IT8224689A1

IT8224689A1 - FLUORESCENCE POLARIZATION IMMUNOSAGE

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Publication number: IT8224689A1
Application number: IT1982A24689A
Authority: IT
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1981-12-11
Filing date: 1982-12-10
Publication date: 1984-06-10
Also published as: JPS58113189A; CA1248086A; DE3245854C2; NZ202613A; DE3245854A1; AU9088082A; GB2111491B; IT1155424B; IT8224689A0; FR2518096B1; BE895300A; FR2518096A1; AU558800B2; GB2111491A

Description

IMMUNOSAGGIO DI POLARIZZAZIONE DI FLUORESCENZA. FLUORESCENCE POLARIZATION IMMUNOSAGE.

RIASSUNTO SUMMARY

La presente descrizione riguarda un metodo e ri guarda reagenti per determinare ligandi in fiilidi biologici come siero, plasma, fluido spinale, fluido amniotico e orina. In particolare, la presente descrizione riguarda un procedi mento di immunos?ggio di polarizzazione di fluorescenza e riguardano una nuova classe di composti traccianti impiegati come reagenti in tali procedimenti. Il procedimento descritto riunisce la specificit? di un immunosaggio con la velocit? e il vantaggio di tecniche di polarizzazione di fluorescen za per realizzare un metodo per determinare la quantit? del lo specifico ligando presente in un campione. The present disclosure relates to a method and reagents for determining ligands in biological philids such as serum, plasma, spinal fluid, amniotic fluid and urine. In particular, the present disclosure relates to a fluorescence polarization immunosis process and relates to a new class of tracer compounds used as reactants in such processes. The described procedure brings together the specificity? of an immunoassay with the speed? and the advantage of fluorescence polarization techniques to provide a method for determining the quantity? of the specific ligand present in a sample.

DESCRIZIONE DESCRIPTION

La presente invenzione riguarda un metodo e riguarda reagenti per determinare ligandi in fluidi biologici come siero, plasma, fluido spinale, fluido amniotico e orina. In particolare, la presente invenzione riguarda un procedimen to di imraunosaggio di polarizzazione di fluorescenza e riguarda traccianti impiegati come reagenti in tali procedimenti. Il procedimento di imraunosaggio di polarizzazione di fluorescenza della presente invenzione riunisce la specificit? di un immunosaggio con la velocit? e il vantaggio di tecniche di polarizzazione di fluorescenza per realizzare un mezzo per determinare la quantit? di uno specifico ligando presente in un campione. The present invention relates to a method and relates to reagents for determining ligands in biological fluids such as serum, plasma, spinal fluid, amniotic fluid and urine. In particular, the present invention relates to a fluorescence polarization imaging procedure and relates to tracers used as reagents in such processes. The fluorescence polarization immunoassay method of the present invention combines the specificity. of an immunoassay with the speed? and the advantage of fluorescence polarization techniques to provide a means of determining the quantity? of a specific ligand present in a sample.

Immunosaggi di legame competitivi per misurare ligandi sono basati sulla competizione tra un ligando in un campione di prova ? un reagente marcato, denominato tracciante, per un limitato numero di siti di legame di ricettori su anticorpi spec?fici nei confronti del ligando e del tracciar, te. La concentrazione del ligando nel campione determina la quantit? di tracciante che si legher? specificamente ad un anticorpo. La quantit? di coniugato tracciante-anticorpo pro dotto pu? venire misurata quantitativamente ed ? inversamente proporzionale alla quantit? di ligando presente nel campio ne di prova. Are competitive binding immunoassays to measure ligands based on competition between a ligand in a test sample? a labeled reagent, called tracer, for a limited number of receptor binding sites on specific antibodies against the ligand and the tracer. The concentration of the ligand in the sample determines the quantity? of tracer that will bind? specifically to an antibody. The quantity of tracer-antibody conjugate produced pu? be measured quantitatively and d? inversely proportional to the quantity? of ligand present in the test sample.

In generale, le tecniche di polarizzazione di fluorescenza sono basate sul principio che un composto marca to fluorescente, quando viene eccitato da luce polarizzata linearmente emetter? fluorescenza avente un grado di polarizzazione che ? in relazione inversa rispetto alla sua velocit? di rotazione. Pertanto, quando una molecola per esempio un coniugato tracciante-anticorpo avente una traccia fluo rescente viene eccitata cnn luce polarizzata linearmente, la luce emessa rimane altamente polarizzata poich? il fluo? roforo ? costretto dalla rotazione entro il tempo durante il quale la luce viene assorbita-ed emessa. Quando un compo sto tracciante "libero" (ossia non legato ad un anticorpo) viene eccitato da luce polarizzata linearmente, la sua rota zione ? molto pi? rapida rispetto al corrispondente coniugato tracciante-anticorpo e le molecole sono maggiormente o rientate con disposizione casuale, pertanto, laluce emessa ? depolarizzata. Cosi, una polarizzazione difluorescenza realizza un mezzo quantitativo per misurare la quantit? di coniugato tracciante-anticorpo prodotta in un immunosaggio con legame competitivo La presente invenzione comprende un metodo per determinare ligandi in un campione che consiste nel mescola re con detto campione un sale biologicamente accettabile di un tracciante avente la formula: In general, fluorescence polarization techniques are based on the principle that a fluorescent branded compound, when excited by linearly polarized light, will emit? fluorescence having a degree of polarization which? in inverse relation with respect to its speed? of rotation. Therefore, when a molecule such as a tracer-antibody conjugate having a fluorescence trace is excited with linearly polarized light, the emitted light remains highly polarized because it is highly polarized. the fluo? roforo? forced by rotation within the time during which the light is absorbed - and emitted. When a "free" tracer compound (i.e. not bound to an antibody) is excited by linearly polarized light, its rotation? much more? rapid compared to the corresponding tracer-antibody conjugate and the molecules are more or more indented with random arrangement, therefore, the light emitted? depolarized. Thus, a difluorescence polarization provides a quantitative means of measuring the quantity? of tracer-antibody conjugate produced in a competitive binding immunoassay The present invention comprises a method for determining ligands in a sample which consists in mixing with said sample a biologically acceptable salt of a tracer having the formula:

in cui X ? un gruppo scelto dalla classe costituito da un gruppo ossalile avente la formula: where X? a group chosen from the class consisting of an oxalyl group having the formula:

un gruppo solfonile avente la formula: a sulfonyl group having the formula:

e un gruppo' carboammidosolfonile avente la formula and a carboammidosulfonyl group having the formula

e And

R ? un ligando-analogo in cui detto ligando-ana? logo ha almeno un epitopo comune con detto ligando in modo da essere specificamente riconoscibile da un anticorpo comime; R? a ligand-analog in which said ligand-ana? logo has at least one epitope common with said ligand so as to be specifically recognizable by a common antibody;

e un anticorpo capace di riconoscere specificamente detto ligando e detto tracciante; e, quindi, determinare la quantit? di coniugato tracciante-anticorpo mediante tecniche di polarizzazione di fluorescenza, come misura della concentrazione di detto ligando nel cauzione. and an antibody capable of specifically recognizing said ligand and said tracer; and, therefore, determine the quantity? of tracer-antibody conjugate by means of fluorescence polarization techniques, as a measure of the concentration of said ligand in the deposit.

la presente invenzione riguarda inoltre una nuova classe di traccianti di formula (i) e loro sali biologicamen te accettabili, che sono utili come reagenti nel metodo de? scritto sopra. I metodi e i tracciatiti della presente invenzione sono particolarmente utili nel controllo quantit? tivo di concentrazioni di farmaci terapeutici nel siero e nel plasma. the present invention further relates to a new class of tracers of formula (I) and their biologically acceptable salts, which are useful as reactants in the method of the invention. written above. The methods and methods of the present invention are particularly useful in quantitative control. tive of therapeutic drug concentrations in serum and plasma.

Il termine "ligando" cosi come viene qui usato si riferisce ad una molecola, in particolare un aptene di basso peso molecolare, con il quale si pu? ottenere o si pu? formare un ricettore, normalmente un anticorpo. Gli apteni sono corpi privi di proteine, generalmente di basso peso molecolare, che non provocano formazione di anticorpi quando vengono iniettati in un animale, ma sono reattivi nei confronti di anticorpi. Anticorpi nei confronti di apte ni in generale vengono fatti aumentare coniugando dapprima gli apteni con una proteina e iniettando il prodotto coniugato in un animale. Gli anticorpi cosi ottenuti vengono isolati adottando tecniche di isolamento di anticorpi tradizio nali The term "ligand" as used herein refers to a molecule, in particular a low molecular weight hapten, with which one can? get or can you? form a receptor, usually an antibody. Hapens are protein-free, generally low molecular weight bodies that do not cause antibody formation when injected into an animal, but are reactive to antibodies. Antibodies to apthenes in general are increased by first conjugating the haptens with a protein and injecting the conjugated product into an animal. The antibodies thus obtained are isolated using conventional antibody isolation techniques

I ligandi determinabili mediante il metodo della presente invenzione variano in un ampio intervallo di peo molecolare. Sebbene si possano determinare ligandi di pe so molecolare elevato, per ottenere i migliori risultati, in generale ? preferibile adottare i metodi della presente invenzione per determinare ligandi di basso peso molecolare, in generale in un intervallo di peso molecolare compreso tra 50 e 4000. Si preferisce maggiormente determinare ligandi aventi un peso molecolare compreso tra 100 e 2000. The ligands that can be determined by the method of the present invention vary over a wide molecular weight range. Although high molecular weight ligands can be determined, for best results in general? It is preferable to adopt the methods of the present invention to determine ligands of low molecular weight, in general in a molecular weight range of between 50 and 4000. It is more preferred to determine ligands having a molecular weight of between 100 and 2000.

Il nuovo tracciante della presente invenzione comprende composti di f?rmula (i) in cui il ligando-analogo rappresentato da R comprende radicali aventi un peso mo lecolare compreso tra 50 e 4000 Tra i nuovi traccianti pre feriti sono compresi composti di formula (i) in cui tra i ligando-analoghi rappresentati da R sono compresi radicali aventi un peso molecolare compreso tra 100 e 2000. The new tracer of the present invention comprises compounds of formula (i) in which the ligand-analog represented by R comprises radicals having a molecular weight between 50 and 4000. in which radicals having a molecular weight comprised between 100 and 2000 are included among the ligand analogues represented by R.

Tra gli esempi rappresentativi di ligandi determinabili mediante i metodi della presente invenzione sono compresi steroidi come esterone, estradiolo, cortisolo, testosterone, progesterone, acido chenodeossicolico, digoss:L na, acido colico, digitossina, acido deossicolico, acidi li_ tocolici e i loro derivati esteri e ammidi; vitamine come vitamina B-12, acido folico;tiroxina, triiodotironina, istamina, serotonina, prostaglandine come PGE, PGF, PGA; far maci antiasmatici come teof?llina; farmaci antineoplastici come doxorubicina e metotrexato; farmaci antiaritmia comediso pirammide, lidocaina, procainammide, propanololo, chinidina, N?acetil?pr?cainammide; farmaci antionvulsivanti come feno? barbitale. fenitoina, primidone, acido valproico, carbammazepina e etosuximide; antibiotici come penicilline, cefalosporine, eritromicina, vancomicina, gentamicina, amicacina, ci?ramfenicolo, streptomicina e tobramicina; farmaci antiartritici come salicilato; farmaci antidepressivi ivi compresi composti triciclici come nortriptilina, amitriptilina, imiprammina e desiprammina;e simili e anche i loro melaboliti. Inoltre, secondo i metodi della presente invenzione si posso no determinare farmaci che provocano farmaco dipendenza per esempio morfina, eroina, idromorfone, ossimorfone, metapone, codeina, idrocodone, diidrocodeina, diidroidrossicodeinone, folcodina, destrometorfano , fenazocina e deonina e loro metaboliti . Representative examples of ligands that can be determined by the methods of the present invention include steroids such as esterone, estradiol, cortisol, testosterone, progesterone, chenodeoxycholic acid, digoss: L na, cholic acid, digitoxin, deoxycholic acid, li-alcoholic acids and their ester derivatives. and amides; vitamins such as vitamin B-12, folic acid; thyroxine, triiodothyronine, histamine, serotonin, prostaglandins such as PGE, PGF, PGA; to make asthmatic maci such as Theophilina; antineoplastic drugs such as doxorubicin and methotrexate; antiarrhythmic drugs such as pyramid, lidocaine, procainamide, propanolol, quinidine, N? acetyl? pr? cainamide; antionvulsant drugs such as pheno? barbital. phenytoin, primidone, valproic acid, carbammazepine and ethosuximide; antibiotics such as penicillins, cephalosporins, erythromycin, vancomycin, gentamicin, amicacin, ci? ramphenicol, streptomycin and tobramycin; anti-arthritic drugs such as salicylate; antidepressant drugs including tricyclic compounds such as nortriptyline, amitriptyline, imipramine and desipramine; and the like and also their melabolites. Furthermore, according to the methods of the present invention it is possible to determine drugs which cause drug addiction, for example morphine, heroin, hydromorphone, oxymorphone, metapone, codeine, hydrocodone, dihydrocodeine, dihydroxycodeinone, pholcodine, dextromethorphan, phenazocine and deonine and their metabolites.

I traccianti della presente invenzione esistono in generale in un equilibrio tra la loro forma acida e la lo ro forma ionizzata, e nello stato ionizzato essi sono efficaci nel metodo della presente invenzione. Pertanto, la presente invenzione comprende i traccianti nello stato acido o nello stato ionizzato e, per praticit?, i traccianti della presente invenzione sono qui rappresentati strutturalmente nella loro forma acida. Quando i traccianti della presente invenzione sono presenti nel loro stato ionizzato, i traccianti esistono nella forma di sali biologicamente accettabili-. Cosi come viene qui usata, l?espressione " sali biologicamente accettabili " si riferisce a sali come sali di sodio, potassio, ammonio e simili che consentono ai traccianti della presente invenzione di esistere nel loro stato ionizzato, quando vengono impiegati nel metodo della presente invenzione. In generale, i traccianti della presente invenzione e sistono in soluzione sotto forma di sali , il sale specifico viene ottenuto dalla sostanza-tampone impiegata, per esempio in presenza di un tampone di fosfato di sodio, i traccianti della presente invenzione in generale esisteranno nel loro stato ionizzato sotto forma di un sale di sodio. The tracers of the present invention generally exist in a balance between their acid form and their ionized form, and in the ionized state they are effective in the method of the present invention. Therefore, the present invention encompasses the tracers in the acid state or ionized state and, for convenience, the tracers of the present invention are shown here structurally in their acid form. When the tracers of the present invention are present in their ionized state, the tracers exist in the form of biologically acceptable salts. As used herein, the term "biologically acceptable salts" refers to salts such as sodium, potassium, ammonium and the like salts which allow the tracers of the present invention to exist in their ionized state when employed in the method of the present invention. . In general, the tracers of the present invention are in solution in the form of salts, the specific salt is obtained from the buffer used, for example in the presence of a sodium phosphate buffer, the tracers of the present invention will generally exist in their been ionized in the form of a sodium salt.

Il termine "ligando-analogo" cosi come viene qui usato si riferisce a un radicale monovalente oppure polivalen te, una sostanziale proporzione del quale ha la medesima strut tura spaziale e polare del ligando per definire uno o pi? siti determinanti o epitopici capaci di competere con il ligando per i siti leganti di un ricettore. Una caratteristica di un tale ligando-analogo e che esso possiede una somiglianza strut turale sufficiente con legando che interessa,in modo da venire riconosciuto dall'anticorpo per il ligando. Per la massima parte, il ligando-analogo avr? la medesima oppure sostan zialmente medesima strattura e distribuzione di carica (organizzazione spaziale e polare) del ligando che interessa per una notevole porzione della superficie molecolare. Poich? spesso, il sito legante per un aptene sar? il medesimo nel preparare l'antigene per la produzione di anticorpi usato per il legame con il ligando, la medesima porzione del ligandoanalogo che realizza la struttura per l?anticorpo sar? esposta dal ligando-analogo nel tracciante? The term "ligand-analogue" as used herein refers to a monovalent or polyvalent radical, a substantial proportion of which has the same spatial and polar structure as the ligand to define one or more? determinant or epitopic sites capable of competing with the ligand for the binding sites of a receptor. A feature of such a ligand-analog is that it has sufficient structural similarity to the ligand of interest to be recognized by the antibody to the ligand. For the most part, the ligand-analog will have? the same or substantially the same structure and charge distribution (spatial and polar organization) of the ligand which affects a considerable portion of the molecular surface. Since? often, the binding site for a hapten will be? the same in preparing the antigen for the production of antibodies used for binding with the ligand, the same portion of the ligandanalogue which forms the structure for the antibody will be? exposed by the ligand-analogue in the tracer?

Quando X ? un gruppo solforile, When X? a sulfuryl group,

la classe di ligando-analoghi rappresentata da R ? derivata dal corrispondente ligando mediante allontanamento di un i? drogeno aromatico, ossia un idrogeno legato a un carbonio a romatico, preferibilmente un carbonio del fenile, oppure dalla formazione di un fenile o di un derivato del fenile sostituito del ligando. Inoltre, un ligando pu? venire modificato strutturalmente dall?aggiunta o dalla sottrazione di uno o pi? gruppi funzionali per formare un ligando-analogo conservando i necessari siti epitopi per il legame con un anticor po. Tuttavia, si preferisce che tali ligando-analoghi modificati siano legati alla porzione di solfonilammino-fluorescenza tramite un atomo di carbonio. the class of ligand-analogs represented by R? derived from the corresponding ligand by moving away an i? aromatic dopene, i.e. a hydrogen bonded to an aromatic carbon, preferably a phenyl carbon, or from the formation of a phenyl or a substituted phenyl derivative of the ligand. Furthermore, a ligand can? be structurally modified by the addition or subtraction of one or more? functional groups to form a ligand analog while retaining the necessary epitope sites for binding to an antibody. However, it is preferred that such modified ligand analogs be bonded to the sulfonylamino-fluorescence moiety via a carbon atom.

Quando X ? un gruppo ossalile, When X? an oxalyl group,

la classe di ligando-analoghi rappresentata da R ? derivata dal corrispondente ligando mediante allontanamento di un atomo di idrogeno legato ad una ammina reattiva, ossia, un ato mo di idrogeno legato ad una ammina primaria oppure ad una am mina secondaria oppure mediante la formazione di un ammino-de rivato del ligando in cui un gruppo imminico the class of ligand-analogs represented by R? derived from the corresponding ligand by the removal of a hydrogen atom bonded to a reactive amine, i.e., a hydrogen atom bonded to a primary or secondary amine or by the formation of an amino derivative of the ligand in which a imminic group

sostituisce uno o pi? atomi originariamente presenti nel ligando, in corrispondenza del sito di legame con una porzione di ossalilamminofluoresceina. Tra gli esempi illustrativi di ligandi che, all'atto dell'allontanamento di un idrogeno, si legano con una ammina reattiva da un ligando-analogo rappresentato da R sono compresi, per esempio, procainammi de, tiroxina, chinidina e gli antibiotici amminoglicosidici. Tra gli esempi illustrativi di ligandi i cui ammino-derivati sono utili come ligando-analoghi cono compresi teofillina cido valproico- fenobarbitale, feniteina, primidone, disopirammide, digossina cloramfenicolo, salicilato, acetamminofene, carbammazepina, desimprammina e nortrifilina. Inoltre, un ligando pu? essere strutturalmente modificato mediante l'aggiunta o l'asportazione di uno o pi? gruppi funzionali per formare un ligando-analogo, conservando i necessari siti epitopi per il legame con un anticorpo. Tuttavia, si preferisce che tali ligando-analoghi modificati siano legati alla porzione di ossalilamminofluoresceina tramite un gruppo imminico. replaces one or more? atoms originally present in the ligand, at the binding site with a portion of oxalylaminofluorescein. Illustrative examples of ligands which, upon removal of a hydrogen, bind with an amine reactive from a ligand-analog represented by R include, for example, procainamine, thyroxine, quinidine and aminoglycoside antibiotics. Among the illustrative examples of ligands whose amino derivatives are useful as cone ligand analogs including theophylline and valproic acid-phenobarbital, phenitein, primidone, disopyramide, digoxin chloramphenicol, salicylate, acetaminophen, carbamazepine, desimpramine and nortrifiline. Furthermore, a ligand can? be structurally modified by adding or removing one or more? functional groups to form a ligand-analog, retaining the necessary epitope sites for binding to an antibody. However, it is preferred that such modified ligand analogs are bound to the oxalylaminofluorescein moiety via an imino group.

Quando X ? un gruppo carboammidosolfonilamminico When X? a carboammidosulfonylamine group

la classe di ligando-analoghi rappresentata da R ? derivata . dal corrispondente ligando mediante allontanamento di un ato mo di idrogeno reattivo, ossia, un atomo di idrogeno legato a un ossigeno ossidrilico o ad una ammina reattiva (primaria o secondaria) oppure mediante la formazione di un ammino-derivato del ligando in cui un gruppo imminico the class of ligand-analogs represented by R? derivative. from the corresponding ligand by removing a reactive hydrogen atom, i.e., a hydrogen atom bonded to a hydroxyl oxygen or a reactive amine (primary or secondary) or by the formation of an amino derivative of the ligand in which an imino group

sostituisce uno o pi? atomi originariamente presenti nel li gando, in corrispondenza del sito di legame con una porzione di carboammidosolfonil-ammino-fluoresceina. Tra gli esempi illustrativi di ligandi che, all?atto dellallontanamento di un idrogeno reatiivo, possono formare un ligando analogo rappresentato da R sono compresi, per esempio, procainammide, tiroxina, chinidina e gli antibiotici amminoglicosidici . Tra gli esempi illustrativi di ligandi i cui ammino-derivati sono utili come ligando-analoghi sono compresi teofillina, acido valproico, fenobarbitale, fenitoina, primidone, disopirammide, digossina,doramfenicolo, salicilato, acetamminofene, carbammazepina, desimprammina,enortriptilina. Inoltre, un ligando pu? venire strutturalmente modificatome diante l?aggiunta o l?asportazione di uno o pi? gruppi funzio nali per formare un ligando-analogo, conservando i necessari siti epitopi per legare con un anticorpo. Tuttavia, si preferisce che tali ligando-analoghi modificati siano legati ad lina porzione di carboamm?dosolfonil-amminofluoresceina tramite un gruppo imminico oppure tramite un ossi-gruppo. replaces one or more? atoms originally present in the ligand, at the binding site with a portion of carboammidosulfonyl-amino-fluorescein. Illustrative examples of ligands which, upon removal of a offending hydrogen, can form an analogous ligand represented by R include, for example, procainamide, thyroxine, quinidine and aminoglycoside antibiotics. Illustrative examples of ligands whose amino derivatives are useful as ligand analogs include theophylline, valproic acid, phenobarbital, phenytoin, primidone, disopyramide, digoxin, doramphenicol, salicylate, acetaminophen, carbamazepine, desimpramine, enortriptyline. Furthermore, a ligand can? be structurally modified by adding or removing one or more? functional groups to form a ligand-analog, retaining the necessary epitope sites to bind with an antibody. However, it is preferred that such modified ligand analogs be bound to the carboamm-dosulfonyl-aminofluorescein moiety via an imino group or via an oxy group.

Si preparano i traccianti della presente invenzione secondo tecniche note. Quando X e un gruppo solforile, The tracers of the present invention are prepared according to known techniques. When X is a sulfuryl group,

i traccianti della presente invenzione vengono preparati facendo reagire un composto avente la formula: the tracers of the present invention are prepared by reacting a compound having the formula:

in cui R ha il significato definito sopra e Y ? un idrogeno aromatico, preferibilmente legato a un anello fenile, con acido clorosolfonico per produrre un clorosolfonil ligandoanalogo avente la formula: where R has the meaning defined above and Y? an aromatic hydrogen, preferably bonded to a phenyl ring, with chlorosulfonic acid to produce a chlorosulfonyl ligand analog having the formula:

Si fa reagire il clorosolfonilligando-analogo con una amminofluoresceina avente la formula: The chlorosulfonyligand analogue is reacted with an aminofluorescein having the formula:

in cui il gruppo amminico ? legato alla posizione 4 o alla po sizione 5 dell'anello dell'acido benzoico; in presenza di un solvente inerte per ottenere un tracciante della presente in venzione avente la formula: in which the amino group? linked to position 4 or position 5 of the benzoic acid ring; in the presence of an inert solvent to obtain a tracer of the present invention having the formula:

Quando X ? un gruppo ossalile, When X? an oxalyl group,

i traccianti della presente invenzione vengono preparati facendo reagire un composto di formula the tracers of the present invention are prepared by reacting a compound of formula

in cui R ha il significato definito sopra e Z ? un idrogeno legato a un azoto reattivo (ammina primaria oppure ammina se condaria), con metilossalilcloruro per ottenere un metossi. ossalil ligando-analogo che viene idrolizzato in presenza di una base ottenendo cos? un idrossiossal il ligando-analogo avente la formula where R has the meaning defined above and Z? a hydrogen bonded to a reactive nitrogen (primary amine or secondary amine), with methyloxalyl chloride to obtain a methoxy. oxalyl ligand-analogue which is hydrolyzed in the presence of a base, thus obtaining a hydroxyxal the ligand analog having the formula

Si fa reagire l'idrossiossalil ligando-analogo con una ammino-fluoresceina di formula (IV) in presenza di un a? gente copulante, per esempio, cloridrato della 1-etil-3 (3 dimetilamininopropil)-carbodiimmide e in presenza di un solvente inerte per dare un tracciante della presente invenzione avente la f?rmula: Is the hydroxyxalyl ligand analog reacting with an amino-fluorescein of formula (IV) in the presence of an a? coupler, for example, 1-ethyl-3 (3 dimethylamininopropyl) -carbodiimide hydrochloride and in the presence of an inert solvent to give a tracer of the present invention having the formula:

Quando X ? un carboammidosolfonile, When X? a carboamide sulfonyl,

I THE

i traccianti della presente invenzione vengono preparati facendo reagire un composto avente la formula the tracers of the present invention are prepared by reacting a compound having the formula

in cui R ha il significato definito sopra e W ? un idrogeno legato a un azoto reattivo (ammina primaria oppure ammina secondaria )oppure aun osaigeno-ossidrilico; con clorosolfonilisocianato per dare un derivato clorosolfonilammidocarbonil-ligan do-analogo avente la formula where R has the meaning defined above and W? a hydrogen bonded to a reactive nitrogen (primary amine or secondary amine) or to an oxo-hydroxyl; with chlorosulfonylisocyanate to give a chlorosulfonylamidocarbonyl-ligando analogue derivative having the formula

Si fa reagire il derivato clorosolfonilammidocar bonil-li gando-analogo con una amminofluoresceina di formula (IV) per ottenere i traccianti della presente invenzione aventi la formula: The chlorosulfonylammidocarbonyl-free-analogue derivative is reacted with an aminofluorescein of formula (IV) to obtain the tracers of the present invention having the formula:

La temperatura in corrispondenza della quale la reazione per preparare i traccianti della presente invenzione decorre non ? critica. La temperatura potr? essere una temperatura sufficiente, tale da fare iniziare e mantenere la reazione. In generale, per praticit? e per ragioni economiche, ? sufficiente la temperatura ambiente. Nel preperare i traccianti della presente invenzione, il rapporto tra i reagenti e non strettamente critico. Per esempio, per ciascuna mole di un composto di formula (II), si potranno impiegare due moli di acido clorosolfonico per ottenere una resa ragionevole. Si preferisce impiegare un eccesso di acido clorosolfonico per facilitare la reazione e per ricuperare i prod?tti della reazione. I composti di formula (IV) impiegati come sostanze di partenza nella produzione dei traccianti della presente invenzione sono reperibili in commercio oppure vengono preparati secondo tecniche note. The temperature at which the reaction for preparing the tracers of the present invention runs is not? criticism. The temperature may? be a temperature sufficient to initiate and maintain the reaction. In general, for convenience? and for economic reasons,? room temperature is sufficient. In preparing the tracers of the present invention, the relationship between the reactants is not strictly critical. For example, for each mole of a compound of formula (II), two moles of chlorosulfonic acid could be used to obtain a reasonable yield. It is preferred to employ an excess of chlorosulfonic acid to facilitate the reaction and to recover the products of the reaction. The compounds of formula (IV) used as starting substances in the production of the tracers of the present invention are commercially available or are prepared according to known techniques.

Per facilit? di manipolazione e di isolamento del prodotto, il procedimento per prepararei traccianti del la presente invenzione viene effettuata in presenza di un solvente inerte. Tra i solventi,inerti adatti sono compresi quei solventi che non reagiscono sostanzialmente con le sostanze di partenza e che sono sufficienti a sciogliere le sostanze di partenza e tra.essi sono compresi per esempio acetone, cloroformio, piridina e simili. Allo scopo di realiz zare rese di prodotto massime, la reazione preferibilmente decorre in condizioni neutre oppure alcaline. Tra le basi a? datte sono comprese per esempio trietilammina, piridina e simi li. I prodotti di reazione vengono generalmente purificati effettuando una cromatografia su strato sottile oppure una cromatografia su colonna prima della applicazione nei metodi della presente invenzione. For ease? of manipulation and isolation of the product, the process for preparing the tracers of the present invention is carried out in the presence of an inert solvent. Among the solvents, suitable inert materials are included those solvents which do not react substantially with the starting substances and which are sufficient to dissolve the starting substances and among them are included, for example, acetone, chloroform, pyridine and the like. In order to achieve maximum product yields, the reaction preferably runs under neutral or alkaline conditions. Between the bases a? such are comprised, for example, triethylamine, pyridine and the like. The reaction products are generally purified by performing thin layer chromatography or column chromatography prior to application in the methods of the present invention.

Secondo il metodo della presente invenzione, si mescola un campione contenente il ligando da determinare con un sale biologicamente accettabile di un tracciante di formula (I) e con un anticorpo specifico per il ligando e per il tracciante. Il ligando presente nel campione e il tracciante competono per limitare i siti dell'anticorpo e si ottiene come risultato la formazione di complessi ligando-anticorpo e tracciante-anticorpo . Mantenendo costante la concentrazione di tracciante e di anticorpo, il rapporto tra complesso ligando-anticorpo e complesso tracciante-anticorpo che viene for mato ? direttamente proporzionale alla quantit? da ligando presente nel campione. Pertanto, all?atto della eccitazione della miscela con luce fluorescente e all?atto della misurazione della polarizzazione della fluorescenza emessa da un tracciante e da un complesse tracciante-anticorpo, si ? in grado di determinare quantitativamente la quantit? di ligando nel campione. According to the method of the present invention, a sample containing the ligand to be determined is mixed with a biologically acceptable salt of a tracer of formula (I) and with an antibody specific for the ligand and for the tracer. The ligand present in the sample and the tracer compete to limit the antibody sites, resulting in the formation of ligand-antibody and tracer-antibody complexes. By keeping the concentration of tracer and antibody constant, the ratio between the ligand-antibody complex and the tracer-antibody complex that is formed? directly proportional to the quantity? from ligand present in the sample. Therefore, upon excitation of the mixture with fluorescent light and upon measurement of the polarization of the fluorescence emitted by a tracer and a tracer-antibody complex, yes? able to quantitatively determine the quantity? of ligand in the sample.

In teoria, la polarizzazione di fluorescenza di un tracciante non complessato con un anticorpo ? bassa, ed ? pros sima allo zero. All?atto della formazione del complesso con un anticorpo specifico, il complesso tracciante-anticorpo co si formato assume la rotazione della molecola dell?anticor? po che ? pi? lenta rispetto alla rotazione della molecola del tracciante relativamente piccola, e cos? si osserva un aurnen to della polarizzazione. Pertanto, quando un ligando compete con il tracciante per siti di anticorpo, la polarizzazione di fluorescenza osservata del complesso tracciante-anticorpo di venta un valore in certo qual modo compreso tra quello del tracciante e quello del complesso tracciante-anticorpo. Se un campione contiene ima elevata,concentrazione di un ligan do, il valore di polarizzazione osservato ? pi? prossimo a quello del ligando libero, ossia, ? basso. Se il campione in esame contiene una bassa concentrazione del ligando, il valore di polarizzazione ? pi? prossimo a quello del ligando legato, ossia ? elevato. Eccitando sequenzialmente la miscela di rea zione di un immunosaggio con luce polarizzata verticalmente e, successivamente, con luce polarizzata orizzontalmente e analizzando soltanto la componente verticale della luce emessa, si pu? determinare con precisione la polarizzazione di fluorescenza della miscela di reazione. La precisa relazione esistente tra polarizzazione e concentrazione del ligando da determinare viene stabilita misurando i valori della polarizzazione di sostanze di taratura aventi concentrazioni note. La concentrazione del ligando pu? venire estrapolata da una curva standard preparata in questo modo. In theory, the fluorescence polarization of a tracer not complexed with an antibody? low, and? next to zero. Upon the formation of the complex with a specific antibody, the tracer-antibody complex is formed assuming the rotation of the antibody molecule. few ? pi? slow compared to the rotation of the relatively small tracer molecule, and so on? an increase in polarization is observed. Thus, when a ligand competes with the tracer for antibody sites, the observed fluorescence polarization of the tracer-antibody complex is somewhat between that of the tracer and that of the tracer-antibody complex. If a sample contains a high ima, concentration of a ligand, the observed polarization value? pi? close to that of the free ligand, that is,? low. If the test sample contains a low concentration of the ligand, the polarization value? pi? close to that of the bound ligand, that is? high. By sequentially exciting the reaction mixture of an immunoassay with vertically polarized light and, subsequently, with horizontally polarized light and analyzing only the vertical component of the emitted light, one can? accurately determine the fluorescence polarization of the reaction mixture. The precise relationship between polarization and concentration of the ligand to be determined is established by measuring the polarization values of calibration substances having known concentrations. The concentration of the ligand can? be extrapolated from a standard curve prepared in this way.

Il pH in corrispondenza del quale si realizza il metodo della presente invenzione deve essere sufficiente a consentire che i traccianti di formula (i) esistano nel loro stato ionizzato. Il pH pu? essere compreso circa tra 3 e 12, pi? usualmente nellintervallo di valori compreso tra 5 e 10, nel modo pi? preferibile nell'intervallo di valori di circa 6-9. Si possono usare diverse sostanze-tampone per ot tenere e mantenere il pK durante il procedimento di prova. The pH at which the method of the present invention is carried out must be sufficient to allow the tracers of formula (i) to exist in their ionized state. The pH can? be between about 3 and 12, pi? usually in the range of values between 5 and 10, in the way pi? preferable in the range of values of about 6-9. Various buffer substances can be used to obtain and maintain the pK during the test procedure.

Ira le sostanze-tampone rappresentative sono comprese borato, fosfato, cartonato , tris , barbitale e simili. La particolare sostanza-tampone impiegata non ? critica ai fini della presente invenzione, ma in un singolo saggio, si pu? preferire una sostanza-tampone specifica in vista dell'anticorpo impiegato e in vista del ligando da determinare. La porzione di catione della sostanza-tampone in generale determiner? la porzione di catione del sale tracciante in soluzione. Representative buffers include borate, phosphate, cardboard, tris, barbital and the like. The particular buffer used is not? critical for the purposes of the present invention, but in a single essay, one can? to prefer a specific buffer substance in view of the antibody employed and in view of the ligand to be determined. The cation portion of the buffer will generally determine? the cation portion of the tracer salt in solution.

I metodi della presente invenzione vengono realizzati in corrispondenza di temperature modeste e prefer?bil ment? ad una temperatura costante. La temperatura, normalmen te, sar? compresa circa tra 0?C e 50?C pi? usualmente sar? compresa tra circa 15?C e 40?C. The methods of the present invention are carried out at low and preferably low temperatures. at a constant temperature. The temperature, normally, will be? between about 0? C and 50? C pi? usually it will be? between about 15? C and 40? C.

La concentrazione di ligando che pu? venire esaminata in generale varier? da circa pi? usual mente varier? circa da Si possono rilevare concentrazioni di ligando pi? elevate Per diluizione del campione originale. The concentration of ligand that can? be examined in general varier? from about pi? usual mind varier? about from Can concentrations of ligand pi? high For dilution of the original sample.

Oltre all?intervallo di concentrazione del ligando che interessa, considerazioni come per esempio se il saggio ? qualitativo, semiquantitativo oppure quantitativo, considerazioni riguardanti l'apparecchiatura impiegata e le caratteristiche del tracciante e dell'anticorpo normalmente determineranno la concentrazione del tracciante e dell'anticorpo da impiegare. Mentre la concentrazione di ligando nel campione determiner? l'intervallo di concentrazione degli al tri reagenti, ossia tracciante e anticorpo, normalmente per rendere ottimale la sensibilit? del saggio, si determineranno in modo empirico le singole concentrazioni dei reagenti. Coloro che sono usualmente esperti nel settore stabiliranno facilmente le concentrazioni del tracciante e dell'anticorpo. In addition to the concentration range of the ligand of interest, considerations such as whether the assay? qualitative, semi-quantitative or quantitative, considerations regarding the equipment used and the characteristics of the tracer and antibody will normally determine the concentration of the tracer and antibody to be used. While the ligand concentration in the sample will determine? the concentration range of the other reagents, ie tracer and antibody, normally to make the sensitivity optimal? of the assay, the individual concentrations of the reagents will be determined empirically. Those of ordinary skill in the art will readily establish the concentrations of the tracer and antibody.

Come precedentemente indicato, i traccianti preferiti della presente invenzione vengono preparati da 5-ammino-fluoresceina oppure da 4-amminofluoresceina e esistono pref eribilmente sotto forma di isomeri aventi la formula: As previously indicated, the preferred tracers of the present invention are prepared from 5-amino-fluorescein or from 4-aminofluorescein and preferably exist in the form of isomers having the formula:

in cui R e X hanno il significato definito sopra. P where R and X have the meaning defined above. P.

Gli esempi non limitativi, illustrativi che seguono serviranno a dimostrare ulteriormente a coloro che sono esterti nel settore il modo secondo il quale si possono preparare specifici traccianti nell'ambito della presente invenzione. Il simbolo / A.F / che compare nelle formula di struttura che illustrano i composti preparati negli esempi che seguono, rappresenta una porzione avente la formula: The following non-limiting, illustrative examples will serve to further demonstrate to those outsiders in the art the manner in which specific tracers can be prepared within the scope of the present invention. The symbol / A.F / which appears in the structural formula illustrating the compounds prepared in the following examples, represents a portion having the formula:

in cui l'azoto imminico ? legato alla posizione 4 oppure alla posizione 5 nella formula di cui sopra, a seconda dello specifico isomero di amminofluoresceina impiegato come sostanza di partenza in which imminic nitrogen? linked to position 4 or position 5 in the above formula, depending on the specific isomer of aminofluorescein used as starting substance

ESEMPIO I EXAMPLE I

A 0,71 g di lidocaina si sono aggiunti 2,8 g di acido clorosolfonico e si ? riscaldata la miscela cos? ottenuta a 60?C per 1 ora. Si ? raffreddata la miscela di reazione e si sono aggiunti alla miscela acqua e ghiaccio triturato per distruggere l ? eventuale acido clorosolfonico non reagito . Si ? neu tralizzata la soluzione acquosa cos? ottenuta fino a pH 7 usando idrossido di sodio. Si ? estratto il prodotto cos? ; ot tenuto due volte con porzioni da 10 ml di cloruro di metilene . Si sono riuniti gli estratti in cloruro di metilene, si sono anidrificati su solfato di sodio , filtrati e evaporati a secco ottenendo cos? 100 mg di una miscela di meta- e para? clorosolfonil lidocaina sotto forma di un prodotto oleoso gom moso . Ad una soluzione contenente 5 mg di 4-amminofluorescenina in 0, 5 ml di piridina si sono aggiunti 5 mg della miscela di clorosolfonillidocaina di cui sopra. Uopo 10 minuti , si ? formato un prodotto grezzo . Si ? purificato il prodotto grezzo mediante cromatografia su strato sottile usando gel di sili ce e cloroformio , quindi usando una mi scela di cloroformio: acetone ( 1 : 1 ) e alla fine usando un miscela di clorofor mio:metanolo ( 1 : 1.) come solventi sviluppatori e si ? ottenuta cos? una miscela di un coniugato di solfonillidocaina amminofluoresceina avente la formula generale: To 0.71 g of lidocaine 2.8 g of chlorosulfonic acid were added and yes? heated the mixture cos? obtained at 60 ° C for 1 hour. Yup ? the reaction mixture was cooled and crushed ice and water were added to the mixture to destroy the reaction mixture. any unreacted chlorosulfonic acid. Yup ? neutralized the aqueous solution so? obtained up to pH 7 using sodium hydroxide. Yup ? extracted the product cos? ; obtained twice with 10 ml portions of methylene chloride. The extracts in methylene chloride were combined, dried on sodium sulphate, filtered and evaporated to dryness, thus obtaining? 100 mg of a mixture of meta- and para? chlorosulfonyl lidocaine in the form of an oily gum product. To a solution containing 5 mg of 4-aminofluorescenine in 0.5 ml of pyridine was added 5 mg of the above chlorosulfonylidocaine mixture. After 10 minutes, yeah? formed a raw product. Yup ? purified the crude product by thin layer chromatography using silica gel and chloroform, then using a mixture of chloroform: acetone (1: 1) and finally using a mixture of chloroform: methanol (1: 1) as solvents developers and yes? obtained cos? a mixture of a conjugate of sulfonylidocaine aminofluorescein having the general formula:

ESEMPIO II EXAMPLE II

A 1 , 2 g di fenobarbitale si sono aggiunti lenta -mente 4,5 g- di acido clorosolfonico e si ? riscaldata la mi scela cos? ottenuta a 60?C per 1 ora? Si ? quindi raffredda ta la miscela di reazione e si sono aggiunti alla miscela di reazione ghiaccio tritato e acqua per distruggere l 'acido clorosolfonico eventualmente non reagito. Si ? quindi fil tr?ta la miscela di reazione ottenendo un precipitato bianco che ? stato lavato con acqua e ? stato essiccato in un essicicatore sotto vuoto ottenendo cos? 0, 8 g di una miscela di meta- e para-clorosolfonilfenobarbitale avente un punto di fusiOne di 190-195?C.Ad una soluzione contenente 5 mg di 5-amminofluoresceina in 0, 5 mi di piridina si sono aggiunti 5 mg della miscela di cui sopra di clorosolfonilfenobarbi -tale? Dopo 10 minuti , si ? formato un prodotto grezzo che ? stato purificato due volte adottando tecniche di cromatografia su strato sottile impiegando gel di silice e una miscela di cloroformio metanolo ( 2: 1 ) come solvente sviluppatore e si' ? ottenuto cos? un coniugato solfonilfenobarbitale-amminofluoresceina avente la formula: 4.5 g of chlorosulfonic acid was added slowly to 1.2 g of phenobarbital and yes? heated, I choose it cos? obtained at 60? C for 1 hour? Yup ? then the reaction mixture was cooled and crushed ice and water were added to the reaction mixture to destroy any unreacted chlorosulfonic acid. Yup ? then filters the reaction mixture obtaining a white precipitate which is been washed with water and? been dried in a vacuum dryer obtaining cos? 0.8 g of a mixture of meta- and para-chlorosulfonylphenobarbital having a melting point of 190-195 ° C. To a solution containing 5 mg of 5-aminofluorescein in 0.5 ml of pyridine was added 5 mg of the mixture above of chlorosulfonylphenobarbs - such? After 10 minutes, yes? formed a raw product which? been purified twice by adopting thin layer chromatography techniques using silica gel and a mixture of chloroform methanol (2: 1) as developer solvent and yes? got cos? a sulfonylphenobarbital-aminofluorescein conjugate having the formula:

ESEMPIO III EXAMPLE III

A 2 g di ?-fenetil- -me tilsuccinnimMide si sono aggiunti goccia a goccia 2,5 g di acido clorosolfonico e si e sottoposta ad agitazione la miscela cos? ottenuta a 26?C per 1 ora. Alla miscela si sono aggiunti ghiaccio tritato e acqua per distruggere l?acido clorosolfonico eventualmente non reagito. Un prodotto di reazione che si era formato ? stato estratto due volte con porzioni da 10 ml di clorofor mio. Si sono riuniti gli estratti cloroformici, si sono anidrificati su solfato di sodio e si sono evaporati ottenendo cos? un prodotto oleoso pesante . Il prodotto oleoso ? stato cristallizzato da una mi scela di toluene e etere di petrolio ottenendo cos? 0, 29 g di una miscela di ? -(meta- e para-cloro solfonilfenetil) -? -metilsuccinimmide avente un punto di fusione di 145-1 50 ?C. Ad una soluzione contenente 5 mg di 4-amminofluoresceina in 0, 5 ml di piridina si sono aggiunti 5 mg della miscela d? cui sopra ottenendo cos? la ? -( clorosolfonilfenetil )? -metilsuccinimmide . Dopo 10 minuti , si ? formato un prodotto grezzo che ? stato purificato due volte adottando tecniche di cromatografia su strato sottile impiegando gel di silice e una miscela di cloroformio : metanolo ( 2: 1 ) come solvente sviluppatore e si ? ottenuta cos? una miscela di coniugato ?-(solfonilfenetil ) - ? -metilsuccinimmide-amminofluoresceina avente la formula: 2.5 g of chlorosulfonic acid were added dropwise to 2 g of? -Phenethyl- -methylsuccinnimMide and the mixture was stirred in this way. obtained at 26 ° C for 1 hour. Crushed ice and water were added to the mixture to destroy any unreacted chlorosulfonic acid. A reaction product that was formed? was extracted twice with 10 ml portions of chlorofor mine. The chloroform extracts were combined, dried on sodium sulphate and evaporated thus obtaining? a heavy oily product. The oily product? been crystallized from a mixture of toluene and petroleum ether obtaining cos? 0, 29 g of a mixture of? - (meta- and para-chloro sulfonylphenethyl) -? -methylsuccinimide having a melting point of 145-150 ° C. To a solution containing 5 mg of 4-aminofluorescein in 0.5 ml of pyridine was added 5 mg of the mixture d? above obtaining cos? the? - (chlorosulfonylphenethyl)? -methylsuccinimide. After 10 minutes, yes? formed a raw product which? been purified twice by adopting thin layer chromatography techniques using silica gel and a mixture of chloroform: methanol (2: 1) as developer solvent and yes? obtained cos? a conjugate mixture? - (sulfonylphenethyl) -? -methylsuccinimide-aminofluorescein having the formula:

ESEMPIO I V EXAMPLE I V

Ad una soluzione contenente 2 g di imminostilbene e 2 ml di trietilammina in 50 ml di cloroformio si sono aggiunti 1,5 g di metilossalilcloruro. Si ? posta sotto riflus so la miscela cos? ottenuta per 1 ora e quindi la si ? evapo rata a secco. Si ? ripreso il residuo in 50 ml di cloroformio e, quindi, lo si ? estratto con 50 ml di acqua. Si ? evapora to lo strato cloroformico fino a secco.Al residuo si sono aggiunti 100 ml di idrossido di sodio 2N e s? ? posto sotto riflusso la miscela cos? ottenuta per 30 minuti. Si ? raffred data la miscela a temperatura ambiente e, quindi, la si ? estratta con 50 ml di cloroformio. Si ? acidificato lo strato acquoso a pH 1 usando acido cloridrico concentrato e, quindi, lo si ? estratto con 100 ml di etere. Si ? anidrificato l'estratto organico su solfato di sodio e lo si ? evaporato a secco. Si ? ripreso il residuo in 50 ml di metanolo e lo si ? triturato con acqua ottenendo cos? un getto di cristalli. Si ? filtrata la miscela e si sono raffreddati i cristalli per 16 ore ottenendo cos? 2J4 g di N-idrossiossalil-imminostilbene (punto di fusione 162-163?C). 1.5 g of methyloxalyl chloride was added to a solution containing 2 g of iminostilbene and 2 ml of triethylamine in 50 ml of chloroform. Yup ? placed in reflus I know the mixture cos? obtained for 1 hour and then the yes? dry evaporation. Yup ? taken the residue in 50 ml of chloroform and, therefore, yes? extracted with 50 ml of water. Yup ? evaporated the chloroform layer until dry. 100 ml of 2N sodium hydroxide and s? ? place under reflux the mixture cos? obtained for 30 minutes. Yup ? cool due to the mixture at room temperature and, therefore, yes? extracted with 50 ml of chloroform. Yup ? acidified the aqueous layer to pH 1 using concentrated hydrochloric acid and, therefore, yes? extracted with 100 ml of ether. Yup ? dried the organic extract on sodium sulphate and yes? evaporated dry. Yup ? taken the residue in 50 ml of methanol and yes? shredded with water obtaining cos? a jet of crystals. Yup ? filtered the mixture and the crystals were cooled for 16 hours obtaining cos? 2J4 g of N-hydroxyoxalyl-iminostilbene (melting point 162-163 ° C).

A 5 mg del N-idrossiossalil-imminostilbene si ? aggiunta una soluzione contenente 5 mg di 4-amminofluoresceina in 0,5 ml di piridina. Si ? lasciata decorrere la reazione per 2 ore a 26 ?C ottenendo cos? un prodotto grezzo. Si ? purificato il prodotto grezzo effettuando una cromatografia su strato sottile impiegando gel di silice e una soluzione di sviluppo costituita da una miscela di cloroformio : acetone (1:1) e si ? ottenuto cos? il coniugato N-ossalil-imminostilbene/amminofluoresceina avente la, formula : At 5 mg of N-hydroxyoxalyl-iminostilbene yes? added a solution containing 5 mg of 4-aminofluorescein in 0.5 ml of pyridine. Yup ? left to run the reaction for 2 hours at 26 ° C, obtaining thus? a raw product. Yup ? purified the crude product by carrying out a thin layer chromatography using silica gel and a development solution consisting of a mixture of chloroform: acetone (1: 1) and yes? got cos? the N-oxalyl-iminostilbene / aminofluorescein conjugate having the formula:

Si sono preparati inoltre i traccianti che seguo no secondo i procedimenti indicati sopra: The following tracers were also prepared according to the procedures indicated above:

ESEMPIO V - Coniugati solfonilprimidone - amminofluoresceina EXAMPLE V - Sulfonylprimidone - aminofluorescein conjugates

ESEMPIO VI - EXAMPLE VI -

ESEMPIO VII EXAMPLE VII

ESEMPIO VIII EXAMPLE VIII

ESEMPIO IX - EXAMPLE IX -

ESEMPIO X - EXAMPLE X -

ESEMPIO XI - EXAMPLE XI -

ESEMPIO XII EXAMPLE XII

ESEMPIO XIII EXAMPLE XIII

ESEMPIO XIV EXAMPLE XIV

ESEMPIO XV EXAMPLE XV

ESEMPIO XVI - EXAMPLE XVI -

ESEMPIO XVII EXAMPLE XVII

ESEMPIO XVIII EXAMPLE XVIII

ESEMPIO XIX - EXAMPLE XIX -

ESEMPIO XX - EXAMPLE XX -

Come precedentemente indicato, i traccianti della presente invenzione sono reagenti efficaci per venire usati in immunosaggi di polarizzazione difluorescenza. Gli esempi che seguono illustrano la idoneit? dei traccianti della presente invenzione in immunosaggi nei quali si adottano tecniche di polarizzazione di fluorescenza. Si effettuano tali saggi secondo il seguente procedimento generale: As previously indicated, the tracers of the present invention are effective reagents for use in fluorescence polarization immunoassays. The following examples illustrate eligibility of the tracers of the present invention in immunoassays in which fluorescence polarization techniques are adopted. These tests are carried out according to the following general procedure:

1) Si introduce un volume misurato di standard oppure di siero in esame in una provetta e s? diluisce con una sostanza-tampone; 1) Is a measured volume of standard or serum under test introduced into a test tube and s? dilutes with a buffer substance;

2; Si aggiunge quindi a ciascuna provetta 2; It is then added to each tube

una concentrazione nota di un tracciante della presente inven zione contenente eventualmente un tensioattivo; a known concentration of a tracer of the present invention possibly containing a surfactant;

3) Alle provette si aggiunge una concentrazio. ne nota di antisiero; 3) A concentration is added to the tubes. notes of antiserum;

4) Si sottopone a incubazione la'miscela di reazione a temperatura ambiente; e 4) The reaction mixture is subjected to incubation at room temperature; And

5) Si misura la quantit? di tracciante legato all ?anticorpo adottando tecniche di polarizzazione di fluorescenza, come una misura della quantit? di ligando presente nel campione 5) Do you measure the quantity? of tracer bound to the antibody by adopting fluorescence polarization techniques, as a measure of the quantity? of ligand present in the sample

ESEMPIO XXI - Saggio della, lidocaina EXAMPLE XXI - Lidocaine assay

Sostanze Substances

1 ) Tampone: fosfato 0, 1M, pH 7,5, contenente 0, 01 % (peso/volume ) di sodio azide e 0,01 % (peso/volume) di gammaglobulina di bue (qui di seguito denominata "tampone BGG" 1) Buffer: 0.1M phosphate, pH 7.5, containing 0.01% (weight / volume) sodium azide and 0.01% (weight / volume) ox gammaglobulin (hereinafter referred to as "BGG buffer"

2) Tracciante: coniugato solfonillidocaina-amminofluoresceina (preparato nell?Esempio i) ad una concentra zione di molare tampone tris cloroidrato0,1M pH 7,8, contenente 0,1$ (peso/volume) di dodecilsolfato di sodio, 0,01% (peso/volume) di gammaglobulina di bue e 0,01% (peso/volume) di sodio azide 2) Tracer: sulfonylidocaine-aminofluorescein conjugate (prepared in Example i) at a molar concentration of 0.1M tris chlorohydrate buffer molar pH 7.8, containing 0.1 $ (weight / volume) of sodium dodecyl sulfate, 0.01% (weight / volume) of ox gamma globulin and 0.01% (weight / volume) of sodium azide

3) Anticorpo: antisiero di coniglio nei confron ti della lidocaina diluito 1 a 80 in tampone BGG. 3) Antibody: rabbit antiserum against lidocaine diluted 1 to 80 in BGG buffer.

4) Standard oppure prodotti non noti: siero umano (oppure altro fluido biologico) contenente lidocaina in un intervallo di concentrazione compreso tra 0 e 10 microgrammi/ml? 4) Standard or unknown products: human serum (or other biological fluid) containing lidocaine in a concentration range between 0 and 10 micrograms / ml?

5) Polarimetro a fluorescenza : strumento capace di misurare la polarizzazione di fluorescenza di una soluzione di fluoresceina unit? di polarizzazione? 5) Fluorescence polarimeter: instrument capable of measuring the fluorescence polarization of a solution of fluorescein unit? of polarization?

Protocollo Protocol

1) A 20 ?l di standard e sostanze non note aggiungere 200 ?l di tampone BGG? 1) To 20? L of standards and unknown substances add 200? L of BGG buffer?

2) A 20 ?l di ciascun standard diluito e ciascun prodotto non noto diluito in una provetta da coltura,aggiungere 200 ?l di tampone BGG. 2) To 20 µl of each diluted standard and each diluted unknown product in a culture tube, add 200 µl of BGG buffer.

3) A ciascuna provetta da coltura contenente standard diluito e prodotto non notodiluito aggiungere 40 ?l di 3) To each culture tube containing diluted standard and undiluted product add 40 µl of

tracciante e 100 ?l di tampone BGG. tracer and 100? l of BGG buffer.

4) Quindi aggiungere 40 ?l di anticorpo e 1000 ul di tampone BGG a ciascuna provetta da coltura. 4) Then add 40 µl of antibody and 1000 µl of BGG buffer to each culture tube.

5) Mescolare i reagenti e sottoporre a incubazione le prov?tte da coltura contenenti standard e prodotti non noti per circa 15 minuti a 23?C. 5) Mix the reagents and incubate the culture tubes containing standards and unknown products for approximately 15 minutes at 23 ° C.

6) Misurare la polarizzazione di fluorescenza di tutte leprovette . Risultati tipici per campioni standard sono presentati nella Tabella I. 6) Measure the fluorescence polarization of all tubes. Typical results for standard samples are presented in Table I.

TABELLA I TABLE I

I valori di polarizzazione decrescono all 'aumentare della concentrazione di lidocaina, consentendo di costru? re una curva standard. Le sostanze non note trattate in modo identi co possono venire rilevate quantitativamente riferendosi alla curva standard The polarization values decrease with the increase of the lidocaine concentration, allowing to build? re a standard curve. Identically treated unknown substances can be quantitatively detected by referring to the standard curve

ESEMPIO XXII - Saggio con fenobarbi tale EXAMPLE XXII - Essay with such phenobarbs

Sostanze Substances

1 ) Tampone BGG 1) BGG buffer

2) Traccianti: coniugato (para-metil-meta-solfonil fenobarbitale-amminofluoresceina (preparato nell?Esempio VII) ad una concentrazione di 5,75 x in colato di sodio al 5,75%? 2) Tracers: conjugate (para-methyl-meta-sulfonyl phenobarbital-aminofluorescein (prepared in Example VII) at a concentration of 5.75 x in 5.75% sodium cast?

3) Anticorpo: antisiero di coniglio nei confronti del fenobarbitale diluito 1 a 78,3 in tampone BGG. 3) Antibody: rabbit antiserum against phenobarbital diluted 1 to 78.3 in BGG buffer.

4) Standard oppure prodotti non noti: sirero umano-(oppure altri fluido biologico) contenente fenobarbitale in un intervallo di concentrazione compreso tra 0 e 80 ug/ml. 4) Standard or unknown products: human sirer- (or other biological fluid) containing phenobarbital in a concentration range between 0 and 80 ug / ml.

5) Polarimetro a fluorescenza: strumento capace di misurare la polarizzazione di fluorescenza di una soluzione di fluoresceina 1 x 10 M fino a 0,001 unita di polarizzazione. 5) Fluorescence polarimeter: instrument capable of measuring the fluorescence polarization of a 1 x 10 M fluorescein solution up to 0.001 polarization units.

Protocollo Protocol

1) A 20 ul di standard e di prodotti non noti ag giungere 200 ul di tampone BGG. 1) To 20 ul of standards and unknown products add 200 ul of BGG buffer.

2) A 20 ul di ciascun standard diluito e ciascun prodotto non noto diluito in una provetta da coltura aggiungere 200 ul di tampone GBB. 2) To 20 ul of each diluted standard and each unknown product diluted in a culture tube add 200 ul of GBB buffer.

3) A ciascuna provettada coltura contenente standard diluito e prodotto non noto diluito aggiungere 40 ul di tracciante e 1000 ul tampone BGG. 3) To each culture tube containing diluted standard and diluted unknown product add 40 ul of tracer and 1000 ul BGG buffer.

4) Quindi, aggiungere 40 ul di anticorpo e 1000 ul di tampone BGG a ciascuna provetta da coltura, 4) Then, add 40 ul of antibody and 1000 ul of BGG buffer to each culture tube,

5) Mescolare i reagenti e sottoporre a incubazio ne le provette da coltura contenenti standard e prodottinon noti per circa 15 minuti a 23?C. 5) Mix the reagents and incubate the culture tubes containing standards and unknown products for approximately 15 minutes at 23 ° C.

6) Misurare la polarizzazione di fluorescenza di tutte le provette. Risultati tipici per campioni standard sono rappresentati nella lamella II.? 6) Measure the fluorescence polarization of all tubes. Typical results for standard samples are represented in lamella II.

TABELLA II TABLE II

I valori di polarizzazione diminuiscono all 'aumentare della concentrazione di fenobarbitale consentendo di costruire una curva standard? Le sostanze non note trattate in modo identi co possono venire rilevate quantitativamente riferendosi alla curva standard? Do the polarization values decrease with increasing phenobarbital concentration allowing to construct a standard curve? Can unknown substances treated in an identi c way be quantitatively detected by referring to the standard curve?

ESEMPIO XXIII - Saggio con carbammazepina EXAMPLE XXIII - Assay with carbammazepine

Sostanze : Substances:

1 ) Tampone BGG. 1) BGG buffer.

2) Tracciante: coniugato N-ossalilimminostilbene? amminofluoresceina (preparato come descritto nell 'Esempio IV) ad una concentrazione di 2nM in tampone BGG contenente 0, 2% (peso/volume ) di colato di sodio . 2) Tracer: N-oxalyliminostilbene conjugate? aminofluorescein (prepared as described in Example IV) at a concentration of 2nM in BGG buffer containing 0.2% (weight / volume) of sodium cast.

3) Anticorpo : antisiero di coniglio nei confronti della carbammazepina diluito 1 a 3040 in tampone BGG. 3) Antibody: rabbit antiserum against carbammazepine diluted 1 to 3040 in BGG buffer.

4) Standard oppure prodotti non noti si ero usano (oppure altro fluido biologico) contenente carbammazepina in una concentrazione compresa tra 0 e 20 ug/ml. 4) Standards or unknown products (or other biological fluid) containing carbammazepine in a concentration between 0 and 20 ug / ml were used.

5) Polarimetro a fluorescenza: strumento capace di misurare la polarizzazione di fluorescenza di 1 x 10 -9 M di soluzione fluorescente fino a 0 ,001 unit? di polarizzazione. Protocollo : 5) Fluorescence polarimeter: instrument capable of measuring the fluorescence polarization of 1 x 10 -9 M of fluorescent solution up to 0, 001 unit? of polarization. Protocol :

1 ) A 10 ul di standard e di sostanze non note aggiungere 300 ul di tampone BGG. 1) To 10 ul of standards and unknown substances add 300 ul of BGG buffer.

2) A 10 ul di ciascun standard diluito e sostanza non nota diluito in una provetta da coltura aggiungere 300 ul di tampone BGG. 2) To 10 ul of each diluted standard and diluted unknown substance in a culture tube add 300 ul of BGG buffer.

3 ) Aggiungere 1 mi di tracciante a ciascuni provetta da coltura. 3) Add 1 ml of tracer to each culture tube.

4) Quindi aggiungere 1 ,0 ml di anticorpo a ciascuna provetta di coltura 4) Then add 1.0 mL of antibody to each culture tube

5) Mescolare i reagenti e sottoporre a incubazione le provette da coltura contenenti standard e sostanze non note per circa 1 5 minuti a 23?G. 5) Mix the reagents and incubate the culture tubes containing standards and unknown substances for approximately 1 5 minutes at 23? G.

6 ) Misurare la polarizzazione di fluorescenza di tutte le provette da coltura. Risultati tipici per campioni standard sono riportati nella Tabella 3. 6) Measure the fluorescence polarization of all culture tubes. Typical results for standard samples are shown in Table 3.

TABELLA III TABLE III

e And

I valori di polarizzazione diminuiscono all 'aumentare della concentrazione di carbammazepina , consentendo di co struire una curva standard. Le sostanze non note trattate in modo identico possono venire rilevate quantitativamente riferendosi alla curva standard. The polarization values decrease with increasing carbammazepine concentration, allowing a standard curve to be constructed. Identically treated unknown substances can be quantitatively detected by referring to the standard curve.

Nella Tabella che segue vengono riassunti i diversi immunosaggi a polarizzazione di fluorescenza che sono sta ti effettuati secondo i procedimenti precedentemente descritti impiegando i traccianti preparati negli esempi precedenti I traccianti impiegati sono identi ficati col numero dell 'esempio e sono indicati gii specifici ligandi determinati . The following table summarizes the different fluorescence polarization immunoassays which have been carried out according to the procedures described above using the tracers prepared in the previous examples. The tracers used are identified with the example number and the specific determined ligands are indicated.

Come ? evidente dai risultati indicati sopra, i traccianti della presente invenzione sono reagenti efficaci in immunosaggi a polarizzazione di fluorescenza. Oltre alle propriet? indicate sopra, i traccianti della presente inven How ? evident from the results indicated above, the tracers of the present invention are effective reagents in fluorescence polarization immunoassays. In addition to the properties? indicated above, the tracers of the present inven

Claims

1? Compound having the formula:

where R? a ligand-analog having a molecular weight ranging from 100 to 2000 in which said ligand-analog has at least one epitope common with said ligand so as to be specifically recognizable to a common antibody, and said ligand-analog has an aromatic carbon atom by which the ligand-analog? bound to the fluorescein sulfonamide moiety;

and its biologically acceptable salts

2. Compound according to the claim? 1 having the formula:

or

and its biologically acceptable salts 3? Compound according to claim 2 wherein R? derived from a ligand selected from the group consisting of steroids, hormones, anti-asthma products, antineoplastics, antiarrhythmics, anticonvulsants, antibiotics, antiarthritics, antidepressants and cardiac glycosides.

4. Compound according to claim 3 wherein R? derived from an antiarritinal?

5. Compound according to claim 4 wherein R? derived from lidocaine.

6. Compound according to claim 5 wherein R e

7 Compound according to claim 3 wherein R is derived from an anticonvulsant?

8. Compound according to claim 7 wherein R is derived from phenytoin.

9 Compound according to claim 8 wherein R and

10. Compound according to claim 7 wherein R? derived from primidone

11. Compound according to claim 7 wherein R

in which R '? alkyl having 1 to 4 carbon atoms.

12. Compound according to claim 7 wherein R? derived from ethosuximide.

13 Compound according to claim 12 wherein R

in which n? an integer between 0 and 3.

14. Composed of formul

where R? a ligand-analog having a molecular weight between 100 and 2000 in which said ligand-analog has at least one epitope in common with said ligand so as to be speci fically recognizable by a common antibody and said ligand analog? bound to the carboammidosolionylaminofluorescein portion by means of a hydroxyl oxygen atom or by means of a reactive amine;

and its biologically acceptable salts.

15 Compound according to claim 14 having the formula

or

or its biologically acceptable salts.

16. Compound according to claim 15 wherein R? derived from a ligand selected from the group consisting of steroids, hormones, antiasthmatic, antineoplastic, antiarrhythmic, anticonvulsant, antibiotic-antiarthritic, antidepressant and cardiac glycosides.

17. Compound according to claim 16 wherein R? derived from an anticonvulsant.

18. Compound according to claim 17 wherein R? derived from carbammazepine.

19. Compound having the formula indicated in claim 18 wherein R?

20. Compound according to claim 16 wherein R? derived from an antiarrhythmic.

21. Compound according to claim 20 wherein R? derived from procainam mide.

22, Compound according to claim 20 wherein n? derived from propanolol, 23. Compound having the formula

0 O H

R-C-C-N

// \

or OH

where R? a ligand-analog having a molecular weight between 100 and 2000 in which said ligand-analog has at least one common epitope with said ligand so as to be specifically recognizable by a common antibody and said ligand-analog has a reactive nitrogen by means of which the tying? analogous? bound to the oxalylaminofluorescein moiety;

and its biologically acceptable salts.

24. Compound having the formula:

or

and its biologically acceptable salts

25 Composed according to rev. 24 where R? derived from a ligand selected from the group consisting of steroids, hormones, antiasthmatics, antineoplastics, antiarrhythmics, anticonvulsants, antibiotics, antiarthritics, antidepressants and cardiac glycosides.

26. Composed according to rev. 25 where R? derived from an antidepressant 27? Composed according to the rev. 26 where R? derived from a tricyclic drug.

28. Composed according to rev. 27 where R? derived from nortriptyline, amitriptyline, imipramine or desipramine.

29 Composed according to rev. 28 where R? derived from a boast anticonvulsant.

30. Compound according to claim 29 wherein R is derived from carbammazepine. 31. Composed according to rev. 30 where R?

32. Method for determining ligands in a sample which consists in mixing with said sample a "biologically acceptable" salt of a trace having the formula:

where R? a ligand-analog having a molecular weight between 100 and 2000 in which said ligand-analog has at least one epitope common with said ligand so as to be specifically recognizable by a common antibody and said ligand-analog has an aromatic carbon atom by means of the which ligand-analogue? bound to the portion of sulfonamideofluorescein and an antibody capable of specifically recognizing said ligand and said tracer and, therefore, determine the quantity? of tracer bound to the antibody by means of fluorescence polarization techniques as a measure of the quantity? of ligand present in the sample.

33. Method according to claim 32 in which the sulfonamide group linked to the group R? also linked to the 4-position or the 5-position of the fluorescein portion.

34 Method according to rev. 33 where said ligand? a steroid, hormone, anti-asthmatic, antineoplastic, anti-arrhythmic, anticonvulsant, antibiotic, anti-arthritic, antidepressant, glycoside. cardiac or one of their metabolites.

35. Method according to rev. 34 in which R has a molecular weight between 50 and 4000.

36. Method according to rev. 35 where R has a molecular weight between 100 and 2000.

37 Method according to rev. 36 where said ligand? an antiarrhythmic.

38. Method according to rev. 37 where said antiarrhythmic? lidocaine.

39 Method according to rev. 38 where said ligand? an anticonvulsant.

40. Method according to rev. 39 where said anticonvulsant? phenytoin.

41. Method according to ziv. 39 where said anticonvulsant? primidone. 42. Method according to rev. 39 where said anticonvulsant? ethosuximide.

43 Method for determining ligands in a sample which consists in mixing with said sample a biologically acceptable salt of a tracer having the formula:

in between 100 and 2000 in. which said ligand-analog has at least one epitope common with said ligand so as to be specifically recognizable by a common antibody and said ligand-analog? linked to the portion of the carboamide group? sulfonylamine via a hydroxyl oxygen or via a reactive amine; and its biologically acceptable salts.

44 Method according to claim 43 wherein the carboamide disulfonylamine group bonded to the R group? also linked to the 4-position or the 5-position of the fluorescein portion.

45. Method according to rev. 44 where said ligand? steroid imo, hormone, antiasthmatic, antineoplastic, antiarrhythmic, anticonvulsant, antibiotic, antiarthritic, antidepressant, cardiac glycoside or one of their metabolites 46. Method according to claim 45 wherein R has a molecular weight between 50 and 4000.

47 Method according to claim 46 wherein R has a molecular weight between 100 and 2000.

48. Method according to rev. 47 in which said ligand? an anticonvulsant.

49 Method according to claim 48 wherein said anticonvulsant? carbammazepine.

50. Method for determining ligands in a sample which consists in mixing with said sample a biologically acceptable salt of a traccinate having the formula

where R? a ligand-analog having a molecular weight between 100 and 2000, in which said ligand-analog has at least one epitope common with said ligand so as to be specifically recognizable by a common antibody and said ligand-analog has a reactive nitrogen by means of which the ligand-analog? bound to the oxalylam? nofluorescein moiety; and its biologically acceptable salts.

51. Method according to rev. 50 in which the oxalylamine group bonded to the R group? also linked to the 4-position or the 5-position of the fluorescein portion.

52. Method according to rev. 51 where said ligand? a steroid, hormone, antiasthmatic, antineoplastic, antiarithraic, anticonvulsant, antibiotic, antiarthritic, antidepressant, cardiac glycoside or a metabolite thereof.

53. Method according to claim 52 wherein R has a molecular weight comprised between 50 and 40OO.

54. Method according to rev. 53 where R has a molecular weight between 100 and 2000.

55. Method according to rev. 54 where said ligand? an anticonvulsant.

56. Method according to rev. 55 where said anticonvulsant? carbammazopine.