IT202100017843A1 - Sviluppo di un KIT per l’identificazione d’origine degli alimenti di origine animale, della valutazione dello stress animale e qualità della carne - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell?invenzione avente per TITOLO: ?Sviluppo di un KIT per l?identificazione d?origine degli alimenti di origine animale, della valutazione dello stress animale e qualit? della carne?,

DESCRIZIONE

Campo della tecnica

La presente invenzione riguarda l'identificazione di biomarcatori proteici per valutazione della qualit? della carne, l'autenticazione e/o la tracciabilit? dei prodotti di origine animale, ovvero l'identificazione della razza/specie di origine o dello stato di stress dell?animale a partire da substrati come carne, latte, etc. e il loro utilizzo nei metodi di screening.

Stato della tecnica preesistente

L'autenticazione di specie e razze negli alimenti di origine animale ? una delle maggiori preoccupazioni di molti paesi per ragioni sanitarie, economiche e religiose

. Oggigiorno, a causa della crescente domanda di prodotti alimentari pronti e quindi pi? trasformati, insieme a un numero maggiore di specie utilizzate nella dieta umana derivate dalla globalizzazione del mercato alimentare, sta diventando sempre pi? difficile identificare le specie di origine dei prodotti alimentari . Ad esempio, le carni intere vendute come carcassa o come tagli primari presentano, entro limiti, caratteristiche morfologiche riconoscibili che rendono pi? difficoltosa l'adulterazione. Tuttavia, un aumento del grado di lavorazione della carne (ad es. disossamento della carne, confezionamento sottovuoto, congelamento, macinazione, marinatura) ha portato a maggiori opportunit? di adulterazione

La fiducia dei consumatori nel cibo che mangiano dipende da una serie di fattori tra cui l'autenticit? . ? di fondamentale importanza che l'autenticit? sia verificata attraverso analisi in grado di valutare se le dichiarazioni sulle etichette degli alimenti corrispondono alla reale composizione del cibo . In questo contesto, l'Unione Europea e l'Autorit? Europea per la Sicurezza Alimentare hanno istituito un quadro legislativo e un sistema per la tracciabilit? degli alimenti al fine di garantire la sicurezza alimentare ?from farm to fork?, monitorando qualsiasi alimento e mangime durante tutte le fasi di produzione (European Communities, 2002; ).

Inoltre, idealmente la qualit? della carne dovrebbe essere valutata al macello con un metodo che dovrebbe essere rapido, poco costoso, accurato, non invasivo e non contaminante della carcassa. Ad esempio, la capacit? di ritenzione idrica (WHC) ? la capacit? della carne di trattenere l'acqua durante il taglio, il riscaldamento e la pressatura. Il WHC ha un'elevata importanza nella produzione di carne suina principalmente per le sue implicazioni economiche e anche perch? influenza direttamente sia la resa finale del prodotto che l'appetibilit? della carne con una grande influenza su attributi come succosit? e tenerezza. ? stato riportato che una perdita d'acqua inaccettabilmente elevata si verifica fino al 50% della carne di maiale prodotta. La perdita di acqua ? responsabile di una significativa perdita di peso nella carne cruda, cotta e lavorata; questa perdita pu? rappresentare fino al 10-12% del peso della carcassa. Inoltre, la carne che presenta elevate perdite essudative pu? presentare un aspetto e una consistenza scadenti (ad es. colore pallido, carne morbida)

Ad oggi, nessuna metodologia ? in grado di discriminare tra razze, mentre l'uso di osservazioni comportamentali dirette (es. utilizzando video di riconoscimento del comportamento) e di biomarcatori che possono riflettere le risposte fisiopatologiche allo stress sono le metodologie pi? comuni utilizzate per valutare lo stress negli animali

. Tuttavia, i criteri oggettivi per valutare lo stress animale devono essere migliorati. In effetti, i metodi di monitoraggio del comportamento animale sono laboriosi e comportano errori soggettivi mentre i biomarcatori di stress che vengono comunemente ricercati nel sangue o nel siero mancano di specificit? e/o convalida e spesso i risultati sono difficili da interpretare. Ad esempio, il cortisolo ? il marker pi? comune di stress, ma la sua concentrazione dipende da molti fattori come stress fisico o psicologico, condizioni ambientali e fattori metabolici, dando luogo a un'elevata variazione inter- e intra-individuale . Inoltre, il campionamento di questo substrato genera di per s? una sostanziale risposta allo stress negli animali (Merlot, Mounier, & Prunier, 2011). Sono stati testati anche substrati non invasivi e che causano poco stress come la saliva, ma la bassa concentrazione proteica di questo substrato, la variabilit? intrinseca e gli artefatti sperimentali durante la preparazione e l'analisi del campione sono alcuni dei principali limiti

Le misurazioni del pH dopo 45 minuti post mortem sono state comunemente utilizzate dall'industria della carne suina per ottenere un'indicazione precoce della qualit? finale della carne. Tuttavia, la correlazione generale tra pH e WHC ha una precisione del 52% e non ? soddisfacente per una corretta categorizzazione della carcassa. Negli ultimi anni sono stati sviluppati molti metodi per misurare il WHC, ma questi sono pi? adatti agli studi di ricerca piuttosto che alle applicazioni industriali (Alessio Di Luca, Hamill, Mullen, Slavov, & Elia, 2016).

Negli ultimi anni, le tecniche genomiche e proteomiche sono state utilizzate come strumenti per determinare le specie di origine e per valutare la qualit? della carne. Tali tecniche devono trovare un componente unico del latte or carne (DNA, proteine) che possa essere utilizzato come indicatore della specie di origine, qualit?, etc.

. La proteomica consente la caratterizzazione a livello proteico, ovvero il livello al quale la cellula, il tessuto e, in definitiva, l'animale reagisce all'ambiente. Per queste caratteristiche, la proteomica pu? essere utilizzata sistematicamente per cercare nuove proteine marker che possono essere utilizzate nell'autenticazione delle specie e per valutare efficientemente la qualit? della carne

In effetti, questi biomarcatori possono essere utilizzati per una valutazione precisa, efficiente e tempestiva del prodotto, che sarebbe di grande valore per l'industria per fornire al mercato dei consumatori prodotti di alta qualit?. Inoltre, il costo del cibo tradizionale per le piccole e medie imprese sar? ridotto. Tali biomarcatori possono anche avvantaggiare i consumatori in quanto viene costantemente garantito un prodotto alimentare della qualit? richiesta e viene assicurato un rapporto qualit?-prezzo nelle decisioni di acquisto.

La presente invenzione si propone di superare alcuni o tutti i problemi associati alla tecnica nota.

Riepilogo dell'invenzione

La presente invenzione si riferisce generalmente all'autenticazione e/o alla tracciabilit? di biomarcatori proteici di prodotti di origine animale in particolare a biomarcatori associati all'autenticazione delle razze/specie, alla risposta allo stress e alla valutazione della qualit? della carne. Ad esempio, fornisce metodi per prevedere la razza di origine nella carne di suino (es. autoctoni vs. suini industriali), nella carne e nel latte di capra (es. autoctoni vs. razze industriali), la risposta allo stress (esempio, stress da trasporto) nei suini, polli, etc. Un insieme preferito di biomarcatori proteici fornisce una firma molecolare rilevabile di autenticazione in un soggetto. Pi? in particolare ad esempio, secondo un primo aspetto dell'invenzione viene fornito un metodo per lo screening della presenza nei prodotti a base di carne (es. suini, caprini, volatili) di razze autoctone e non.

In un secondo aspetto, fornisce un metodo per valutare il livello di stress dell'animale.

In un terzo aspetto, fornisce un metodo per valutare la qualit? della carne (esempio, ritenzione idrica, tenerezza, etc.).

In un altro aspetto, fornisce un metodo per valutare l'origine del latte e dei prodotti contenente il latte e prodotti lattiero-caseari freschi e stagionati.

Nella presente invenzione, l'espressione "rilevamento" si riferisce a qualsiasi uso di qualsiasi metodo di osservazione, accertamento o quantificazione dei segnali indicativi della presenza della proteina in un campione o la quantit? assoluta o relativa di detta proteina bersaglio in un campione.

La quantificazione del biomarcatore pu? corrispondere alla misurazione della quantit? o alla misurazione di un?alterazione nella quantit? del biomarcatore, pi? in particolare ad un aumento o una diminuzione della quantit? del biomarcatore.

I biomarcatori proteici possono essere rilevati nei campioni utilizzando un anticorpo specifico per ciascuna proteina (biomarcatore proteico), per esempio in un test ELISA o Western blotting. In alternativa, le proteine differenzialmente espresse possono essere rilevate mediante, tra gli altri, elettroforesi su gel 2D o tecniche di spettrometria di massa, comprese le LC-MS/MS, SRM-MS, etc.

Descrizione dettagliata dell?invenzione

I biomarcatori e i metodi associati sono stati identificati attraverso l'analisi dell'abbondanza di proteine in diverse matrici (ad esempio muscolo, latte) in diverse specie e razze.

Mentre i campioni muscolari preferiti sono diaframma e longissimus thoracis et lumborum, pettorali caudale, fegato ? contemplato che un campione appropriato possa essere derivato da qualsiasi muscolo, come tricipiti, intercostali, ecc. e/o altri tessuti animali (esempio, polmone, etc.).

? inoltre previsto che queste tecniche e classi di pannelli marcatori possano essere utilizzate per valutare le razze, specie, la qualit? della carne e il livello di stress in altri animali.

Il campione pu? essere trattato prima dell'uso mediante tecniche convenzionali, come la preparazione del siero del latte, campionamento del muscolo e simili. I metodi di trattamento del campione possono includere la filtrazione, estrazione, concentrazione, inattivazione di componenti interferenti, aggiunta di caotropi, aggiunta di reagenti e simili. Le proteine possono essere isolate e i loro livelli di espressione per gli analiti descritti di seguito possono essere anche usati nei metodi dell'invenzione.

Il presente studio applicando tecniche di proteomica ha identificato in diverse matrici (muscolo, latte, etc.) nuovi biomarcatori proteici. Un totale di 1395 biomarcatori sono stati identificati. Pi? in particolare ad esempio, secondo un primo aspetto dell'invenzione viene fornito un metodo per lo screening nei prodotti a base di carne (fresca e/o stagionata) della specie/razza utilizza (suini, caprini, volatili, etc.).

In un secondo aspetto, vengono forniti metodi per aiutare o che sono in grado di valutare il livello di stress dell'animale prima o dopo la macellazione (es. stress da trasporto).

In un terzo aspetto, vengono forniti metodi per aiutare o che sono in grado di valutare la qualit? della carne (es. ritenzione idrica, tenerezza, etc.).

In un altro aspetto, vengono forniti metodi per aiutare o che sono in grado di valutare l'origine del latte e dei prodotti contenente il latte e prodotti lattiero-caseari freschi e stagionati.

La presente divulgazione ? vantaggiosamente utilizzata per lo screening della qualit? della carne, l'autenticazione e/o la tracciabilit? dei prodotti di origine animale e dello stress animale. Tuttavia, i metodi di divulgazione non dovrebbero essere considerati limitati esclusivamente all'individuazione del tipo di razza/specie, qualit? carne o di fattori di stress nel muscolo o nel latte. Piuttosto, i metodi dell'invenzione possono essere utili anche nello screening di prodotti animali. Ad esempio, un campione di carne di un prodotto animale per uno o pi? biomarcatori selezionati dal gruppo definito in Tabella 1 per suino, in cui la presenza o in/diminuita espressione di uno o pi? biomarcatori rispetto al campione di Nero d'Abruzzo ? indicativo che la carne del prodotto ? stata raccolta dalla razza Nero d'Abruzzo.

Si prevede inoltre che le classi di biomarcatori individuate dalla presente divulgazione possano trovare applicazione anche per la valutazione delle razze/specie, qualit? della carne e del livello di stress in altri animali.

Campioni per lo screening

Il campione per lo screening pu? includere qualsiasi muscolo o tessuti animali come diaframma, longissimus thoracis et lumborum, intercostali, pettorali caudale, fegato, ecc. e tutte le loro possibili combinazioni, secrezioni come il latte e derivati.

Il campione pu? essere preparato con qualsiasi metodo convenzionale per estrarre proteine da un campione biologico. Un metodo esemplare dall'essudato muscolare pu? essere trovato in Biomarcatori

La presente divulgazione fornisce una serie di biomarcatori che possono essere rilevati direttamente da campioni di carne, tessuti animali o secrezioni e che si sono dimostrati indicatori affidabili per la presenza di razze specifiche, specie, qualit? della carne e fattori di stress negli animali.

I biomarcatori identificati sono elencati nella Tabella 1. In un aspetto, i metodi dell'invenzione selezionano pi? di un biomarcatore dal gruppo definito nella Tabella 1, per esempio due, tre, quattro, cinque, sei, sette, otto, nove, dieci, ottanta, novanta, cento, trecentoventinove dei biomarcatori del gruppo definito in Tabella 1 per lo screening nei prodotti a base di carne della specie/razza utilizza (suini, caprini, volatili, etc.). Ad oggi nessuna metodologia ? in grado di discriminare tra le razze/specie.

In un secondo aspetto, i metodi dell'invenzione selezionano pi? di un biomarcatore del gruppo definito nella Tabella 1, ad esempio due, tre, quattro, cinque, sei, sette, otto, nove, dieci, ottanta, novanta, centosessantacinque, quattrocentodiciassette dei biomarcatori del gruppo definito nella Tabella 1 per lo screening del livello di stress negli animali (esempio stress da trasporto). Questo metodo dell?invenzione fa uno screening per uno o pi? biomarcatori aventi un potere discriminatorio superiore al cortisolo. In altre parole, l'uno o pi? biomarcatori hanno una maggiore sensibilit? e specificit? rispetto al cortisolo nel rilevare la presenza di fattori di stress negli animali.

In un terzo aspetto, i metodi dell'invenzione selezionano pi? di un biomarcatore del gruppo definito nella Tabella 1 per la qualit? della carne (es. ritenzione idrica, tenerezza), ad esempio due, tre, quattro, cinque, sei, sette, otto, nove, dieci, venti, trenta, quarantuno, centouno dei biomarcatori del gruppo definito in Tabella 1.

Nel quarto aspetto, i metodi dell'invenzione selezionano pi? di un biomarcatore del gruppo definito nella Tabella 1 per lo screening del latte dei prodotti contenente il latte e prodotti lattiero-caseari freschi e stagionati., ad esempio due, tre, quattro, cinque, sei, sette, otto, nove, dieci, venti, ventinove, ottanta, cento dei biomarcatori del gruppo definito in Tabella 1.

TABELLA 1

La seguente tabella elenca i biomarcatori identificati nella presente invenzione per la presenza o l'aumentata espressione di uno o pi? proteine:

Accession Number

1 A0A286ZN24

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J9JIK8 A0A287AE58 A0A287ACN2 F1SQ10 F1SA96 F1SGM1 F1RJ93 A5PF00 A0A286ZXA4 F1SJB5 K7ZRK0 E0AD19 A0A2C9F356 F1RIF8 A0A287BQ72 A0A287AFE3 F1SUC9 A0A287B5Z7 I3LK50 I3LNC7 A0PA00 I3LGH6 A0A287AA21 A0A287A784 I3LIN5 F1RX36 A0A287AII8 Q8WNY6 F1RH19 K9IVP8 F2Q9A3 A0A287A531 A0A287AF47 A0A287AK19 B3CL06 A0A287AZJ9 A0A287ALA0 F1RGK5 A0A287AHU1 F1SLX2 A0A287A5T1 A0A286ZIJ9 I3L704 A0A287B4G4 I3L8H4 I3LJA6 I3LLH5 A0A2C9F3C5 F1S3H9 F1SMX5 A0A287BNK4 A0A287BBB5 A0A287A6V9 A0A287B826 A0PA01 F1S1E7 A0A287AX98 F1RFE3 F1SJC2 I3L9I6 F1RQW7 B5APU6 A0A286ZUK6 F1SUW2 Q0Z8R0 A0A287AJU1 A0A287AH70 F1RJS3

F1RKG2 A0A287AV07 A0A286ZSJ7 F1RVS9 F1S574 F6PYW2 Q19QT8 F1SDJ8 A0A287AIM8 A0A287AZR0 M9MMN4 F1S432 L8B0V6 F1RYQ0 A0A286ZRJ3 I3LEN7 I3LUR7 B8XSK0 K7GQY9 A0A287ASW4 I3LGI8 A0A286ZWS0 F1S0N2 F2Z5V1 F1S415 F1S8H8 I3LK68 A0A287AEC1 A0A286ZHZ3 A0A286ZVG3 H6TBN0 F1SN68 A0A287AYR8 A0A287BB72 F8SUW1 A0A287BIL8 I3LP41 F1S1G8 A0A287B9B3 A0A287BPN0 A0A287ARC8 L8B0S2 A0A287BPJ1 A0A287AI92 I3LEI8 A0A287ARJ8 F1RHE6 F1SN71 A0A287B8Z2 F1RG45 G8G223 A0A287AUT0 I3LRJ4 A0A286ZTU7 F1SFI5 A0A286ZVF6 A0A287A278 F1RUM4 A0A287ARR1 A8U4R4 A0A287BAY9 F1SCC7 A0A287AT21 A0A286ZTC4 F1SFI4 I3LN42 A0A287B7P2 F1SGS9 K7GSW5 A0A287BJF1 F1RKY2 A0A286ZIF4 I3L7D6 F1RIF3 A0A068F143 F1RQ75 I3LQS0 F1SBS4 F1SRI8 F1SCF0 F2Z594 A0A287A363 K9IVR7 F1RXC2 E0D7H7 I3LIM2 F1SV14 F1RIP3 F1SRC5 A0A287ANV7 A0A2C9F3C3 F1RX37 F1S3H7 I3LVD5 Q58G70 F1S232 A0A286ZIM7 A0A287ADI8 I3LQ57 A0A287BN06 I3LDM7

I3LBF1 I3LCC7 F1S9H9 F1RMN7 F1SLZ3 A0A287BQT2 F1RQM4 A5A8W8 A0A286ZTB0 I3LC10 I3LD43 F1S0B9 F1SH92 A0A287AMB2 A0A287A7R5 I3LP02 A0A287AFK2 A0A287BGY0 A0A286ZTC9 F1SMJ1 E1CAJ5 A0A287A608 B3STX9 A0A286ZWJ9 F2XWZ9 F1SB81 A0A287AC34 F1S7K2 A0A287ALP4 F2Z5E2 F1RNW4 A0A2C9F3B1 L8AXL9 F1S4X9

A0A287ANU5 F1SQ01 A0A287B800 K7GQS5 A0A2C9F393 F1RKJ9 I3LS60 F1SR05 A0A287BG23 A7E1S9 G9F6X8 F1RMT5 I3VKE6 L8AXM5 A0A287AIE4 F1RUS8 A0A287B8G0 F1S5H7 A0A286ZRV2 F1RF31 A0A287AF76 A0A287A1V5 F2Z4Y7 Q2HYU1 A0A287B0N7 F1S5J3 F1S2E2 I3L9N5 A0A287AG13 A0A287A725 A0A024BTL2 A0A287A5M7 F1S1X3 I3LQH7

F1S9Q3 A0A287AQK7 A0A287ATD7 F1SBA5 I3LNG8 A0A287B3F4 A0A287AKT7 K7GSI9 A0A287AZB0 I3LFR2 A0A286ZJK1 I3LEQ7 A0A287ARU4 F1SGD7 A0A287AZ91 F2Z5J9 A0A286ZYW6 A0A287A291 F1SN05 F1S5N8 A0A287A194 K7GNZ3 K7GRY0 F1RFV5 C1PIG4 A0A287BSL7 M3VH45 M3VK13 A0A287A042 F1SB16 I3LVF5 F2Z4Z1 F1SV04 A0A287AMP3 A0A287A1Z9 Q8WMK2 B6VAQ2 F1RQQ8 F1S2K3 A0A287BSE8 F1RII7 F1SQN1 F1S814 F1SQ89 F1SSF5 F1RYU9 F1S7W3 F1RN71 F1RGX4 A0A287AV98 A0A287A690 A0A287BB89 F1S663 F1SIS9 F2Z540 A0A287AIP7 F1S8Y0 A0A452FV98 A0A452F4U3 A0A452EQV3 A0A452E9L8 A0A452EN73 A0A452F308 A0A452ET82 A0A452F4M2 A0A452ENA3 A0A452F5L1 A0A452FJF9 A0A452EBL1 A0A452G2F7 A0A452DZD6 A0A452FHG1 A0A452G990 A0A452G686 A0A452EK60 A0A452FGQ8 A0A452FKN8 A0A452EC94 A0A452EW54 A0A452FWT8 A0A452EVA0 A0A452G9P0 A0A097C2Z1 A0A452F4D5 A0A452FI94 A0A452F919 A0A452EKS9 A0A452DP52 A0A452F4A3 A0A452EST7 A0A452EWN3 A0A452EJT8 A0A452DSI4 A0A452G2Q3 A0A452FIA0 A0A452EXW7 A0A452GAE9 A0A452EHC4 A0A452E570 A0A452FS72 A0A452EJD6 A0A452FZ19 A0A452FST7 A0A452EKH4 A0A452G9S2 A0A452DUT2 A0A452FEE2 A0A452DLF9 A0A452ELU5 A0A452ECP7 A0A452DTR0 A0A452E2Y0 A0A452FJL5 A0A452FLI7 A0A452G270 A0A452FYF5 A0A452FTI8 A0A452EMT6 A0A452ENH1 A0A452E633 A0A452EJ76 A0A452F1S1 A0A452FX49 A0A452DUC4 A0A452FP98 A0A452F4M6 A0A452G069 A0A452F327 A0A452G8Z0 A0A452DWP9 A0A452FIW7 A0A452F1P8 A0A452EHA4 A0A452EDQ1 A0A452FUS0 A0A452EL14 A0A452FIG7 A0A452G4W5 A0A452FWP3 A0A452FFJ4 A0A452DU61 A0A452EPE5 A0A452E9A0 A0A452FEP4 A0A452EW28 A0A452EU44 A0A452F9C0 A0A452ETL2 A0A452F4J5 A0A452DMC5 A0A452E0G5 A0A452E5T3 A0A452E6F8 A0A452EC09 A0A452G497 A0A452EIZ0 A0A452FTG3 A0A452EMB1 A5YV76 K7GND8 A0A287BF33 F2Z5B1 A0A287BM29 F1S0J2 A0A287B3S3 A0A287AQ20 A0A287BJ64 F1RWI8 A0A286ZXN4 A0A286ZFW3 A0SEH2 A0A286ZX26 I3LIE7 F1SMN5 F1REW5 F1S564 F1S9T0 L8B0U3 I3L9V2 Q0PM28 F1SFI6 A6YNL5 A0A287BJR8 R4H1Z8 F1SC80 I3L677 A0A287APX6 F1SLU6 F1S682 A0A287BH90 A0A287BRF1 E7D6R2 F1RXM6 O77657 A7E1S8 K7GR72 A0A287BJQ6 A0A286ZKH3 F1RHN1 A0A286ZIZ4 A0A287A217 F1SSI1 M3V815 F1SHU0

A0A286ZJV6 F1RMZ8 F1RZN7 A0A286ZNR9 A0A287AVV2 A0A287B1T7 A0A287AP73 F1RN41 F1SDN2 I3LF89 Q75NH3 A0A287BEZ5 A0A287AFF5 A0A287ATJ4 K7GNK7 A0A287A793 A0A286ZW70 A0A287A286 F1S325 F1SS66 F1SS26 C6L245 Q8HZW2 A0A286ZP65 I3LUD1 A0A286ZMS2 E7EI20 D6QST6 I3LIB5 Q2TJA5 F1S066 A0PFK5 F1RGN8 A0A287APK5 L8B0Y6 D0G0C9 A0A287ARC6 K9IW73 A0A287B959 A0A287A044 Q684M6 A0A287A211 A0A287AFQ4 I3L7Z6 A0A287A9M0 L8B180 L8AXK8 F1RPS8 A0A287BG25 F1RSG9 Q29286 I3LDC7 A0A2C9F3E2 A0A287BA50 I3L638 A0A286ZNH3 I3LR51 F1RK01 A0A287A703 A0A286ZLR0 A0A287BEH6 F1RX93 F1SCC6 A0MWC5 A0A1B2TT50 A0A287B443 A0A287AA47 A1XQT5

F1SI09 A0A287BR93 Q19PY1 F1RRD6 F1RPH0 A0A2C9F380 F1SSL6 Q9N0M7 A0A286ZXD9 F1RWJ6 B5KJG2 A0A286ZXV0 F1SMQ4 I3LHC8 F1S4J7 A0A287AT18 F2Z5L7 A0A287BPP9 F1S7K4 A0A287AGG3 A5GFT5 F1S0C1 A0A287BDV9 F2Z5R6 A0A286ZXT7 A0A286ZYS8 F1RX84 A0A287B6J6 F1SRB9 A0A287BQU9 A0A287A424 F2Z5K2 A0A287BIV4 F1SKY2

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K7GNY9 A0A286ZQ31 I3LAB6 A0A287AYJ0 F1SK00 F1RNX2 F1S8D4 A0A286ZL79 A0A287BHP0 F6PVY0 A0A287BHL2 A0A286ZND5 I3L8U8 I3LEY2 I3LLU0 A0A287BNE4 A0A1B2TT55 A0A287BAM0 A0A286ZQC1 A0A2C9F397 A0A287AG25 B5APU4 F1RUK8 I3LR41 A0A287BGW4 A0A287AZ17 F1SV59 I3LL97 F1RPW9 I3LTC6 A0A287AFJ9 F1RGF7 A0A286ZRE7 B1Q0K1

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1196 Q5ZMB8 1197 A0A3Q2TZM7 1198 A0A3Q2TUW7 1199 Q5ZJT7 1200 F1N9H4 1201 A0A1D5PDE6 1202 F1NB66 1203 F1P0N2 1204 A0A3Q2U6I8 1205 A0A3Q3AZM2 1206 Q5ZL50 1207 A0A1L1RZK1 1208 A0A1L1RPT1 1209 E1BZ03 1210 A0A3Q2UD70 1211 Q6LDD0 1212 A0A1D5P0U5 1213 R9PXM5 1214 F1NSP7 1215 F1NSK8 1216 A0A3Q2U9M3 1217 E1C4M6 1218 A0A3Q2U839 1219 A0A1D5P3I6 1220 A0A3Q2U434 1221 A0A1D5P9K2 1222 A0A3Q2U7L8 1223 A0A1D5P6F4 1224 A0A1L1RZV0 1225 F1NBV0 1226 A0A1I7Q422 1227 A0A1D5NUH1 1228 H9NDQ3 1229 A0A1L1RSI2 1230 E1C7A7 1231 Q5ZKJ2 1232 E1C6V0 1233 Q5ZLX9 1234 A0A1L1RYL5 1235 A0A1D5PM92 1236 A0A3Q2U4M1 1237 A0A1D5NW27 1238 A0A1L1RXA3 1239 F1NM03 1240 A0A1L1RQ91 1241 Q5ZJV0 1242 F1NI05 1243 A0A1L1RRR1 1244 A0A1D5PUA5 1245 Q90ZG0 1246 F1P331 1247 Q8AYP8 1248 Q58I02

1249 F1NMY1 1250 Q5ZM58 1251 R4GMB6 1252 F1NJV4 1253 A0A3Q3A970 1254 F1NC33 1255 F1NBZ6 1256 F1NUI2 1257 A0A3Q3ANZ2 1258 A0A3Q2UAA5 1259 A0A452J7V2 1260 A0A3Q3AIE0 1261 E1C6J9 1262 A0A1L1RLL0 1263 F1NF81 1264 A0A3Q2UF40 1265 Q5ZIE2 1266 E1BXC2 1267 F1NQG5 1268 A0A3Q2U5Z0 1269 A0A3Q2U6M6 1270 A0A1D5PNU2 1271 A0A1L1RY95 1272 A0A3Q2U474 1273 Q5ZHW6 1274 A0A3Q2UCH4 1275 Q5ZJX9 1276 A0A1D5PEL7 1277 A0A1L1RQQ1 1278 F1NMK5 1279 Q5ZJY1 1280 E1C6N0 1281 A0A1D5PCD2 1282 F1NYA2 1283 D5M8S2 1284 A0A1L1RSN3 1285 Q5ZMN1 1286 A0A3Q3AQH7 1287 A0A1D5P650 1288 A0A1D5P6V5 1289 A0A1D5P2K1 1290 F1NSZ4 1291 F1NMT5 1292 A0A3Q2TV88 1293 E1BXR1 1294 A0A1D5PLI5 1295 Q5ZIA3 1296 A0A3Q2TZ57 1297 A0A3Q2U0E4 1298 A0A3Q3AT29 1299 Q5ZIP7 1300 F1NNP6 1301 A0A1S5WGN8 1302 A0A1D5PLW0 1303 A0A1D5NXK7 1304 Q5ZL15 1305 A0A452J848 1306 A0A3Q2UF48 1307 C7G537 1308 A0A1D5NYF3 1309 A0A1L1RN46 1310 F1NU56 1311 E1BSN7 1312 A0A1D5PI23 1313 E1BZS2 1314 A0A1L1RT94 1315 A0A1L1RX77 1316 A0A452J7Z5 1317 E1C5A3 1318 A0A1L1RNL6 1319 E1BRC1 1320 A0A1D5PC23 1321 Q5F3D2 1322 A0A1D5PH14 1323 F1NQT9 1324 F1NJ53 1325 E1BY89 1326 E1BQN9 1327 A0A1D5PJ18 1328 A0A1D5PSF9 1329 A0A1D5NXA6 1330 F1NHA9 1331 A0A3Q2UBQ4 1332 A0A1D5PB69 1333 F1NQ35 1334 Q5ZKH1 1335 A0A3Q3AS95 1336 G1K338 1337 A0A1D5PAE3 1338 R4GMD9 1339 Q91008 1340 Q9I882

1341 Q9IAR9 1342 Q9PS17 1343 E1C3U6 1344 A7UEB0 1345 A0A3Q2TYR0 1346 P79757

1347 F1P541 1348 E1BSH9 1349 E1C5Z5 1350 F1N9J4 1351 A0A1D5NYX1 1352 A0A1D5PXT0 1353 F1NKW4 1354 A0A3Q2U3Y5 1355 A0A3Q3ALF0 1356 A0A3Q2UEJ5 1357 O57484 1358 E1C123 1359 Q2PBA1 1360 Q5ZI14 1361 Q5F412 1362 F1P5G4

1363 A0A3Q2TU97 1364 Q6KDZ1 1365 A0A1D5PAA8 1366 Q7T0B7 1367 A0A3Q2TVV5 1368 A0A1D5PPP9 1369 A0A1D5PN46 1370 F1NQS2 1371 Q98TF9

1372 A0A3Q2U9U9 1373 F2Z4L4

1374 A0A0A0MQ61 1375 A0A3Q3AC33 1376 A0A1D5P462 1377 E1C6T8

1378 A0A3Q8WI14 1379 A0A1D5NXY4 1380 E1BU93 1381 A0A3Q2TW12 1382 A0A1D5PEK3 1383 A6BLM7 1384 A0A3Q2UMW0 1385 A0A1D5PNV5 1386 E1C7T1

1387 Q9DEH4 1388 A0A1D5PEM4 1389 A0A1D5P1R0 1390 A0A1D5PPG9 1391 A0A3Q2UGU7 1392 Q5ZM47 1393 A0A1D5NYI5 1394 Q08243

1395 A0A1D5PJJ4 Metodi di screening

Nella presente invenzione, il campione biologico, ad esempio il campione di latte, pu? essere sottoposto a screening per uno o pi? biomarcatori utilizzando la spettrometria di massa (mirata). La scoperta e lo screening di marcatori proteici mediante LC-MS/MS e il rilevamento di marcatori proteici basato su ipotesi mediante SRM-MS sono stati applicati in precedenza su campioni animali ( Inoltre, i biomarcatori proteici possono essere rilevati nei campioni utilizzando un anticorpo specifico per ciascuna proteina (biomarcatore proteico), per esempio in un test ELISA o Western blotting.

Materiali e metodi

Al fine di comprendere ulteriormente le differenze biologiche tra razze, specie e condizioni di stress, abbiamo utilizzato diverse tecniche di proteomica come il ?label-free LC-MS? e il Western blot per caratterizzare il proteoma di diverse matrici come l'essudato muscolare, secrezioni, etc. di diversi animali.

La concentrazione proteica di tutti i campioni ? stata determinata in triplicato utilizzando il Bio-Rad Protein Assay Kit seguendo il metodo Bradford utilizzando uno standard BSA.

Dopo l'estrazione delle proteine, uguali concentrazioni di tutti i campioni di proteine sono stati purificati e digeriti utilizzando il metodo ?Filter Aided Sample Preparation? (FASP), purificati e quindi analizzati mediante spettrometria di massa (label-free LC/MS analysis). La quantificazione Label-free MS, una forma di " shotgun proteomics?", ? un metodo per misurare le concentrazioni di peptidi in campioni complessi utilizzando una combinazione di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e MS. Il metodo comparativo LC-MS opera sull'osservazione che i volumi di picco dei peptidi in LC-MS sono proporzionali all'abbondanza relativa dei peptidi all'interno del campione. Confrontando i volumi di picco MS su pi? esecuzioni LC-MS, ? possibile effettuare un confronto quantitativo relativo su molti peptidi e, infine proteine. La LC-MS comparativa ha dimostrato di essere riproducibile ed ? un potente approccio per le analisi proteomiche quantitative. La tecnica di LC-MS comparativa ? conveniente e relativamente semplice, tuttavia, ci sono una serie di considerazioni tecniche e di interpretazione dei dati. ? necessario un sistema LC altamente riproducibile per facilitare l'allineamento dei picchi LC-MS e i confronti tra le corse MS separate. Inoltre, il gran numero di esecuzioni LC-MS genera una grande quantit? di dati, in particolare per campioni complessi, e questi dati devono essere elaborati per estrarre dati significativi. In commercio sono disponibili numerosi pacchetti software ?open source? progettati per elaborare questi dati, tutti progettati per gestire questi dati utilizzando tecniche diverse. L'analisi Western blot ? stata quindi utilizzata per confermare alcune delle proteine identificate dall'analisi label-free LC/MS. Western blot viene utilizzato per rilevare proteine specifiche in un dato campione. Una volta che le proteine sono state separate in una dimensione mediante elettroforesi su gel (viene utilizzato per separare proteine cariche in un campo elettrico), vengono quindi trasferite mediante elettroforesi e immobilizzate su una membrana (PVDF o nitrocellulosa), dove vengono sondate (rilevate) utilizzando anticorpi specifici per la proteina bersaglio. Dopo che le sonde non legate sono state lavate via, il Western blot ? pronto per il rilevamento delle sonde etichettate e legate alla proteina di interesse. Sono disponibili diversi metodi per il rilevamento delle proteine, come il rilevamento chemiluminescente, il rilevamento fluorescente, il rilevamento radioattivo o il rilevamento colorimetrico.

Claims (5)

RIVENDICAZIONI dell?invenzione avente per TITOLO: ?Sviluppo di un KIT per l?identificazione d?origine degli alimenti di origine animale, della valutazione dello stress animale e qualit? della carne?, RIVENDICAZIONI (Italiano)

1. Metodo per lo screening della presenza di razze/specie specifiche, nella carne e prodotti a base di carne, il metodo comprende: i campioni ottenuti da muscolo e/o altri tessuti animali o un prodotto trasformato fresco e stagionato contenente muscolo e/o altri tessuti animali (carne, fegato, polmone, etc.) per uno, due o pi? biomarcatori dall'elenco.

2. Metodo per lo screening del livello di stress negli animali, il metodo comprende: i campioni ottenuti da secrezioni animali (saliva, latte, etc.), dal muscolo e/o altri tessuti animali (carne, fegato, polmone, etc.) per uno, due o pi? biomarcatori dall'elenco.

3. Metodo per lo screening della qualit? della carne, il metodo comprende: i campioni ottenuti dal muscolo e/o altri tessuti animali o un prodotto trasformato fresco e stagionato contenente muscolo e/o altri tessuti animali (carne, fegato, polmone, etc.) per uno, due o pi? biomarcatori dall'elenco.

4. Metodo per lo screening della presenza di razze/specie specifiche dal latte e prodotti lattiero-caseari, il metodo comprende: i campioni ottenuti dal latte tal quale, latticini freschi o stagionati o da prodotti contenente latte per uno, due o pi? biomarcatori dall'elenco.

5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la rilevazione di dette proteine differenzialmente espresse (biomarcatori) ? ottenuta utilizzando un anticorpo proteina specifico, spettrometria di massa o elettroforesi su gel bidimensionale.