IT202100011903A1

IT202100011903A1 - Procedure for the treatment of biological, cytological, histological and autopsy samples.

Info

Publication number: IT202100011903A1
Application number: IT102021000011903A
Authority: IT
Inventors: Carmelo Lupo; Nadia Casatta; Giorgio Manenti; Ottaviano Bussi; Paolo Danzi; Alberto Battistel
Original assignee: Diapath S P A
Priority date: 2021-05-10
Filing date: 2021-05-10
Publication date: 2022-11-10

Description

DESCRIZIONE dell?invenzione avente per titolo: DESCRIPTION of the invention entitled:

?Procedimento per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici? ?Procedure for the treatment of biological, cytological, histological and autoptic samples?

Riassunto dell?invenzione Summary of the invention

La presente invenzione si riferisce a un procedimento per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici, in particolare a un procedimento per effettuare i trattamenti di fissazione e/o disidratazione e/o chiarificazione e/o infiltrazione in paraffina di campioni che comprende l?irrorazione continua dei detti campioni. The present invention relates to a process for the treatment of biological, cytological, histological and autopsy samples, in particular to a process for carrying out the treatments of fixation and/or dehydration and/or clarification and/or paraffin infiltration of samples which comprises continuous spraying of said samples.

Contesto Tecnico Technical context

La diagnosi anatomo-patologica ? il risultato dell?interpretazione da parte dell?anatomopatologo delle caratteristiche morfologiche, macroscopiche e microscopiche, del campione biologico in esame. The anatomical-pathological diagnosis? the result of the interpretation by the pathologist of the morphological, macroscopic and microscopic characteristics of the biological sample under examination.

Per fornire una diagnosi accurata e completa, il campione escisso dal paziente deve essere sottoposto ad una serie di trattamenti che hanno lo scopo di assicurare la sua conservazione nel tempo. Tali trattamenti prevedono sostanzialmente: To provide an accurate and complete diagnosis, the sample excised from the patient must undergo a series of treatments which aim to ensure its conservation over time. These treatments essentially include:

i. fissazione; the. fixation;

ii. disidratazione; ii. dehydration;

iii. chiarificazione; e iii. clarification; And

iv. infiltrazione in paraffina. iv. paraffin infiltration.

Il primo stadio di tali processi consiste nella fissazione del campione in una soluzione di formalina neutra tamponata al 10%, che ? in grado di minimizzare i fenomeni di degradazione causati dalla rimozione del tessuto dal proprio ambiente vitale e dall?eventuale presenza di microrganismi. The first stage of these processes consists in the fixation of the sample in a 10% neutral buffered formalin solution, which is ? capable of minimizing the degradation phenomena caused by the removal of the tissue from its vital environment and by the possible presence of microorganisms.

Dopo la fissazione, il campione viene di norma disidratato mediante svariati passaggi successivi con soluzioni etanoliche a concentrazione crescente, fino ad etanolo al 99% e successivamente chiarificato con xilene. Questi passaggi hanno lo scopo di rimuovere l?acqua dal campione per permettere la sua successiva infiltrazione con paraffina, che ? una sostanza idrofoba. After fixation, the sample is normally dehydrated by several successive passages with ethanolic solutions of increasing concentration, up to 99% ethanol and subsequently clarified with xylene. These steps have the purpose of removing the water from the sample to allow its subsequent infiltration with paraffin, which is a hydrophobic substance.

I vari passaggi del trattamento di disidratazione (con soluzioni etanoliche) hanno lo scopo di sostituire l?acqua all?interno del tessuto con soluzioni ad idrofobicit? crescente per rendere possibile la penetrazione della paraffina che ? una sostanza del tutto idrofoba. L?infiltrazione in paraffina finale ? necessaria per rendere il campione sufficientemente solido da potere essere tagliato in sezioni micrometriche, per essere successivamente colorato e analizzato. The various steps of the dehydration treatment (with ethanolic solutions) have the aim of replacing the water inside the tissue with hydrophobic solutions. growing to make possible the penetration of the paraffin that ? a completely hydrophobic substance. The final paraffin infiltration? necessary to make the sample solid enough to be cut into micrometric sections, to be subsequently stained and analyzed.

Generalmente, dopo la fissazione in formalina, un protocollo di trattamento di disidratazione e chiarificazione prevede di sottoporre il campione ai seguenti passaggi: Generally, after formalin fixation, a dehydration and clarification treatment protocol involves subjecting the sample to the following steps:

- trattamento con alcol 70%; - treatment with 70% alcohol;

- trattamento con alcol 90%; - treatment with 90% alcohol;

- trattamento con alcol 99% (tre volte); e - treatment with 99% alcohol (three times); And

- trattamento chiarificante con xilene (tre volte). - clarifying treatment with xylene (three times).

Dopo il passaggio di chiarificazione con xilene, che ? in grado di rimuovere l?alcol e aumentare nettamente la compatibilit? con la paraffina, in termini di idrofobicit?, il tessuto viene infiltrato, generalmente mediante tre bagni consecutivi di paraffina fusa alla temperatura di circa 60?C. Il triplice passaggio consente di ottenere un tessuto infiltrato privo di xilene, che viene rilasciato dal campione soprattutto nel primo bagno di paraffina. After the xylene clarification step, what is it? able to remove? alcohol and clearly increase the compatibility? with paraffin, in terms of hydrophobicity, the tissue is infiltrated, generally by means of three consecutive baths of melted paraffin at a temperature of about 60°C. The three-step process results in a xylene-free infiltrate tissue, which is especially released from the sample in the first paraffin bath.

Dopo l?infiltrazione in paraffina, il campione pu? essere incluso in un blocchetto di paraffina e tagliato al microtomo. After infiltration in paraffin, the sample can be embedded in a paraffin block and microtome cut.

Per la loro processazione, i campioni, all?interno di apposite cassettine, vengono immersi per un certo periodo nel liquido adatto a ciascun trattamento, poi recuperati e immersi nel liquido del trattamento successivo. For their processing, the samples, inside special boxes, are immersed for a certain period in the liquid suitable for each treatment, then recovered and immersed in the liquid for the subsequent treatment.

I trattamenti (ii), (iii) e (iv) sopra riportati richiedono notevole tempo ed energia, oltre all?impiego di grandi quantit? di solventi. The treatments (ii), (iii) and (iv) reported above require considerable time and energy, in addition to the use of large quantities of solvents.

Un comune protocollo prevede infatti l?utilizzo di 4-5 litri di solvente per ogni singolo passaggio. Si noti che per le seguenti lavorazioni: In fact, a common protocol calls for the use of 4-5 liters of solvent for each single step. Note that for the following processes:

- trattamento con alcol 70% (disidratazione); - treatment with 70% alcohol (dehydration);

- trattamento con alcol 90% (disidratazione); - treatment with 90% alcohol (dehydration);

- trattamento con alcol 99% (tre volte) (disidratazione); - treatment with 99% alcohol (three times) (dehydration);

- trattamento chiarificante con xilene (tre volte); e - clarifying treatment with xylene (three times); And

- trattamento di infiltrazione in paraffina (tre volte). - paraffin infiltration treatment (three times).

vengono impiegati complessivamente circa 40-45 litri di solventi (alcol e xilene) ogni circa 1000 campioni, oltre alla paraffina che viene utilizzata per l?infiltrazione, circa 10-15 litri per ciclo di processazione, in un procedimento che dura circa 14 ore. a total of about 40-45 liters of solvents (alcohol and xylene) are used for every about 1000 samples, in addition to the paraffin which is used for the infiltration, about 10-15 liters per processing cycle, in a process that lasts about 14 hours.

Esiste pertanto la necessit? di disporre di nuove tecniche e reagenti che permettano di ottenere campioni biologici processati in modo pi? omogeneo e inoltre risparmiare tempo e solventi, rendendo cos? pi? rapido, economico ed ecologico il trattamento dei campioni da analizzare. Is there therefore a need? to have new techniques and reagents that allow to obtain biological samples processed in a more? homogeneous and also save time and solvents, thus making? more rapid, economic and ecological treatment of the samples to be analysed.

Scopi dell?invenzione Purposes of the invention

? uno scopo della presente invenzione fornire un procedimento per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici che permetta la completa e omogenea fissazione e/o disidratazione e/o chiarificazione e/o infiltrazione in paraffina dei detti campioni in modo veloce e preferibilmente automatizzato. ? an object of the present invention is to provide a process for the treatment of biological, cytological, histological and autoptic samples which allows the complete and homogeneous fixation and/or dehydration and/or clarification and/or paraffin infiltration of said samples in a fast and preferably automated way .

? un altro scopo dell?invenzione l?uso nel procedimento dell?invenzione di una composizione come reagente unico per la realizzazione simultanea dei trattamenti di disidratazione, chiarificazione e infiltrazione in paraffina di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici. ? another object of the invention is the use in the process of the invention of a composition as a single reagent for carrying out the simultaneous dehydration, clarification and paraffin infiltration treatments of biological, cytological, histological and autoptic samples.

Breve descrizione delle Figure Brief description of the Figures

La Figura 1 mostra un esempio di apparecchio utile nel procedimento dell?invenzione, chiuso, a destra, e senza coperchio, a sinistra.1: cassettina per alloggiamento del campione; 2: soluzione per il trattamento del campione; 3: pompa; 4: coperchio; 5: foro superiore; 6: foro inferiore. Le Figure 2 e 3 mostrano il confronto di campioni processati mediante processazione tradizionale e mediante il procedimento dell?invenzione, come descritto rispettivamente nell?Esempio 2 e nell?Esempio 3. Figure 1 shows an example of an apparatus useful in the process of the invention, closed, on the right, and without a lid, on the left. 1: small box for housing the sample; 2: sample treatment solution; 3: pump; 4: cover; 5: upper hole; 6: bottom hole. Figures 2 and 3 show the comparison of samples processed by traditional processing and by the process of the invention, as described respectively in Example 2 and Example 3.

Descrizione dell?invenzione Description of the invention

Secondo uno dei suoi aspetti, l?invenzione ha per oggetto un procedimento per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici che comprende realizzare i passaggi di fissazione e/o di disidratazione e/o di chiarificazione e/o di infiltrazione in paraffina su almeno un campione alloggiato in un contenitore opportuno, mediante irrorazione del campione in modo continuo. According to one of its aspects, the invention relates to a process for the treatment of biological, cytological, histological and autopsy samples which comprises carrying out the steps of fixation and/or dehydration and/or clarification and/or infiltration in paraffin on at least one sample housed in a suitable container, by continuously spraying the sample.

Per ?trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici? si intende qui indicare le procedure di fissazione e/o di disidratazione e/o di chiarificazione e/o di infiltrazione in paraffina. For ?treatment of biological, cytological, histological and autopsy samples? it is intended here to indicate the procedures of fixation and/or dehydration and/or clarification and/or infiltration in paraffin.

Secondo la presente invenzione i termini ?irrorare? e ?irrorazione?, come pure le voci da essi derivate, indicano un processo attraverso il quale la composizione per il trattamento del campione, come sopra definita, viene fatta circolare in modo continuo all?interno del contenitore in cui ? alloggiato il campione. According to the present invention the terms ?spraying? and ?spraying?, as well as derivative wordings thereof, denote a process by which sample treating composition, as defined above, is continuously circulated within the container in which it is? housed the sample.

Per ?campione? si intende qui indicare un qualsiasi campione biologico, di origine animale o vegetale, preferibilmente derivante da un mammifero, come l?essere umano. Per la realizzazione del procedimento dell?invenzione, l?almeno un campione ? preferibilmente posizionato in un contenitore opportuno adatto al trattamento del campione. Tali contenitori sono ben noti all?esperto del ramo e sono generalmente chiamati ?cassettine?. For ?sample? here it is intended to indicate any biological sample, of animal or vegetable origin, preferably deriving from a mammal, such as the human being. For the realization of the process of the invention, the at least one sample ? preferably placed in a suitable container suitable for the treatment of the sample. Such containers are well known to those skilled in the art and are generally called "little boxes".

Secondo una forma di realizzazione, detto campione, ? irrorato in sequenza con dei liquidi opportuni per ciascuno dei detti passaggi. According to one embodiment, said sample, ? sprayed in sequence with suitable liquids for each of said steps.

I liquidi opportuni per i passaggi di fissazione, disidratazione, chiarificazione ed infiltrazione in paraffina sono ben noti all?esperto del ramo e possono essere ad esempio la formalina per la fissazione, uno o pi? alcoli per la disidratazione, lo xilene per la chiarificazione e una paraffina per l?infiltrazione. Altri liquidi o miscele di liquidi possono comunque essere utilizzati. The suitable liquids for the steps of fixation, dehydration, clarification and infiltration in paraffin are well known to the skilled in the art and can be, for example, formalin for fixation, one or more liquids. alcohols for dehydration, xylene for clarification and a paraffin for infiltration. Other liquids or mixtures of liquids can still be used.

Per le sostanze che non sono liquide alla temperatura ambiente, come la paraffina, prima dell?irrorazione secondo l?invenzione si riscalda la sostanza per portarla allo stato liquido, in modo tale che sia liquida prima del suo contatto con il campione da irrorare. For substances which are not liquid at ambient temperature, such as paraffin, before spraying according to the invention the substance is heated to bring it to the liquid state, so that it is liquid before its contact with the sample to be sprayed.

Secondo una forma di realizzazione, detto campione, ? irrorato in sequenza con formalina per la fissazione e/o con uno o pi? alcoli per la disidratazione e/o con xilene per la chiarificazione e/o con una paraffina per l?infiltrazione. According to one embodiment, said sample, ? sprayed in sequence with formalin for fixation and/or with one or more? alcohols for dehydration and/or with xylene for clarification and/or with a paraffin for infiltration.

Secondo una forma di realizzazione, detto campione, ? irrorato almeno per i passaggi di disidratazione e di chiarificazione in sequenza, preferibilmente con uno o pi? alcoli e con xilene, rispettivamente. According to one embodiment, said sample, ? sprayed at least for the dehydration and clarification steps in sequence, preferably with one or more? alcohols and with xylene, respectively.

Secondo una forma di realizzazione, detto campione, ? irrorato almeno per i passaggi di disidratazione, di chiarificazione e di infiltrazione in paraffina in sequenza, preferibilmente con uno o pi? alcoli, con xilene e con una paraffina, rispettivamente. According to one embodiment, said sample, ? sprayed at least for the dehydration, clarification and paraffin infiltration steps in sequence, preferably with one or more? alcohols, with xylene and with a paraffin, respectively.

Il procedimento dell?invenzione permette di ottenere un campione processato in modo pi? omogeneo rispetto ai campioni processati in modo tradizionale, cio? semplicemente immersi in modo statico nei liquidi di processazione. The process of the invention allows to obtain a sample processed in a more efficient way. homogeneous compared to the samples processed in the traditional way, the cio? simply static immersed in the processing liquids.

Secondo un?altra forma di realizzazione, l?invenzione ha per oggetto un procedimento per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici che comprende irrorare in modo continuo almeno un campione alloggiato in un contenitore con una composizione che comprende paraffina, almeno un alcol e almeno un idrocarburo scelto tra isoparaffina, limonene, nafta e ottano, per realizzare simultaneamente i trattamenti di disidratazione, di chiarificazione e di infiltrazione in paraffina. According to another embodiment, the invention relates to a process for the treatment of biological, cytological, histological and autopsy samples which comprises continuously spraying at least one sample housed in a container with a composition comprising paraffin, at least one alcohol and at least one hydrocarbon selected from isoparaffin, limonene, naphtha and octane, to simultaneously carry out the dehydration, clarification and infiltration treatments in paraffin.

La composizione come sopra definita, qui di seguito definita anche ?composizione unica?, permette di realizzare simultaneamente i trattamenti di disidratazione, di chiarificazione e di infiltrazione in paraffina. The composition as defined above, hereinafter also referred to as a "single composition", allows the dehydration, clarification and paraffin infiltration treatments to be carried out simultaneously.

Per ?paraffina? si intende qui indicare la paraffina per analisi, preferibilmente per analisi istologiche, preferibilmente avente un punto di fusione di 56-58?C. For ?paraffin? it is intended here to indicate the paraffin for analysis, preferably for histological analyses, preferably having a melting point of 56-58°C.

Secondo l?invenzione, l?almeno un alcol ? scelto tra gli alcoli C1-C4, lineari o ramificati, preferibilmente scelti tra l?alcol etilico e l?alcol isopropilico. Secondo una forma di realizzazione preferita, la composizione comprende una miscela di alcol etilico e alcol isopropilico, pi? preferibilmente una miscela di alcol isopropilico/alcol etilico in un rapporto in volume rispettivamente che va da 2-4/1 a 1/2-4, vantaggiosamente di circa 3/1 o 1/3. According to the invention, the at least one alcohol is selected from C1-C4 alcohols, linear or branched, preferably selected from ethyl alcohol and isopropyl alcohol. According to a preferred embodiment, the composition comprises a mixture of ethyl alcohol and isopropyl alcohol, plus? preferably a mixture of isopropyl alcohol/ethyl alcohol in a volume ratio ranging from 2-4/1 to 1/2-4, respectively, advantageously about 3/1 or 1/3.

Per ?nafta? si intende qui indicare una miscela di idrocarburi derivanti da una frazione del petrolio priva di idrocarburi aromatici e prevalentemente composta da molecole aventi da 4 a 11, principalmente da 7 a 9 atomi di carbonio. Secondo una forma di realizzazione preferita, la nafta ? la ?Naphtha hydrotreated light?, avente il numero di Chemical Abstracts 64742-49-0. Secondo una forma di realizzazione preferita, almeno un idrocarburo ? la nafta, come sopra definita. For ?naphtha? here it is intended to indicate a mixture of hydrocarbons deriving from a fraction of petroleum free of aromatic hydrocarbons and mainly composed of molecules having from 4 to 11, mainly from 7 to 9 carbon atoms. According to a preferred embodiment, naphtha is the "Naphtha hydrotreated light", having the number of Chemical Abstracts 64742-49-0. According to a preferred embodiment, at least one hydrocarbon ? naphtha, as defined above.

Per ?isoparaffina? si intende qui indicare una miscela di idrocarburi alifatici, sostanzialmente priva di idrocarburi aromatici (di norma inferiori al 2%) con punto di fusione inferiore a 60?C e prevalentemente composta da molecole aventi da 9 a 28 atomi di carbonio, principalmente da 11 a 15 atomi di carbonio. Secondo una forma di realizzazione preferita, l?isoparaffina della composizione dell?invenzione ha numero di Chemical Abstracts 90622-58-5. For ?isoparaffin? here it is intended to indicate a mixture of aliphatic hydrocarbons, substantially free of aromatic hydrocarbons (usually less than 2%) with a melting point lower than 60°C and mainly composed of molecules having from 9 to 28 carbon atoms, mainly from 11 to 15 carbon atoms. According to a preferred embodiment, the isoparaffin of the composition of the invention has Chemical Abstracts number 90622-58-5.

Secondo una forma di realizzazione preferita, almeno un idrocarburo ? l?isoparaffina, come sopra definita. According to a preferred embodiment, at least one hydrocarbon ? isoparaffin, as defined above.

Per ?limonene? si intende qui indicare il 4-isopropenil-1-metil-1-cicloesene, racemo o in forma di uno dei suoi isomeri o miscele anche non racemiche di questi, preferibilmente l?isomero (R) del 4-isopropenil-1-metil-1-cicloesene. For ?limonene? here it is meant to indicate 4-isopropenyl-1-methyl-1-cyclohexene, racemic or in the form of one of its isomers or even non-racemic mixtures thereof, preferably the isomer (R) of 4-isopropenyl-1-methyl- 1-cyclohexene.

Salvo diversamente specificato, tutte le percentuali ed i rapporti qui descritti sono espressi in volume. Unless otherwise specified, all percentages and ratios described herein are by volume.

Secondo una forma di realizzazione, la composizione pu? anche comprendere 2,2-dimetossipropano. According to one embodiment, the composition may also include 2,2-dimethoxypropane.

La composizione come sopra definita ? oggetto delle domande di brevetto italiano No. The composition as defined above? object of the Italian patent applications No.

102020000025159 e No.102020000031031, a nome della stessa Richiedente. 102020000025159 and No. 102020000031031, in the name of the same Applicant.

Il procedimento dell?invenzione avviene in modo automatizzato all?interno di un apparecchio qui definito ?perfusore?. The process of the invention takes place in an automated way inside an apparatus defined herein as a "perfusor".

Per ?contenitore? secondo l?invenzione, si intende indicare un recipiente che prevede un foro superiore a cui ? collegato un tubo per l?alimentazione della composizione e un foro inferiore a cui ? collegato un altro tubo per l?uscita della stessa; detto contenitore ? inserito in una unit? che comprende anche dei mezzi per riscaldare la composizione quando necessario. Nel caso sia utilizzata paraffina, la temperatura viene impostata preferibilmente intorno a 60?C al fine di renderla liquida. For ?container? according to the invention, it is intended to indicate a container which has an upper hole to which connected a tube for? supply of the composition and a lower hole to which? connected another tube for the outlet of the same; said container? inserted in a unit? which also includes means for heating the composition when necessary. If paraffin is used, the temperature is preferably set around 60°C in order to make it liquid.

Mediante un collegamento a una pompa, ad esempio una pompa peristaltica, il detto contenitore viene riempito con la composizione che circola in modo continuo, attraverso i fori praticati nel contenitore. By means of a connection to a pump, for example a peristaltic pump, said container is filled with the composition which circulates continuously through the holes made in the container.

Un esempio di perfusore ? riportato nella Figura 1, dove si possono apprezzare la cassettina contenente il campione 1, il contenitore 2, il foro superiore al quale ? collegato il tubo per l?alimentazione della composizione 3 ed il foro inferiore al quale ? collegato il tubo per l?uscita della composizione 4. An example of a perfusor? shown in Figure 1, where you can appreciate the box containing the sample 1, the container 2, the upper hole to which ? connected the tube for the supply of composition 3 and the lower hole to which ? connected the tube for the output of the composition 4.

Il perfusore pu? contenere diversi contenitori 1, come anche mostrato nell?esempio di cui alla Figura 1, permettendo cos? di processare pi? campioni contemporaneamente. The perfusor can contain several containers 1, as also shown in the example referred to in Figure 1, thus allowing to process pi? samples simultaneously.

Nella pratica, in questa forma esemplificativa, detta irrorazione avviene alimentando la detta composizione nel contenitore 2 attraverso il foro superiore al quale ? collegato il tubo per l?alimentazione della composizione 3 e facendo uscire la detta composizione attraverso il foro inferiore al quale ? collegato il tubo per l?uscita della composizione 4. In practice, in this exemplary form, said spraying takes place by feeding said composition into the container 2 through the upper hole to which ? connected the tube for feeding the composition 3 and causing said composition to come out through the lower hole to which ? connected the tube for the output of the composition 4.

Un esperto del ramo ? perfettamente in grado di realizzare un perfusore per la realizzazione del procedimento dell?invenzione, alla luce della presente descrizione e delle Figure allegate e pu? anche realizzare soluzioni tecniche alternative, ad esempio relativamente alla disposizione dei fori, rispetto a quella sopra indicata, che pure rientrano nell?ambito di protezione della presente invenzione. An expert in the field? perfectly capable of realizing a perfusor for carrying out the process of the invention, in the light of the present description and of the attached Figures and can also realizing alternative technical solutions, for example in relation to the arrangement of the holes, with respect to the one indicated above, which also fall within the scope of protection of the present invention.

Generalmente il ricircolo di un volume di 40-100 ml, ad esempio circa 50 ml di composizione ? sufficiente per l?irrorazione di un campione; nel caso in cui si usi il procedimento che utilizzi i singoli liquidi in sequenza per la processazione del campione, tale quantitativo si applica a ciascun singolo liquido, nel caso in cui si utilizzi la composizione unica come sopra definita tale quantitativo si applica ad essa. Generally the recirculation of a volume of 40-100ml, for example about 50ml of composition is ? sufficient for spraying a sample; in the event that the procedure is used which uses the single liquids in sequence for the processing of the sample, this quantity applies to each single liquid, in the case in which the single composition as defined above is used, this quantity applies to it.

Si ? osservato che l?irrorazione in modo continuo del campione favorisce la fuoriuscita dell?acqua e dei liquidi biologici dal campione, evitandone il ristagno all?interno dello stesso e facilita una o pi? operazioni scelte tra la fissazione, la disidratazione, la chiarificazione e l?infiltrazione in paraffina. Yes ? observed that the continuous spraying of the sample favors the escape of water and biological liquids from the sample, avoiding their stagnation inside the same and facilitates one or more? operations chosen from fixation, dehydration, clarification and paraffin infiltration.

La portata del ricircolo della composizione pu? variare e ad esempio pu? essere di 30-100 ml/minuto, ad esempio intorno a 50 ml/minuto. The flow rate of the recirculation of the composition can? vary and for example pu? be 30-100 ml/minute, for example around 50 ml/minute.

La durata dell?irrorazione dipender? dalla grandezza del campione e potr? ad esempio variare tra 1 e 5 ore, come per esempio 1,5-3 ore. The duration of? Spraying will depend? from the size of the sample and can? for example vary between 1 and 5 hours, such as 1.5-3 hours.

Al termine dell?irrorazione con la composizione unica, la cassettina viene estratta dal contenitore ed il campione, perfettamente infiltrato con la composizione pu? essere incluso in un blocchetto di paraffina e tagliato al microtomo. At the end of the spraying with the single composition, the box is extracted from the container and the sample, perfectly infiltrated with the composition, can be embedded in a paraffin block and microtome cut.

Secondo una forma di realizzazione, al termine di ciascuna irrorazione il liquido utilizzato viene filtrato e trattato meccanicamente e chimicamente al fine di rimuovere le impurit? rilasciate dai campioni e i residui di umidit?, in modo che possa essere riutilizzato per il trattamento di ulteriori campioni in condizioni ottimali. In questo modo il liquido viene ripulito e questo permette che tutti i campioni vengano processati con un liquido rigenerato, che fornir? migliori prestazioni. Sebbene la rigenerazione del liquido utilizzato per l?irrorazione sia una procedura vantaggiosa, essa rappresenta solo una forma di realizzazione dell?invenzione e pu? non essere realizzata all?interno del procedimento dell?invenzione. According to one embodiment, at the end of each spraying, the liquid used is filtered and treated mechanically and chemically in order to remove impurities. released from the samples and the residual moisture, so that it can be reused for the treatment of further samples under optimal conditions. In this way the liquid is cleaned and this allows all the samples to be processed with a regenerated liquid, which will provide? better performance. Although the regeneration of the liquid used for spraying is an advantageous procedure, it represents only one embodiment of the invention and can be not be made within the process of the invention.

Secondo un altro dei suoi aspetti, l?invenzione ha per oggetto l?uso di una composizione che comprende paraffina, almeno un alcol e almeno un idrocarburo scelto tra isoparaffina, limonene, nafta e ottano, per irrorare in modo continuo almeno un campione biologico. According to another of its aspects, the invention relates to the use of a composition comprising paraffin, at least one alcohol and at least one hydrocarbon selected from isoparaffin, limonene, naphtha and octane, for continuously spraying at least one biological sample.

Secondo una forma di realizzazione preferita, l?uso della composizione secondo l?invenzione ? realizzato in un apparecchio automatizzato. According to a preferred embodiment, the use of the composition according to the invention is made in an automated apparatus.

Esempi Examples

Esempio 1 Example 1

La Tabella 1 sotto riporta a titolo esemplificativo le tempistiche di processazione per diversi tessuti, confrontando quanto avviene con la processazione tradizionale e con il procedimento di irrorazione dell?invenzione. Mediante irrorazione sono stati processati i campioni per i passaggi di disidratazione e di chiarificazione: Table 1 below shows, by way of example, the processing times for different fabrics, comparing what happens with the traditional processing and with the spraying process of the invention. The samples for the dehydration and clarification steps were processed by spraying:

Tabella 1 Table 1

<1 >Processazione tradizionale con scala alcolica -crescente (etanolo 70-95-99) xilene <1 > Traditional processing with increasing alcohol scale (ethanol 70-95-99) xylene

<2 >Processazione con la ?composizione unica? <2 >Processing with the ?unique composition?

Esempio 2 Example 2

La Figura 2 mostra il confronto di campioni animali processati mediante processazione tradizionale e mediante il procedimento dell?invenzione. Campioni speculari di 3 mm di spessore sono stati fissati in formalina 4% e processati in parallelo mediante processazione tradizionale e mediante irrorazione (2 step da 45 minuti di irrorazione; 50 ml di soluzione per ogni passaggio con movimentazione della soluzione alla velocit? costante e continua di 50 ml/minuto). In questo caso, mediante irrorazione, sono stati effettuati i passaggi di disidratazione e chiarificazione. I campioni sono stati infiltrati invece in vuoto. Figure 2 shows the comparison of animal samples processed by traditional processing and by the process of the invention. Specular samples of 3 mm thickness were fixed in 4% formalin and processed in parallel by traditional processing and by spraying (2 steps of 45 minutes of spraying; 50 ml of solution for each step with movement of the solution at constant and continuous speed of 50 ml/minute). In this case, the dehydration and clarification steps were carried out by spraying. Instead, the samples were infiltrated in a vacuum.

Per ogni tipo di tessuto, il campione a sinistra ? stato processato mediante processazione tradizionale, quello a destra mediante il procedimento dell?invenzione. A: fegato; B: polmone; C: rene; D: cuore; E: apparato gastrointestinale; F: cervello. Come si pu? notare, il procedimento dell?invenzione permette di ottenere un?ottima processazione dei campioni, paragonabile a quella delle processazioni tradizionali. For each type of fabric, the sample on the left ? been processed by traditional processing, the one on the right by the process of the invention. A: liver; B: lung; C: kidney; D: heart; E: gastrointestinal tract; F: brain. How can you? note, the process of the invention allows to obtain an excellent processing of the samples, comparable to that of traditional processing.

Esempio 3 Example 3

La qualit? della processazione rispecchia quella della processazione tradizionale, come visibile anche dal risultato delle colorazioni speciali riportate in Figura 3. Si tratta di colorazioni che vengono effettuate per evidenziare alcune caratteristiche specifiche dei diversi tessuti, sfruttando la tintorialit? e le caratteristiche chimico-fisiche dei singoli componenti tissutali. Di seguito, a titolo esemplificativo, un confronto del risultato di campioni processati secondo processazione tradizionale (sinistra) e secondo il procedimento dell?invenzione utilizzando la composizione unica (destra). A: campioni di polmone colorati con la metodica Tricromica di Masson; B: campioni di tratto gastrointestinale colorati con la metodica pentacromica di Russell-Movat. The quality? of the processing mirrors that of the traditional processing, as can also be seen from the result of the special colors shown in Figure 3. These are colors that are carried out to highlight some specific characteristics of the different fabrics, taking advantage of the dyeing and the chemical-physical characteristics of the individual tissue components. Below, by way of example, a comparison of the result of samples processed according to traditional processing (left) and according to the process of the invention using the single composition (right). A: lung samples stained with Masson's Trichrome method; B: Gastrointestinal tract specimens stained with the Russell-Movat pentachrome method.