore.
Separazione degli enantiomeri del 2-cloro-1-fenil etanolo A 1 g di (R,S) 2-cloro-1-fenil etanolo, sciolto in 25 mi di toluene, sono aggiunti 1,5 g di Celite 577 contenente 350 mg di enzima Lipasi P immobilizzato e 830 mg di anidride propionica.
La miscela viene vigorosamente agitata a 25°C e la reazione viene seguita in gas-cromatografia.
Dopo 6 ore (conversione del 50%) l'enzima viene recuperato per filtrazione, mentre la fase organica viene lavata con una soluzione di carbonato sodico al 5%. Il toluene, dopo esser stato seccato su solfato di sodio, viene evaporato a pressione ridotta e il residuo viene cromatografato su una colonna di gel di silice eluendo con una miscela di esano-acetato d'etile 95:5 V/V.
Si ottengono in tal modo 620 mg di (S)-2-cloro-1-fenil etil propionato comè olio incolore, con [α] =+73 (c=1,acetone), ee = 98%, <1>H-NMR (200 MHz,CDCl3)δ(ppm): 1,2 (3H, d), 2,4 (2H, q), 3,7 (2H, m), 6,1 (1H, m), 7,4 (6H, s); e 500 mg di
25
(R)-2-cloro-1-fenil etanolo, olio incolore, con [α] = -51,8 (c=1, cicloesano), ee = 99%, <1>H-NMR (200 MHz, CDCl3),£(ppm): 3,15 (1H, s), 3,7 (2H, dd), 4,85 (1H, m), 7.35 (6H, s).
Sia l'estere che l'alcool sono successivamente disciolti in una miscela 1:1 di alcool metilico - acqua al 10% di idrossido di potassio, a temperatura ambiente, in modo da ottenere i rispettivi epossidi. Su tali composti viene determinata la purezza ottica, determinando l'eccesso enantiomerico per mezzo dell'analisi degli spettri <1>H-NMR in presenza di Eu(hfc)3.
ESEMPI 2-4
Utilizzando la procedura descritta nell'esempio 1, si sono separati gli enantiomeri del 2-bromo-1-fenil etanolo, 2-bromo-1-(4-nitrofenil)etanolo e 2-bromo-1-{4-bromofenil)etanolo.
I risultati ottenuti sono riportati nella Tabella 1.
ESEMPIO 5
Separazione degli enantiomeri del 2-bromo-1-(2-naftil)etanolo A 2 g di (R,S)-2-bromo-1-{2-naftil)etanolo, sciolto in 25 mi di toluene, sono aggiunti 1,1 g di anidride propionica e 4 g di Celite 577 contenente 900 mg di enzima Lipasi P, immobilizzato come in esempio 1.
La miscela viene vigorosamente agitata per 8 ore a 25°C, seguendo la reazione in gas-cromatografia.
Alla fine della reazione (conversione 48%) l'enzima viene separato per filtrazione, mentre la fase organica viene lavata con una soluzione di carbonato di sodio al 5%. Dopo essiccazione su solfato di sodio e evaporazione del solvente a pressione ridotta, il residuo viene cromatografato su colonna di gel di silice con eluente esano-acetato d'etile 9:1 V/V.
Si ottengono in questo modo 960 mg di (R)-2-bromo-1-(2-naftil)etanolo, [α]<25 >= -41,0 (c = 1, CHC1 ), ee> 95%, <1>H-NMR
D <J>
(200 MHz.CDCl3),é (ppm): 2,7 (1H, s), 3,6 (1H, dd), 3,72 (1H, dd), 5,15 (1H, m), 7,50 - 7,60 e 7,8 - 7,9 (7H, m); e 1,18 g di
25
(S)-2-bromo-1-(2-naftil)-etil propionato, [α] = 69,4 (C = 1, cHCl3}, ee> 95%, <1>H-NMR (200 MHz, CDCΊ3), δ (ppm): 1,2 (3H, t), 2,45 (2H, m), 3,7 (2H, m), 6,15 (1H, m), 7,4-7,55 e 7,8-7,92 (7H, m).
L'eccesso enantiomerico di tali composti è stato determinato come nell'esempio 1.
ESEMPIO 6
Separazione degli enantiomeri del 1-cloro-3-fenossi propan-2-olo
Si discioglie 1 g di (R,S)-1-cloro-3-fenossipropan-2-olo in 25 mi di toluene, in cui sono aggiunti 0,7 g di anidride propionica e 1,5 g di Celite 577 contenente 350 mg di enzima Lipasi P immobilizzato come in esempio 1.
Dopo circa 5 ore (conversione 50%) si recupera l'enzima per filtrazione, lavando la fase organica con una soluzione acquosa al 5% di carbonato sodico.
Dopo essiccamento ed evaporazione a pressione ridotta del solvente, il residuo viene separato per cromatografia su colonna con eluente esano - acetato d'etile 95:5 V/V. Si ottengono in questo modo 640 mg di (S)-1-cloro-3-fenossi-propan-2-olo propionato come olio incolore, con [α] = 29,2 (C = 1, acetone) ee>95%, <1>H-NMR (200 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,15 (3H, t), 2,4 (2H, q), 3,8 (2H, d), 4,2 (2H, d), 5,4 (1H, dd), 6,9 e 7,4 (5H, m); e 490 mg di (R)-1-cloro-3-fenossi-propan-2-olo, come solido cristallino bianco, con [α] = -0,81 (c = 1, CHCl3, ee >95%, <1>H-NMR (200 MHz, CDCl3), δ (ppm); 2,6 (1H, s), 3,85 {2H, d), 4,15 (2Η, d), 4,25 (1H, m), 6,75 e 7,25 (5H, m). Gli eccessi enantiomerici dei composti sono stati determinati in base all'analisi degli spettri <1>H-NMR dei derivati dell'acido di Mosher.
ESEMPIO 7
Utilizzando la procedura descritta nell'esempio 6, si sono separati gli enantiomeri del (R,S)-1-cloro-3-(4-metossifenossi)-propan-2-olo. I risultati sono riportati nella Tabella 2. ESEMPIO 8
Separazione degli enantiomeri del 1-cloro-3-(1-naftossi)-propan-2-olo
Si sciolgono in 50 mi di toluene 2 g di (R,S)-1-cìoro-3-(1-naftossi)-propan-2-olo, a cui si aggiungono 1,1 g di anidride propionice e 4 g di Celite 577 contenente circa 912 mg di enzima Lipasi P immobilizzato come descritto nell'esempio 1.
Si mantiene la miscela in vigorosa agitazione per circa 6 ore (conversione 47%), dopodiché si separa per filtrazione l'enzima supportato.
La miscela organica viene seccata su solfato di sodio ed evaporata a pressione ridotta. Il residuo così otenuto è separato su colonna di gel di silice con eluente esano-acetato d'etile 9:1 V/V.
Si separano in questo modo 1,2 g di (S)-1-cloro-3-(1-25 naftossi)-propan-2-olo propionato come olio incolore, [d] =+ 21,5 (c=1, CHCl3), ee = 90%, H-NMR (200 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,25 (3H, t), 2,48 (2H,q), 3,9 (2H, d), 4,45 (2H, d), 5,5 (1H, dd), 6,8-7,45 e 7,7-8.32 (7H, m); e 980 mg di (R)-1-cloro-3-(1-naftossi)-propan-2-0lo come solido cristallino bruno, [α ]<25>=-7,l (c = 1, CHC1 ), ee =<'>92%, <1>H-NMR(200 MHz, CDCl3), b(ppm): 2,65 (1H, s), 3,84 (2H, d), 4,3 (2H, d), 4,45 (1H, m), 6,8 - 7,45 e 7,7 - 8,3 (7H, m).
L'eccesso enantiomerico di tali composti è stato determinato come nell'esempio 6.
a (c=1 , CHC13) b (c=1 , acetone )
a (c=1 , CHC13) b (c=1 , acetone )
Claims (19)
- RIVENDICAZIONI 1) Processo per la separazione enzimatica di miscele raceme degli isomeri ottici degli alfa-alogeno-alcoli di formula (I):dove R rappresenta un atomo di un alogeno, rappresenta un gruppo di formula (II):in cui n rappresenta 0 oppure 1; Ar rappresenta un gruppo scelto tra un gruppo fenilico, un gruppo fenilico mono- oppure bi-sostituito con atomi di alogeno oppure con alchili o alchenili C1 -C10, cicloalchili C -C fenili alcossili C1-C6 , eterocicli, nitro,-NHCOCH-, -CH CONH , e un gruppo naftilico il quale processo è caratterizzato dal fatto che si fa reagire detta miscela con una anidride di acidi alitatici saturi,operando in presenza di una lipasi derivante da microorganismi capace di provocare selettivamente la reazione di esterificazione dell'isomero S, lasciando sostanzialmente invariato l'isomero R del composto (I) di partenza, che vengono indi separati secondo tecniche note.
- 2) Processo, secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che nella formula (I) R è costituito da un atomo di cloro o di bromo.
- 3) Processo, secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che detta anidride di acido alifatico saturo ha la formula (III):in cui rappresenta un gruppo alchilico C1-C6.
- 4) Processo, secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detta anidride è scelta tra l'anidride acetica e l'anidride propionica.
- 5) Processo, secondo le rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che si opera in un solvente organico.
- 6) Processo, secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che detto solvente organico è scelto tra gli idrocarburi aromatici e gli idrocarburi alitatici alogenati.
- 7) Processo, secondo le rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il rapporto molare di detta anidride di formula (III) rispetto a detto substrato alcol racemo di formula (I) è compreso fra 0,6:1 e 5:1 circa.
- 8) Processo, secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detto rapporto molare anidride (III): alcol (I) è compreso tra 0,8:1 e 1,5:1 circa.
- 9) Processo, secondo le rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che si opera secondo un rapporto in peso tra l'enzima impiegato e il substrato di formula (I) compreso tra 1:1 e 1:100 circa.
- 10) Processo, secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che detto rapporto in peso enzima: substrato (I) è compreso tra 0,5:1 e 1:20 circa.
- 11) Processo, secondo le rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la concentrazione molare dell'alcol racemo di formula (I) nella miscela di reazione è compresa tra 0,01 M e 2 M circa.
- 12) Processo, secondo la rivendicazione 11, caratterizzato dal fatto che detta concentrazione dell'alcol racemo (I) nella miscela di reazione è compresa tra 0,05 M e 1 M circa.
- 13) Processo, secondo le rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che si opera a temperatura compresa tra 0°C e 50°C circa.
- 14) Processo, secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che si opera a temperatura compresa tra 20°C e 30°C, circa.
- 15) Processo, secondo le rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta lipasi di origine microbica è costituita da una lipasi derivante da Pseudomonas.
- 16) Processo, secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che detta lipasi è scelta tra lipasi LPL da Pseudomonas aeruginosa, lipasi P da Pseudomonas fluorescens lipasi CES da Pseudomonas sp, e Lipasi da Cromobacterium.
- 17) Processo, secondo le rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto enzima viene impiegato allo stato libero.
- 18) Processo, secondo le rivendicazioni da 1 a 16, caratterizzato dal fatto che detto enzima viene impiegato immobilizzato su un supporto, preferibilmente di tipo poroso ad elevata area superficiale, scelto tra Celite, vetro poroso, silice.
- 19) Processo per la separazione enzimatica degli isomeri ottici R ed S degli alfa-alogeno-alcoli secondari di formula (I), come sopra descritto e rivendicato.
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| IT9021557A0 IT9021557A0 (it) | 1990-09-24 |
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