IT8222589A1 - CULTURES PERFECTED FOR CELLULAR TISSUES - Google Patents
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Description
Titolo Perfezionamenti a colture di tessuti cellilari Titolo Perfezionamenti a colture di tessuti cellulari Title Improvements in cell tissue cultures Title Improvements in cell tissue cultures
Questa invenzione si riferisce a colture di tessuti cellulari. Nella produzione di tessuti di cellule animali,secondo la tradizione,le cellule venivano coltiva?e in bottiglie Roux e a rullo. Per ottenere grandi quantit? di tessuto, deve venir usato un forte numero di queste bottiglie,e ci? ? un lavoro assai pesante. This invention relates to cell tissue cultures. In the production of animal cell tissues, according to tradition, the cells were cultured in Roux and roller bottles. To obtain large quantities? of fabric, a large number of these bottles must be used, and there? ? a very heavy job.
La produzione di molti vaccini virali e di sostanze biochimiche,quali interferon, ormoni o altre, dipende dalla fortunata coltura delle oellule in un monostrayo attaccato alla superficie. Per grandi produzioni,si richiede quindi una grande area superficiale.Dato ohe ? stata prevista una produzione in scala maggiore,sono stati sviluppati sistemi operativi che offrono maggiori aree superficiali. The production of many viral vaccines and biochemicals, such as interferons, hormones or others, depends on the successful culture of the cells in a monostray attached to the surface. For large productions, a large surface area is therefore required. a larger scale production has been planned, operating systems have been developed that offer more surface areas.
In particolare,? disponibile un'unit? di elaborazione che comprende una aeree di dischi metallici montati in modo da ruotare con un albero,Questi dischi sono sistemati in un recipiente dotato di tubazioni di alimentazione e scarico per mezzi liquidi e gassosi. Per funzionare,il recipiente ? riempito di siero e sistemato con i dischi in piani orizzontali,perch? le oellule possano depo?itarsi sui piani.Il recipiente viene poi ruotato in modo che i dischi siano in piani verticali;essi sono parzialmente vuoti peSfornire uno sdazio di testa per l'aereazione.Poi,i dischi vengono fatti girare lentamente in vista della propagazione delle cellule,ed il loro successivo trattamento. In un altro tipo di apparecchio,le cellule sono coltivate e trattate in una serie di tubi. In particular,? a unit available? which comprises an area of metal discs mounted to rotate with a shaft. These discs are arranged in a vessel equipped with supply and discharge pipes for liquid and gaseous media. To work, the vessel? filled with serum and arranged with discs in horizontal planes, why? the cells can settle on the planes. The vessel is then rotated so that the discs are in vertical planes; they are partially empty to provide a head space for aeration. Then, the discs are rotated slowly in view of propagation. of cells, and their subsequent treatment. In another type of apparatus, the cells are cultured and processed in a series of tubes.
Un apparecchio di questo tipo ? costoso a preparare e non pu? venir modificato con prontezza secondo le esigenze di produzione. Anche acuurati controlli del processo non sono facili perch? il mezzo di coltura o il s?ero sono impiegati essenzialmente come in un processo discontinuo,e la temperatura e le altre variabili non rispondono facilmente a regolazioni dall'esterno. A device of this type? expensive to prepare and can not? be modified promptly according to production needs. Even careful controls of the process are not easy why? the culture medium or serum are used essentially as in a batch process, and the temperature and other variables do not respond easily to external adjustments.
Secondo il primo aspetto dell?invenzione,viene fornito un metodo per colture di tessuto di cellule animali,nel quale le cellule sono poste sulle piastre di imo scambiatore di calore a piastre e fra gli spazi operativi,delimitati dalle piastre, scorre,in circolazione continua, un mezzo di crescita. According to the first aspect of the invention, a method is provided for tissue culture of animal cells, in which the cells are placed on the plates of a plate heat exchanger and between the operating spaces, delimited by the plates, it flows, in continuous circulation. , a means of growth.
Preferibilmente,per la coltura nello scambiatore di calore, sono usati solo gli spazi alterni di flusso; gli spazi intermedi di flusso vengono usati per far circolare acqua o altro mezzo a temperatura controllata. Preferably, for the culture in the heat exchanger, only the alternate flow spaces are used; the intermediate flow spaces are used to circulate water or other medium at a controlled temperature.
In un secondo aspetto dell<1>invenzione,viene fornito un apparecchio per colture di tessuti di cellule animali,che comprende uno scambiatore di calore a piastre,sistemi per far circolare un mezzo di controlibo termico attraverso un gruppo di zone di flusso dello scambiatore di calore,dispositivi per far circolare un mezzo di crescita attraverso l'altro gruppo di zone di flusso, sistemi per rimuovere i gas dal mezzo c?rcolante di accrescimento dopo che esso ha abbandonato lo scambiatore di calore,sistemi per iniettare aria o ossigeno nel mezzo circolante, sistemi per iniettare sostanze inoculanti nel mezzo circolante e la fctrumentazione atta a misurare i parametri operativi per consentire il controllo del processo. In a second aspect of the invention, an animal cell tissue culture apparatus is provided, which includes a plate heat exchanger, systems for circulating a thermal control food medium through a group of flow zones of the heat exchanger. heat, devices for circulating a growth medium through the other group of flow zones, systems for removing gases from the growth medium after it has left the heat exchanger, systems for injecting air or oxygen into the medium circulating, systems for injecting inoculating substances into the circulating medium and the instrumentation to measure the operating parameters to allow the control of the process.
Si fa quindi uso di un?area superiiciaie relativamente glande disponibile in uno scambiatore di ca?ore a piastre,e si noti che l'aggiunta o la rimozione delle piastre ? relativamente semplice,sicch? l'area ?uperficiale disponibile pub venir rapidamente adattata,Incendo circolare un mezzo,a temperatura controllata,di riscaldamento o raffreddamento nelle zone intermedio di flusso,si pu? controllare la temperatura d?lia coltura,Se si usa una piastra a superficie oorrugata, come ? normale negli scambiatori di calore a pia?tre,le cellule introdotte all'inizio sono in grado di sistemarsi senza che ci sia bisogno di un ri-orientamente delle superfici grolle quali le cellule saranno coltivate. Poich? solo una piccola quantit? del mezzo totale in circolazione di accresoimento,? a contatto in ogni momento oon le cellule,il controllo del processo pu? essere fatto,trattando il mezzo fuori dello scambiatore di calore,p.es. in relazione al pH,al contenuto di ossigeno disciolto,ecc. Poich? gli scambiatori di calore a piastre sono facilmente disponibili come attrezzature standard in industrie quali fabbriche di birra e di prodotti caseari dove sono essenziali le operazioni igieniche,il costo dell'impianto ? inferiore a quello di altre sistemazioni a piastre per colture specificatamente indicate. We then make use of a relatively glans surface area available in a plate heat exchanger, and note that the addition or removal of the plates? relatively simple, so? the surface area available can be quickly adapted. By circulating a means, at controlled temperature, of heating or cooling in the intermediate flow zones, it is possible to check the culture temperature. If using a corrugated surface plate, how? normal in flat heat exchangers, the cells introduced at the beginning are able to settle down without the need for a re-orientation of the grolla surfaces which the cells will be cultured. Since? only a small amount? of the total mean in circulation of accretion ,? in contact at all times with the cells, the control of the process can? be done, by treating the medium outside the heat exchanger, eg. in relation to pH, dissolved oxygen content, etc. Since? plate heat exchangers are readily available as standard equipment in industries such as breweries and dairy factories where hygienic operations, plant cost are essential? lower than that of other plate arrangements for specifically indicated cultures.
Con l?espressione' scambiatore di calore a piastre? si intende Tino scambiatore di calore che comprende un pacco separabile di piastre con guarnizioni,di solito corrugate,sistemate una di fronte all'altra,per delimitare zone di passaggio fra piastre adiacenti.Le piastre preseitano fori allineati che costituiscono portelli o collettori per l'entrata e lo scarico di mezzi,da e verso le zone di flusso,in cui le guarnizioni comprendono guarnizioni di controllo del flusso fra i collettori ed i portelli e le zone di passaggio,normalmente in modo che un mezzo scorra attraverso zone alterne di passaggio e l'altro mezzo attraversi le zone intermedie di passaggio. Le parti corrugate possono incrociarsi fra loro e supporti interpiastra possono venir realizzati con cavit? o sporgenze compresse,In alternativa,e jfii? spesso, le parti corrugate di piastre adiacenti possono incrociarsi ed appoggiarsi fra loro per dare un supporto interpiastra su una molteplicit? di punti. With the expression plate heat exchanger? we mean Tino heat exchanger which includes a separable pack of plates with gaskets, usually corrugated, arranged one in front of the other, to delimit passage areas between adjacent plates. inlet and outlet of media, to and from the flow zones, where the seals comprise flow control seals between the manifolds and the hatches and passageways, normally so that a medium flows through alternate passage zones and the other vehicle crosses the intermediate passage areas. The corrugated parts can cross each other and interplate supports can be made with cavities. or compressed ledges, Alternatively, and jfii? often, the corrugated portions of adjacent plates can cross and rest against each other to provide interplate support on a multiplicity of plates. of points.
L'invenzione sar? ora desartitta con riferimento all'allegato disegno schematico in cui l'unica figura illustra un impianto per colture di tessuti a monostrato, usando uno scambiatore di calore a piastre come bioreattore di grande area superficiale. The invention will be? now described with reference to the accompanying schematic drawing where the single figure illustrates a single-layer tissue culture plant, using a plate heat exchanger as a large surface area bioreactor.
Il disegno fa vedere una forma di apparecchio per colture di tessuti a monostrato,in cui si usa uno scambiatore di calore a piastre 1,come bioreattore di grande area superficiale,Come ? usuale in uno scambiatore di calore a piastre,lo scambiatore di calore 1 contiene un pacco di piastre corrugate (non illustrate^ sistemate una di fronte all'altra e distanziate.Per ancorare le cellule,le piastre hanno punti di contatto fra piastre adiacenti sia incrociando che avvicinando gli elementi corrugati, sia sistemando sporgenze localizzate sugli elementi corrugati, che nominalmente forniscono il supporto interpiastra. The drawing shows a form of single-layer tissue culture apparatus, in which a plate heat exchanger 1 is used, as a large surface area bioreactor. How? usual in a plate heat exchanger, the heat exchanger 1 contains a pack of corrugated plates (not shown ^ arranged opposite each other and spaced apart. To anchor the cells, the plates have points of contact between adjacent plates either by crossing and by approaching the corrugated elements, both by arranging localized protrusions on the corrugated elements, which nominally provide the interplate support.
Questi punti di contatto forniscono un sicuro ancoraggio da cui le cellule possono diffondersi sulla superficie della piastra,quando si propagano. These contact points provide a secure anchor from which cells can spread to the surface of the plate as they propagate.
Oh serbatoio di attesa 2 per un mezzo nutritizio o di accrescimento ha una tubazione d'uscita 3 collegata ad una pompa 4,che fa passare il mezzo dal serbatoio 2 attraverso un gruppo di zone di flusso (illustrate in 5) dello scambiatore di calore 1. Dallo scambiatore 1,il mezzo tom a indietro attraverso un degassatore 6 fino al serbatoio 2 lungo una linea di ritorn o 7* Fra la pompa 4 ? lo scambiatore di calore 1,ci sono tubazioni di iniezione 8,9,10,11 che possono essere usate per mandare nel circuito vapore,aria o ossigeno,acqua ed una sostanza inoculata. A valle della pompa 4 c'? anche una linea di scarico 12. In parallelo al serbatoio 2,c'? un serbatoio 13 di immagazzina*? mento d'acqua,affinch? l?acqua,fornita da una tubazione 14?possa circolare mediante la pompa 4 attraverso lo scambiatore di calore 1. Oh holding tank 2 for a nutrient or growth medium has an outlet line 3 connected to a pump 4, which passes the medium from tank 2 through a group of flow zones (shown in 5) of heat exchanger 1 From exchanger 1, the half tom back through a degasser 6 to tank 2 along a return line 7 * Between pump 4? the heat exchanger 1, there are injection pipes 8,9,10,11 which can be used to send steam, air or oxygen, water and an inoculated substance into the circuit. Downstream of the pump 4 c '? also a drain line 12. In parallel to the tank 2, c '? a tank 13 of stores *? ment of water, so that? the water supplied by a pipe 14 can circulate by means of the pump 4 through the heat exchanger 1.
Il degassatore 6 pub avere p.es. la forma di un recipiente sotto vuoto,e serve a rimuovere aria e/o biossido di oarbonio dal mezzo circolante,in modo da evitare contaminazione da batteri aerobici e rimuovere i prodotti di scarto della crescita delle cellule entro lo scambiatore di calore 1.Aria o biossido di carbonio espulsi vengono fatti uscire attraverso un filtro d4 sterilizzazione 15? The degasser 6 can, for example, have the form of a vacuum vessel, and serves to remove air and / or carbon dioxide from the circulating medium, in order to avoid contamination by aerobic bacteria and to remove waste products of cell growth. within the heat exchanger 1. Are expelled air or carbon dioxide vented through a filter d4 sterilization 15?
La strumentazione per il controllo del processo comprende un misuratore di pH 1?,un manometro 17,ed un termometro 18.11 misuratore di pH 16 controlla l'iniezione di acidi o alcali correttivi,attraverso una linea 21 ed il manometro 17 controlla una valvola a pressione 22. The process control instrumentation includes a pH meter 1?, A manometer 17, and a thermometer 18.11 pH meter 16 controls the injection of corrective acids or alkalis, through a line 21 and the manometer 17 controls a pressure valve 22.
Le zone di flusso,fra quelle occupate dal mezzo circolante posseggono una circolazione d'acqua di riscaldamento o di raffreddamento realizzata mediante una pompa 23. Per esempio,l'acqua pu? venir Satta circolare attraverso uno scambiatore di calore 24 dove ? riscaldata con vapore mandato da una tubazione 25, attraverso una valvola 26 controllata dal termometro 18.Se si vuole raffreddare,via la linea 27,si pu? mandare acqua fresca o addirittura faffreddata, pompandola attraverso lo scambiatore di calore e poi scaricandola attraverso la valvola di drenag^ gio 28. The flow zones, among those occupied by the circulating medium, have a circulation of heating or cooling water achieved by means of a pump 23. For example, the water can? come Satta circulate through a heat exchanger 24 where? heated with steam sent from a pipe 25, through a valve 26 controlled by the thermometer 18. If you want to cool, via the line 27, you can? send fresh or even cooled water by pumping it through the heat exchanger and then discharging it through the drain valve 28.
Prima dell'avviamento,l'impianto illustrato deve venir sterilizzato sia con sterlizzanti chimici o,meglio,con vapore a ?2i?C,per 30 minuti,attraverso l'iniettore 8 Before start-up, the illustrated plant must be sterilized either with chemical sterilizers or, better, with steam at? 2i? C, for 30 minutes, through the injector 8
Nel serbatoio d?attesa 2 pu? venir introdotto,in modo asettico,un siero sterile di accrescimento.Nello stesso tempo,attra verso l'iniettore 11 viene iniettata la classe di cellule contenenti la sostanza inoculata da propagare,in quantit? sufficiente da riempire il lato dello scambiatore di calore 1, e da qui irrorare l'intera area superficiale della piastra. In the holding tank 2 can? a sterile growth serum is introduced aseptically. At the same time, through the injector 11 the class of cells containing the inoculated substance to be propagated is injected, in quantities? sufficient to fill the side of the heat exchanger 1, and from there to spray the entire surface area of the plate.
Volendo,aria sterile o ossigeno possono venir fatti gorgogliare attraverso il liquido inoculato,dall'iniettore 9. Data la natura corrugata delle piastre,nel caso della inoculazione, le cellule si disporranno naturalmente sulla superficie della piastra,e quindi non c'? bisogno di meccanismi di ri-orientamento o altro attacco di cellule come nel caso delle piastre piatte o dei dischi, I molti punti di contatto,piastra a piastra o sporgenza contro sporgenza, forniscono un sicuro ancoraggio,dal quale le;cellule possono espandersi sulla superficie della piastra. If desired, sterile air or oxygen can be bubbled through the inoculated liquid from injector 9. Given the corrugated nature of the plates, in the case of inoculation, the cells will naturally arrange themselves on the surface of the plate, and therefore there is no? need for mechanisms of re-orientation or other attachment of cells as in the case of flat plates or discs, The many points of contact, plate to plate or protrusion against protrusion, provide a secure anchorage, from which the cells can expand on the surface of the plate.
?ia vilt? ottenuta l?adesione delle cellule,il siero o il mezzo di crescita viene ricircolato dal serbatoio 2,mediante la pompa 4 dopo l?iniettore d'aria 9 e lo scambiatore di calore 1. Da qui,il siero ? fatto passare attraverso il dispositivo 6 di rimozione aria /CO2 allo scopo di eliminare la contaminazione con batteri aerobici e rimuovere i prodotti di scarto della crescita delle cellule?Viene inserito il filtro sterile 15 per evitare la fuga di organismi patogeni.il siero ? rimandato al serbatoio 1 ? ia vilt? Once cell adhesion has been achieved, the serum or growth medium is recirculated from tank 2, by pump 4 after air injector 9 and heat exchanger 1. Hence, the serum? passed through the air / CO2 remover 6 in order to eliminate contamination with aerobic bacteria and remove waste products of cell growth? Is the sterile filter 15 inserted to prevent the escape of pathogenic organisms. the serum? sent back to tank 1
Durante la fase di crescita delle cellule,le condizioni della coltura devono venir mantenute al livello ottimale.La introduzione di aria,attraverso l?iniettore 9 deve venir attentamente controllata,come pure il pH del siero.Aria o ossigeno ? distiolto nel mezzo circolante. Yiene mantenuto uno strettissimo controllo della temperatura mediante ricircolazione di acqua calda o fredda nel lato servizio delle piastre,mediante una pompa 23. During the growth phase of the cells, the conditions of the culture must be maintained at the optimum level. The introduction of air through the injector 9 must be carefully controlled, as well as the pH of the serum. Air or oxygen? dissolved in the circulating medium. Very strict temperature control is maintained by recirculating hot or cold water on the service side of the plates, by means of a pump 23.
Quando la fase di crescita delle cellule ? completa,? possibile iniettare,attraverso l'iniettore 11,una qualunque altra sostanza di inooulazione,p,es,un virus 0 un additivo,quale butirrato di sodio per stimolare la produzione di interferon. La rimozione del prodotto extracellulare ? ottenuta semplicemente drenando il mezzo attraverso la tubazione 12 e la valvola di controllo 12a. Se le cellule stesse devono venir raccolte,si ricicla acqua sterile dal serbatoio 13 ad alta velocit?,per indurre turbolenza nulle piastre di flusso 5 dello scambiatore di calore 1, strappando via le cellule dalla superficie. Le cellule in sospensione vengono allontanate Imago la tubazione 12, I vantaggi di questo sistema sono: When is the cell growth phase? complete ,? It is possible to inject, through the injector 11, any other inoculation substance, for example, a virus or an additive, such as sodium butyrate, to stimulate the production of interferon. Removal of the extracellular product? obtained simply by draining the medium through the pipe 12 and the control valve 12a. If the cells themselves are to be collected, sterile water is recycled from the tank 13 at high speed, to induce turbulence in the flow plates 5 of the heat exchanger 1, stripping the cells away from the surface. The cells in suspension are removed from the pipe 12, The advantages of this system are:
a) estesa area superficiale,fino ad un massimo di 1500 mq,per accrescimento di cellule in un volume piccolo; a) extended surface area, up to a maximum of 1500 square meters, for the growth of cells in a small volume;
b) superficie corrugata per una buona adesione delle cellule; c) area superficiale variabile,togliendo o aggiungendo piastre; d) buon controllo del prooesso dato il basso volume medio trattemito ed il flusso riciclante} b) corrugated surface for good cell adhesion; c) variable surface area, by removing or adding plates; d) good control of the process given the low average volume treated and the recycling flow}
e) basso costo dato l?uso di attrezzature standard. e) low cost given the use of standard equipment.
Per la pulizia,le cellule vengono fatte sloggiare dalle piastre e lavate all?esterno del sistema; segue un lavaggio con vapore e la sterilizzazione. Si evita la cottura. For cleaning, the cells are dislodged from the plates and washed outside the system; a steam wash and sterilization follows. Cooking is avoided.
Possono venir aggiunti altri dispositivi rivelatori, quali analizzatori per glucosio,ossigeno e biossido di carbonio. Other detector devices may be added, such as glucose, oxygen and carbon dioxide analyzers.
Varie modifiche possono venir fatte nei termini della invenzione . Various modifications can be made in terms of the invention.
-Domanda-di Brevetto -per -Invenzione Industriale dal -titolo ~Colture-perfezionate_per_tessuti-cellulari -Patent-Application -for -Industrial Invention with -title ~ Perfected-cultures_for_cellular-tissues
Riassunto Summary
.Per.produzioni in.scala piccola_di colture di tessuti cel .lulari,si usano normalmente__bottiglie_a rullo. Si tratta di un lavoro pesante rispetto alla quantit? di tessuto prodotto,per; cui si fa ricorso a bioreattori,che sono sorti per avere gran di aree superficiali. Secondo l'invenzione,viene prodotto un tessuto cellulare,specialmente a monostrato,sulle piastre di uno scambiatore d? calore a piastre,attraverso il quale circolaun mezzo di crescita con aria o ossigeno in soluzione.il mezzo_?_fatto circolare dal serbatoio (2) mediante una pompa (4) attraverso lo scambiatore di oalore (l) e ritorna al serbatoio (2) attraverso un'unit? di rimozione del gas(6) oon filtro sterile (15) . ha temperatura ? controllata facendo cir colare,mediante una pompa (55) acqua calda o fredda attraverso l'altro lato dello scambiatore di calore (l). For small scale productions of cellular tissue cultures, roller bottles are normally used. Is it a heavy job compared to the quantity? of fabric produced, for; which resorted to bioreactors, which arose to have large surface areas. According to the invention, a cellular tissue, especially monolayer, is produced on the plates of a d? plate heat, through which circulates a growth medium with air or oxygen in solution. a unit? gas removal (6) or with sterile filter (15). does it have temperature? controlled by circulating hot or cold water through a pump (55) through the other side of the heat exchanger (1).
_ Questa invenzione si riferisce a colture di tessuti di cellule This invention relates to cell tissue cultures
Nella produzione di tessuti di cell?le,secondo la tradizione le cellule vengono coltivate in bottiglie Eoux o a rullo, Per -ottenere- grandi -quantit? di -tessuto, deve essere usato-un -gran -numero-di? queste -bottiglie, e -ci? -? un -lavoro -assai-pesante.-Sono-stati proposti-molti-sistemi-diversi-per realizzarel'ingrandimento di_.colture_di-cellule?dm funzione delliancorag gio_per-cellule di animali,di piante e d: funghi che crescono ?n. mono strato attaccate._alla .superficie. La presente invenzione -intende.fornire un metodo,per eseguire la coltura,di_un _tessuto di cellule.e_1^apparecchio per..effettuare detto metodo. In the production of cellular tissues, according to tradition, the cells are grown in Eoux bottles or rollers. of -fabric, must-a-large-number-of-be used? these -bottles, and -ci? -? a -very-hard-work.-Have-been-proposed-many-different-systems-to achieve the enlargement of_cultures_of-cells? dm function of anchoring_for-cells of animals, of plants and d: growing fungi? single layer attached ._to .surface. The present invention is intended to provide a method for culturing a tissue of cells and apparatus for carrying out said method.
Come necessit? per la loro crescita,molte classi.di cellule presentano ima "dipendenza dall?ancoraggio" per una adatta superficie e,dato che il contatto cellula/celluda impedisceuna ulteriore crescita,si ? trovato una coltura completamento a_ monostrato,che_coprei_la superficie disponibile. Pertanto ? richiesta una grande area superficiale per alte produzioni di sostanze biochimiche, p_.es. vaccini per orecchioni,rosolia, _ Mareks,morbillo,influenza,parainfluenza e malattie respirato- _ torie dovute a classi di cellule,quali fibroblasti da embrioni di pulcino, cellule di reni di bovini,cellule di scimmie verdi e fibroblasti diploidi di polmone e pelle d'uomo. How is it necessary? for their growth, many classes of cells exhibit an "anchor dependency" for a suitable surface and, since cell / cell contact prevents further growth, yes? found a fully monolayer culture, which would cover the available surface. Therefore ? a large surface area is required for high productions of biochemicals, eg. vaccines for mumps, rubella, Mareks, measles, influenza, parainfluenza and respiratory diseases due to cell classes, such as chick embryo fibroblasts, bovine kidney cells, green monkey cells, and diploid lung and skin fibroblasts of man.
La produzione di molti vaccini virali e di sostanze biofahimiche , quali 11 interferon,! 1 ormone della crescita dell 'uomo, somatastatina,alfatimasina-1 e l'insulina dell'uomo,dipende The production of many viral vaccines and biophemic substances, such as 11 interferons,! 1 human growth hormone, somatastatin, alfatimasin-1 and human insulin, depends
dalla fortunata coltura di cellule animali in un monostrato_ attaccato alla superficie. Prodotti simili possono venir ottemiti da colture di tessuti di cellule vegetali e fungine. by the successful culture of animal cells in a monolayer attached to the surface. Similar products can be obtained from plant and fungal cell tissue cultures.
- Le -tecniche della-biologia-molecolare hanno prodotto_nuo-_ ve-classi-di-cellule_e_quindi si_sono creati nuovi tipi di pr?-_ duzione-e-sono stati_sviluppati^rocessi che offrono_grandi_ uuperfici.-In -particolare,esiste__un'unit?.di elaborazione che comp^en de-.una-serie di dischi-metallici montati in moto _da_ruotare_oon un_albero._Qaesti dischi sono_montati_in un recipiente dotato di tubazioni _di_.alimentazione e scarico,per mezzi liquidi e gassosi._Per funzionare,il recipienteeviene riempito di siero e sistemato in modo che idischi siano in piani orizzontali_ perche_le cellule possano depositarsi sui piani. Il recipiente viene ruotato in modo che i dischi siano in piani verticali: essi sono p>arzialmente vuoti per fornire uno spazio di testa per l?aereazione. Poi i dischi vengono fatti girare lentamente per la propagazione delle cellule ed il loro successivo trattamento. In un altro tipo di apparecchio,le cellule sono coltivate e trattate su una serie di tubi. - Molecular-biology-techniques have produced_y-six-classes-of-cells_and_therefore new kinds of production have been created_and_procedures have been_developed_ that offer_large_ surfaces. of processing which comprises a series of metal discs mounted in motion to rotate on a shaft. serum is arranged so that the discs are in horizontal planes so that the cells can settle on the planes. The vessel is rotated so that the discs are in vertical planes: they are partially empty to provide a head space for aeration. Then the discs are slowly spun for the propagation of the cells and their subsequent treatment. In another type of apparatus, the cells are cultured and processed on a series of tubes.
_ Un apparecchio di questo tipo ? di preparazione costosa e_non pu? venir modificato con prontezza secondo le esigenze della produzione. Anche accurati controlli del processo non sono facili,perch? la coltura ? essenzialmente un processo discontinuo e la temperatura e le altre variabili non sono facilmente adattabili a regolazioni dall?esterno. _ A device of this type? of expensive preparation and _ can not? be modified promptly according to production needs. Even accurate process controls are not easy, why? the crop? essentially a discontinuous process and the temperature and other variables are not easily adaptable to external regulations.
La presen?e invenzione supera queste difficolt?. The present invention overcomes these difficulties.
Secondo il primo aspetto dell* invenzione , viene descritto According to the first aspect of the invention, it is described
_ Opportunamente, un virus o altro additivo, ? addizionato al ! roezzo circolante di crescitaj duiante la circolazione _ Appropriately, a virus or other additive,? added to! circulating medium of growth by means of circulation
_ Inoculando il mezzod? crescita con un virus,si pu? realizzare in situ,!?infezione delle cellule.producendo cos? un i goccino. H virus pu? essere an'che usato per trasformare J.1_ ! itipo di cellula. Al "la colt'ura.pu? venir.aggiunta.u.n.a.sos.ta.-nza &i trasposizione plasmoide. In certi casi,possono essere richie sti altri additivi,quali antibiotici o un additivo quale sodio but irrato per stimolare la produzione di interferon. _ Inoculating the mezzod? growth with a virus, can you? to realize in situ,!? infection of the cells. thus producing? an i goccino. H virus can also be used to transform J.1_! cell type. The culture may be added to the plasmoid transposition. In some cases, other additives, such as antibiotics or an additive such as sodium butyrate, may be required to stimulate the production of interferon. .
_ Di preferenza. pel mezzo circolare di crescita, quando entra hello'scambiatore di calore,?.diBcio.lta.aria o ossige ?no.* _ Vengono.anche_forniti_dispositivi_per_allontanare aria,ossigeno o.biossido carbonio dal mezzo di.crescita,quando_esce_ dallo scambiatore di calore. _ _ Preferably. For the circular growth medium, when the heat exchanger enters, there is no. _
Injuna forma di.realizzazione,sono usati solo spazi alteri .ni di..flusso_per la ool tura; gli _spazi_ _ intermedi ..vengono . _u-_ sati per _far circolare l?acqua o .altro mezzo a_temperatura confrollata. In one embodiment, only alternate spaces of flow are used for the processing; the intermediate _spaces_ .. come. used to circulate the water or other medium at controlled temperature.
In una forma di realizzazione , si jottiene una^ variazione _ selezionata della area effettiva,dove erescono tessuti di cellui e animali, deviando l?inoculazione ed il mezzo di crescita attraverso?spazi_selezionati_di_flusso_nello_stesso scambiatore DI calore In one embodiment, a selected variation of the effective area is obtained, where cell and animal tissues erect, diverting the inoculation and growth medium through selected_flow_spaces_in the same heat exchanger.
Dividendo_lo_scambiatore__di_calore.,in due o .pi?_d.istifate regioni di accre sedimento l'inoculato iniziale pu? essere lievemente maggiorato j rima _del trasferimento asettico nell* intero scamBIatore di calore.Oh vantaggio di un simile_me todo ? che l? Bottocoltara,eresoendo in scala ridotta.pn? venir analizzata^ per det?rmlnaztoni morfologiche, cariologiche e di durata della vita .prima di fondare una coltura pi? grande. Se la Bottoeoitura dovesse imitare o essere inquinata. la si pu? _atlbandonare. _ la selezione pu? venir fatta con tuia griglia di raccordo. fEnjuna.forma di realizzazione. la velocit? di inoculazione e del mezzo di crescita ? sostanzialmente costante, in tutti gl spazi di flusso del processo. By dividing the heat exchanger into two or more established regions of accretion the initial inoculate can be slightly increased before the aseptic transfer in the entire heat exchanger. Oh, the advantage of such a method? what l? Bottocoltara, eresoendo on a reduced scale.pn? be analyzed for morphological, karyological and lifespan details before founding a larger crop. great. If the Bottoeoitura were to imitate or be polluted. can you? _atlbandon. _ the selection can? be made with your connecting grid. fEnjuna. form of realization. the speed? of inoculation and growth medium? substantially constant, in all the flow spaces of the process.
Con V elocit?' si intende sia la direzione che la portata de Influsso . E* stato trovato ohe-certe plas si_di_oellule ere- j soono meglio quando il mezzo di crescita scorre in direzione_ verso l'alto, lungo un monostrato attaccato ad una superficie verticale ,e che altri dipi di cellule preferiscono un mezzo discendente? Se s? ? c?rti che la velocit? della corrente ? sostanzialmente costante, si pu? mantenere ,su tutta la Buperficie della piastra, il flusso preferito per una particolare classe di cellule . With V elocit? ' we mean both the direction and the extent of the Influence. Has it been found that certain cells of cells are best when the growth medium flows upward along a monolayer attached to a vertical surface, and that other cell types prefer a descending medium? If yes? ? c? rti that the speed? of the current? substantially constant, you can? to maintain, over the entire surface of the plate, the preferred flow for a particular class of cells.
In una forma di realizzazione, l'area effettiva sulla qual^e i tessuti cellulari vengono fatti ereecere,0 aumentata mediante inserimentodi_un_elemento_in uno.o.pi?.spazi.di..flusso dello scambiatore di calore. In one embodiment, the effective area over which cellular tissues are created is increased by inserting one element into one or more flow spaces of the heat exchanger.
Aumentando.l'area .superficiale_con_un_inserto,pu?.essere aumentato il numero totale di cellule coltivabili nello fctesso scambiatore di oalore. By increasing the surface area with an insert, the total number of cells that can be grown in the actual heat exchanger can be increased.
l'inserto pu? essere una griglia dijpolipropilene,una rete di filo_diacciato inossidabile o una piastra metallica forata. the insert can? be a polypropylene grid, a stainless steel wire mesh or a perforated metal plate.
Introducendo uno dei^citati_inserti tra le piastre nella zona di flusso,la area auperficisle totale,disponibile per lo accresermento,pu? essere aumentata fino al 65?% per lo stesso volume interno_dello scambiatore. La grigliagli polipropilene ? _ meno costosa della rete o delle piastre metalliche,di acciaio inossidabile,ma ? meno adatta per mezzi dotati di un contenuto di solidi o altri componenti incrostanti,perch? le maglie sono pi? difficilmente pulibili e sterilizzabili. By introducing one of the aforementioned inserts between the plates in the flow area, the total surface area, available for augmentation, can be achieved. be increased up to 65% for the same internal volume_of the exchanger. The polypropylene grid? _ less expensive than mesh or metal plates, made of stainless steel, but? less suitable for vehicles with a content of solids or other encrusting components, why? the shirts are more? difficult to clean and sterilize.
l,'inserto pu? esseri. una piastra di uno scambiatore di calore,a piastre, l, the insert can? beings. a plate of a heat exchanger, with plates,
L?effetto di aggiungere le piastre inserite nel pacchetto ? di aumentare l'area superficiale della zona di flusso,del 100% o pi?,creando un numero di zone operative di flusso fra una coppia di zone di servizio. The effect of adding the plates included in the package? to increase the surface area of the flow zone, by 100% or more, by creating a number of operational flow zones between a pair of service zones.
In una,forma di realizzazione,l?adesione del tessuto cellulare alle superfici degli spazi operativi di flusso viene migliorata pretrattando le dette superfici. In one embodiment, the adhesion of the cellular tissue to the surfaces of the flow operating spaces is improved by pretreating said surfaces.
Il pretrattamento pu? comprendere la sabbiatura o la vetrificazione. delle _superfici_degli_.spazi operativi di flusso .La superficie _cos?_ "butterata fornir? adatte condizioni ambientali sia .per . l ' intrappolamento iniziale_ sia_per una buona adesione a lungo.termine per quelle cellule chenon aderiscono prontamente ad una superficie liscia. The pretreatment can? include sandblasting or vitrification. The pitting surface will provide suitable environmental conditions for both initial entrapment and good long-term adhesion for those cells that do not readily adhere to a smooth surface.
Il .pretrattamento ..pu? .comprendere. _la_ applicazione di un rivestimento superficiale alle superficl degli spazi opgrativi di flusso. The .pretreatment ..pu? .comprehend. The application of a surface coating to the surfaces of the opgrative flow spaces.
Hivestendo la superficie degli spazi operativi di flusso p.es. con polilisim ,istoni,protamina,collageno,gelatina,vetro o plastica al polistirolo con protoni estratti dai suoi gruppi aromatici superciciali,risulta aumentata l'affinit? della celiale per la superficie. By covering the surface of the flow operative spaces, for example with polylysim, histones, protamine, collagen, gelatin, glass or polystyrene plastic with protons extracted from its supercycial aromatic groups, the affinity is increased. of the celial for the surface.
_ Per ottenere il distacco delle cellule.dalla..superficie, si pu? usare.un agente proteolitico,quale.tripsina o.pronase. Un vantaggio..di uno.Boambiatoredi_calore.a.piastre come .recipiente di coltura ? che la temperatura pu? essere facilmente abbassata sotto 15?C,prima del trattamento.con l'agente pr? Neolitico. A temperatura inferiore a 15?Cj? fortemente ridotto l'accesso della tripsina e pronase ai componenti critici della cellula,_Inoltre,la bassa temperatura riduce il grado di adesivit? dela superficie dei bordi laterali delle cellule e aumenta l'esposizixme degli altri punti d'attacco. Questi effetti si combinano per ridurre sia le unit? richiesta di atti? vit? della tripsina e della pronase,sia il tempo di esposizione per-il-dlstacco, _ To obtain the detachment of the cells. From the .. surface, you can? use a proteolytic agent, such as tripsin or pronase. An advantage ... of one. Plate heat exchanger as a culture vessel? that the temperature can? be easily lowered below 15? C, before treatment. with the agent pr? Neolithic. At temperatures below 15? Cj? strongly reduced the access of trypsin and pronase to the critical components of the cell, _In addition, the low temperature reduces the degree of adhesiveness. dela surface of the lateral edges of the cells and increases the exposure of the other attachment points. These effects combine to reduce both units? request for documents? vit? trypsin and pronase, both the exposure time for the detachment,
In una f orma _di_realizzazione,l*ade sione del tessuto cellulare.alle superficidella zona..operativa.di flusso ? ridotta pre?rattando le superfici stesse. In one form of realization, the adhesion of the cellular tissue to the surfaces of the operative flow zone? reduced by pre-treating the surfaces themselves.
Iljretrattamento comprende 1'applicazione di un sottile film di rieoprimentodi ????, sulla superficie degli spazi operativi di flusso The treatment includes the application of a thin film of re-covering of ????, on the surface of the operational flow spaces
_ Questa superficie ? adatta._a cellule che richiedono solo una leggera aderenza alla superficie e possono venir rimosse facilmente. _ This surface? suitable for cells which require only a slight adhesion to the surface and can be removed easily.
In una formadi realizzazione,viene usato un gruppo a guam iai?ne doppia. In one embodiment, a double guamid assembly is used.
sono Quando^le cellule o il prodotto delle cellule di natura particolarmente pericolosa,lo scambiatore a piastre pu? essere costruito in una forma tale da impedire perdite di mat.eriale are When ^ the cells or the product of the cells of a particularly dangerous nature, the plate exchanger pu? be constructed in such a way as to prevent loss of material
pericoloso..nell'aria onel.mezzo_di_controllo_termico,attraverso la guarnizione di chiusura._Ci si riferisce al ns. bre vettp inglese No. 20628J3, dove ? descritto un intrinseco Bisteina._di_sicurezza^di chiusura a piastra,per evitare ogni fuga di fluidi pericolosi sia versol'atmosfera che verso il fluido di servizio. E'anche descritto un sistema di rivelazione per un immediato allarme di ogni perdita attraverso la guarnizione primaria. Ci? pu? essere molto importante se si tratta di colture di organismo altamente patogeni. dangerous..in the air onel.mezzo_of_controllo_termico, through the sealing gasket. br vettp english No. 20628J3, where? an intrinsic Bysteine is described as a safety plate closure, to avoid any leakage of dangerous fluids both towards the atmosphere and towards the service fluid. A detection system is also described for an immediate alarm of any leak through the primary seal. There? can be very important when dealing with highly pathogenic organism cultures.
In una forma di realizzazione,la lisi delle cellule at? caccate alla superflcie_? _e seguita in situ. In one embodiment, the lysis of the at? caccate to the superflcie_? _e followed in situ.
Con la lisi in situ delle cellule attaccate alla superficie si pu? recuperate il contenuto delle cellule. La lisi pu? essere provocata da un_gran numero di processi,quali l'infezione virale, ii^cambiatente della temperatura o una scossa osmotica. With the in situ lysis of the cells attached to the surface you can? recover the contents of the cells. The lysis can? be caused by a number of processes, such as viral infection, temperature change or an osmotic shock.
fin .un aecondo_aspetto dell'.invenzione,viene fomitoun_ap-_ parecchio_per colture di tessuti cellulari animali,che comprende uno scambiatore di calore a piastre,sistemi per far circolare un mezzo di controllo termico attraverso un gruppo^di zone di flusso dello scambliatore di calore,dispositivi per far circolare un mezzo di crescita attraverso l'altro gruppo di zone di flusso, sistemi per rimuovere i gas dal mezzo circolante di accrescimento dopo che esso ha abbandonato lo scambiatore di caloro,sistemi per iniettare aria o ossigeno nel mezzo circolante, Bistemi per iniettare la sostanza inoculante nel mezzo circolari te,e la strumentazione atta a misurare i parametri operativi per consentire il controllo del processo. In a second aspect of the invention, a number of animal cell tissue cultures are provided, which includes a plate heat exchanger, systems for circulating a thermal control medium through a group of heat exchanger flow zones. , devices for circulating a growth medium through the other group of flow zones, systems for removing gases from the circulating growth medium after it has left the heat exchanger, systems for injecting air or oxygen into the circulating medium, Bistemi to inject the inoculating substance into the circulating medium, and the instrumentation adapted to measure the operating parameters to allow the control of the process.
In certi casi p.es. nell'accrescimento di cellule patogeniche,le cellule inoculate con un patogeno o una classe di cellule crescono in presenza di una tossina o un carcinogeno; pu? essere desiderabile usare uno scambiatore di calore in cui le piastre adiacenti,ohe formano gli spazi per il flusso del mezzo operativo,sono saldate a coppie attorno la periferia delle piastre ed attorno ai fori passanti che formano le aperture attraverso cti passa il mezzo di servizio attraversando le coppie saldate di piastre,mentre le .zone di flusso per.il mezzo di ser vizio Bono chiuse da_cappucci .flessibili In certain cases, eg in the growth of pathogenic cells, cells inoculated with a pathogen or a class of cells grow in the presence of a toxin or carcinogen; can It would be desirable to use a heat exchanger in which the adjacent plates, which form the spaces for the flow of the working medium, are welded in pairs around the periphery of the plates and around the through holes which form the openings through which the service medium passes through. the welded pairs of plates, while the flow zones for the service medium are closed by flexible caps
Si impiega quindi l'area superficiale relativamente grande disponibile in uno scambiatore di calore a piastre,e si nota che con l'aggiunta o la rimozione_delle piastrejl'area superficiale disponibile pu? essere rapidamente adattata alla bisogna. Facendo circolare un mezzo a temperatura controllata,?i riscaldamento o raffreddamento nelle zone di flusso,si pu? controllare la temperatura della coltura.Se si usa una piastra a superficie corrugata,le cellule introdotte all'inizio sono in grado di sistemarsi senza che ci sia bisogno di un riorientamente delle superfici sulle quali le cellule saranno coltivate Poich? solo una piccola quantit? del mezzo totale di crescita che circola ? a contatto,in ogni -momento,con- le cellule il_con trollo del processo pu? essere fatto esaminando il mezzo fuori dallo scambiatore di calore,p.es. in relazione al grado nutritizio del pH, del contenuto di ossigeno disciolto,ecc. > L'invenzione sar? descritta con riferimento ai disegni schematici allegati, dove: The relatively large surface area available in a plate heat exchanger is then used, and it is noted that with the addition or removal of the plates the available surface area can be used. be quickly adapted to the need. By circulating a medium at a controlled temperature, heating or cooling in the flow areas, one can? control the temperature of the culture. If a corrugated surface plate is used, the cells introduced at the beginning are able to settle without the need for reorienting the surfaces on which the cells will be grown. only a small amount? of the total medium of growth that circulates? in contact, at any moment, with the cells, the control of the process can? be done by examining the medium outside the heat exchanger, eg. in relation to the nutritional degree of pH, dissolved oxygen content, etc. > The invention will be? described with reference to the attached schematic drawings, where:
la fig.1 ? un diagramma schematiepidi un apparecchio per coltura di cellule che esemplifica la presente invenzione} la fig.2 h un diagramma schematico di un altro apparecchio ?>er coltura di cellule, che esemplifica la presente invenzione; fig. 1? a schematic diagram of a cell culture apparatus exemplifying the present invention; FIG. 2 is a schematic diagram of another cell culture apparatus exemplifying the present invention;
la fig.J ? una vista di uno scambiatore di calore a pia?stre,smontato a pezzi;_ fig.J? a view of a plate heat exchanger, disassembled to pieces; _
la fig.4 ? un diagramma schematicodi due possibili inser _ ti,con i quali pu? essere aumentata l?area superficiale disponibile per_la crescita delle cellule. fig. 4? a schematic diagram of two possible inserts, with which can? the surface area available for cell growth be increased.
La fig.1 illustra,una forma di apparecchio per una coltura di un tessuto^ a qnonostratoj in cui si usa uno scam.b.iator 1A e 1B di calore a piastre,come_biorettaore ad alta area su perficiale. Come ? usuate in uno scambiatore di calore a pia stre, 1A e 1B contengono un pacco di piastre corrugate ( non illustrate) una di.fronte all'altra e distanziate. Per ancorare le cellule, le piastre hanno punti di contatto fra p?asire adiacenti formate sia.incrociando ohe affiancando gli .elementi corrugati,..sia sistemando fra gli elementi corrugat .delle tubazioni che.normalmente forniscono il supporto inter piastre. Questi punti di contatto forniscono un sicuro ancora^ gio_da cii le cellule possono diffondere sulla superficie della piastra,quando si propagano. FIG. 1 illustrates one form of apparatus for a non-layered tissue culture in which plate heat exchanger 1A and 1B is used as a high surface area biorettor. How ? Used in a plate heat exchanger, 1A and 1B contain a pack of corrugated plates (not shown) facing each other and spaced apart. To anchor the cells, the plates have points of contact between adjacent walls formed by either crossing or flanking the corrugated elements, or by arranging between the corrugated elements of the piping which normally provide interplate support. These points of contact provide a secure anchor that cells can diffuse onto the surface of the plate as they propagate.
Un serbatoio (2)-di-attesa.per un mezzo nutritizio di 1 accrescimento ha una tubazione_d'uscita (3) oollegata ad una' pompa-(4) che fa passare.di mezzo dal serbatoio (2),attraverso un -gruppo di zone di.flusso,(illustrate in 43) dello scambiatore-di calore (l). B?lio.scambiatore (l),il mezzo toma indietro attraverso un.dggassatore (6) fino al serbatoio (2) lungo una linea di ritorno (27) A holding tank (2) for a growth nutrient medium has an outlet_pipe (3) connected to a pump (4) which passes medium from the tank (2) through a group of flow zones, (illustrated at 43) of the heat exchanger (1). B? Lio.exchanger (1), the middle tends back through a degasser (6) to the tank (2) along a return line (27)
_ .ira la pompa (4)_e_lo scambiatore di calore 1A e 1B, c'?una linea di iniezione (?) che pu? essere usata per mandare aria o ossigeno nel circuito.Una linea di prelievo(28) si trovi a valle della pompa ^4).? serbatoio di stoccaggio (5) ? sistemato in parallelo al serbatoio (2),affinch? un mezzo secondario possa venir fatto circolare dalla pompa (4) attraverso lo scam biatore di calore (1? e 1B). H mezzo ? mandato al serbatoio (5) attraverso la tubazione (42). _ .ira the pump (4) _and_ the heat exchanger 1A and 1B, there is an injection line (?) that can? be used to send air or oxygen into the circuit. A sampling line (28) is located downstream of the pump ^ 4). storage tank (5)? arranged in parallel to the tank (2), so that? a secondary medium can be circulated by the pump (4) through the heat exchanger (1? and 1B). H half? sent to the tank (5) through the pipe (42).
Le entrate di vapore (9,10,11,12,13,14,15,16) servono a The steam entries (9,10,11,12,13,14,15,16) serve a
nterilizzare il sistema in situ,con vapore; le linee di condensa sono.17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Il dispositivo (6) di 'degasBazione pu? avere p.es. la forma di un recipiente a vuo-.to,e serve a rimuovere aria e/o biossido di carbonio e/o altri gas dal mezzo circolante,in modo da evitare contaminazione da batteri aerobici e rimuovere i prodotti di scarto della erescita delle cellule entro lo scambiatore di calore (1A e 1B). Aria o.biossido di aarbonio espulsi vengono fattijuscire attraverso un filtro di steriliazazione (7),che impedisce la fuga di organismi patogeni verso l'ambiente. sterilize the system in situ, with steam; the condensate lines are 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. The degassing device (6) can have the shape of a vacuum container, for example, and is used to remove air and / or carbon dioxide and / or other gases from the circulating medium, in order to avoid contamination by aerobic bacteria and remove waste products cell growth within the heat exchanger (1A and 1B). Expelled air or carbon dioxide are made to escape through a sterilization filter (7), which prevents the escape of pathogenic organisms to the environment.
Se non ? richiesto un dispositivo con degassatore,1'eccesso di aria dal.punto di iniezione_(9) pu? venir semplicemente : sfiatato dal serbatoio (2) attraverso un filtro (29) If not ? a device with degasser is required, the excess air from the injection point_ (9) can? simply: vented from the tank (2) through a filter (29)
misuratore di pH(30),un manometro (31 ) ed un termometro (32j) Il misuratore di pH(30) controlla 1'iniezione di acidi o alcali correttivi attraverso una linea (33),ed il manometro (31 ) con? trolla ima valvola a pressione (34)? pH meter (30), a manometer (31) and a thermometer (32j) The pH meter (30) controls the injection of corrective acids or alkalis through a line (33), and the manometer (31) with? trolls a pressure valve (34)?
Le-zone di-flusso,fra quelle_occupate_dal mezzo circolant posseggono-una-circolazione.d'acqua_di riscaldamento p di raffreddamento realizzata mediante_una.pompa (35)?Per esempio,la acqua pu? venir-fatta circolare attraverso uno scambiatore di ?alore (36) dove ?-riscaldata con vapore mandato dauna tubazione (3?) attraverso una valvola (38) controllata dal termome 'tro (32).Se si vuole raffreddare, attraverso la linea (^) si pu? mandare acqua fresca o addirittura raffreddata,pompandola attraverso lo scambiatore di calore e poi scaricandola attraverso la valvola di drenaggio (40). Do the flow zones, among those occupied by the circulating medium, possess a circulation of heating and cooling water carried out by means of a pump (35). be circulated through a? alue exchanger (36) where? -heated with steam sent from a pipe (3?) through a valve (38) controlled by the thermometer (32). If you want to cool, through the line ( ^) can you? send fresh or even cooled water, pumping it through the heat exchanger and then discharging it through the drain valve (40).
Prima dell1avviamento,1'impianto illustrato deve venir sterilizzato con sterilizzanti chimici o,meglio,con vapore a :121?C per 30 minuti,attraverso le entrate di vapore (9,10,11, 12,13,14,15,16). Before start-up, the illustrated system must be sterilized with chemical sterilants or, better, with steam at: 121 ° C for 30 minutes, through the steam inlets (9,10,11, 12,13,14,15,16) .
Nel serbatoio (2) pu? venir introdotto,in modo asettico, un mezzo sterile.di accrescimento contenente l'adatta sostanla di_inoculazione della classe di cellule. Questa sostanza inoculata viene caricata nella sezione 1A dello scambiatore di calore a piastre, in quantit? sufficiente da riempire il suo lato dello scambiatore di calore 1A a piastre e da qui, .irrigare l?area superficiale della piastra. In alternativa, dal serbatoio_(2)_pu? venir introdotto un mezzo sterile di accrescimento,ed inoculato con l?adatta classe di cellule per venir propagato al portellojii iniezione (44)? Volendo,aria sterile _o ossigeno possono venir fatti gorgogliare_attraverso ; il.liquido inoculato,mediante l'iniettore (8).In alternativa,il liquido da inoculare pu? venir introdotto in entrambe le sezioni (1A e 1B) dello scambiatore di calore a piastre.Data la natura corrugata delle piastre,nel caso della inoculazione,le ce_l 'Iurte si disporranno naturalmente sulla componente orizzontale della superficie della piastra,e quindi non c'? bisogno di meccanismi di riorientamento o altro attacco di cellule,come nel caso delle piastre piatte rispetto ai dischi. I molti punti di contatto,piastra a piastra o sporgenza contro sporgenza,forniscono un sicuro ancoraggio,dal quale le cellule possono espandersi sulla superficie della piastra. In ogni caso in cui si usa un inserto in uno o pi? spazi di flusso,le cellule rimangono attaccate alla superficie dell'inserto. In the tank (2) can a sterile growth medium containing the appropriate inoculation substance of the cell class is introduced aseptically. This inoculated substance is loaded into section 1A of the plate heat exchanger, in quantity? enough to fill its side of the plate heat exchanger 1A and from there, irrigate the surface area of the plate. Alternatively, from the tank_ (2) _pu? be a sterile growth medium introduced, and inoculated with the appropriate class of cells to be propagated at the injection port (44)? If desired, sterile air or oxygen can be bubbled through; the. inoculated liquid, through the injector (8). Alternatively, the liquid to be inoculated can? be introduced into both sections (1A and 1B) of the plate heat exchanger. ? need for reorientation mechanisms or other cell attachment, as in the case of flat plates versus discs. The many contact points, plate-to-plate or protrusion-to-protrusion, provide a secure anchor, from which cells can expand onto the surface of the plate. In any case in which an insert is used in one or more? flow spaces, the cells remain attached to the surface of the insert.
Una volta raggiunta l'adesione della cellula,il mezzo di inoculazione pu? venir drenato via.Il sistema viene ricaricato con mezzo fresco,che pu? essere riciclato attraverso 1A ,oppure 1A e 1B,affinch? le cellule aderenti possano crescere alla den sit? richiesta. Volendo,attraverso il portello -(s) pu? venir iniettata aria o ossigeno ,H dispositivo^di allontanamento aria_/CO (6) pu? venir attivato per evitare contaminazione da batteri aerobici ed eliminare prodotti di scarto della crescitajielle cellule. Il mezzo ? riciclato al serbatio (2). . Once cell adhesion has been achieved, the inoculation medium can? be drained away. The system is refilled with fresh medium, which can? be recycled through 1A, or 1A and 1B, so that? can adherent cells grow at den sit? request. If you want, through the hatch - (s) pu? be injected with air or oxygen, the air / CO removal device (6) can? be activated to avoid contamination by aerobic bacteria and eliminate growth waste products in cells. The middle ? recycled to the tank (2). .
Durante la fase di crescita delle cellule,le condizioni ; .della coltura devonovenir mantenute al livello ottimale.la introduzione di-aria sterile,attraverso-l'iniettore (8) deve venir attentamente controllata,come pure il_pH del mezzo.Aria o ossigeno sono-disciolti nel-mezzo circolante.Viene.mantenuto imo strettissimo controllo della -temperatura mediante circola? zione d'acqua calda o fredda nel lato servizio(4l) delle piaatre,mediante una pompa During the cell growth phase, the conditions; of the culture must be maintained at the optimum level. The introduction of sterile air through the injector (8) must be carefully controlled, as well as the pH of the medium. Air or oxygen are dissolved in the circulating medium. very strict control of the -temperature by means of circulating? hot or cold water on the service side (4l) of the plates, by means of a pump
. Se si sta usando solo la sezione inoculata 1A dello scam biatore di calore a piastre,una volta completata la crescita delle cellule,queste possono venir allontanate drenando il mezzo di crescita e ricaricando il sistema con una soluzione :di tripsina per liberare le cellule dalla superficie della pia stra ed infine aumentando la portata per creare una turbolenza ;nel flusso sulle piastre della sezione 1A onde staccare le cel_ lule_dalla superficie della piastra. . If only the inoculated section 1A of the plate heat exchanger is being used, once cell growth is complete, they can be removed by draining the growth medium and refilling the system with a trypsin solution to free the cells from the surface. plate and finally increasing the flow rate to create turbulence in the flow over the plates of section 1A to detach the cells from the surface of the plate.
La sospensione di cellule pu? allora veni caricata in entrambe le sezioni 1A e,1E dello scambiatore di calore a piastre,in modo da permettere la sistemazione delle cellule sp. tutta la superficie disponibile della piastra. A completamento del riattacco,si allontana la soluzione di tripsina ed il sistema ? ricaricato col mezzo di crescita. Si ripete il procedimento come detto,fino a che l'accrescimento delle cellule ? completo. The suspension of cells can? then you are charged in both sections 1A and 1E of the plate heat exchanger, so as to allow the accommodation of the sp cells. all available surface of the plate. Upon completion of the reattachment, is the trypsin solution and system removed? recharged with the growth medium. The procedure is repeated as mentioned, until the growth of the cells? full.
E' possibile iniettare un qualunque altro agente indut? tore,quale virus o un additivo,p.es. butirrato di sodio per stimolare la produzione dell'interieron. Is it possible to inject any other induction agent? tor, such as a virus or an additive, eg. sodium butyrate to stimulate interieron production.
La rimozione -dei -prodotti extracellulari ._? ottenuta drenando -completamente^ilmezzo . dal sistema. The removal -of -extracellular products ._? obtained by completely draining the medium. from the system.
Se .le.stesse-cellule devono_venir raccolte,si applica la stessa procedura di prima e la sospensione delle cellule ? eliminata alla fine,lungo la linea (28). If the same cells are to be collected, is the same procedure applied as before and suspension of the cells? eliminated at the end, along the line (28).
_ Un?alternativa all1iniezione di aria o ossigeno per aereat zione ? la sovrasaturazionedel mezzo con ossigeno, come detto nel ns. brevetto GB No. 2034_750? _ An alternative to the injection of air or oxygen for aeration? the supersaturation of the medium with oxygen, as mentioned in the ns. GB patent No. 2034_750?
Nella fig.2 ? illustrata un'altra forma dell?apparecchio per la coltura di cellule usando uno scambiatore di calore (50 a piastre. In fig. 2? another form of cell culture apparatus using a heat exchanger (plate 50.
un serbatoio del mezzo di crescita (51 ) dotato di agitatore (52),sonda termometrica (53) e di pH(54) venir sterilizzato con iniezione di vapore dal portello (-56). Il mezzo di crescita viene introdotto nel serbatoio da portello (55) Attraverso un altro portello (74) .si possono fare le correzioni del pH,ecc. a growth medium tank (51) equipped with stirrer (52), temperature probe (53) and pH (54) being sterilized by steam injection from the hatch (-56). The growth medium is introduced into the hatch tank (55) Through another hatch (74), pH corrections, etc. can be made.
Una valvola a tre vie (57) collega il serbatoio (51) ad un portello d?entrata(5B) della soluzione di racoolta e la pompa(59)? La pompa(59) fa circolare il mezzo di crescita dal recipiente attraverso i portelli di entrata e di uscita (60) nelle zone operative di ,flusso (61) dello scambiatore di calore.Il mezzo di crescita toma al serbatoio attraverso un flussimetro_(62). A three-way valve (57) connects the tank (51) to an inlet port (5B) of the racoolta solution and the pump (59)? The pump (59) circulates the growth medium from the vessel through the inlet and outlet ports (60) into the flow operating zones (61) of the heat exchanger. The growth medium returns to the reservoir through a flowmeter (62). ).
La parte superiore del serbatolo (51 ) pu? venir riempita di gas,attraverso la linea (63)e flussimetro (64).Nella /tubazione del gas (63) pu? venir inserito un filtro sterilizzante (65). Dal^portello (70) pu? venir prelevato un campione The upper part of the tank (51) can be filled with gas, through the line (63) and flow meter (64). a sterilizing filter (65) is inserted. From the ^ hatch (70) pu? a sample will be taken
- Le zone operative di flusso dello scambiatore di calore sono sterilizzate con vapore,introdotto dal portello (6?) e sca ricato come condensa dal portello (69). - The flow operating zones of the heat exchanger are sterilized with steam, introduced from the hatch (6?) And discharged as condensate from the hatch (69).
_ Illiquido da inoculare pu? venir introdotto nel sistema ; attraverso il portello_(60) per riempire le zone operative di flusso (6l)dello scambiatore di calore (50).La temperatura dei fluidi di processo e di servizio pu? essere misurata dalle sonde (66 e 67).Il gas di eccesso nel sistema pu? venir sfiatato attraverso il filtro di sterilizzazione (71).U fluido di servizio che circola nelle zone (72) pu? essere raffreddato o scaldato da una unit? (73)?? _ Illiquid to inoculate can? be introduced into the system; through the hatch_ (60) to fill the flow operating areas (6l) of the heat exchanger (50). The temperature of the process and service fluids can? be measured by the probes (66 and 67) .The excess gas in the system can? be vented through the sterilization filter (71). A service fluid circulating in the areas (72) can be cooled or heated by a unit? (73) ??
I vantaggi di questi due sistemi comprendono: The advantages of these two systems include:
1) estesa area superficiale fino ad un massimo di 1500 mq p?r accrescimento di cellule in un volume piccolo; 1) extended surface area up to a maximum of 1500 square meters for the growth of cells in a small volume;
2) superficie corrugata per una buona adesione delle cel(? lule; 2) corrugated surface for good cell adhesion (? Lule;
3) - area superficiale variabile,togliendo o aggiungendo piastre; 4) buon controllo del prooesso causa il basso volume medio trattenuto e flusso riciclante; 3) - variable surface area, by removing or adding plates; 4) good process control due to low average retained volume and recycling flow;
5) rapido_equilibrio termico che permette la ottimazione della formazione del prodotto e riduce al minimo le perdite di cellule durante il trasferimento fra le fasi di - inseminazione-e di-produzione; 5) rapid thermal equilibrium which allows the optimization of the formation of the product and reduces to a minimum the losses of cells during the transfer between the phases of - insemination - and of - production;
6) crescita e reoupero del prodotto in condizioni asettiche. 6) growth and recovery of the product under aseptic conditions.
La fig.3 -fa vedere i - pezzi -smontati di - uno scambiatore di calore a piastre. Le piastre(80,84) sono compresse fra una testata (81) ed un terminale (82). La griglia di collegamento (83) serve a separare le correnti del liquido processuale e del liquido di servizio sulle piastre .80 e-81,disponendo in effetti di due scambiatori di calore nello stesso telaio. Fig. 3 - shows the - removed - pieces of - a plate heat exchanger. The plates (80,84) are compressed between a head (81) and a terminal (82). The connection grid (83) serves to separate the streams of the process liquid and the service liquid on the plates 80 and 81, effectively having two heat exchangers in the same frame.
Con una.sistemazione sostanzialmente simile,il flusso del liquido nutritizio attraverso la sezione (??) (1A di fig.1) , come si vede in fig.3?linea a punti, pu? essere separato dal flusso del liquido nutritizio attraverso la sezione 84(lB di fig.l),come si vede in fig.3,linea continua, mentre il fluido di serv?zio(fig.3,linea a trattini) attraversa entrambe le se? zioni 80 e 84.. With a substantially similar arrangement, the flow of the nutrient liquid through the section (??) (1A of fig. 1), as seen in fig. 3? Line with points, can? be separated from the flow of the nutrient liquid through section 84 (1B of fig. 1), as seen in fig. 3, solid line, while the service fluid (fig. 3, dashed line) crosses both sections ? 80 and 84 ..
La fig.4 fa vedere,alcuni possibili inserti,che possono venir posti fra le piastre delle zone operative di flusso,per aumentare l'area superficiale disponibile alla crescita delle cellule. Fig. 4 shows some possible inserts, which can be placed between the plates of the flow operating zones, to increase the surface area available for cell growth.
La piastra metallica forata (90) ha dei buchi (91 ) nei quali trovano posto i punti di contatto delle piastre adiacenti che delimitano la zona di flusso.La piastra pu? essere,p. es. di acciaio inossidabile, titanio o altro metallo adatto. The perforated metal plate (90) has holes (91) in which the contact points of the adjacent plates that delimit the flow area are located. be, p. ex. of stainless steel, titanium or other suitable metal.
La griglia (92)._pu? essere di rete di filo d'acciaio inoasidatile o di polipropilene The grid (92) ._ can? be made of stainless steel wire mesh or polypropylene
Per-pulire,le-cellule-sono-Sfoggiate dalle-piastre e/o come descritto prima, lavate fuoridal sistema..Segue,.un.lavag gio con vapore e..la sterilizzazione_. Si evita la.cottura. - - Per comprendere meglio.l'invenzione,vengono presentati i sgguenti esempi. To-clean, the-cells-are-removed from-the-plates and / or as described above, washed out of the system. A steam washing and sterilization follows. Cooking is avoided. - - To better understand the invention, the following examples are presented.
Esempio 1 Example 1
L'apparecchio..descritto.prima,con una area superficiale disponibile per coltura di.cellule di.2 mq,con 24 piastre di acciaio inossidabile,fu usato per la coltura di fibroblasti umani,come segue: The apparatus described above, with a surface area available for cell culture of 2 m2, with 24 stainless steel plates, was used for the culture of human fibroblasts, as follows:
Lo scambiatore di calore e parte della tubazione associata che lo collega al serbatoio del mezzo di crescita furono sterilizzati per iniezione diretta di vapore e mantenuti a 1.05 kg/cmq per 60 minuti. Il_recipiente serbatoio,comprendente un recipiente di fermentazione in vetro e acciaio inossidabile della capacir? operativa -di 3-litri,unitamente,al.resto della tubazione e la pompa usata per la circolazione del mezzo di crescita furono sterilizzati in autoclave per 140 minuti a 1.05 kg/cmq. The heat exchanger and part of the associated tubing connecting it to the growth medium reservoir were sterilized by direct steam injection and kept at 1.05 kg / cm2 for 60 minutes. The reservoir, comprising a glass and stainless steel fermentation vessel of the capacity operating - of 3-liters, together with the rest of the tubing and the pump used for the circulation of the growth medium were sterilized in an autoclave for 140 minutes at 1.05 kg / cmq.
Lo scambiatore di calore fu raffreddato facendo passare acqua fredda nel lato della camiciaila temperatura fu stabilii zata a 36-37?C mediante circolazione d'acqua a temperatura con frollata,attraverso la camicia. Il serbatoio,il resto della ? tubazione e la pompa furono collegati allo scambiatore di calore,in modo asettico. The heat exchanger was cooled by passing cold water into the side of the jacket and the temperature was stabilized at 36-37 ° C by circulating the matured temperature water through the jacket. The tank, the rest of the? piping and the pump were connected to the heat exchanger, aseptically.
Una-inoculazione di-1.8x10- HRC-cellule umane di fibroblasti sospesa -in 2.7-litri di-mezzo -di-cresoita fu introdotta verso l?alto nella,camera di coltura delle cellule dello scarobiatore-di calore, fino a -ohe -la -camera fu completamente p?!aa. il- mezzo di -crescita usato era il mezzo di Eagle,con sali di Earle addizionati di -8/i-siero -bovino, aminoacidi -non essenziali e penioillina/streptomicina.Il-mezzo fu tamponato con 2.2 g bicarbonato -sodio per- litro , caricato -di biossido di carboilio- in aria, in presenza dell 'indicatore di _pH, feno-rosso _ Altri 3.1-litri di mezzo di crescita furono,aggiunti nel recipiente serbatoio,in modo asettico.H .tutto fu agitato;la . testa del.recipiente fu gassata con arie,al '5% biossido di carbonio,riscaldata e mantenuta.a.37-C._ An inoculation of-1.8x10- HRC-human fibroblast cells suspended in 2.7-liters of-cresoite-medium was introduced upward into the cell culture chamber of the heat-scarobiator, up to -ohe -the -room was completely p?! aa. the growth medium used was Eagle's medium, with Earle salts added with -8 / i-serum -bovine, non-essential amino acids and penioillin / streptomycin. The medium was buffered with 2.2 g bicarbonate -sodium per- liter, loaded -carboyl dioxide- in the air, in the presence of the indicator of _pH, pheno-red _ Another 3.1-liters of growth medium were added aseptically to the reservoir. H. everything was stirred; the . head of the vessel was gassed with air, at 5% carbon dioxide, heated and maintained. to 37-C._
_ II.,sistema..fu.lasciato indisturbato.a 3?C_per 24_ore,affinch?_le .cellule si attacchino alla superficie delle piastre dello scambiatore di calore. The system was left undisturbed at 3 ° C for 24 hours for the cells to stick to the surface of the heat exchanger plates.
Alla fine del periodo di attacco, il mezzo di crescita fu fatto circolare nel circuito che comprende il serbatoio,la pompa ed il lato di coltura delle cellule dello scambiatore di calore a 100-130 mi/minuto,per un periodo di 7 giorni,?n modo che il flusso fosse diretto verso l'alto attraverso lo scambiatore di calore ed in equicorrente con l'acqua della camicia.Alla fine,il mezzo fu drenato completamente dall'apparecchio e furono introdotti,asetticamente, 5*6 litri di mezzo fresco di crescita. Questo mezzo fresco di crescita,fu fatto_ circolare_aA 30-280 ml/minuto_per altri3-giorni. At the end of the etching period, the growth medium was circulated in the circuit comprising the reservoir, pump and cell culture side of the heat exchanger at 100-130ml / minute for a period of 7 days. so that the flow was directed upwards through the heat exchanger and in co-current with the jacket water.At the end, the medium was completely drained from the apparatus and 5 * 6 liters of fresh medium were introduced, aseptically of growth. This fresh growth medium was circulated at 30-280 mL / minute for another 3-days.
La circolazione del mezzo crescita.fu_fermata.Furono introdotti 3 litri di liquido salino_tamponato al fosfato per spostare il mezzo di crescita verso_.il_basso,attraverso lo scam biatore di calore,Il liquido salino tamponato al fosfato fu a sua volta spostato con 0.25/%tripsina in 1 li^ro di liquido. salino tamponato al fosfato. La camera di coltura delle cellule fu drenata completamente e Btantenuta 1 ora a 36-37?P mediante circolazione di acqua nella camicia. Tre aliquote di 2 litri di mezzo di crescita senza siero furono poi introdotti,in successione,in direzione verso l?alto nella camera di coltura cellule. Aria al 5% biossido d? carbo?io fu mandata ad intermittenza fra !Ogni aliquota,prima di drenare la camera dal liquido restante cpn l?aliquota successiva. The circulation of the growth medium was stopped. 3 liters of phosphate-buffered saline liquid was introduced to move the growth medium downwards through the heat exchanger. The phosphate-buffered saline liquid was in turn displaced with 0.25 /% trypsin in 1 liter of liquid. phosphate buffered saline. The cell culture chamber was drained completely and held 1 hour at 36-37? P by circulating water in the jacket. Three 2-liter aliquots of serum-free growth medium were then successively introduced upward into the cell culture chamber. Air at 5% dioxide d? carbo? io was sent intermittently between! each aliquot, before draining the chamber of the remaining liquid with the next aliquot.
Il numero delle cellule inoculate e raccolte fu determina to con un contatore Coulter e controllate con un emocitometro. The number of inoculated and harvested cells was determined with a Coulter counter and checked with a hemacytometer.
Esempio 2 Example 2
-Con il metodo dell?es.1-furono coltivati fibroblasti-umani -come segue: - With the method of example 1 - human-fibroblasts were cultured - as follows:
- Uno-scambiatore -di-calore_con 24-piastre_di_accia?o..inossidabile per-ima superficie-di..2-mq.disponibile alla coltura di cellule fu inoculato coni 135x10 .HRC..5 .di.cellule fibroblasti umane.Le cellule furono introdotte come sospensione in.un.mezzo di crescita,che comprende.un mezzo essenzial? minimo(Eagle) con tenente sali .di Earle addizionati di 8> %iero bovino,aminoacidi non essenziali,penicillina/streptomicina e 2.2.g/l di.bicarbonato di sodio. - A heat exchanger with 24 steel plates or stainless steel for a surface area of 2 sq m available for cell culture was inoculated with 135x10 HRC 5 human fibroblast cells. cells were introduced as a suspension in a growth medium, which includes an essential medium. minimum (Eagle) containing added Earle salts of 8>% bovine iero, non-essential amino acids, penicillin / streptomycin and 2.2 g / l of sodium bicarbonate.
. ...Il recipiente inoculato fu tenuto a 36?C per 17.5 giorni. Il volume..del mezzo di crescita fu aumentato a 5?? litri ed il mezzo di crescita fu fatto circolare attraverso la camera di coltura cellule a 100-200 mi/minuto,per un periodo di 5 giorni in modo che il flusso fosse diretto verso l?alio attraverso lo ;scambiatore di calore ed in controcorrente all'acqua nella camicia. Il mezzo di crescita fufrenato a sostituito con 5.8 li tri di mezzo fresco di erescitacche fu fatto circolare per altri 5 giorni. Il mezzo circolante fu aantenuto ad una temperatura di 34?5??C ed ossigenato facendo passare aria al 5 ?? CO nello spazio libero del serbat?io. Il pH del mezzo di crescita fu mantenuto con aggiunte di bicarbonato di sodio. . ... The inoculated vessel was kept at 36? C for 17.5 days. The volume of the growth medium was increased to 5 ?? liters and the growth medium was circulated through the cell culture chamber at 100-200 ml / minute, for a period of 5 days so that the flow was directed towards the alium through the heat exchanger and countercurrent to the water in the shirt. The growth medium was retained and replaced with 5.8 l tri of fresh erescitacche medium was circulated for a further 5 days. The circulating medium was maintained at a temperature of 34? 5 ?? C and oxygenated by passing air at 5 ?? CO in the free space of the tank. The pH of the growth medium was maintained with additions of sodium bicarbonate.
..Il mezzo di crescita fu lxvato dalla camera di coltura delle cellule con liquido salino tamponato al fosfato e le ce_l lude frurono preparate per 1?allontanemento dalla superficie di crescita lavando con 0.25% tripsina sciolta in liquido salino tamponato al fosfato. Dopo che tutte le soluzioni sono state R i v e n d i c a z i o n i The growth medium was removed from the cell culture chamber with phosphate buffered saline liquid and the cells were prepared for removal from the growth surface by washing with 0.25% trypsin dissolved in phosphate buffered saline. After all the solutions have been R i v e n d i c a z i o n i
1.) un metodo di coltivare un.tessuto cellulare cara tterizzato dal fatto che le cellule vengono, disposte,sulle piastre .di uno : scambiatore di calore a piastre e dal^fatto?chejun mezzo.di ere scita_?_fatto passare in circolazione continua.attraverso spazi operitivi delimitati dalle dette piastre. 1.) a method of culturing a cellular tissue characterized by the fact that the cells are arranged on the plates of a plate heat exchanger and by the fact that a medium of growth is passed into continuous circulation. .through operating spaces delimited by said plates.
2)_ Un metodo .secondo .la .rivendicazione .1 ,caratterizzato dal fatto _che,durante la circolazione,al mezzo circolante di erescita viene aggiunto un virus o.altro.additivo._ 2) A method according to claim 1, characterized by the fact that, during circulation, a virus or other additive is added to the circulating medium of growth.
5) .Un.metodo.secondo_la rivendicazionE 1o_2,caratterizzato dal.fatto che_aria o ossigeno.viene..sciolto_nel_mezzo circolante di crescita,quando esso entra.nello scambiatore.di calore. 5). A method according to claim 1 or 2, characterized by the fact that air or oxygen is dissolved in the circulating medium of growth as it enters the heat exchanger.
4) ...Un.metodo secondo la rivendicazione 1,2.0_3,caratterizzato dal fatto che vengono fomiti sozzi jper eliminare ossigeno o CO2 dal mezzo di crescita quando esso abbandona il detto scambiatore di calore. 4) ... A method according to claim 1,2.0_3, characterized in that filthy substances are supplied to remove oxygen or CO2 from the growth medium when it leaves said heat exchanger.
5) Un metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti,caratterizzato dal fatto che vengono usate solo zone alterne operative per la coltura e che altre zone di flusso vengono usate per la oircolazione di acqua o altro mezzo a temperatura controllata. 5) A method according to one of the preceding claims, characterized in that only alternate operative zones are used for the cultivation and that other flow zones are used for the circulation of water or other medium at controlled temperature.
6) Uh metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti,caratterizzato dal fatto che una variante selezionata nell'area effettiva su cui crescono i tessuti di cellule animali,? ottenuta separando il liquido,inoculato ed il mezzo di crescita mediante scelte zone di flusso nello scambiatore di calore,. 7) _Un metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti,caratterizzato dal fatto che la velocit? del liquido inoculato e del mezzo di crescita ? praticamente costante in tutte le zone operative di flusso. 6) A method according to one of the preceding claims, characterized in that a variant selected in the effective area on which the tissues of animal cells grow,? obtained by separating the inoculated liquid and the growth medium by means of selected flow zones in the heat exchanger. 7) _ A method according to one of the preceding claims, characterized by the fact that the speed? of inoculated liquid and growth medium? practically constant in all operational flow areas.
8) Ln metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti,ca -ratterizzato dal fatto che l'area effettiva,dove crescono i tessuti cellilari,? aumentata mediante un inserto in una o pi?. delle zone operative di flusso dello scambiatore di calore._ 9) ?? metodo secondo.una delle-rivendicazioni_preoedenti,ca?-ratterizzato dal fatto CHEL'adesione_dei_tessuti-cellulari-alla superficie della zona operativa_di_flusso.? migliorata_conjzn pretrattamento di queste superfici._ 8) The method according to one of the preceding claims, characterized in that the effective area, where the cellular tissues grow,? augmented by an insert in one or more ?. of the operational flow zones of the heat exchanger._ 9) ?? method according to one of the preceding claims, characterized by the fact that the adhesion of the cellular tissues to the surface of the operative flow zone. improved_withjzn pretreatment of these surfaces._
10) Un metodo secondo le rivendicazioni 1?8,caratterizzato dal fatto che l?adesione dei tessuti cellulari.alle superfici .della zona operativa di flusso ? ridotta mediante un-pretrattamento di queste superfici. 10) A method according to claims 1? 8, characterized by the fact that the adhesion of the cellular tissues to the surfaces of the operative flow area? reduced by pre-treatment of these surfaces.
11) Tft?metodo secondo tuia rivendicazione precedente,caratterizzato dal fatto che si usa un gruppo a doppia guarnizione,. 11) A method according to the preceding claim, characterized in that a double gasket unit is used.
:12) Uh metodo.secondo una rivendicazione precedente,caratteriz zato dal-fatto che la lisi-delie Cellule-attaccate alla super*? ficie ? eseguita in .sit : 12) A method according to a preceding claim, characterized by the fact that the lysis of the Cells attached to the super *? cool? performed in .sit
.13)--Un metodo-secondo una.delle-rivendicazioni precedenti,ca- : ratterizzato dal .fatto che _la composizione -del -liquido di ino- . -.culazione e del .mezzo -di crescita, le -temperature -dei fluidi -di processo, e di servizio, e le velocit? ..di -flusso sono .registrate .e controllate da un dispositivo elettronico di controllo .13) - A method according to one of the preceding claims, characterized by the fact that the composition of the-ino-liquid. -culation and medium-of growth, -temperature -of process and service fluids, and velocities ... of flow are recorded and controlled by an electronic control device
.1.4) .Oh apparecchio,per colture di tessuti cellulari,che comprende uno scambiatore di calore a.piastre,sistemi per far circolare un mezzo di_controllo termico attraverso un gruppo di . .. zone di flusso dello scambiatore di calore,sistemi per far circolare un mezeo di crescita attraversoJL?altro gruppo di zone di flussodispositivi per eliminare gas dal mezzo circolante di'_ crescita quando esce dallo scambiatore di calore dispositivi per.iniettare .aria o ossigeno nel mezzo Giocolante di-crescita,-caratterizzato dal .possedere sistemi per -iniettare liquido ino-.culante nel.mezzo di .circolazione,e.strumenti .per.misurare i -parametri operativi onde consentire il controllo-del processo.. 1.4) .O apparatus, for cell tissue cultures, which includes a plate heat exchanger, systems for circulating a thermal control medium through a group of. flow zones of the heat exchanger means systems for circulating a growth mezeo through another group of flow zones devices for removing gas from the circulating growth medium as it exits the heat exchanger devices for injecting air or oxygen. in the juggling growth medium, characterized by having systems for injecting inoculating liquid into the circulation medium, and tools for measuring the operating parameters in order to allow process control.
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