IT202100027581A1 - Peptide derivato da defensine ad attività antibatterica anche verso batteri multiresistenti ad antibiotici - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

?PEPTIDE DERIVATO DA DEFENSINE AD ATTIVIT? ANTIBATTERICA ANCHE VERSO BATTERI MULTIRESISTENTI AD ANTIBIOTICI?

La presente invenzione riguarda un peptide derivato da defensine e il suo uso come agente antibatterico, in particolare nel trattamento di infezioni

Introduzione-stato della tecnica

Le infezioni associate a batteri multiresistenti (MDR), come lo Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA), lo Pseudomonas aeruginosa multiresistente e l'Escherichia coli produttore di beta-lattamasi a spettro esteso (ESBL) rappresentano ancora una grande sfida a causa delle limitate opzioni terapeutiche. Si stima che solo in Europa ci siano 171.200 infezioni associate a MRSA ogni anno, che colpiscono sia adulti che bambini. Inoltre, gli alti livelli di E. coli produttori di ESBL e la crescente frequenza di resistenza ai principali antimicrobici ? una seria preoccupazione e riflette una continua perdita di efficacia nel trattamento dei pazienti con infezioni gravi (ad esempio, infezioni ematiche, del tratto urinario e intra-addominale).

L'emergere di questi ceppi batterici MDR ha pertanto aumentato i costi per la salute pubblica. La ricerca di sistemi pi? sofisticati per trattare efficacemente i batteri MDR ? oggi essenziale e rappresenta una delle principali sfide del 21mo<t >secolo. I peptidi antimicrobici cationici (CAMP) sembrano essere candidati promettenti per superare la resistenza ( Front Pharmacol 2014; 5: 105; Clin Immunol 2009; 135: 1-11).

I CAMP sono un grande gruppo di peptidi naturali a basso peso molecolare che svolgono un ruolo importante nell'immunit? innata della maggior parte degli organismi viventi, compresi invertebrati e vertebrati, che si sono sviluppati come parte del meccanismo immunitario protettivo primordiale ( , Cell Mol Life Sci 2006; 63: 1294-1313) con un ampio spettro di attivit? contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi, funghi e virus e anche attivit? citotossica contro le cellule tumorali. Le ?-defensine umane (hBDs) rappresentano una prima linea di difesa contro le infezioni causate da un ampio spettro di patogeni. L'espressione delle hBDs si trova nei tessuti dell'ospite pi? esposti ai microrganismi (come il tratto respiratorio e gastrointestinale) e nelle cellule del sistema immunitario (ad esempio macrofagi, linfociti, piastrine).

E? stato descritto un peptide Host Defense (HDP) all'interno della ?-Defensin 3 (hBD3) umana, denominata peptide ? ( Sci Rep 2015; 5: 18450, Tabella 1) perch? corrisponde al motivo ancestrale che si trova in tutti gli HDP stabilizzati a pi? disolfuri chiamato ?-core ( Yeaman MR. Proc Nat Acad Sci U.S.A 2004; 101: 7363-8 e Annu Rev Pharmacol Toxicol 2012; 52: 337-60; Yount NY. Nat Rev Microbiol 2007; 5: 727-40).

Il peptide ? mantiene tutte le propriet? chiave della hBD3 full-length in una struttura semplificata a singolo disolfuro, con un'accessibilit? sintetica molto pi? facile e un costo pi? favorevole ( Sci Rep 2015; 5: 18450;

J Pept Sci 2017; 23: 303-10; Molecules 2017; 22(7): 1217).

Il peptide ? ? una piccola molecola che mostra la maggior parte delle propriet? biologiche delle ?-defensine naturali a lunghezza intera. Analoghi di beta defensine utili per il trattamento di infezioni sono stati descritti in EP 2990 415 e in EP 2 077 274

Descrizione dell?invenzione

Si ? ora trovata una nuova sequenza peptidica caratterizzata da un cambiamento pi? sostanziale nella sequenza ?-core rispetto al full-length hBD3 che migliora l?attivit? del peptide ?. Il nuovo peptide ha una sequenza pi? breve e un minor numero di siti suscettibili di scissione da parte delle proteine del siero. Il nuovo peptide dell?invenzione ? pertanto stabile nel sangue, non ? citotossico, esercita un'efficace capacit? antibatterica sia contro i batteri planctonici che sessili e mostra un effetto battericida anche contro i ceppi batterici MDR Gram-positivi e Gram-negativi.

Il peptide dell?invenzione, denominato in seguito come peptide ?2, ha la seguente sequenza amminoacidica (SEQID1): Ac-CLPKRRQIGKSSTRGRKSCKK-NH2

Il peptide pu? presentarsi in forma ossidata o ridotta, entrambe attive.

L?invenzione ha anche per oggetto il peptide non acetilato e suoi derivati convenzionali.

Il peptide dell?invenzione ? utile per il trattamento di infezioni batteriche, in particolare per infezioni sostenute da batteri antibiotico-resistenti non trattabili con le terapie antibiotiche convenzionali. Allo scopo, il peptide o i suoi derivati saranno formulati in composizioni farmaceutiche con opportuni veicoli o eccipienti. Le composizioni dell?invenzione saranno preferibilmente somministrate per via parenterale, ad esempio intramuscolare, sottocutanea o endovenosa, in forma di soluzioni in solventi sterili iniettabili con concentrazione del peptide da 0.001 a 10% in peso. La dose del peptide sar? determinata dagli esperti del settore sulla base delle sperimentazioni pre-cliniche e cliniche. In linea di massima, in considerazione delle favorevoli caratteristiche farmaco-tossicologiche, la dose potr? variare, anche a seconda del peso, et? e gravit? del paziente, da 0.1 a 10 mg/Kg/die.

L?invenzione sar? descritta in dettaglio nella seguente parte sperimentale.

Sintesi peptidica. Sintesi e purificazione del peptide ?2

Peptide ?2 ? stato sintetizzato con tecniche di sintesi peptidica in fase solida con il protocollo (US-SPPS) utilizzando Fmoc/tBu (9-fluorenylmethoxycarbonyl/tert-butyloxycarbonyl) come riportato in Merlino F et al., Org Lett 2019; 21: 6378-82. Ogni peptide ? stato assemblato a 100 ?mol scala su una resina Rink Amide AM-PS da cicli iterativi di deprotezione Fmoc e reazione di accoppiamento ammide. Brevemente, il gruppo protettivo Fmoc ? stato rimosso trattando la resina due volte con una soluzione di piperidina al 20% in DMF (1 1 minuto con ultrasuoni). Le reazioni di accoppiamento sono state effettuate utilizzando un eccesso molare di aminoacido e COMU / Oxyma come partner di accoppiamento, in presenza di 6 volte l'eccesso molare di DIPEA come base, e irradiando per cinque minuti in un bagno ad ultrasuoni. Infine, il peptide ? stato acetilato con anidride acetica (due equivalenti) e DIPEA (4 equivalenti) in DMF. Il peptide ? stato rilasciato dalla resina trattando con un cocktail acido di scissione (soluzione TFA/TIS/Dithiothreitol 95:2.5:2.5) per tre ore e le miscele precipitate in etere etilico freddo, prima di essere centrifugato ed evaporato a secco. Il peptide lineare grezzo ? stato quindi ossidato utilizzando N-clorosuccinimide in una soluzione acquosa a 1 mM di concentrazione e poi liofilizzato. La miscela grezza ? stata purificata mediante HPLC preparativa a fase inversa (solvente A: acqua 0,1% TFA; solvente B: acetonitrile 0,1% TFA; dal 10 al 60% del solvente B in 25 minuti, velocit? di flusso: 10 mL minuto<?1>) e poi l'identit? dei picchi purificati confermata dall'analisi ESI-MS (range di massa 200-3000 m/z).

Ceppi batterici e condizioni di crescita

L'attivit? antimicrobica del peptide ?2 ? stata valutata contro Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 13762, e Staphylococcus aureus ATCC 6538 e contro isolati clinici multidrug resistant (MDR) di Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), E. coli produttore di ?-lattamasi a spettro esteso (ESBL), P. aeruginosa e Acinetobacter baumannii complex. L'identificazione degli isolati ? stata eseguita mediante spettrometria di massa utilizzando lo spettrometro di massa MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization) e mediante metodo di fenotipizzazione biochimica in un sistema VITEK <?>2 bioM?rieux

, secondo le istruzioni del produttore. Anche il profilo di suscettibilit? agli antibiotici ? stato valutato utilizzando il VITEK <?>2 bioM?rieux System. I microrganismi sono stati coltivati in brodo e in agar a 37 ?C. I terreni utilizzati erano BD Brain Heart Infusion broth (BHI) e BHI agar (OXOID, Basingstoke, Hampshire, Inghilterra), BD Trypticase Soy agar con 5% di sangue di pecora e MacConkey agar (OXOID, Basingstoke, Hampshire, Inghilterra). Gli isolati sono stati conservati congelati a -80?C in brodo BHI integrato con glicerolo al 10% (v/v) fino all'utilizzo e le colture di lavoro sono state attivate nei rispettivi brodi a 37?C per 15-18 h.

Saggio di assorbimento del SYTOX green mediante spettroscopia a fluorescenza

L?effetto del peptide ?2 sull?integrit? della membrana di S. aureus ATCC 6538 e P. aeruginosa ATCC 27853 ? stato valutato misurando l'entit? di accumulo intracellulare di SYTOX green ( Biochim Biophys Acta.

2015;1848(5):1081-91). Le cellule sono state raccolte a met? della fase logaritmica, lavate e risospese in 10 mM di tampone fosfato. La densit? finale ? stata regolata a 5?10<7 >CFU/mL. Le cellule sono state poi trattate con peptide ?2 (0.625, 1.25, 2.5, 12.5, 25 ?M) in presenza di 200 nM SYTOX green (Invitrogen). L?aumento della fluorescenza di SYTOX green, una misura diretta del grado di permeabilizzazione della membrana, ? stato monitorato in uno spettrofotometro a fluorescenza. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione utilizzate erano 503 nm e 523 nm, rispettivamente.

Saggio di attivit? antibatterica e saggio di cinetica di uccisione in vitro.

Sono stati eseguiti saggi di attivit? antibatterica del peptide ?2, sia in forma ridotta che ossidata, contro P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 13762, S. aureus ATCC 6538 e isolati clinici MDR. I ceppi sono stati coltivati in condizioni aerobiche in brodo BHI a 37?C e sono stati incubati con il peptide ?2 per 2 ore a 37?C. Sono state usate diverse concentrazioni di peptide da 1?M a 128?M. Ogni test ? stato eseguito in triplicato con tre colture indipendenti. La concentrazione minima inibitoria (MIC) e la concentrazione minima battericida (MBC) del peptide sono state determinate con una versione modificata del saggio di microdiluizione in brodo del Clinical and Laboratory Standards Institute utilizzando una concentrazione finale di inoculo di 10<5 >CFU/ml, come precedentemente descritto (Scudiero O et al., Antimicrob Agents Chemother 2010; 54: 2312-22; Scudiero O et al. Antimicrob Ag Chemother 2013; 57: 1701-8).

La MIC ? indicata dall'intervallo di concentrazione che comprendeva il limite superiore di crescita e la prima concentrazione che non poteva sostenere una crescita batterica visibile dopo l'incubazione. L? MBC ? stato definito come la concentrazione pi? bassa in cui non sono state osservate colonie vitali. Le concentrazioni del peptide erano 128.0, 64.0, 32.0, 16.0, 8.0, 4.0, 2.0 e 1?M. Per gli studi di time-kill contro i ceppi ATCC e MDR i batteri sono stati coltivati in brodo BHI fino alla tarda fase di crescita logaritmica a 37?C. Le sospensioni batteriche, contenenti circa 10<6 >CFU/ml (regolate dallo spettrofotometro a OD600nm) sono state diluite 1:100 in PBS1X e poi incubate a 37?C con o senza il peptide selezionato a concentrazioni corrispondenti a 1, 2 e 4X MIC (come determinato sopra). Al tempo basale e dopo 1, 2, 3 e 5 ore di incubazione ? stata raccolta un'aliquota di ogni campione, diluita in serie in PBS1X e seminata su agar BHI. Le piastre sono state incubate per 24-18 ore a 37?C e la conta dei batteri vitali ? stata eseguita con il metodo CFU. Tutti i dati sono stati espressi come media ?SD di tre esperimenti indipendenti.

Saggi antibatterici. Formazione e maturazione del biofilm

Il test di formazione di biofilm di S. aureus ATCC 6538 e P. aeruginosa ATCC 27853 ? stato condotto in piastre da 96 pozzetti come precedentemente riportato ( Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. 2005; Chapter 1: Unit 1B.1.)

In breve, i batteri da colture overnight sono stati diluiti e cresciuti fino a 0,5 McFarland. I batteri sono stati diluiti 1:100 e piastrati in ogni pozzetto contenente 100 ?L di brodo BHI. Per valutare l'impatto del peptide ?2 sulla formazione del biofilm, il terreno ? stato integrato con diverse concentrazioni di peptide (2.5, 12.5, 25 e 125 ?M) e incubato tutta la notte. Per valutare la maturazione del biofilm, i batteri delle colture cresciute tutta la notte sono stati diluiti 1:1000 e 5 ?L di queste sospensioni batteriche sono stati aggiunte ad ogni pozzetto, contenente 100 ?L di brodo BHI e fatti crescere tutta la notte. Il terreno ? stato quindi rimosso e sostituito da un terreno fresco contenente diverse concentrazioni del peptide (2.5, 12.5, 125 ?M). Alla fine dell'incubazione, il terreno ? stato rimosso; i biofilm sono stati lavati due volte con PBS e colorati con cristalvioletto (1%) per 30 minuti, poi risospesi in 200 ?L di etanolo. I controlli negativi erano batteri incubati con il solo mezzo. I controlli positivi erano batteri incubati in un terreno supplementato con gentamicina 0.42 ?M.

La formazione di biofilm di S. aureus ATCC 6538 e P. aeruginosa ATCC 27853 ? stata valutata anche attraverso l'imaging. Dopo che il terreno ? stato integrato con diverse concentrazioni di peptide (2.5, 12.5, 25 ?M) e incubato per una notte, i biofilm sono stati colorati con un kit di vitalit? del biofilm FilmTracer LIVE/DEAD (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Le immagini sono state acquisite con Cell Discoverer 7, Zeiss.

Cultura cellulare e studi di citotossicit?: Test MTT. Le cellule parentali HT-1080, HUVEC, i fibroblasti umani SH-SY5Y (HF) e A549 della Culture Cell Lines Facility CEINGE Biotecnologie , e le cellule HeLa (ATCC CCL-2) conservate in azoto liquido sono state scongelate agitando delicatamente le fiale per 2 minuti in un bagnomaria a 37?C. Dopo lo scongelamento, il contenuto di ogni fiala ? stato trasferito in una flasca da coltura per tessuti di 75 cm di superficie e diluite come segue: HT-1080, A549, SH-SY5Y e HeLa con il 90% di Dulbecco Modified Eagle's Minimal Essential Medium (DMEM), integrato con 10% di siero fetale bovino e 1% di L-glutamina; le cellule HUVEC sono state coltivate in Eagle Basal Medium (EBM) integrato con 4% FBS, 0.1% di gentamicina, 1?g/mL di idrocortisone, 10 ?g/mL di fattore di crescita epidermico e 12 ?g/mL di estratto di cervello bovino, e sono state impiegate tra il terzo e il settimo passaggio. Gli HF sono stati coltivati in coltura in terreno di Dulbecco (DMEM) integrato con 20% di siero bovino fetale e 1% di lglutamina.

Le cellule sono state incubate per 24 ore a 37?C in 5% CO2 per permettere loro di crescere e formare un monostrato nella beuta. Le cellule cresciute all'80-95% di confluenza sono state lavate con PBS, tripsinizzate con 3 mL di soluzione trypsin-EDTA 1X, diluite, contate e seminate (4x10 <3 >cellule/200 ?l per pozzetto) in piastre da 96 pozzetti per coltura di tessuti per 24 h in triplicato. La riduzione della proliferazione delle cellule ? stata valutata con il saggio 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) che permette la misurazione dei cambiamenti metabolici. Il giorno successivo, le cellule sono state incubate con o senza il peptide ?2 secondo diversi schemi: dopo 24, 48 e 72 ore di incubazione a 37 ?C a diverse concentrazioni, cio? 2.5, 12.5, 25 e 125 ?M. Le cellule aderenti sono state colorate con la soluzione di colorante MTT, cio? 20 ?L di soluzione stock MTT diluita 1:10 (5 mg/mL) e incubate per 4 ore. Dopo l'incubazione, si ? valutata la presenza dei cristalli viola che normalmente indicano la metabolizzazione dell?MTT. Il terreno ? stato quindi rimosso (180 ?L) e sono stati aggiunti 180 ?L di dimetilsolfossido per dissolvere i cristalli di MTT. La colorazione specifica eluita ? stata misurata con uno spettrofotometro (550 nm). L'indice di proliferazione delle cellule non trattate ? stato confrontato con quello del controllo negativo (cellula pi? mezzo senza peptide). L'inibizione percentuale delle cellule ? stata determinata utilizzando la seguente formula:

% Inibizione delle cellule = 100 - (Assorbanza delle cellule trattate/Assorbanza delle cellule di controllo) x 100. I valori sono medie ? SD di esperimenti in triplicato. Allo stesso modo, il test ? stato ripetuto su cellule HeLa con una concentrazione di peptide ?2 di 40 ?M dopo 6 ore di incubazione a 37?C.

I valori medi di inibizione percentuale delle cellule per ogni linea cellulare a diverse concentrazioni di peptide ?2 rispetto alle cellule non trattate sono stati analizzati utilizzando One-way ANOVA.

Attivit? emolitica

L'attivit? emolitica del peptide ?2 ? stata determinata contro le cellule di mammifero utilizzando eritrociti umani come descritto in precedenza (Evans BC et al J Vis Exp. 2013; 73: e50166) con lo scopo di valutare la sicurezza del nuovo peptide. In breve, il sangue umano intero (da un donatore sano) ? stato centrifugato a 500 ? g per 5 minuti a temperatura ambiente per isolare gli eritrociti. Le cellule sono state lavate due volte con una soluzione di 150 mM NaCl e successivamente gli eritrociti sono stati risospesi in un volume uguale di PBS 1X. Il campione ? stato tappato e capovolto alcune volte per mescolarlo delicatamente ed ? stato centrifugato a 500 x g per 5 minuti e risospeso in un volume uguale di PBS 1X. Gli eritrociti sono stati poi diluiti 1:50 aggiungendo 1mL di cellule a 49 mL di PBS1X e poi trasferiti in microprovette da 1,5 mL, insieme a 2.5, 12.5, 25 e 125 ?M del peptide ?2. Dopo l'incubazione a 37?C per 1 ora, i campioni sono stati centrifugati e il surnatante trasferito in una piastra a 96 pozzetti per misurarne la densit? ottica ad una lunghezza d'onda di 450nm. Il 20% di Triton X-100 (MCC-Medical Chemical Corporation) e PBS1X sono stati usati come controlli positivi e negativi, rispettivamente. La percentuale di emolisi ? stata calcolata utilizzando la seguente formula:

% Emolisi = (A450 trattamento con il peptide) - (A450 PBS1X) / (A450 Triton X-100) - (A450 PBS1X).

Saggi di migrazione cellulare.

I saggi di migrazione cellulare sono stati eseguiti come precedentemente descritto (Bifulco K et al., Mol Cancer Ther 2013; 2: 1981-93), utilizzando camere di Boyden e filtri in policarbonato senza polivinilpirrolidone con pori da 8 ?m che sono interposti tra un compartimento inferiore e uno superiore. In breve, la sospensione cellulare (1 x10<5 >cellule vitali/mL di terreno senza siero) ? stata seminata in ogni camera superiore. Le camere inferiori sono state riempite con DMEM solo, DMEM contenente 10nM N-formil-metionil-leucilfenilalanina peptide (fMLF) come controllo positivo o concentrazione crescente di peptide ?2. L'incubazione ? stata effettuata per 4 h a 37?C in aria umidificata con 5% CO2. Alla fine del test, le cellule sulla superficie inferiore del filtro sono state fissate con etanolo, colorate con ematossilina e 10 campi casuali/filtro sono stati contati ad un ingrandimento di 200X. L'entit? della migrazione cellulare ? stata espressa come percentuale della migrazione cellulare basale valutata in assenza di chemoattrattori, considerata come 100% (CTRL).

Misurazione delle citochine.

I surnatanti per la valutazione delle citochine sono stati raccolti da colture di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs) e analizzati con il Invitrogen ProcartaPlex bead-based immunoassay

utilizzando la piattaforma strumento Luminex (Luminex 200, Luminex Corporation), secondo le istruzioni del produttore. Il software xPONENT 3.1 (Luminex) ? stato utilizzato per l'acquisizione e l'analisi dei campioni.

Saggi di invasione e protezione con il peptide ?2.

I saggi di invasione di S. aureus ATCC 6538, MRSA ceppo 2 e MRSA ceppo 3 sono stati eseguiti come descritto in precedenza (Colicchio R et al., Antimicrob Agents Chemother 2015; 59: 7637-49; Spinosa MR et al. Infect Immun 2007; 75: 3594-3603). Per l'invasione standard e i saggi di vitalit? intracellulare sono state utilizzate HeLa cell (ATCC CCL-2). Le cellule sono state coltivate in DMEM con 2 mM L-glutamina. Le cellule sono state infettate ad una molteplicit? di infezione (MOI) di 50 per 1 h, lavate due volte con PBS1X per eliminare la maggior parte dei batteri extracellulari, esposte a gentamicina (Sigma-Aldrich) per uccidere i batteri extracellulari rimanenti, e successivamente distrutte utilizzando saponina (0,5%) per rilasciare i batteri intracellulari. Per quantificare gli stafilococchi intracellulari rilasciati dalle cellule HeLa, la sospensione cellulare lisata ? stata piastrata su agar BHI e il numero di CFU ? stato contato il giorno dopo. Quando richiesto, le cellule sono state reincubate nel terreno di coltura cellulare per vari tempi (3 e 5 ore) dopo il trattamento con gentamicina. Il trattamento con gentamicina ? stato eseguito utilizzando 105 ?M, una concentrazione 10 volte superiore alla MIC per 30 minuti a 37?C con 5% CO2. Le cellule sono state poi lavate abbondantemente con PBS1X per rimuovere la gentamicina e i batteri extracellulari morti e poi lisate o reincubate nel mezzo. Per valutare la protezione con il peptide ridotto ?2 dopo il trattamento con gentamicina, la molecola ? stata aggiunta al campione alla concentrazione finale di 40 ?M per 1 ora, successivamente lavata due volte con PBS1X e infine distrutta con saponina. L'attivit? antibatterica del peptide ?2 ridotto e ossidato contro S. aureus ATCC 6538 era sovrapponibile (Tabella 1), quindi solo la forma ridotta ? stata utilizzata nel test. In tutti gli esperimenti, i batteri sono stati centrifugati (60 x g) sulle cellule per iniziare il saggio. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e i dati sono stati espressi come media SD.?

Risultati

Attivit? antibatteriche del peptide ?2.

Per valutare l'attivit? antibatterica del peptide ?2, sia in forma ridotta che ossidata, sono state valutate diverse concentrazioni di ciascun peptide (da 1 a 128?M) contro batteri Gram negativi come P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 13762, batteri Gram positivi come S. aureus ATCC 6538 e contro i rispettivi isolati clinici MDR e anche contro due ceppi clinici A. baumannii. Le MIC dei peptidi sono state determinate mediante saggi convenzionali di microdiluizione in brodo. I valori MIC variavano da 2 a 4-8 ?M per tutti i microrganismi testati, con l'eccezione del ceppo 1 MDR di P. aeruginosa e del ceppo 1 di A. baumannii che sono resistenti fino a una concentrazione di 32-64 ?M di entrambe le forme di peptide (Tabella 1)

Tabella 1 attivit? antimicrobica di peptide ?2

<a>MIC, minima concentrazione inibente espressa come concentrazione ?M di Peptide; <b>MBC, minima concentrazione battericida espressa come concentrazione ?M di Peptide; <c>ATCC, American Type Culture Collection; <d>MRSA, methicillinresistant Staphylococcus aureus; <e >ESBL, extended-spectrum beta-lactamase; <f>MDR, multidrug-resistant.

Il peptide ?2 ha esercitato forti effetti antibatterici contro S. aureus ATCC 6538 e contro tutti i ceppi MRSA testati. ? interessante notare che entrambe le forme ridotte e ossidate del peptide hanno mostrato forti effetti inibitori e battericidi sia contro batteri Gram positivi (S. aureus) sia contro batteri Gram negativi (E. coli, P. aeruginosa, A. baumannii) e tutti gli isolati clinici MDR (tabella 1). Infine, il ceppo clinico 2 di A. baumannii multiresistente ai farmaci ha mostrato un profilo sensibile sia alla forma ossidata che a quella ridotta con valori MIC di 4 ?M e 1 ?M, rispettivamente.

Valutazione dell'attivit? antimicrobica del peptide ?2 tramite il test Time-Killing.

Sulla base della maggiore attivit? antimicrobica, il peptide ?2 ridotto ? stato selezionato per eseguire studi time-kill contro ceppi MDR rappresentativi. I ceppi ATCC di riferimento sono stati utilizzati anche come controllo interno. I dati relativi all'attivit? antimicrobica del peptide selezionato sono stati mostrati nella Figura 1 e Figura 2. Come mostrato dopo 2 ore di incubazione con il peptide ?2 tutti i ceppi MRSA, i ceppi ESBL di E. coli e i rispettivi ceppi di riferimento ATCC hanno mostrato una totale diminuzione della crescita per tutto il periodo di osservazione, a concentrazioni di peptide corrispondenti alla MIC (Figura 1 e Figura 2 A-C). Invece, sia il ceppo P. aeruginosa ATCC 27853 che il corrispondente ceppo MDR 2, alla concentrazione di peptide antimicrobico corrispondente solo alla MIC hanno mostrato una riduzione iniziale della crescita e della vitalit? nelle prime ore di osservazione, viceversa a tempi prolungati (5 e 7h) si ? osservata una leggera ripresa della crescita e della vitalit? per entrambi i ceppi (Figura 2 D, E). ? interessante notare che a concentrazioni del peptide ?2 corrispondente a 2xMIC non c'era crescita per entrambi i ceppi (Figura 2 D, E). Infine, per il ceppo A. baumannii MDR 2 il saggio ha mostrato una forte diminuzione della crescita e della vitalit? dopo le 2 ore di trattamento con il peptide ?2 e un leggero recupero della crescita e della vitalit? a tempi di osservazione prolungati anche a concentrazioni di peptide corrispondenti a 4xMIC (Figura 2 F).

Permeabilizzazione di S. aureus e P. aeruginosa indotta dal 2 peptide E?stata valutata la capacit? del peptide ?2 di permeabilizzare S. aureus ATCC 6538 e P. aeruginosa ATCC 27853 (Figure 3 A e B). La permeabilizzazione SYTOX Green ? stata valutata 15, 40, 60 min dopo l'aggiunta di SYTOX Green e il peptide ?2 a diverse concentrazioni (0.625, 1.25, 2.5, 12.5, 25 M). Il peptide ?2 ha causato un aumento dell'afflusso di SYTOX Green gi? dopo 15 minuti di incubazione per P. aeruginosa, mentre per S. aureus, era evidente dopo 40 minuti di incubazione. Il peptide ? stato efficace nel permeabilizzare entrambi i batteri gi? a una dose di 1.25 M e in modo dipendente dalla dose, con l'effetto pi? rilevante alla dose pi? alta e il tempo massimo di esposizione.

Valutazione dell'attivit? antimicrobica del peptide ?2 sulla formazione e maturazione del biofilm.

In risposta a vari stress, i batteri possono formare biofilm, una comunit? di microbi racchiusi in una matrice autoprodotta che spesso contiene polisaccaridi, DNA e proteine, adesa alle superfici, dando origine a infezioni croniche resistenti al trattamento antimicrobico, antibiotici e particolarmente difficili da trattare.

La MIC per il peptide ?2 contro S. aureus ATCC 6538 e P. aeruginosa ATCC 27853 planctonici variava tra 1-2?M sia per la forma ridotta che ossidata. Pertanto, lo stesso peptide ? stato testato per l'inibizione della formazione e della maturazione del biofilm (Figura 4). Il peptide ha inibito significativamente la formazione e la maturazione di biofilm sia di S. aureus ATCC 6538 che di P. aeruginosa ATCC 27853 (Figura 4), a concentrazioni leggermente superiori a quelle della MIC per i batteri planctonici. L'attivit? del peptide ?2 era dose-dipendente, con la massima attivit? a 125 ?M, in particolare, l'attivit? del peptide ?2 era molto forte durante la fase di formazione del biofilm (Figura 4A e B). Come controllo, ? stata impiegata gentamicina.

Inoltre, per valutare se il peptide ?2 diminuisce il volume dei biofilm di S. aureus ATCC 6538 e P. aeruginosa ATCC 27853, i biofilm formati da entrambi i ceppi batterici dopo 24 h di cultura statica sono stati colorati con una colorazione LIVE / DEAD e imaged da Cell Discoverer 7, Zeiss (Figura 5). All'esame delle immagini, i biofilm formati da batteri non trattati (sia S. aureus e P. aeruginosa) erano notevolmente pi? spessi e pi? grandi in volume di quelli formati da batteri trattati con peptide ?2. L'inibizione della formazione di biofilm indotta dal peptide ?2 era dose-dipendente, gi? evidente per la dose minima (2.5 ?M) ma con il massimo effetto ottenuto utilizzando 125 ?M di peptide.

Valutazione dell'attivit? di citotossicit? del peptide ?2.

L'attivit? citotossica del peptide ?2 ? stata testata su cellule HT-1080, A549, HeLa, SH-SY5Y, HUVEC e HF a concentrazioni di 2.5, 12.5, 25,0 e 125? M con tempi di esposizione di 24, 48 e 72 ore. Le figure 6 A-D e 7 A-B mostrano rispettivamente le percentuali di vitalit? di HT-1080, A549, SH-SY5Y e HeLa, dei modelli cellulari primari, HUVEC e cellule HF, esposti al peptide ?2.

Il peptide non era tossico a concentrazioni di 2.5, 12.5, 25 ?M dopo 24 e 48 ore di esposizione per tutte le linee cellulari testate. Dopo 72 ore di incubazione, il peptide ha ridotto la vitalit? cellulare di circa il 20%, anche a concentrazioni pi? basse, solo nelle cellule A549, HUVEC e HF. Viceversa, per le cellule HeLa, HT1080 la vitalit? rimane alta a basse concentrazioni di peptide anche per tempi prolungati. Tuttavia, la concentrazione pi? alta del peptide ?2 ha ridotto la vitalit? cellulare in tutti i tipi di cellule, gi? significativamente a 24 ore per le cellule A549 e HeLa e a 48 ore per le cellule SH-SY5Y.

Pertanto, questa serie di esperimenti mostra che il peptide ?2 non induce effetti citotossici rilevanti in vitro, quando utilizzato ad una concentrazione di 2.5, 12.5 e 25,0 ?M fino a 48 ore di esposizione consecutiva in tutte le linee cellulari analizzate.

Al fine di escludere un'attivit? citotossica del peptide, l'attivit? emolitica contro i globuli rossi ? stata valutata anche come indicatore di sicurezza del peptide ?2. Il peptide non ? risultato causare emolisi anche alla massima concentrazione di 125 ?M, con meno del 2-3% di emolisi osservata (Figura 8).

Effetto del peptide ?2 sulla migrazione delle cellule HT-1080, A549 e HUVEC.

Per valutare se il peptide ?2 si comporta come un fattore chemiotattico, saggi di migrazione cellulare sono stati eseguiti in camere Boyden utilizzando HT-1080 e cellule tumorali A549 e cellule endoteliali primarie HUVEC. Le cellule sono state fatte migrare verso il peptide di derivazione batterica fMLF, usato come controllo positivo, o concentrazioni crescenti di peptide ?2. Non sorprendentemente, 10 nM fMLF ha suscitato una notevole migrazione cellulare di HT-1080, A549 e cellule endoteliali, raggiungendo 167%, 153% e 166% della migrazione cellulare basale, rispettivamente. In tutti i casi, basse concentrazioni di peptide ?2 hanno suscitato un leggero effetto chemiotattico che ? aumentato quando il peptide ? stato impiegato a 50?M o 100?M concentrazione (Figura 9). Il grado di HT-1080, A549, e la migrazione cellulare direzionale endoteliale innescato da 50?M di peptide ?2 era molto simile a quello promosso da fMLF, raggiungendo 158%, 169% e 156% della migrazione cellulare basale, rispettivamente. Alla concentrazione di 100?M, il peptide ?2 non ha ulteriormente aumentato la migrazione cellulare direzionale (Figura 9).

Il peptide ?2 induce la secrezione di citochine nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

Per valutare se il peptide ?2 pu? stimolare la secrezione di citochine dalle PBMC umane, abbiamo esaminato la secrezione di un pannello di 20 citochine nelle PBMC dopo il trattamento con il peptide ?2. Sono state utilizzate due dosi dei peptidi (1.25 e 12.5 M) per stimolare le PBMC isolate da donatori sani, e le seguenti citochine sono state dosate nei terreni dopo 18 ore: fattore stimolante la colonia dei granulociti-macrofagi (GM-CSF), interferone (INF)-, interleuchina (IL)-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, MCP-1, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23. Come mostrato nella Figura 10, la secrezione di INF-, IL-1, IL-6 e IL-9 ? up-regolato in PBMCs dopo il trattamento con peptide ?2, suggerendo la sua capacit? di indurre la secrezione di citochine pro-infiammatorie in un modo antigene-indipendente.

Protezione del peptide ?2 sull'infezione delle cellule HeLa.

Per valutare se il peptide ?2 protegge le cellule eucariotiche dall'infezione batterica, sono stati eseguiti saggi di invasione in cellule HeLa con S. aureus ATCC 6538 e MRSA ceppo 2 e ceppo 3. A questo scopo, abbiamo valutato la sopravvivenza e la crescita di ceppi selezionati di S. aureus dopo l'ingresso nella linea cellulare umana HeLa, con o senza peptide ridotto ?2 ad una concentrazione finale di 40?M. Le cellule HeLa e i batteri sono stati utilizzati ad una MOI di 1:50 (Figura 11 A-C). Dopo 1 h di incubazione seguita da un trattamento con gentamicina per eliminare i batteri extracellulari e/o aderenti, le cellule sono state successivamente trattate con il peptide ?2 per 1 h. Infine, il numero di batteri intracellulari vitali ? stato determinato con il metodo CFU. I risultati hanno dimostrato una forte diminuzione dei batteri intracellulari vitali del ceppo wild type e del ceppo MRSA 3 in presenza del peptide ?2 in tutti i tempi testati, mentre per il ceppo MRSA 2 ha mostrato un effetto batteriostatico con l'inibizione della replicazione batterica. Questi dati suggeriscono che il nuovo analogo hBD3 ? in grado di internalizzare in modo efficiente nelle cellule umane ed esibisce una forte attivit? antibatterica anche durante la fase intracellulare dell'invasione. Inoltre, per escludere un possibile effetto citopatico sulle cellule HeLa alla concentrazione del peptide ?2 utilizzato nei saggi di protezione, il test MTT ? stato eseguito anche ad una concentrazione del peptide ?2 di 40 ?M per 6 ore, che ha confermato una vitalit? cellulare del 97% rispetto alle cellule di controllo (Figura 11 D).

Claims (4)

RIVENDICAZIONI

1. Un peptide di sequenza (SEQID1) Ac-CLPKRRQIGKSSTRGRKSCKK-NH2.

2. Un peptide di sequenza (SEQID1) Ac-CLPKRRQIGKSSTRGRKSCKK-NH2 per uso nel trattamento di infezioni batteriche.

3. Peptide per uso della rivendicazione 2 in cui le infezioni sono sostenuti da batteri antibiotico-resistenti.

4. Composizioni farmaceutiche comprendenti il peptide della rivendicazione 1 e opportuni veicoli o eccipienti.