IT202100023381A1 - Composizione per il trattamento delle mucositi orali radio-indotte - Google Patents

Description

TITOLO: COMPOSIZIONE PER IL TRATTAMENTO DELLE MUCOSITI ORALI RADIO-INDOTTE

CAMPO DELLA TECNICA

L?invenzione riguarda una composizione per prevenire e trattare le mucositi orali indotte da radiazioni e un procedimento per la produzione di tale composizione. Sono descritti metodi per la profilassi e il trattamento delle mucositi orali indotte da radiazioni.

STATO DELLA TECNICA

La mucosite orale indotta da radiazioni (radiation-induced oral mucositis ? RIOM) ? considerata una dei principali effetti collaterali della radioterapia dei tumori testa-collo. Con il termine mucosite si indica il danno ai tessuti sani non tumorali, con durata compresa tra i 7 e 98 giorni, che interessa con infiammazione acuta la mucosa orale, della lingua e del faringe con il richiamo di cellule immunitarie e il rilascio di citochine, fattori chemiotattici e fattori di crescita [1]. La RIOM pu? progredire fino a determinare una grave ostruzione fisica all?ingestione di cibi e liquidi, con conseguente perdita di peso e complicanze settiche [2]. La RIOM ? un?entit? clinica molto frequente, presente in circa l?80 % dei pazienti con tumori del distretto testa-collo sottoposti a radioterapia [3]. Tra i fattori di rischio per le radio-mucositi vi sono: chemioterapia (CT) concomitante, scarsa igiene orale, status nutrizionale inferiore alla norma, mancanza di utilizzo di antibiotici negli stadi precoci della malattia e il fumo di sigaretta [4]. Le RIOMs sono entit? che sottendono numerosi sintomi e quadri clinici diversi, come dolori nella cavit? orale, disfagia [1, 5]. La qualit? di vita dei pazienti affetti da RIOM si riduce in maniera talmente drastica che, nel 11-16 % dei pazienti, porta ad una interruzione della terapia della patologia tumorale e, quindi, ad una mancata risoluzione della neoplasia [6].

Studi recenti hanno confermato che la patogenesi delle mucositi radio-indotte ? costituita da quattro fasi distinte: una fase iniziale infiammatoria e/o vascolare, una fase epiteliale, una fase ulcerativa/infettiva e una fase di guarigione [7]. Durante la fase iniziale infiammatoria si verifica, in seguito all?esposizione al trattamento radiante, un danno diretto al DNA cellulare cui consegue la liberazione di specie reattive dell?ossigeno (ROS) da parte delle cellule epiteliali, endoteliali e da fibroblasti e macrofagi [8]. Patogenesi e meccanismo patogenetico sono stati descritti da diversi autori [8, 9, 10, 11]. Viene descritto l?instaurarsi di fenomeni micro-coagulativi e la neutropenia post-attinica che facilitano ulteriormente la colonizzazione da parte di batteri Gram negativi e lieviti e la successiva infezione da parte di questi. Le esotossine microbiche, in particolare batteriche, peggiorano ulteriormente la reazione infiammatoria, incrementando il rilascio di IL-1?, TNF-? e ossido nitrico [10].

Le RIOM si sviluppano solitamente entro circa due settimane dall?inizio della radioterapia. La diagnosi di mucosite indotta da radioterapia ? fondamentalmente clinica. Per la stima dell?impatto clinico delle RIOM esistono molte scale di valutazione diverse [12]. Riconoscere precocemente lo sviluppo di mucosite orale ? essenziale per intraprendere una terapia [13]. L?insorgenza di mucosite ? notevolmente limitata grazie all?utilizzo di nuove tecniche radianti come la radioterapia ad intensit? modulata (intensity modulated radiation therapy - IMRT) [14].

Uno degli elementi preventivi fondamentali per evitare il manifestarsi delle lesioni ? la corretta igiene orale. Tuttavia, un?eccessiva igiene orale potrebbe essere responsabile del depauperamento della flora microbica residente e conseguentemente generare disbiosi, ampliando le possibilit? di sovracrescita di germi opportunisti e di complicanze infettive. L?utilizzo del fattore di crescita dei cheratinociti (Keratinocyte growth factor ? KGF) ? sicuramente un?arma efficace per la prevenzione dello sviluppo di RIOM e sono gi? stati approvati dalla FDA come trattamento preventivo [15].

Altri interventi preventivi comprendono: l?utilizzo di amifostina, un agente antiossidante e citoprotettivo somministrato per via sottocutanea e intravenosa [16, 17]; l?utilizzo di dispositivo intra-orali per la schermatura delle radiazioni [18, 19], l?utilizzo di laser ad elio-neon a bassa energia prima del trattamento radiante [20].

Il trattamento delle mucositi, che deve essere iniziato il pi? precocemente possibile, ha due fini principali: ridurre il quadro sintomatologico che impatta notevolmente sulla qualit? di vita dei pazienti e accorciare il tempo di convalescenza, facilitando la guarigione e limitando le complicanze. La terapia delle mucositi sfrutta sia agenti applicati localmente sia presidi farmacologici somministrati per via sistemica.

La terapia topica si basa su analgesici, antiossidanti ed antinfiammatori locali che consentono sia di ridurre lo stato infiammatorio localizzato sia la sintomatologia algica, che causa un notevole disagio e impatta in maniera importante sulla qualit? di vita dei pazienti. Tra gli agenti topici maggiormente usati vi sono: gel a base di acido glicerritinico, iodio povidone o ialuronato di sodio; L-glutammina; manganese superossido dismutasi; anestetici locali come difenidramina, xilocaina, lidocaina, idrocloruro di diclonina; Vitamina A e Vitamina E. Quando la lesione ? in stadio avanzato e compromette notevolmente la nutrizione e la qualit? di vita del paziente, o qualora la terapia locale non sia pi? sufficiente a controllare la sintomatologia, risulta necessario ricorrere a presidi farmacologici che agiscono sull?organismo in toto. Gli agenti ad azione sistemica, somministrati per via orale, intramuscolare o endovenosa, sono: gli inibitori della ciclossigenasi 2 (COX-2); N-acetilcisteina; analgesici minori e oppioidi; azelastina, corticosteroidi sistemici; agenti antibatterici e antifungini (in caso di infezioni batteriche o fungine). [21-31]

La riduzione del flusso salivare, la perdita della barriera mucosale e la disbiosi conseguente all?esposizione a radiazioni possono indurre una sovracrescita di popolazioni polimicrobiche commensali. In queste condizioni germi normalmente presenti in qualit? di microrganismi residenti possono dare infezione. [32]

Qualora la lesione iniziale dovesse complicarsi con un?infezione, sia essa batterica che fungina, sar? necessario implementare la terapia analgesica e anti-infiammatoria con la somministrazione di agenti antimicrobici. Agenti antibiotici, come la brilacidina, hanno mostrato un notevole beneficio sia nel prevenire l?insorgenza della mucosite, sia nel ridurre il grado di severit? e le complicanze settiche della stessa [33].

Molto spesso le infezioni che complicano il quadro clinico, soprattutto nei pazienti immunocompromessi, sono causate da funghi. La famiglia di patogeni pi? frequentemente isolata nelle infezioni del cavo orale dopo trattamento radiante ? Candida spp. Nell?80% dei casi ? coinvolta C. albicans, nei restanti casi si tratta di infezioni causate da C. glabrata e C. tropicalis.[14, 34] Risulta quindi di fondamentale importanza, in presenza di tale complicanza, l?utilizzo per via sistemica di agenti antifungini come il fluconazolo e il clotrimazolo. Gli stessi agenti hanno mostrato, tuttavia, anche una notevole efficacia in senso preventivo: la somministrazione precoce garantisce non solo di evitare l?infezione da Candida spp. nei pazienti immunocompromeessi, ma anche di ridurre l?incidenza e la severit? delle RIOMs.[3, 35]

Il microbioma orale ? considerato uno dei pi? complessi sistemi microbici del nostro organismo, secondo solo a quello intestinale. Grazie al database del microbioma umano orale (Human Oral Microbiome Database - HOMD) ? stato possibile capire l?esatta composizione e le possibili variazioni delle popolazioni microbiche nelle varie patologie che possono intaccare il cavo orale. [36]

Il microbioma orale ? composto principalmente da cinque phyla: Firmicutes, Bacterioidetes, Proteobacteria, Actinobacteria e Spirochaetes. Queste cinque grandi famiglie comprendono circa il 94% di tutti i microrganismi rilevati. Si tratta di batteri che, grazie alla produzione di metaboliti utili al nostro organismo (post-biotici) e alla tolleranza immunologica che li rende commensali, garantiscono l?omeostasi tissutale. [36]

La perdita di equilibrio tra queste specie, definita disbiosi, pu? causare l?insorgenza di una ricca schiera di patologie orali: a partire dalle carie dentarie fino a infezioni locali e sistemiche. In varie patologie sono state dimostrate oscillazioni delle specie predominanti del microbioma orale.

La patogenesi delle mucositi ? multifattoriale e si basa su un insieme di fattori diversi che cooperano al fine di provocare l?insorgenza della lesione. Questo ?puzzle? non riconosce precisi fattori eziologici, si tratta piuttosto di un coacervo di fattori concomitanti che determinano il movente per l?insorgenza delle mucositi.

Diversi gruppi di ricerca hanno cercato di dimostrare la presenza di variazioni nel cluster di microorganismi presenti prima e durante il trattamento radiante, allo scopo di verificare che tipo di effetto avesse la radioterapia sul microbioma.

In uno studio del 2012 ? stato analizzato il microbioma del cavo orale di otto pazienti con neoplasie del distretto testa collo sottoposti a trattamento radiante. Da queste analisi emerse non solo che, durante la radioterapia, vi era una rarefazione della ricca comunit? batterica, e di conseguenza un calo delle operational taxonomic units (OTUs), ma anche che la prevalenza relativa di specie batteriche cariogene, rispetto ai controlli sani, come Streptoccoccus, Veillonella e Actinomyces. [37]

Grazie al sequenziamento del gene della subunit? 16S dell?RNA ribosomiale batterico, il gruppo di ricerca di Zhu et al. nel 2017, ha valutato la biodiversit? del microbioma orale, in pazienti sottoposti a radioterapia per carcinoma nasofaringeo. Dalle analisi effettuate risult? una stretta correlazione tra la dose radiante cumulativa, severit? delle mucositi e alterazioni quali-quantitative della comunit? microbica. Nelle mucositi pi? severe infatti venne riscontrata una prevalenza relativa di generi batterici come: Phenylobacterium, Acinetobacter, Burkholderia, Sphingomonas, Azospirillum, Rhizobium, Hydrogenophaga, Paracoccus e Nocardioides. Questi generi sembrerebbero, quindi, positivamente associati allo sviluppo di mucositi medio-gravi, mentre i generi Leptotrichia e Peptostreptococcus risultano depleti in tali condizioni, di conseguenza negativamente associati. [38]

Pi? recentemente, nel 2018 Hou et al. tentarono di codificare le variazioni a cui va incontro il microbioma durate il trattamento radiante. La microflora orale mostr? delle notevoli variazioni durante il trattamento radiante: i generi Pseudomonas, Treponema e Granulicella risultavano notevolmente aumentati in corso di terapia radiante, mentre Prevotella, Fusobacterium, Leptotrichia, Campylobacter e Prevotalla erano nettamente diminuiti nei pazienti irradiati rispetto ai controlli sani. [39]

Alla luce di ci?, la riduzione della biodiversit? del microbioma del cavo orale sembra positivamente correlata alla quantit? di radiazioni assorbite dal cavo orale e alla possibilit? di sviluppare RIOM, oltre che alla loro gravit?. La deplezione quali-quantitativa della microflora orale ? massima durante la fase ulcerativa. Un?alterazione cos? importante sottende una perdita dell?omeostasi microbiota-tessuto ospite, ripercuotendosi inevitabilmente anche nella simbiosi dell?ecosistema. Questo meccanismo disbiotico potrebbe spiegare il processo per cui, proprio durante la fase ulcerativa, vi sia la massima probabilit? di sviluppare infezioni, soprattutto fungine. Controllare l?alterazione della distribuzione delle popolazioni microbiche sembra risultare un ottimo espediente per prevenire il diffondersi di lieviti e l?istaurarsi di quadri complicati di candidiasi. Un aumento di xerostomia, infezioni fungine e presenza di Lactobacilli spp. ? strettamente correlata a una riduzione della biodiversit? del microbioma orale e della simbiosi dell?ecosistema.[40]

Le infezioni fungine sono una delle complicanze pi? frequenti e anche pi? invalidanti che seguono l?insorgenza di mucosite. Questo accade poich? vengono meno le normali difese mucosali, come la produzione di IgA salivari, e perch? la disbiosi che si genera determina la perdita delle normali condizioni simbiotiche tra microorganismi commensali e tessuto dell?ospite.

Durante la fase ulcerativa, quando viene persa la fisiologica simbiosi, ? stata dimostrata una maggiore presenza di Lactobacillus reuteri. Questo particolare microorganismo ? a tutti gli effetti un protettore dell?omeostasi orale, capace di salvaguardare la mucosa dal diffondersi dei lieviti come Candida spp.

Dai ricercatori dell?Universit? di Perugia ? stato dimostrato, infatti, che questo microorganismo, particolarmente presente nella mucosa gastrica e del piccolo intestino, ? in grado di degradare il triptofano in derivati indolici con potenti attivit? post-biotiche, pro-rigenerative, immunogeniche e tollerogeniche. In particolare gli indoli prodotti possono legare il recettore degli idrocarburi arilici (aryl hydrocarbon receptor ? AhR). L?attivazione dell?AhR, specialmente a livello dei linfociti del piccolo intestino, stimola la risposta IL-22 dipendente, atta sia a potenziare la difesa mucosale, inducendo la proliferazione delle cellule epiteliali basali, sia a combattere la diffusione fungina. Lo stesso recettore attivato ? in grado di sollecitare la risposta anti-infiammatoria grazie all?espansione dei linfociti T regolatori (Treg) e alla produzione di interleuchine anti-infiammatorie come l?interleuchina 19 (IL-10).[41] Il ruolo di Lactobacillus reuteri nella difesa contro le complicanze della mucosite non ? ancora del tutto chiaro, ma ? sicuramente un esempio lampante di come il microbioma spesso ? in grado di proteggere il nostro organismo da tutto ci? che tenta di minare la sua omeostasi. Guo e il suo gruppo di ricerca hanno analizzato il microbioma intestinale murino e la possibile relazione tra le fluttuazioni di questo con il danno acuto da radiazioni.

La sindrome acuta da radiazione (acute radiation syndrome ? ARS) ? definita come quella condizione patologica conseguente all?esposizione parziale o total body a radiazioni ionizzanti. L?insorgenza di questa sindrome ? correlata ad una scarsa risposta midollare ematopoietica e alla morte delle cellule epiteliali mucosali del tratto gastrointestinale.

Gli scienziati notarono che un piccolo sottogruppo di topi SPF C57BL/6, circa il 5-15%, esposti ad alte dosi radianti total body (circa 9,2 Gy), non solo guarivano molto rapidamente dalla ARS ma erano anche contraddistinti da una pi? lunga sopravvivenza. Questi topi vennero definiti ?elite survivors? e ne venne analizzato il microbioma confrontandolo con quello dei topi non sopravvissuti alla dose radiante. Vennero utilizzati trapianti fecali e una metodica peculiare definita ?dirty cage-sharing?, ovvero la condivisone di gabbie sporche tra topi ?elite survivors? topi na?ve allo scopo di ?trasferire? il microbioma intestinale dai primi ai secondi. L?analisi del microbioma, tramite sequenziamento del gene per la subunit? 16S dell?RNA ribosomiale su campioni fecali, ha mostrato una notevole prevalenza, a partire dal 7 giorno dall?inizio dell?irradiazione, di Lachnospiraceae, Enterococcaceae e Lactobacillaceae negli elite survivors, rispetto ai controlli.

Nei topi ?elite survivors? e nei topi che con questi condividevano la gabbia (e di conseguenza il microbioma) ? stata riscontrata una pi? intensa proliferazione midollare (grazie a colorazioni istologiche con Ki67) e una migliore ematopoiesi extra-midollare splenica. La pi? efficace ematopoiesi rende ragione della pi? breve guarigione e della pi? lunga sopravvivenza di questi topi dopo l?esposizione a radiazioni.

Il presupposto per cui le tre specie batteriche sopracitate hanno un?azione radioprotettiva ? da imputarsi alla loro capacit? di produrre metaboliti attivi: i post-biotici. Tra i metaboliti attivi pi? importanti sono annoverati gli acidi grassi a corta catena (short chain fatty acids ? SCFAs). Sia le Lachnospiraceae che le Lactobacillaceae sono in grado di produrre importanti quantit? di SCFAs come proprionato e butirrato. Questi metaboliti sono associati a ridotti livelli di proteine prodotte conseguentemente al danno genomico come ?H2AX, p53 e 53BP1. La ridotta produzione di queste proteine, insieme alla diminuzione dei livelli di ROS intra-midollari, ? indice di un minore stress genomico e ossidativo e di conseguenza di una maggior resistenza cellulare ai danni da radiazione. [42]

Il ruolo dei microorganismi presenti nel nostro microbioma non ? ancora del tutto chiaro, tuttavia ? limpida l?importanza che essi rivestono nel mantenimento dell?omeostasi dei vari tessuti e organi.

ESPOSIZIONE DELL?INVENZIONE

L?invenzione si pone lo scopo di proporre una composizione alternativa a quanto noto nello stato dell?arte per prevenire e/o trattare le mucositi orali indotte da radiazioni. Ulteriore scopo ? sviluppare un relativo procedimento di prevenzione/profilassi e trattamento della mucosite orale indotta da radiazioni, proporre formulazioni che permettono un?efficace applicazione della composizione, e un relativo dispositivo di somministrazione.

In un primo aspetto dell?invenzione, lo scopo viene raggiunto da una composizione, in particolare in forma di un gel, che comprende Lactobacillaceae reuteri per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di mucosite orale, in particolare mucosite orale radio-indotta, preferibilmente con un?applicazione orale. Un?applicazione orale vantaggiosa avviene a spruzzo.

Gli inventori hanno individuato L. reuteri come lactobacillus particolarmente idoneo nel trattamento della mucosite e hanno trasferito la funzione dei lactobacilli nell?intestino alla cavit? orale, un passo anche alla luce dello stato dell?arte non ovvio, viste le condizioni molto diverse nei due ambienti. ? stata trovata una via di sfruttare il ruolo delle Lactobacillaceae nell?intestino anche nella cavit? orale, in particolare perch? era possibile individuare una formulazione specifica che permette l?applicazione del lactobacillus in modo efficace nella cavit? orale. Il genere lactobacillus ? molto rappresentato in ambiente intestinale, ma poco in quello orale; il cambio ambiente del batterio quindi non era un ovvio approccio. A tal proposito ? particolarmente vantaggioso avere la composizione in forma di un gel, preferibilmente di un termogel, cio? di un gel termoreversibile. Con il termine ?termoreversibile? ? inteso un gel che pu? essere riutilizzato riscaldandolo una volta addensato. Questo ? importante per rendere il gel stoccabile a temperature basse, ad esempio a 4?C per proteggere i lactobacilli, e poi utilizzabile alle temperature presenti nella cavit? orale. Il gel ? un materiale colloidale bifasico elastico, costituito da un liquido disperso e inglobato nella fase solida. Il liquido "abita" nella struttura costituita dal solido, che a sua volta sfrutta la tensione superficiale del liquido per non collassare.

A tal proposito, una variante preferita dell?invenzione prevede che la composizione comprende inoltre:

(b) un copolimero poliossi-alchilenico, in particolare un copolimero poliossi-etilenicopropilenico, preferibilmente con la formula generale HO[CH2CH2O]x[CH2CH(CH3)O]y[CH2CH2O]zH in cui preferibilmente x = 99, y = 67 e z = 99;

(c) un polimero mucoadesivo, preferibilmente di natura cellulosica, in particolare carbossimetilcellulosa; e

(d) uno o pi? stabilizzanti, preferibilmente scelti tra zuccheri come saccarosio, trealosio, mannitolo, sorbitolo e glucosio, sodio ascorbato, molto preferibilmente lo zucchero ? saccarosio.

Il gel termoreversibile non ? solo spruzzabile, ma anche in grado di veicolare un probiotico a livello buccale. La composizione, in particolare nella sua forma a termogel, ? idono per uso orale.

Un poliolo preferito ? disponibile sul mercato sotto il nome pluronic? F-127. ? ipotizzabile l?uso di zuccheri diversi, anche combinazioni di zuccheri, i migliori risultati sono stati ottenuti con saccarosio. Gli zuccheri sono importanti per la crescita batterica e per la protezione dei microrganismi durante un eventuale processo di liofilizzazione, fungono anche da criostabilizzanti. La carbossimetilcellulosa ? nota come additivo alimentare identificato con il codice E466. Questi componenti non hanno un effetto negativo sulla vitalit? dei batteri contenuti.

In una variante particolarmente vantaggiosa dell?invenzione la composizione comprende il copolimero, in particolare della formula generale di cui sopra, in una quantit? tra il 20 e 25% (p/v), preferibilmente di 21 % (p/v), il polimero mucoadesivo, in particolare la carbossimetilcellulosa, in una quantit? tra 0,1 e 0,5 % (p/v), preferibilmente di 0,3 % (p/v) e lo zucchero, in particolare il saccarosio in una quantit? tra il 5 e 15% (p/v), preferibilmente di 8 % (p/v).

I componenti sopra indicati nelle rispettive concentrazioni hanno dato i risultati migliori. Preferibilmente, nella composizione il L. reuteri ? presente in una concentrazione da 1 ? 10<8 >a 1 ? 10<9 >CFU/ml, in particolare in una concentrazione di circa 1 ? 10<9 >CFU/ml.

La componente liquida della composizione ? vantaggiosamente realizzata da un tampone fosfato salino. Sono ipotizzabili altri liquidi, in particolare tamponi, noti alla persona esperta del settore.

Il gel proposto, oltre a permettere di valutare l?effetto dei pro- e post-biotici nel decorso clinico della mucosite ? in grado di veicolare, senza uccidere, i microorganismi benefici. Il gel ? in grado di veicolare batteri, in particolare Lactobacillus reuteri, mantenendone la vitalit?. Inoltre, ? un gel facilmente conservabile e di agevole somministrazione. Il gel proposto ? liofilizzabile e la sua ricostituzione integrando la componente liquida o acquosa, permettendogli di gelificare solo a temperature proprie del cavo orale (~30-34?C).

Un secondo aspetto dell?invenzione riguarda un liofilizzato ottenuto dalla composizione secondo l?invenzione, in particolare dalla composizione in forma di gel, tramite liofilizzazione, quindi un liofilizzato comprendente L. reuteri e vantaggiosamente gli altri componenti indicati. Un terzo aspetto dell?invenzione riguarda un procedimento per la produzione della composizione secondo l?invenzione che comprende le seguenti fasi:

(I) preparazione di tampone fosfato salino (PBS) e solubilizzazione di una sospensione batterica di L. reuteri al fine di ottenere una concentrazione desiderata preferibilmente verificata tramite assorbanza con taratura secondo la retta ed evitando preferibilmente stress meccanici;

(II) solubilizzazione di desiderate quantit? di un polimero mucoadesivo, preferibilmente di natura cellulosica, in particolare carbossimetilcellulosa, e un copolimero poliossialchilenico, in particolare un copolimero poliossi-etilenico-propilenico, preferibilmente con la formula generale HO[CH2CH2O]x[CH2CH(CH3)O]y[CH2CH2O]zH nella sospensione batterica, in cui preferibilmente si integra prima il polimero mucoadesivo e successivamente il copolimero poliossi-alchilenico a temperature attorno a 0?C con successivo stoccaggio del sistema a circa 4?C per circa 12 ore per ottenere la completa solubilizzazione del polimero; e

(III) aggiunta di uno o pi? stabilizzanti, in particolare zuccheri, preferibilmente dopo l?avvenuta solubilizzazione dei polimeri.

L?individuazione della composizione idonea e del procedimento per la sua produzione idoneo per poter applicare il gel in modo efficace nella cavit? orale ? stata accompagnata dal test di temperature e tempi di gelificazione, della forza di mucoadesione e della spruzzabilit? della composizione, test descritti pi? avanti.

In una variante molto vantaggiosa dell?invenzione, il procedimento comprendente inoltre la fase

(III) liofilizzazione del sistema ottenuto nella fase (II), in particolare a circa 4?C per circa 24 ore; e opzionalmente la fase di

(IV) ricostituzione del gel integrando il liofilizzato con una componente acquosa, in particolare con un tampone fosfato salino.

Un liofilizzato ? facilmente stoccabile e integrabile a basse temperature; la ricostituzione della composizione acquosa integrando il liofilizzato con la componente acquosa ? possibile a temperature basse. La soluzione fredda cos? ottenuta ha viscosit? idonee ad essere spruzzata con un erogatore non pressurizzato classico nella cavit? orale e solo in situ a temperature maggiori sopra i 20?C, la composizione gelifica coprendo la mucosa della cavit? orale con buone caratteristiche adesive.

Un altro aspetto dell?invenzione riguarda un metodo di profilassi della mucosite orale, in particolare indotta da radioterapia, che prevede l?applicazione del gel secondo l?invenzione, come sopra specificato, un giorno prima del trattamento di radioterapia, il giorno stesso del trattamento di radioterapia e nel secondo e terzo giorno dopo il trattamento di radioterapia, quindi nei giorni -1, 0, 2 e 3.

Un ulteriore aspetto dell?invenzione riguarda un kit comprendente:

(i) come prima componente un liofilizzato secondo l?invenzione o una composizione secondo l?invenzione in forma liofilizzata;

(ii) come seconda componente un liquido acquoso, in particolare un tampone fosfato salino; e opzionalmente

(iii) un erogatore, in particolare un erogatore non pressurizzato.

Il kit pu? essere stoccato in frigorifero e nel momento di bisogno, il liofilizzato viene integrato con la componente acquosa e pu? essere somministrato al paziente tramite l?erogatore.

Un aspetto dell?invenzione riguarda un metodo per verificare l?efficacia del trattamento con L. reuteri che prevede l?analisi dell?espressione genica delle componenti implicati nel signaling della 3-IALD, come Cyp1A1, AhR, IL-10 e IL-22; dell?espressione di R-spondina 1; dell?espressione sistemica di AhR e/o dell?espansione dei linfociti T regolatori.

In un ulteriore aspetto dell?invenzione, la composizione proposta ? destinata a trattare l?intestino gocciolante ovvero il leakage intestinale.

DESCRIZIONE DI PREFERITI ESEMPI DI ESECUZIONE

Breve descrizione dei disegni

La fig.1 illustra l?allestimento del gel con probiotico: a) definizione della retta di taratura per la valutazione spettrofotometrica quantitativa di L. reuteri; b) conta delle colonie su colture su piastra con MRS Agar (secondo De Man, Rogosa e Share) per valutare la vitalit? del gel; c) determinazione della migliore composizione del gel probiotico.

La fig.2 illustra il modello murino per l'induzione di mucosite e trattamento con gel arricchito di L. reuteri: a) timing del protocollo; b), c), d), e) popolazioni di topi presi in esame.

La fig.3 illustra l?applicazione del modello murino; a) sviluppo della mucosite orale nei topi, la freccia indica la mucosite macroscopicamente visibile; b) somministrazione del gel tramite sonda.

La fig.4 illustra la valutazione clinica del modello murino: a) valutazione dell'aumento di peso dei topi in seguito ad induzione di mucosite; b) valutazione della perdita di peso dei topi in seguito all'induzione di mucosite.

La fig.5 illustra la valutazione al giorno (day) 8 della sopravvivenza dei vai gruppi di topi.

La fig.6 illustra le istologie delle lingue asportate ai topi dopo sacrificio: a) NAIVE, istologia di lingua dei topi na?ve; b) CTIOM GEL, istologia di lingua dei topi controllo trattati solo con gel; b) CTIOM GEL , istologia di lingua dei topi trattati con L. reuteri.

La fig.7 illustra la risposta immunologica del tessuto linguale al giorno 5, dopo induzione di CTIOM: a) espressione genica di IL-10; b) espressione genica di IL-22; c) espressione genica di Cyp1A1; d) espressione genica di AhR.

La fig.8 illustra l?analisi dell'espressione di R-spondina 1 nelle lingue di: topi na?ve, topi controllo, topi che ricevono gel con L. reuteri.

La fig.9 illustra l?espressione genica valutata a livello della milza: a) IL-10; b) IL-22; c)

AhR; d) Cyp1A1; e) R-spondina 1.

La fig.10 illustra la crescita degli organoidi vista al microscopio: a), b) immagine del pozzetto dove sono stati coltivati gli organoidi visto al microscopio in campo chiaro; c) ,d) immagine di organoidi dopo 11 giorni di coltura al microscopio a contrasto di fase, diametro massimo rispettivamente di 730 ?m e 460 ?m circa; e) immagine di organoide dopo 11 giorni di coltura al microscopio a contrasto di fase. Tutte le immagini sono state scattate presso il dipartimento di Patologia e Immunologia dell?Universit? di Perugia.

La fig.11 illustra le istologie degli organoidi linguali: a) H&E (Hematoxylin and Eosin) -colorazione con ematossilina eosina (EE); b) CKHMW - immunomarcatura per citocheratine ad alto peso molecolare; c) p63 - immunocolorazione per p63. La fig.12 illustra la valutazione della risposta trascrizionale degli organoidi in seguito ad infezione con L. reuteri, analisi dell'espressione di R-spondina 1.

MATERIALI E METODI

Descrizione del modello murino

Per il modello murino sono stati utilizzati topi C57/BL6 wild type, di otto o nove settimane di vita e di 20-25 grammi di peso corporeo iniziale. Gli animali sono stati mantenuti in condizioni ambientali standard, ad una temperatura ambientale di 23 ? 2?C e un?umidit? di circa 60 ? 10%. Ai topi ? stato garantito libero accesso a cibo e acqua. La progettazione sperimentale ? stata inviata a OPBA e Ministero della Salute e approvata con progetto n.725/2019 PR.

Induzione della Chemiotherapy Induced Oral Musitis (CTIOM) acuta

L?induzione di mucosite ? stata ottenuta grazie alla somministrazione di un agente chemioterapico, il 5-fluorouracile (5-FU), e un agente ulcerante, l?acido acetico (AA). L?utilizzo del 5-FU ? atto a garantire il verificarsi dello stato immunosoppressivo tipico sia del trattamento chemioterapico che di quello radioterapico. L?acido acetico ? invece necessario per indurre il danno locale a livello della mucosa orale: essendo un agente ustionante, esso provoca la perdita dell?epitelio superficiale determinando la comparsa delle ulcere caratteristiche delle CTIOM. Il 5-FU ? stato somministrato ad un dosaggio di 50 mg/kg di peso corporeo, attraverso un?iniezione intraperitoneale. La somministrazione di questo agente chemioterapico ? stata fatta 5, 3 e 1 giorni prima del tempo 0 e in prima giornata. Al giorno 0 ? stata applicata una premedicazione anestetica con pentobarbital e xilazina cloridrato al 2%, successivamente ? stata applicato un gel contenente xilocaina allo scopo di ottenere anestesia localizzata nel punto di esposizione all?acido. Entrambi i margini linguali, destro e sinistro, sono stati trattati con un tampone di cotone precedentemente infuso con 25 ?l di acido acetico al 50%. La somministrazione una tantum di acido acetico, della durata variabile di 30-60 secondi, ? lo stimolo nocivo locale essenziale per innescare la comparsa di mucosite. Per rimuovere eventuali residui o eccessi di acido acetico, la mucosa trattata ? stata accuratamente detersa attraverso l?uso di tamponi di cotone infusi con soluzione salina sterile. Per tutta la durata dell?esperimento ai topi ? stato garantito libero accesso a cibo adeguatamente triturato e mescolato con acqua. I topi sono stati poi, in quinta giornata, sacrificati e sono stati prelevati, attraverso procedure asettiche, organi ed altri elementi utili per le analisi di laboratorio, come lingua, guancia e milza. I prelievi cos? ottenuti sono stati posti immediatamente in una soluzione con formalina al 10% per garantirne un?adeguata fissazione e conservazione fino al momento dell?analisi.

I parametri che sono stati valutati nel corso dell?esperimento sono:

- Il peso dei topi, misurato prima di ogni somministrazione, parametro estremamente affidabile per la determinazione della presenza di mucosite e disfagia. Il calo ponderale ? infatti un indicatore molto sensibile dell?incapacit? dei topi di alimentarsi autonomamente per via enterale.

- Il consumo del cibo in gabbia.

- La morte precoce prima del sacrificio programmato.

Dopo l?induzione della mucosite ai topi ? stato somministrato il (termo)gel secondo l?invenzione, un gel che solidifica a determinate temperature e che include agenti probiotici.

Preparazione del (termo)gel

Il gel in questione ? stato ottenuto miscelando precise quantit? di eccipienti in grado di conferire al composto le suddette caratteristiche. Per determinare i giusti ingredienti e le loro esatte concentrazioni sono state elaborate varie formulazioni con costituenti che differivano sia in qualit? che in quantit?. Inizialmente sono state testate 3 formulazioni diverse contenenti saccarosio, treaolosio o glucosio, zuccheri essenziali per la crescita batterica e per la protezione dei microrganismi durante il processo di liofilizzazione. Oltre alla componente saccaridica erano presenti carbossimetilcellulosa (CMC), polivinilpirrolidone (PVP), acido ascorbico e pluronic F-127, per il PVP per? ? stato dimostrato che inibisce la crescita batterica, mentre il poliolo la favorisce. L?acido ascorbico ? un potenziale stabilizzante. Altre composizioni e componenti testati riducono notevolmente la vitalit? batterica. A questi ingredienti ? stata inoltre aggiunta una concentrazione tra 1 ? 10<8 >e 1?10<9 >CFU/ml di Lactobacillus reuteri. Preferibile ? una concentrazione di 1 ? 10<9 >CFU/ml.

Per l?allestimento del gel ? stata preparata una dispersione polimerica in un mezzo disperdente costituito da tampone fosfato salino (phosphate buffered saline ? PBS). In primis, in un idoneo volume di PBS (14.52 ml), ? stata solubilizzata la sospensione batterica, in quantit? pari a 480?10<-3 >ml, al fine di ottenere una concentrazione finale pari 320?10<6 >CFU/ml. Per limitare una eventuale riduzione della vitalit? del ceppo batterico, la procedura, nella sua totalit?, ? stata eseguita sotto cappa e sono stati ridotti gli stress meccanici a cui i batteri potrebbero essere stati sottoposti. In secundis, i polimeri sono stati opportunamente pesati e solubilizzati direttamente nella sospensione batterica, secondo precise concentrazioni p/v %.

La solubilizzazione dei polimeri ha richiesto una particolare procedura: inizialmente sono stati integrati PVP e CMC, successivamente pluronic F-127 ? stato disciolto a freddo nella soluzione. In breve, il polimero ? stato aggiunto alla soluzione di PVP e CMC posta in bagno di ghiaccio in modo graduale per sfavorire processi di aggregazione. Dopodich?, il sistema ? stato conservato a 4?C per circa 12 ore ottenendo la completa solubilizzazione del polimero. La sospensione ? stata quindi conservata a 4?C fino al suo utilizzo per evitarne la gelificazione. La vitalit? del batterio incluso nel gel ? stata poi valutata attraverso semine del gel su piastre di MRS Agar incubate a 37?C con CO2 al 5%.

Determinazione della temperatura di gelificazione

La temperatura di gelificazione (Tgel) per ottimizzare la composizione del gel ? stata determinata mediante indagine reologica tramite reometro rotazionale Viscotech (Reologica AB instruments) in configurazione piatto-piatto munito di sistema Peltier per il controllo della temperatura. L?analisi ? stata eseguita in modalit? oscillatoria selezionando un gap pari a 0,5 mm. Inoltre, sono stati impostati valori di sforzi di taglio (shear stress) pari a 1 Pa e velocit? di taglio (share rate) di 1 s<-1>, mentre l?intervallo di temperatura utilizzato ? di 15-37?C (velocit? rampa di riscaldamento di 1?C/min). I campioni (0,7 ml) sono stati accuratamente applicati sul piatto inferiore del reometro e lasciati equilibrare per un tempo di 2 minuti prima di ogni analisi.

Determinazione del tempo di gelificazione

Il tempo di transizione sol-gel (tgel) per ottimizzare la composizione del gel ? stato determinato mediante ispezione visiva, utilizzando il metodo di inversione. Una quantit? pari a 0,5 ml del campione ? stata posta in una provetta (vial). Questa ? stata messa in contatto con un bagno d'acqua termostato a 32?C. ? stato definito come tempo di gelificazione il momento in cui non si osserva alcun movimento del campione a seguito del ribaltamento della provetta.

Determinazione della forza di mucoadesione

? stato eseguito un metodo indiretto per determinare le caratteristiche di adesione del sistema in esame rispetto a muco gastro-intestinale simulato. L?analisi ? stata eseguita, tramite reometro, in modalit? oscillatoria sweep stress, con configurazione piatto-piatto e selezionando un gap pari a 0,6 mm. Il test ? stato eseguito ad un valore di frequenza pari ad 1 Hz e ad una temperatura di 32 ?C, mentre l?intervallo di stress selezionato ? di 0,009 ? 1,5 Pa. ? stato valutato il comportamento viscoelastico per determinare la capacit? di binding tra il gel e il fluido mucosale simulato. Al fine di valutare la capacit? mucoadesiva e di ottenere una previsione di una ipotetica somministrazione nella cavit? buccale, ? stato allestito un saggio che potesse permettere di simulare la somministrazione in vivo, l?adesione del sistema alla mucosa, la forza e il tempo di permanenza del gel. Una quantit? pari a 0,5 ml del campione ? stato posto sul piatto inferiore, mentre su quello superiore sono stati fatti stratificare 0,3 ml del fluido simulato. Il test ? stato avviato dopo 5 minuti, tempo di contatto tra i due componenti al fine di garantire un binding sufficiente. Il valore di stress al quale si ? osservato un cambiamento del comportamento viscoelastico ? stato considerato come forza necessaria per il distacco del sistema dal muco.

Test di spruzzabilit?

Considerando che questa formulazione ? destinata ad essere somministrata mediante un dispositivo a spruzzo non pressurizzato, ? stato sviluppato un metodo per valutare l'efficienza e l'omogeneit? dell'erogazione della formulazione, che pu? essere ostacolata dalla viscosit? e dal processo di gelificazione.

La formulazione ? stata inserita in un dispositivo costituito da flaconi di vetro ambrato (5-20 ml) e dotato di un ugello che consente l?erogazione di quantit? pari a 70/100/140 ?l. Il dispositivo ? stato posizionato ad una distanza di 6 cm da una lamina di carta rotonda avente un'area di 23 cm<2 >divisa in otto settori uguali utili per valutare l'omogeneit? della distribuzione dello spray.

Il tempo di soglia per la completa somministrazione del gel ? stato determinato mantenendo il dispositivo riempito precedentemente conservato in frigorifero a temperatura ambiente per diversi intervalli di tempo prima dell'azionamento del dispositivo. Svuotamento incompleto del dispositivo e blocco degli ugelli sono stati utilizzati come indicatori.

Inoltre, al fine di valutare l?effetto dello stress dovuto all?erogazione sui batteri ? stato poi valutata la vitalit? dopo l?erogazione.

Liofilizzazione

Il processo di liofilizzazione ? stato utilizzato per trasformare la sospensione batterica termoreversibile in una polvere secca in modo da aumentare la stabilit? allo stoccaggio del prodotto. Il processo ? stato condotto tramite il congelamento lento iniziale della sospensione liquida partendo dalla temperatura di conservazione di 4?C. La liofilizzazione ? stata condotta per 24 ore. Al termine del processo il prodotto in polvere ? stato conservato al riparo da umidit? a 4?C. Al fine di garantire una stabilit? durante il processo di congelamento criostabilizzanti, quali trealosio, mannitolo e saccarosio, sono stati testati dal punto di vista dell?effetto sul comportamento reologico e della ritenzione della vitalit? dei batteri dopo il processo di liofilizzazione. Ulteriori additivi, quali antiossidanti, sono presi in considerazione per aumentare la stabilit? durante lo stoccaggio.

Analisi della stabilit?

La stabilit? del prodotto ? stata determinata su campioni liquidi e liofilizzati conservati alla temperatura di 4?C. I campioni liofilizzati sono anche stati mantenuti al riparo dall?umidit?.

Test di vitalit? e reologici sono stati realizzati a tempi prestabiliti nell?arco di sei mesi secondo gli standard internazionali.

Induzione e valutazione di RIOM acuta

Gli stessi topi utilizzati per l?induzione della CTIOM possono essere usati per riprodurre l?insorgenza delle RIOM attraverso un protocollo standardizzato. [71]

Inizialmente, i topi vengono anestetizzati con ketamina in modo da non compromettere, a causa di movimenti non calcolati, il processo d?irradiazione.

Inoltre, sempre allo stesso scopo, i topi vengono posizionati supini in dei contenitori ad hoc che permettono l?immobilizzazione dei topi stessi e, al contempo, l?emissione di radiazioni dirette esclusivamente alla testa e al collo dell?animale. ? stato creato uno scudo fisico su misura: si tratta di un coperchio di piombo, spesso 6 mm, applicabile al di sopra dei contenitori in modo da schermare il corpo dei topi e lasciare scoperto solo il distretto testa-collo.

Le radiazioni ionizzanti sono somministrate ai topi attraverso un irradiatore a raggi X specifico per animali da laboratorio. L?irraggiamento viene veicolato con un?intensit? di dose costante di 1,325 Gy/min. La dose totale somministrata ? di 16,5 Gy in singolo frazionamento oppure 8 Gy in 3 frazioni (8 Gy al giorno per 3 giorni consecutivi).

Dopo l?irraggiamento i topi vengono messi in un supporto riscaldato e, poi, riposti nelle loro gabbie. Ai topi viene garantito, per tutta la durata dell?esperimento, l?accesso libero ad acqua e a cibo morbido. I parametri valutati nel corso dell?esperimento sono: peso corporeo e sopravvivenza. Successivamente i topi vengono sacrificati e vengono prelevate, attraverso procedure asettiche, le lingue dalla cavit? orale.

Per analizzare macroscopicamente la comparsa di RIOM, le lingue cos? estratte vengono colorate con una soluzione all?1% di Blu di Toluidina (Toluidine Blue ? TB). Il colorante in eccesso viene poi rimosso con un tampone di cotone infuso di acido acetico, il processo viene poi ripetuto finch? il tessuto non cessa di scaricare il colorante. La valutazione si basa sulla capacit? del tessuto espiantato di captare il colorante: se non rimane colorante, oppure se ne rimane una quota esigua, il test ? negativo e la lingua non ? affetta da mucosite; se, invece, il tessuto si impregna di colorante, allora il test ? considerato positivo e indica la presenza di RIOM. Sia nell?induzione di CTIOM che nell?induzione di RIOM ? di fondamentale importanza l?analisi istologica degli organi prelevati.

Istologia dei prelievi

I tessuti (guancia, lingua e milza) sono stati rimossi e immediatamente fissati con formalina neutra tamponata al 10% (Bio-optica) per 24 ore. I tessuti sono stati disidratati, imbevuti in paraffina e successivamente sezionati in fette da 3-4 ?m di spessore. I vetrini sono stati, infine, colorati con ematossilina ed eosina (EE) e analizzati.

Estrazione dell?RNA e reazione a catena della polimerasi di tipo quantitativo (qPCR)

L?RNA ? stato estratto a partire dagli organi prelevati alla fine della procedura di induzione della mucosite. L?estrazione dell?RNA ? stata operata tramite l?utilizzo di TRIzol (Invitrogen, Milano, Italia), nome commerciale del tiocianato di guanidinio utile a lisare le cellule, degradare le proteine cellulari e bloccare l?attivit? di DNA-asi e RNA-asi.

Per la successiva retro-trascrizione, ? stato utilizzato il cDNA synthesis-kit della BioRad (Milano, Italia).

Le real-time PCR (CFX96 Touch? Real-Time PCR Detection System) sono state messe a punto utilizzando il SYBR Green master mix (Agilent Technologies, Milano, Italia). In questo studio la reazione a catena della polimerasi si componeva di 45 cicli di amplificazioni suddivisi in tre distinte fasi:

- Fase di denaturazione, a 95?C per 1 minuto,

- Fase di annealing, della durata di 1 minuto con una temperatura specifica per ogni primer (Tabella 1),

- Fase di prolungamento, a 72?C per 30 secondi.

Tutte le reazioni sono state ripetute almeno tre volte, al fine di garantire la riproducibilit? dei risultati. ? stata scelta la ?-actina come gene housekeeping per la normalizzazione della determinazione quantitativa dell?RNA. Per il calcolo della quantit? relativa dei geni target, utilizzando il software BioRad, ? stata usata la formula del ??ct:

Le sequenze dei primers per l?amplificazione dei trascritti tramite PCR di organi murini sono state riportate nella seguente tabella 1.

Tabella 1

Sperimentazione in vitro: L?uso degli organoidi

Preparazione degli organoidi

La preparazione degli organoidi si basa sull?estrazione delle AdSC (adipose-derived stem cells = cellule staminali mesenchimali da tessuto adiposo) a partire da organi, in particolare la lingua, espiantati da topi adulti dopo il sacrificio.

Le lingue cos? estratte sono state poi frazionate in piccole parti in modo da far penetrare gli enzimi atti a digerire la parte cartilaginea della lingua e sono state accuratamente lavate con PBS freddo.

Il materiale ottenuto ? stato immerso, quindi, in dispasi 50 UI/ml a 37 ?C con CO2 al 5% per 60 minuti, in modo tale da eliminare la componente parenchimatosa dell?organo e liberare le cellule staminali. Dopo un ulteriore lavaggio con PBS la materia rimasta ? stata posta in 10 ml di soluzione chelante (chelating buffer) e posizionata in un agitatore alla temperatura di 4?C per 15 minuti. Il chelating buffer utilizzato ? composto da: sodio citrato (27 mM), idrogenofosfato di sodio (5 mM), cloruro di sodio (94 mM), diidrogenofosfato di potassio (8 mM), cloruro di potassio (1,5 mM), D-sorbitolo (55mM) e sucrosio (44 mM). Successivamente la miscela ottenuta, contenente le cellule staminali, ? stata passata attraverso un filtro 40 ?M. Cos? facendo ? stata ottenuta una parte di materiale gi? filtrato, o fraction 1, e una parte di materiale non filtrato che viene posto in ulteriori 10 ml di chelating buffer, o fraction 2. Entrambe le frazioni sono state poi centrifugate a 400 giri ad una temperatura di 4?C ed ? stato sostituito il sovranatante con 1 ml di DMEM F12 base. Il DMEM F12 ? costituito da F12 con l?aggiunta di: Glutamax (2 mM), Hepes (10 mM), penicillina (100 U/ml), streptomicina (100 ?g/ml) e N-acetilcisteina (1 ?M). Nel materiale rimanente per ogni frazione viene aggiunta una quantit? di Matrigel (miscela proteica gelatinosa secreta da cellule di sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)) proporzionale al materiale ottenuto. ? stata poi depositata una goccia di 50 ?l di Matrigel per ogni pozzetto in una piastra precedentemente pre-riscaldata a 37? C, data la peculiarit? di questo scaffold di solidificarsi a temperatura ambiente. La piastra con Matrigel ? stata, poi, posta in incubatrice a 37? C con CO2 al 5% per 20 minuti al fine di garantire la solidificazione del gel. Una volta solidificato, sono stati aggiunti allo scaffold 250 ?l di terreno DMEM F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium) addizionato delle sostanze necessarie a garantire la crescita e la proliferazione delle cellule staminali adulte. I supplementi aggiunti al terreno base sono: R-spondina (1000 ng/ml), noggin (100 ng/ml), supplemento B27 (1X), supplemento N2 (1X), mEGF (50 ng/ml) e Y27632 (10 ?m).

Gli organoidi sono stati fatti crescere in incubatrice a 37? C con CO2 al 5%, e ogni 2/4 giorni ? stato cambiato il terreno di coltura.

Preparazione di L. reuteri e infezione degli organoidi

Lactobacillus reuteri (L. reuteri) ? un batterio appartenente alla famiglia delle Lactobacillaceae normalmente presente, in qualit? di microrganismo commensale, nel tratto gastro-intestinale di umani e animali. Numerosi studi clinici hanno dimostrato come una adeguata somministrazione di L. reuteri possa apportare benefici alla salute dell'uomo, per tale motivo ? attualmente considerato un organismo probiotico. Cresce in un mezzo di coltura specifico per l?isolamento di lactobacilli detto terreno di De Man, Rose e Sharp (MRS). L. reuteri ? disponibile sul mercato e facilmente accessibile tramite vari fornitori. Un ceppo esemplificativo utilizzabile ? il Lactobacillus reuteri ATCC BAA-2837<TM >disponibile in banca ATCC (American Type Culture Collection); inoltre ceppi idonei, che hanno lo stesso metabolismo e attivazione di recettori endogeni, sono isolabili per la persona esperta del ramo dal tratto gastro-intestinale, cio? da isolati clinici del L. reuteri.

Preparazione del brodo MRS per la coltura in mezzo liquido

Il brodo MRS per la crescita di L. reuteri ? stato preparato in laboratorio e contiene i seguenti ingredienti: peptone, estratto di carne, estratto di lievito, D(+)-Glucosio, idrogenofosfato di dipotassio, sodio acetato triidrato, citrato di triammonio, solfato di magnesio eptaidrato, solfato manganoso tetraidrato.

Il pH finale ? risultato essere 6,2 ? 0,2 a 25?C. In seguito sono stati sciolti 51 g di esso in 1 litro di acqua distillata ed ? stato aggiunto 1 ml di Tween 80 (Sigma-Aldrich, Cat. No. P8074), un detergente che ne facilita la crescita. Il tutto ? stato sottoposto a bollitura per sciogliere completamente il mezzo. Sono stati infine riempiti con esso dei contenitori e sterilizzati in autoclave a 121?C per 15 minuti.

Preparazione delle piastre di MRS Agar per la coltura in colonie

Le piastre Agar MRS presentano la seguente composizione: peptone universale, estratto di carne, estratto di lievito, D(+)-Glucosio, idrogenofostato di dipotassio, diammonio idrogeno citrato, acetato di sodio, solfato di magnesio, solfato manganoso, Agar.

Il risultato ? stato un pH finale di 6,5 ? 0,2 a 25?C. In seguito sono stati sciolti 61,15 g di composto in acqua distillata ed ? stato aggiunto 1 ml di Tween 80 (Sigmar-Aldrich, Cat. No. P8074) e portato il volume a 1000 ml. Il tutto ? stato bollito per sciogliere completamente il mezzo e messo in autoclave a 121?C per 15 minuti.

Determinazione della retta di taratura per il ceppo ATCC di L. reuteri

Al fine di rendere precisa la valutazione quantitativa delle colture di L. reuteri ? stata creata una retta di taratura per le misurazioni tramite spettrofotometria.

? stata preparata una sospensione dalla madre (ATCC: American Type Colture Collection) di colonie isolate di L. reuteri in 10 ml di brodo di coltura MRS e sono state lasciate in incubazione overnight. Il giorno seguente, sono state preparate le seguenti diluizioni in volume finale di 1 ml in eppendorf sterili:

La tabella 2 mostra le diluizioni da utilizzare per la determinazione della retta di taratura del ceppo ATCC di L. reuteri.

Tabella 2

? stata misurata la OD600 (densit? ottica misurata a 600 nm) di ognuna delle diluizioni. Le diluizioni sono state poi seminate su piastre MRS agar. La conta ? stata effettuata il giorno seguente.

Infezione degli organoidi con ceppo ATCC di L. reuteri

Dopo almeno 5 giorni di coltura e crescita degli organoidi, questi sono stati esposti a L. reuteri. L?infezione ? stata effettuata utilizzando 1?10<3 >di L. reuteri, in fase di crescita esponenziale, per ogni pozzetto contenente 1-2 organoidi murini di lingua. Prima dell?infezione ? necessario rimuovere il terreno completo contenente penicillina e streptomicina all?1% che potrebbero limitare la crescita batterica. Dopo esposizione overnight a 37?C 5% CO2, ? stata fatta l?estrazione dell?RNA. La quantit? di cui sopra ? stata applicata in vitro con un rapporto 1:10 con le cellule presenti nell?organoide. Per il modello di mucosite in vivo invece si utilizzano da 1 ? 10<8 >a 1 ? 10<9 >CFU/ml.

Estrazione dell?RNA dagli organoidi

Per estrarre RNA dagli organoidi ? necessario raccogliere gli aggregati cellulari dai pozzetti e processarli adeguatamente al fine di non perdere lo scarso materiale genetico presente.

Inizialmente ? stata centrifugata a 1200 giri/minuto per 5 minuti la piastra contenente gli organoidi. Il mezzo di coltura sovranatante, se presente, ? stato rimosso dai pozzetti, tuttavia ? stato conservato per eventuali analisi citofluorometriche per la valutazione del profilo citochinico. Gli organoidi sono stati trattati, successivamente, con 500 ?l di cell recovery medium e incubati alla temperatura di 4?C per 10-15 minuti. Il contenuto di ogni pozzetto ? stato poi trasferito in eppendorf sterili da 2 ml ed ? stata applicata la procedura gi? descritta per l?estrazione dell?RNA.

I primers utilizzati per l'amplificazione dei trascritti tramite PCR su organoidi murini sono riportati, insieme alle rispettive sequenze senso e antisenso e alle temperature di annealing, nella seguente tabella 3:

Tabella 3

Istologia e immunoistochimica degli organoidi

Al pari dei tessuti ottenuti in vivo, gli organoidi possono essere trattati per ricavarne immagini istologiche e immunoistochimiche al fine di ottenere una valutazione qualitativa della composizione cellulare.

Gli organoidi sono stati, quindi, separati dal Matrigel, grazie all?utilizzo della cell recovery solution, e le loro sezioni di paraffina sono state colorate con il colorante ematossilina/eosina (EE). L'ematossilina colora in blu/violetto le componenti cellulari cariche negativamente come acidi nucleici, proteine di membrana, membrane cellulari e elastina localizzati prevalentemente a livello del nucleo. L'eosina invece colora in rosso/rosato le componenti cellulari cariche positivamente come molte proteine cellulari, le proteine mitocondriali, le fibre collagene, il citoplasma e le sostanze extracellulari. L?osservazione ? stata fatta ad ingrandimenti di 400? e 200?. ? stata successivamente effettuata un?immuno-marcatura con anticorpi anti-cheratina K5 e K14 che ha evidenziato la positivit? nelle cellule dello strato pi? esterno degli organoidi. L?immuno-colorazione per p63, un antigene di differenziazione squamocellulare, che marca in particolare cellule basali, soprabasali e parabasali all?interno dell?epitelio della lingua, ? risultata positiva all?interno del nucleo delle cellule dell?organoide.

Risultati del modello murino

Allestimento del gel probiotico

Per la valutazione dell?efficacia del gel contenente L. reuteri nella mucosite a livello murino, ? stato creato (come descritto nella sezione dei materiali e metodi), un gel probiotico, somministrato durante il processo di induzione della mucosite.

I vari tentativi nella determinazione delle pi? adatte componenti del gel e delle loro concentrazioni relative hanno portato a comprendere che, tra tutti gli ingredienti utilizzati, due in particolare intaccano la crescita del batterio. Infatti, ? stato dimostrato che il polivinilpirrolidone inibisce la crescita del Lactobacillus reuteri, mentre il pluronil F-127 la promuove.

Sono state testate numerose formulazioni (Figura 1 c), tuttavia la composizione che ? risultata ottimale a veicolare Lactobacillus reuteri, garantendo contemporaneamente la vitalit? del microrganismo e le caratteristiche necessarie del gel, ? composta da Pluronic F-127, carbossimetilcellulosa (CMC) e saccarosio, miscelati secondo precise quantit? percentuali (Figura 1c, termogel C; Tabella 4).

Tabella 4

Il gel contiene, inoltre, precise quantit? di L. reuteri, determinate grazie a tecniche di spettrofotometria e a conta delle colonie in colture classiche su MRS Agar. Per un utilizzo adeguato della tecnica spettrofotometrica ? stato necessario stilare una retta di taratura, che ha permesso di limitare errori nella conta della concentrazione batterica su mezzo di coltura liquido (MRS broth).

Attraverso la retta di taratura (Figura 1a) ? stato possibile ottenere la seguente equazione, utile a normalizzare la conta batterica tramite assorbanza:

Per garantirne una corretta conservazione e un?agevole somministrazione, il gel ? stato successivamente liofilizzato. Al momento dell?utilizzo ? necessario ricostituire il materiale essiccato addizionando un mezzo acquoso. Viene, quindi, aggiunto al liofilizzato una soluzione di ripristino a base di tampone fosfato salino. Il volume di PBS da integrare dipende dalla concentrazione iniziale degli eccipienti e dal processo di liofilizzazione, esso ? pertanto variabile.

Una volta ricostituito, il gel deve essere conservato in frigo, a causa della sua capacit? di gelificare a temperatura ambiente, e pu?, poi, essere somministrato ai topi.

? stato quindi ideato un protocollo di 11 giorni, durante il quale i topi sono stati stimolati all?insorgenza di mucosite e sono stati successivamente trattati con il gel probiotico contenente L. reuteri (Figura 2).

Applicazione del protocollo per l?induzione della mucosite

Per l?applicazione del modello murino (Figura 2a) sono stati individuati 11 tempi, giorni (days) consecutivi, in cui il giorno 0 coincide con l?effettiva induzione della mucosite (ovvero il trattamento con acido acetico al 50%).

Il protocollo ? stato temporalmente articolato come segue (Figura 2a):

- Giorno -5: somministrazione intraperitoneale di 5-FU;

- Giorno -3: somministrazione intraperitoneale di 5-FU;

- Giorno -1: somministrazione intraperitoneale di 5-FU e somministrazione locale intra-orale del gel;

- Giorno 0: somministrazione locale intra-orale di acido acetico e somministrazione locale intra-orale del gel;

- Giorno 1: somministrazione intraperitoneale di 5-FU;

- Giorno 2: somministrazione locale intra-orale del gel;

- Giorno 3: somministrazione locale intra-orale del gel;

- Giorno 5: sacrificio e prelievo dei campioni di interesse (lingua, guancia e milza).

I topi analizzati sono stati divisi in quattro sottogruppi.

Vi sono i topi na?ve (Figura 2e), che non ricevono n? lo stimolo nocivo n? il trattamento e i topi che ricevono esclusivamente lo stimolo nocivo ma non beneficiano del trattamento con gel (Figura 2c). Vi sono, inoltre, i controlli (Figura 2d), ovvero topi che ricevono lo stimolo nocivo ma il cui trattamento ? costituito da solo gel in assenza di L. reuteri. Quest?ultimo gruppo di topi ? necessario per escludere che gli effetti benefici derivanti somministrazione del gel siano da imputarsi esclusivamente alla presenza o all?attivit? di eccipienti presenti nella formulazione del gel stesso piuttosto che alla presenza dell?agente probiotico. Infine vi sono i topi test (Figura 2b) che ricevono sia lo stimolo nocivo sia il trattamento con gel veicolante L. reuteri.

Il gel ? stato applicato tramite una sonda a livello del cavo orale dei topi al giorno -1, giorno 0, giorno 2 e giorno 3 (Figura 3). La valutazione in corso d?opera ? stata operata grazie all?utilizzo di due parametri fondamentali: la sopravvivenza e la perdita o il guadagno di peso. Sia la perdita che il guadagno di peso risultano parametri affidabili della capacit? dei topi di nutrirsi e, di conseguenza, della gravit? della mucosite. Nei topi trattati con gel contenente L. reuteri ? stata dimostrata una minore perdita di peso rispetto ai controlli trattati con gel privo di microrganismi. I topi che ricevono il trattamento probiotico, quindi, manifestano una mucosite meno grave che non interferisce con la normale nutrizione enterale per via orale (Figura 4a,b) Ai controlli viene somministrato un gel che non contiene L.reuteri, pertanto si esclude che l?azione benefica sull?oral intake sia correlata all?azione meccanica protettiva del gel a livello della mucosa orale.

? stata inoltre valutata la sopravvivenza al giorno 8 dei vari gruppi di topi in studio (Figura 5). ? emerso che dopo l?induzione della mucosite la sopravvivenza ? estremamente pi? alta nel gruppo che riceve il trattamento probiotico rispetto ai controlli. La sopravvivenza dei topi trattati ? infatti quasi sovrapponibile ai na?ve, che non ricevono n? lo stimolo nocivo n? il trattamento probiotico. La somministrazione di L. reuteri riduce quindi la gravit? della mucosite, diminuisce la disfagia e l?impatto che la mucosite avrebbe sulla nutrizione per os, limita la perdita di peso e aumenta la sopravvivenza.

Istologie delle lingue

Al giorno 5 sono stati prelevati dai topi gli organi necessari alle indagini istologiche e laboratoristiche. I campioni istologici sono state colorate con ematossilina/eosina e analizzate. L?istologia della lingua ottenuta dai topi na?ve mostra reperti di normalit? (Figura 6a). Si pu? osservare, infatti, la presenza di muscolatura nettamente separata dall?epitelio dalla lamina propria, evidenziata in blu violetto. La mucosa appare di morfologia normale. Si riscontra la presenza di papille filiformi formate da una parte centrale di connettivo denso rivestite da tessuto fortemente cheratinizzato. Si evidenziano, inoltre, sporadiche immagini riferibili a papille fungiformi sormontate da un epitelio pi? sottile.

Le immagini istologiche derivanti da lingue di topi trattati con gel senza L. reuteri mostrano notevoli alterazioni della fisiologica trama istologica dell?organo (Figura 6b). Si evidenzia un notevole assottigliamento della mucosa con perdita della normale morfologia papillare e degli strati cornei pi? esterni. La lamina propria risulta pi? sottile e appiattita. Tale sovvertimento cito-architetturale del tessuto mucoso ? compatibile con la presenza di mucosite.

I vetrini delle lingue prelevate dai topi trattati con gel probiotico mostrano reperti molto simili a quelli fisiologici. L?assottigliamento della membrana mucosa e della lamina propria ? modesto, la cito-architettura ? parzialmente conservata. Si evidenzia ancora la presenza di papille filiformi e dello strato corneo esterno, nonostante sia stata operata l?induzione di CTIOM. L. reuteri protegge la mucosa dai danni indotti dalla mucosite, conservando la normale architettura istologica linguale.

Risposta immunologica e cellulare

La risposta immunologica ? stata valutata tramite qPCR su RNA ottenuto dagli organi espiantati al giorno 5. In particolare sono state valutate le variazioni dell?espressione genica di alcune proteine e recettori importanti nella risposta immunitaria e nella rigenerazione tissutale. Sono state eseguite analisi a livello della mucosa linguale, per valutare le alterazioni localizzate nel sito della mucosite, e della milza, per valutare variazioni immunologiche sistemiche.

I prodotti genici analizzati sono motivati da due incognite principali: capire come varia l?attivit? immunitaria durante la mucosite e come impatta l?utilizzo del probiotico nel decorso del processo patologico.

Il L. reuteri ? considerato un probiotico per la sua intrinseca capacit? di catabolizzare il triptofano in derivati indolici con attivit? post-biotica. Uno dei cataboliti con maggiore attivit? post-biotica ? la 3-indolaldeide (3-IALD). Per questo motivo l?analisi dell?espressione genica delle componenti implicati nel signaling della 3-IALD risulta una valida spia dell?efficace azione probiotica di L. reuteri.

La 3-IALD ? in grado di attivare il recettore degli idrocarburi arilici (aryl hydrocarbon receptor ? AhR), un importante agente che media la difesa della mucosa da infezioni e da insulti. AhR ? in grado di stimolare la produzione di IL-22 per la risposta mucosale ad infezioni, soprattutto fungine. Questo recettore media, inoltre, l?attivazione di Cyp1A1, un gene che codifica per un enzima appartenente alla super-famiglia del citocromo p450, utile alla degradazione degli idrocarburi arilici. AhR sembra, in aggiunta, correlato alla stimolazione della risposta immune in senso anti-infiammatorio favorendo l?espansione e l?attivazione dei linfociti T regolatori (Treg) e la produzione di IL-10, nota citochina anti-infiammatoria.

Alla luce di ci?, ? stata analizzata l?espressione genica di: Cyp1A1, AhR, IL-10 e IL-22 (Figura 7).

I topi che hanno ricevuto il trattamento con L. reuteri manifestano maggiore produzione di IL-22 e IL-10 (Figura 7a,b). Ci? conferma l?importante ruolo che questo microrganismo svolge nei confronti dell?infiammazione. Risulta quindi un alleato fondamentale per combattere le infezioni a livello locale: stimolando la produzione di IL-22, potenzia la risposta anti-fungina; aumentando la produzione di IL-10, controlla l?infiammazione impedendone una smodata attivazione, che aggraverebbe il danno mucosale.

Anche Cyp1A1 risulta particolarmente espresso nei topi trattati con gel probiotico (Figura 7c). Questo reperto testimonia la produzione di cataboliti del triptofano, come la 3-IALD, con potente attivit? post-biotica.

? stata riscontrata, inoltre, un?aumentata espressione di R-spondina 1 nelle lingue dei topi trattati con probiotico rispetto a quelle dei controlli.

L?R-spondina 1 ? una proteina di fondamentale importanza per la proliferazione cellulare e per la ripopolazione epiteliale a seguito di insulti. Si tratta di un prodotto specifico della mucosa orale che ? in grado, grazie all?inibizione di Dkk1, di favorire la traslocazione nucleare della ?catenina e, di conseguenza, di modulare il pathway WNT/ ?-catenina. L?attivazione di questo meccanismo si traduce nell?aumentata proliferazione del compartimento cellulare basale, nell?ispessimento e nella ripopolazione della mucosa orale.

L?aumento di R-spondina riscontrato (Figura 8) ?, quindi, un importante indice di come L. reuteri stimoli la rigenerazione epiteliale della porzione mucosa esposta all?insulto.

Le analisi a livello della milza (Figura 9), rivelano un?aumentata espressione sistemica di AhR (Figura 9c), in accordo con le precedenti asserzioni.

Risultati degli esperimenti sugli organoidi

Crescita degli organoidi

La Figura 10 mostra la crescita in vitro degli organoidi. Nella sezione a e b sono rappresentati i pozzetti dove sono stati coltivati gli organoidi, visualizzati con microscopio in campo chiaro. Nelle immagini si riesce ad apprezzare la tridimensionalit? delle colture cellulari che crescono dando vita a strutture ?bottoniformi? di epitelio linguale. Nelle immagini c e d ? possibile vedere organoidi completamente maturi. Attraverso gli scatti microscopici si pu? intuire l?architettura tridimensionale di queste colture: al centro ? presente uno strato spesso cheratinizzato, in periferia risulta particolarmente evidente la componente cellulare. Le dimensioni raggiunte dagli organoidi maturi sono all?incirca nell?ordine dei 500 ?m.

Istologia degli organoidi

Dopo circa due settimane di coltura in vitro, gli organoidi sono stati separati dallo scaffold e sono stati inclusi in paraffina e colorati con ematossilina/eosina. Questa colorazione permette di colorare in blu/violetto i componenti cellulari carichi negativamente, come per esempio acidi nucleici e altre componenti nucleari, e in rosso/rosa le sostanze basiche come proteine e fibre collagene.

Dalla Figura 11a si evince come la parte dell?organoide maggiormente ricca di nuclei, e quindi di cellule, sia quella pi? esterna. L?anello esterno degli organoidi, in violetto nell?immagine, ? quindi rappresentato da cellule epiteliali staminali contenenti nucleo che, nel progressivo differenziarsi, si dirigono verso il centro dell?organoide. Nella porzione centrale infatti si evidenzia materiale cheratinizzato ricco di proteine e fibre che gli conferiscono la classica colorazione rosacea.

La conferma della morfologia concentrica dell?organoide si ha con l?utilizzo di immunomarcatori per le citocheratine ad alto peso molecolare (Figura 11b) e con l?immunocolorazione per p63. Le citocheratine, marcatori citoplasmatici, risultano particolarmente presenti nella porzione cheratinizzata dell?organoide, quella centrale. Al contrario p63, un marcatore nucleare, risulta prevalentemente localizzato a livello degli strati cellulati esterni.

Questa peculiare morfologia ?a bersaglio? ? spiegata dal fatto che, durante il processo di differenziamento, le cellule basali esterne vanno incontro a maturazione e si spostano dal compartimento esterno a quello pi? interno, perdendo la componente nucleare e diventando cheratinociti.

Analisi della risposta trascrizionale degli organoidi

Nel corso dello studio gli organoidi sono stati infettati con L. reuteri per evidenziare possibili risposte da parte del tessuto coltivato in vitro.

Gli organoidi sono stati divisi in cinque gruppi, ciascuno dei quali ? stato trattato con concentrazioni crescenti di L. reuteri: 0, 10<1>, 10<2>, 10<3>, 10<4>. Successivamente gli organoidi sono stati prelevati dal Matrigel ed ? stata analizzata la loro risposta trascrizionale attraverso qPCR. Dall?analisi ? emerso che: gli organoidi infettati con maggiori quantit? di L. reuteri presentano una maggiore produzione di R-spondina 1, proteina che svolge un ruolo fondamentale nella rigenerazione epiteliale. La maggiore risposta ? stata osservata per concentrazioni pari a 10<3>. L. reuteri induce quindi una risposta epiteliale in senso rigenerativo e riparativo, per questo motivo, promette di essere un presidio molto utile nel trattamento del danno mucosale da RIOM.

I risultati dimostrano come l?utilizzo di un gel probiotico possa effettivamente ricostituire la normale omeostasi tissutale.

L. reuteri, in particolare, svolge un ruolo fondamentale nella regolazione dell?immunit?. Stimolando la risposta immunitaria IL-22 mediata, impedisce l?instaurarsi di infezioni opportunistiche, soprattutto di natura fungina. L?aumentata produzione di IL-10 e l?attivazione dei linfociti T regolatori modula, invece, la risposta infiammatoria, garantendo un?immunit? n? troppo intensa da provocare danni, n? troppo blanda da suscitare infezioni. L. reuteri stimola il tessuto linguale, sia nel topo che negli organoidi, a produrre R-spondina 1, una proteina fondamentale per la rigenerazione dei tessuti. Questa macromolecola infatti ? strettamente correlata ad una pi? intensa proliferazione del compartimento cellulare basale e, di conseguenza, ad un notevole effetto rigenerativo a livello della mucosa. L?azione citoprotettiva e proliferativa di L. reuteri ? stata dimostrata sia in vivo, attraverso il modello murino, che in vitro, grazie all?utilizzo di organoidi.

Il modello murino sfrutta l?induzione della mucosite attraverso agenti chimici, comparabili alla mucosite radio-indotta. Dai risultati ottenuti con induzione chimica della mucosite ? molto plausibile che sono trasferibili anche a RIOM.

Il testo libero nella lista delle sequenze (sequence listing)

Il testo libero per le sequenze da SEQ.1 a SEQ.16 indica il tipo di primer come da colonna 1 delle tabelle 1 e 3 e la categoria senso (sense) o antisenso (antisense) come da colonna 2 delle tabelle 1 e 3.

(La colonna 2 delle tabelle 1 e 3 indica per ogni primer la corrispondenza con il relativo numero di sequenza.)

Claims (10)

RIVENDICAZIONI

1) Composizione, in particolare in forma di un gel, comprendente

(a) Lactobacillaceae reuteri per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di mucosite orale, in particolare mucosite orale radio-indotta, preferibilmente tramite un?applicazione orale.

2) Composizione secondo la rivendicazione 1 comprendente inoltre:

(b) un copolimero poliossi-alchilenico, in particolare un copolimero poliossi-etilenicopropilenico, preferibilmente con la formula generale HO[CH2CH2O]x[CH2CH(CH3)O]y[CH2CH2O]zH in cui preferibilmente x = 99, y = 67 e z = 99;

(c) un polimero mucoadesivo, preferibilmente di natura cellulosica, in particolare carbossimetilcellulosa; e

(d) uno o pi? stabilizzanti, preferibilmente scelti tra zuccheri come saccarosio, trealosio, mannitolo, sorbitolo e glucosio, sodio ascorbato, molto preferibilmente lo zucchero ? saccarosio.

3) Composizione secondo la rivendicazione 2 in cui la composizione comprende il copolimero, in particolare della formula generale HO[CH2CH2O]x[CH2CH(CH3)O]y[CH2CH2O]zH in cui preferibilmente x = 99, y = 67 e z = 99, in una quantit? tra il 20 e 25% (p/v), preferibilmente di 21 % (p/v), il polimero mucoadesivo, in particolare la carbossimetilcellulosa, in una quantit? tra 0,1 e 0,5 % (p/v), preferibilmente di 0,3 % (p/v) e lo zucchero, in particolare il saccarosio in una quantit? tra il 5 e 15% (p/v), preferibilmente di 8 % (p/v).

4) Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il L. reuteri ? presente in una concentrazione da 1 ? 10<8 >a 1 ? 10<9 >CFU/ml, in particolare in una concentrazione di circa 1 ? 10<9 >CFU/ml.

5) Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui la componente liquida della composizione ? realizzata da un tampone fosfato salino.

6) Liofilizzato ottenuto dalla liofilizzazione della composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.

7) Procedimento per la produzione della composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente le seguenti fasi:

(I) preparazione di tampone fosfato salino (PBS) e solubilizzazione di una sospensione batterica di L. reuteri al fine di ottenere una concentrazione desiderata preferibilmente verificata tramite assorbanza con taratura secondo la retta

ed evitando preferibilmente stress meccanici;

(II) solubilizzazione di desiderate quantit? di un polimero mucoadesivo, preferibilmente di natura cellulosica, in particolare carbossimetilcellulosa, e un copolimero poliossialchilenico, in particolare un copolimero poliossi-etilenico-propilenico, preferibilmente con la formula generale HO[CH2CH2O]x[CH2CH(CH3)O]y[CH2CH2O]zH nella sospensione batterica, in cui preferibilmente si integra prima il polimero mucoadesivo e successivamente il copolimero poliossi-alchilenico a temperature attorno a 0?C con successivo stoccaggio del sistema a circa 4?C per circa 12 ore per ottenere la completa solubilizzazione del polimero; e

(III) aggiunta di uno o pi? stabilizzanti, in particolare zuccheri, preferibilmente dopo l?avvenuta solubilizzazione dei polimeri.

8) Procedimento secondo la rivendicazione 7 comprendente inoltre la fase

(III) liofilizzazione del sistema ottenuto nella fase (II), in particolare a circa 4?C per circa 24 ore; e opzionalmente la fase di

(IV) ricostituzione del gel integrando il liofilizzato con una componente acquosa, in particolare con un tampone fosfato salino.

9) Kit comprendente:

(i) come prima componente un liofilizzato secondo la rivendicazione 6 o una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in forma liofilizzata; (ii) come seconda componente un liquido acquosa, in particolare un tampone fosfato salino; e opzionalmente

(iii) un erogatore, in particolare un erogatore non pressurizzato.

10) Metodo per verificare l?efficacia della prevenzione o del trattamento di mucosite orale, in particolare di mucosite orale radio-indotta, con L. reuteri che prevede l?analisi dell?espressione genica delle componenti implicati nel signaling della 3-IALD, come Cyp1A1, AhR, IL-10 e IL-22; dell?espressione di R-spondina 1; dell?espressione sistemica di AhR e/o dell?espansione dei linfociti T regolatori.