IT202000021358A1 - Nanoparticelle per migliorare il segnale analitico - Google Patents
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Description
NANOPARTICELLE PER MIGLIORARE IL SEGNALE ANALITICO
Campo Tecnico
La presente invenzione riguarda una nuova famiglia di nanoparticelle di silice (SNP o NP) o nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP), che mostrano miglioramenti distintivi quando impiegate nell'analisi basata sull?elettrochemiluminescenza.
Contesto
La quantificazione di marcatori diagnostici, o biomarcatori, ha un impatto enorme sulla diagnosi precoce da un punto di vista della ricerca e clinico. In questo contesto, l'elettrochemiluminescenza (ECL) sembra essere una tecnica di trasduzione principale per la rilevazione di quantit? bassissime di queste molecole.
L'ECL si basa sulla generazione elettrochimica di specie che vengono sottoposte a reazioni di trasferimento elettronico ad alta energia. La combinazione di metodi elettrochimici e spettroscopici rende l?ECL una tecnica analitica potente, la cui caratteristica vantaggiosa principale ? il rapporto segnale-rumore notevole dovuti all'assenza di una sorgente di luce per la generazione di stati eccitati.
L'ECL potenzia inoltre l'eccellente controllo spaziale e temporale con la possibilit? di eseguire misurazioni rapide su piccoli volumi di campioni. Grazie a queste caratteristiche, l'ECL ? stata usata per saggio immunologico e rilevazione ultrasensibile di un'ampia gamma di analiti in differenti campi come diagnostica medica, analisi ambientale e fabbricazione di (bio)sensori.
La successiva applicazione di principi ECL nella microscopia ha permesso nuove frontiere e nuove applicazioni in particolare per analisi di multiplazione, rendendo possibile lo studio dei meccanismi ECL a livello di nanoscala, in particolare per l'applicazione di sensori e per caratterizzazioni biologiche. Per queste ragioni, la microscopia ECL ? una tecnica molto promettente per la mappatura confinata alla superficie e quantificazione di vari analiti estremamente diluiti.
La strategia pi? usata per generare ECL in un ambiente acquoso si basa sul cosiddetto meccanismo coreagente di ossido-riduzione in cui tri-n-propilammina (TPrA) viene usata come co-reagente sacrificale e tris(2,2?-bipiridina)rutenio(II) ([Ru(bpy)3]<2+>) come luminoforo, permettendo un numero enorme di applicazioni.
Questa strategia viene impiegata anche in saggi immunologici basati su ECL sviluppati da Roche Diagnostics (Elecsys<?>) e Meso Scale Diagnostics.
Ricercando una sensibilit? in continua crescita, molti ricercatori hanno cercato di combinare ECL con nanomateriali, come nanoparticelle, utilizzandoli come coloranti o co-reagenti. In particolare, le nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) hanno dimostrato di essere una opzione molto interessante come coloranti ECL, per via dei loro vari vantaggi come (i) una intensit? di segnale potenziata (fino a un incremento potenziale di migliaia di volte) grazie a un grande numero di coloranti attivi interni, (ii) schemi sintetici semplici e versatili per la loro preparazione, che permettono tipicamente una elevata stabilit? colloidale in acqua, e (iii) una facile bioconiugazione.
Un potenziale problema correlato all'uso di DDSNP ? che il processo che porta alla formazione dello stato eccitato di emissione in ECL ? molto pi? complesso rispetto alla foto-luminescenza. In particolare nel caso di DDSNP, la generazione del segnale ECL inizia tipicamente dall'ossidazione del co-reagente (la cui scelta ? quindi di particolare importanza) in corrispondenza della superficie dell?elettrodo; le specie ossidate e i loro prodotti, che sono radicali con un tempo di vita (durata) limitata, devono diffondersi per raggiungere rapidamente le sonde ECL dentro la matrice di silice, generando infine lo stato eccitato di emissione.
Questo implica che per aumentare la sensibilit? offerta dalle DDSNP, la loro dimensione dovrebbe essere ottimizzata considerando che la quantit? di specie attive all?ECL ? strettamente collegata al volume delle NP. Allo stesso tempo, in particelle eccessivamente grandi, questo vantaggio ? controbilanciato dal fatto che troppe sonde non sono raggiungibili dalle specie radicali in diffusione. Inoltre, la natura della superficie di NP, incluso il suo rivestimento/involucro, dovrebbe essere progettata per rendere le NP stabili da un punto di vista colloidale in acqua e dotata di gruppi adatti per la derivatizzazione appropriata ma allo stesso tempo per permettere la diffusione rapida del radicale; in particolare, ci si aspetta che i rivestimenti sottili con un potenziale ? complessivamente negativo diano i segnali pi? alti. Infine, si prevede inoltre che la porosit? giochi un ruolo importante e favorevole, quindi la procedura di sintesi dovrebbe considerare questo effetto.
Pertanto, vi ? l'esigenza di sviluppare nuove particelle che permettono di migliorare il segnale analitico, in particolare quando interessato nell'analisi a base di elettrochemiluminescenza.
Sommario
La presente invenzione riguarda una nuova nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP) comprendente:
a) un nucleo di rete di silicato con un diametro in un intervallo tra 10 nm e 500 nm, preferibilmente tra 20 nm e 250 nm, in cui almeno un luminoforo (colorante) ? confinato in detto nucleo di rete di silicato, o collegato in modo covalente alla rete di silicato del nucleo poich? detto luminoforo (colorante) ha una porzione di ancoraggio in grado di formare almeno un legame covalente con il nucleo di rete di silicato, in cui questa porzione di ancoraggio ? preferibilmente una porzione di ancoraggio idrofobica, pi? preferibilmente una porzione di alcossisilano, ancora pi? preferibilmente una porzione di trialcossisilano;
b) uno strato di rivestimento/involucro sul nucleo di rete di silicato drogato a) che incorpora uno o pi? coloranti, detto strato di rivestimento/involucro b) con uno spessore tra 0,5 e 7 nm, preferibilmente tra 0,5 e 6 nm, pi? preferibilmente da 1 a 5 nm, comprendente uno o pi? agenti stabilizzanti colloidali, come agente anti-incrostazione elettrostatico o agenti anti-incrostazione di polietere, preferibilmente un agente stabilizzante comprendente almeno una struttura a catena (cs) avente una porzione di ancoraggio cs-1) avanti al/verso il nucleo di rete di silicato a) che incorpora uno o pi? coloranti e una porzione idrofila cs-2 verso l'esterno del nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti, preferibilmente la porzione di ancoraggio cs-1 ? una porzione di ancoraggio idrofobica, pi? preferibilmente una porzione di alcossisilano, ancora pi? preferibilmente una porzione di trialcossisilano e/o la porzione idrofilica cs-2 comprende una porzione di polietere, pi? preferibilmente una porzione di -PEGn-OH [-Poli(etilene glicole)n-OH] in cui n ? tra 3 e 100, preferibilmente tra 4 e 50, pi? preferibilmente 4, 5, 6, 7, 8 ,9 o 10;
in cui il potenziale ? della superficie esterna della nanoparticella di silice ? neutro o negativo.
Un ulteriore scopo della presente invenzione ? costituito dalla/e nanoparticella/e di silice prima citate in cui lo strato di rivestimento/involucro b) comprende un bio-linker (bioconnettore/legante/collegatore) (bl) e/o un linker (connettore/legante/collegatore) chimico (cl) e/o un linker (connettore/legante/collegatore) biochimico (bcl) come descritto di seguito, nella presente invenzione.
Un ulteriore scopo della presente invenzione ? un processo per la produzione di una o pi? nanoparticelle di silice secondo la presente invenzione, detto processo comprendendo il metodo di micro-emulsione inverso (RME) in cui sono presenti le seguenti fasi:
i) Preparare una emulsione di acqua in olio stabilizzata con uno o pi? tensioattivi non ionici, e infine/come preferito mediante la presenza di uno o pi? tensioattivi,
ii) Aggiungere alla porzione di acqua dell'emulsione di acqua in olio stabilizzata ottenuta nella fase i) un luminoforo avente una porzione di ancoraggio, un precursore di silice e una base per formare il nucleo di rete di silicato drogato con colorante a) della nanoparticella,
iii) Rivestire il nucleo di rete di silicato a) incorporante l'uno o pi? coloranti ottenuti nella fase ii) mediante aggiunta di un agente stabilizzante colloidale, per ottenere uno strato di rivestimento/involucro b) della nanoparticella.
Come ulteriore forma di realizzazione del processo secondo la presente invenzione, nella fase iii) si deve inoltre aggiungere un linker (connettore/legante/collegatore) selezionato dal gruppo comprendente: bio-linker (bioconnettore/legante/collegatore) e/o linker (connettore/legante/collegatore) biochimico e/o linker (connettore/legante/collegatore) chimico, come definito secondo la presente invenzione, e/o, detto processo comprende la fase:
iv) Purificare la nanoparticella ottenuta nella fase iii) da tensioattivo non ionico e olio.
Data la presente invenzione, la combinazione di tecniche altamente sensibili come ECL con la nanotecnologia ha consentito di eseguire brillantemente nuove applicazioni analitiche in particolare per sistemi di rilevazione basate su saggi immunologici. In questo contesto, i nanomateriali di silice secondo la presente invenzione, in particolare, nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione, sono di particolare interesse, poich? possono offrire vari vantaggi in termini di sensibilit? e rendimento.
Secondo la presente invenzione, Quale forma di realizzazione preferita delle nanoparticelle di silice o delle nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP), sono state sintetizzati due gruppi di nanoparticelle di silice drogate con [Ru(bpy)3]<2+ >biotinilate monodisperse, chiamate bio-Triton@RuNP e bio-Igepal@RuNP, rispettivamente.
Sono stati ottenuti seguendo il processo secondo la presente invenzione, detto processo comprendendo il metodo di microemulsione inverso, utilizzando due tipi differenti di tensioattivi non ionici.
Controllando le procedure di sintesi secondo la presente invenzione, ? possibile ottenere nanoparticelle di silice (SNP o NP) o nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione, offrendo un segnale di elevata intensit?, utilizzando tri-n-propilammina (TPrA) come co-reagente, in particolare bio-Triton@RuNps essendo pi? efficiente di bio-Igepal@RuNP.
? interessante che, sebbene solo una piccola porzione dei circa 4800 complessi, ossia luminoforo (colorante) secondo la presente invenzione, contenuti in ciascuna NP di silice fosse interessata nella generazione di segnale, quando usati nella modalit? analitica di ECL, le nanoparticelle di silice o nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione: Bio-Triton@RuNP rivelano un?intensit? di ECL 8,5 volte maggiore confrontato a un sistema che riproduce un sistema di saggio immunologico a base di ECL commerciale.
In aggiunta, le NP di silice o nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione hanno mostrato una stabilit? di ECL migliorata per via della matrice di silice, aumentando ancora di pi? il loro potenziale rendimento.
Un ulteriore scopo della presente invenzione ? l'uso delle nanoparticelle di silice (NP) o nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDNSP) secondo la presente invenzione, in particolare come una sonda, in tecniche di microscopia ECL e suggerisce un possibile ulteriore incremento di segnali ottenibile agendo sulla procedura di sintesi, che apre nuovi percorsi promettenti verso la maggiore sensibilit? dell'analisi a base di ECL, in particolare saggi immunologici a base di ECL, con applicazioni per la biorilevazione e i dispositivi presso i punti di assistenza.
Breve descrizione dei disegni
La figura 1 mostra: una rappresentazione schematica della sintesi di microemulsione inversa delle nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP), come nanoparticelle di silice drogate con [Ru(bpy)3]<2+>, identificate come bio-Triton@RuNP e bio-Igepal@RuNP, rispettivamente, secondo la presente invenzione.
La figura 2 mostra: (A) Immagini TEM di di NP di silice parte superiore: bio-Igepal@RuNP, fondo: bio-Triton@RuNP. (barra della scala 200 nm);(B) Distribuzione dei diametri del nucleo di silice calcolati con TEM. sinistra: bio-Igepal@RuNP e destra bio-Triton@RuNP; (C-D) Assorbimento e resa quantica di fosforescenza normalizzate di bio-Igepal@RuNP (linea continua nera), bio-Triton@RuNP (linea continua grigia) e [Ru(bpy)3]<2+ >(linea tratteggiata) in acqua come riferimento per il confronto.
La figura 3 mostra: (A) Curve di potenziale di intensit? ECL in presenza di TPrA 180 mM in una soluzione da 1 nM di bio-Igepal@RuNp (linea continua) e di bio-Triton@RuNp (linea tratteggiata).
Voltammetrie cicliche con tensione scansionata tra 0 V e 1,6 V, velocit? di scansione 0,1 V s<-1>. Elettrodo di carbonio vetroso riferito a Ag/AgCl. Spirale di Pt come contro-elettrodo. Polarizzazione PMT 750 V. (B) Il meccanismo eterogeneo per la generazione di ECL di coreagente "di ossido-riduzione" ottenuto utilizzando perle da 2,8 ?m marcato con bio-Triton@RuNp (ys) attraverso un legame di streptavidina (gt)-biotina (rt).
La tri-n-propilammina (TPrA) viene ossidata in corrispondenza dell'elettrodo, generando il catione radicale (TPrA<+?>), che si deprotona, formando il radicale (TPrA<?>). Il radicale e il catione di radicale reagisce con il luminoforo di ECL [Ru(bpy)3]<2+ >(yd), dentro il bio-Triton@RuNp situato sulle perle magnetiche (rss). (C) L'imaging ECL di singola perla da 2,8 ?m marcata con complesso di [Ru(bpy)3]<2+ >biotinilato (perle@bio-Ru [beads@bio-Ru]) e (D) con bio-Triton@RuNp (perle@Triton [beads@Triton]). Sono stati ottenuti mediante applicazione di un potenziale costante di 1,4 V (rispetto a Ag/AgCl) per 4 s in 180 mM TPrA e 0,2 M di tampone fosfato (PB). Filo di Pt come controelettrodo. Videocamera EMCCD accoppiata con un potenziostato. Tempo di integrazione: 8 s; ingrandimento: x 100; Barra della scala, 5 ?m. (E) Confronto delle linee di profilo delle perle (linea nera perle@bio-Ru [Beads@bio-Ru]; linea grigia, perle@Triton [Beads@Triton]). Inserto del confronto tra valori di intensit? integrati calcolati per Perle@bio-Ru (nero) e Perle@Triton (grigio), la barra degli errori mostra la deviazione standard (n = 9).
La figura 4 mostra la distribuzione di diametro idrodinamico con curva sottodimensionata (prima fila) e immagini TEM (seconda fila) per bio-Triton@RuNP (A) e bio-Igepal@RuNP (B).
La figura 5 mostra: A) il decadimento del tempo di vita/durata della fosforescenza (cerchio) e relativo adattamento (linea) del bio-Triton@RuNP (grigio, ?m = 790 ns) e bio-Igepal@RuNP (nero, ?m = 618 ns); B) Valori Residui dell?adattamento del tempo di vita /durata della fosforescenza del bio-Triton@RuNP (sinistra) e bio-Igepal@RuNP (destra).
La figura 6 mostra: Curve di potenziale di intensit? ECL in presenza di TPrA 180mM (linea tratteggiata) o DBAE 30 mM (linea continua) in una soluzione da 10 mM di bio-Triton@RuNp. Voltammetrie cicliche con tensione scansionata tra 0 v e 1,6 V, velocit? di scansione 0,1 V s<-1>. Elettrodo di carbonio vetroso riferito ad Ag/AgCl. Spirale di Pt come controelettrodo. Polarizzazione PMT 750 V.
La figura 7 mostra immagini confocali di perle@bio-Ru (a) e perle@RuNPs (b), = exc = 401 nm, filtro di emissione 595/50 nm. Immagini FLIM a commutazione di tempo (t > 100 ns) di perle@bio-Ru (c) e perle@RuNP (d), ?exc = 405 nm, filtro di emissione long-pass 560 nm. Il tempo medio di arrivo dei fotoni (tempo di vita/durata "rapida") viene rappresentato dalla scala del colore di grigi.
La figura 8 mostra immagini ottiche (colonna sinistra) e rispettive ECL (colonna destra) di perla singola da 2,8 ?m marcata con (A) bio-Triton@RuNp (perlte@Triton). Sono state ottenute mediante l?applicazione di un potenziale costante di 1,4 V (rispetto a Ag/AgCl) per 4 s in 180 mM TPrA e 0,2 M di tampone fosfato (PB). Filo di Pt come contro-elettrodo. Tempo di integrazione: 8 s; ingrandimento: x 100; Barra della scala, 5 ?m.
La figura 9 mostra immagini ottiche (colonna sinistra) e rispettive immagini ECL (colonna destra) di perla singola da 2,8 ?m marcata con complesso di Ru(bpy)3<2+ >biotinilato (perle@bio-Ru). Sono state ottenute mediante applicazione di un potenziale costante di 1,4 V (rispetto a Ag/AgCl) per 4 s in 180 mM TPrA e 0,2 M di tampone fosfato (PB). Filo di Pt come contro-elettrodo. Tempo di integrazione: 8 s; ingrandimento: x 100; Barra della scala: 5 ?m.
La figura 10 mostra immagini ottiche (colonna sinistra) e rispettive immagini ECL (colonna destra) di perla singola da 2,8 ?m marcata con (A) bio-Triton@RuNp (perlte@Triton) e (B) complesso di Ru(bpy)3<2+ >biotinilato (perle@bio-Ru). Sono state ottenute mediante applicazione di un potenziale costante di 1,4 V (rispetto a Ag/AgCl) per 2 s in 180 mM TPrA e 0,2 M di tampone fosfato (PB). Filo di Pt come controelettrodo. Videocamera EMCCD accoppiata con un potenziostato. Tempo di integrazione: 4 s; ingrandimento: x 40; Barra della scala: 5 ?m.
La figura 11 mostra la stabilit? dell?intensit? ECL per singola perla da 2,8 marcata con (A) complesso di Ru(bpy)3<2+ >biotinilato (perle@bio-Ru) e (B) con bio-Triton@RuNp (perle@Triton). Immagini ECL acquisite ogni 200 ms (tempo di integrazione) e intensit? ECL integrata rappresentata rispetto al tempo. Si noti che l'intensit? ECL di perle@bio-Ru viene moltiplicata per un fattore 4 per il facile confronto con intensit? ECL di perle@Triton. Le intensit? ECL hanno una caduta del 74% e del 40%, rispettivamente, per perle@bio-Ru e perle@Triton. Sono state ottenute mediante l?applicazione di un potenziale costante di 1,4 V (rispetto a Ag/AgCl) per 4 s in 180 mM TPrA e 0,2 M di tampone fosfato (PB). Filo di Pt come contro-elettrodo.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
La Richiedente ha sviluppato in modo sorprendente e inatteso una nuova nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP) comprendente:
a) un nucleo di rete di silicato con un diametro in un intervallo tra 10 nm e 500 nm, preferibilmente tra 20 nm e 250 nm, in cui almeno un luminoforo (colorante) ? confinato in detto nucleo di rete di silicato, o collegato in modo covalente alla rete di silicato del nucleo poich? detto luminoforo (colorante) ha una porzione di ancoraggio in grado di formare almeno un legame covalente con il nucleo di rete di silicato, in cui questa porzione di ancoraggio ? preferibilmente una porzione di ancoraggio idrofobica, pi? preferibilmente una porzione di alcossisilano, ancora pi? preferibilmente una porzione di trialcossisilano;
b) uno strato di rivestimento/involucro sul nucleo di rete di silicato drogato a) incorporante uno o pi? coloranti, detto strato di rivestimento/involucro b) con uno spessore tra 0,5 e 7 nm, preferibilmente tra 0,5 e 6 nm, pi? preferibilmente tra 1 e 5 nm, comprendente uno o pi? agenti stabilizzanti colloidali, come agente anti-incrostazione sterico o elettrostatico o agenti anti-incrostazioni di polietere, preferibilmente un agente stabilizzante comprendente almeno una struttura a catena (cs) avente una porzione di ancoraggio cs-1) in avanti rispetto al nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti e una porzione idrofila cs-2) verso l?esterno rispetto al nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti, preferibilmente la porzione di ancoraggio cs-1) ? una porzione di ancoraggio idrofobica, pi? preferibilmente una porzione di alcossilano, ancora pi? preferibilmente una porzione di trialcossisilano e/o la porzione idrofilica cs-2 comprende una porzione di polietere, pi? preferibilmente una porzione di -PEGn-OH [-Poli(etilene glicole)n-OH] in cui n ? tra 3 e 100, preferibilmente tra 4 e 50, pi? preferibilmente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
in cui il potenziale ? della superficie esterna della nanoparticella di silice ? neutro o negativo.
Un ulteriore scopo della presente invenzione ? una:
Nanoparticella di silice comprendente:
a) un nucleo di rete di silicato con un diametro in un intervallo tra 10 nm e 500 nm, preferibilmente tra 20 nm e 250 nm, in cui almeno un luminoforo (colorante) ? confinato in detto nucleo di rete di silicato, o collegato in modo covalente alla rete di silicato del nucleo poich? detto luminoforo (colorante) ha una porzione di ancoraggio in grado di formare almeno un legame covalente con il nucleo di rete di silicato, in cui questa porzione di ancoraggio ? preferibilmente una porzione di ancoraggio idrofobica, pi? preferibilmente una porzione di alcossisilano, ancora pi? preferibilmente una porzione di trialcossisilano;
b) uno strato di rivestimento/involucro sul nucleo di rete di silicato drogato a) incorporante uno o pi? coloranti, detto strato di rivestimento/involucro b) con uno spessore tra 0,5 e 7 nm, preferibilmente tra 0,5 e 6 nm, pi? preferibilmente tra 1 e 5 nm, comprendente:
b1) uno o pi? agenti stabilizzanti colloidali, come agenti anti-incrostazione sterici o elettrostatici o agenti anti-incrostazioni di polietere, preferibilmente un agente stabilizzante comprendente almeno una struttura a catena (cs) avente una porzione di ancoraggio cs-1) in avanti rispetto al/verso il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti e una porzione idrofilica cs-2) verso l?esterno rispetto al nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti, preferibilmente la porzione di ancoraggio cs-1) ? una porzione di ancoraggio idrofobica, pi? preferibilmente una porzione di alcossisilano, ancora pi? preferibilmente una porzione di trialcossisilano e/o la porzione idrofilica cs-2 comprende una porzione di polietere, pi? preferibilmente una porzione di -PEGn-OH [-Poli(etilene glicole)n-OH] in cui n ? tra 3 e 100, preferibilmente tra 4 e 50, pi? preferibilmente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10;
b2) un bio-linker (bioconnettore/legante/collegatore) (bl) e/o un linker (connettore/legante/collegatore) chimico (cl) e/o un linker (connettore/legante/collegatore) biochimico (bcl) ciascuno di essi comprendendo una porzione di ancoraggio bl-1), cl-1) o bcl-1), rispettivamente, in avanti rispetto al/verso il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti e una porzione idrofila bl-2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, verso l'esterno del nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti, in cui:
? la parte terminale della porzione idrofilica bl-2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, comprende almeno una porzione di bioriconoscimento br-3)), una porzione di riconoscimento chimico cr-3) o una porzione di riconoscimento biochimico bcr-3), rispettivamente, in particolare, in cui la natura della "porzione di bioriconoscimento", porzione di riconoscimento biochimico" o "porzione di riconoscimento chimico" dipende dalla bio-natura o natura biochimica o natura chimica del corrispondente bio-analita, o analita biochimico o analita chimico da studiare o
? la parte terminale della porzione idrofilica bl-2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, comprende almeno un gruppo funzionale, utile per l'introduzione di una porzione di bioriconoscimento br-3)), una porzione di riconoscimento chimico cr-3)) o una porzione di riconoscimento biochimico bcr-3)), rispettivamente, detto gruppo funzionale preferibilmente selezionato dal gruppo comprendente ammina, -COOH, -N3, alchino, alchene, acriloile, -SH, maleimmide, aldeide, -OH, isotiocianato, solfonil cloruro, iodoacetil, TCT (2,4,6-Tricloro-1,3,5-triazina) o un gruppo carbossilico attivato come NHS o NHS-solfo esteri (Nidrossisuccinimmide e solfo N15 idrossisuccinimmide), TFP estere (2,3,5,6-Tetrafluorofenolo), PFP estere (pentafluorofenolo), HOBt estere (1-idrossibenzotriazolo), N-acilimidazolo, in particolare in cui la natura della "porzione di bioriconoscimento", porzione di riconoscimento biochimico" o "porzione di riconoscimento chimica" dipende dalla bio-natura o natura biochimica o natura chimica del corrispondente bio-analita, o analita biochimico o analita chimico da studiare, in cui il potenziale ? della superficie esterna della nanoparticella di silice ? neutro o negativo.
Il nucleo di rete di silicato
Il nucleo di rete di silicato ? derivato da un precursore di silice o una miscela di precursori di silice selezionati dal gruppo comprendente precursori di alcossisilano come TEOS (tetraetossisilano), TMOS (tetrametossisilano), tetrabutossisilano, 1,2-Bis(trietossisilill)etano, 1,2-Bis(trimetossisililossisilil)etano,
organoalcossisilano 1-4 come: 1,1'-(etano-1,2-diil)bis(3-(3-(trietossisilil)propil)urea), 1,1'-(esano-1,6-diil)bis(3-(3-(trietossisilil)propil)urea), 1,1'-(1,4-fenilene)bis(3-(3-(trietossisilil)propil)urea), 1,1'-(etano-1,2-diil)bis(1-fenil-3-(3-(trietossisilil)propil)urea).
Il luminoforo (colorante)
Il luminoforo (colorante) secondo la presente invenzione ? un luminoforo (colorante) avente una funzionalit? utile per l'introduzione di una porzione di ancoraggio, preferibilmente una porzione idrofobica, pi? preferibilmente una porzione di alcossisilano, ancora pi? preferibilmente una porzione di trialcossisilano, per il collegamento/legame del luminoforo (colorante) al nucleo di rete di silicato, detta funzionalit? preferibilmente selezionata dal gruppo comprendente: ammina, -COOH, -N3, alchino, alchene, acriloile, -SH, maleimmide, aldeide, -OH, isotiocianato, solfonil cloruro, iodoacetil, TCT (2,4,6-Tricloro-1,3,5-triazina) o un gruppo carbossilico attivato come NHS o NHS-solfo esteri (N-idrossisuccinimmide e solfo N-idrossisuccinimmide), TFP estere (2,3,5,6-Tetrafluorofenolo), PFP estere (pentafluorofenolo), HOBt estere (1idrossibenzotriazolo), N-acilimidazolo. Preferibilmente, il luminoforo (colorante) ? un complesso di metallo, pi? preferibilmente selezionato dal gruppo comprendente:
- Derivati di rutenio(II) polipiridina, come Ru(bpy)3<2+ >in cui bpy ? tris(2,2?-bipiridina), Ru(fen)3<2+ >in cui fen ? 1,10-fenantrolina, Ru(bpy)2(bps), Ru(fen)2 (bps) - in cui bps ? 4,7-difenil-1,10-fenantrolina disolfonato e loro derivati con struttura generale [Ru(bpy)3-n (bps)n]<2-2n >o [Ru(fen)3-n (bps)n]<2-2n >in cui n ? 1, 2 o 3, Ru(fen)2(dppz)<2+ >o Ru(bpy)2(dppz)<2+ >- in cui dppz ? dipirido[3,2-a:2,3-c]fenazina.
- Complessi di metallo Ir(III) ciclometallati omolettici, come Ir(C^N)3 in cui C^N ? un legante monoanionico come 2-fenilpiridina, e Ir(C^N)2 (L^L) eterolettico in cui C^N ? un legante monoanionico come 2-fenilpiridina e L^L ? 2,2?-bipiridina
o
il luminoforo (colorante) ? un luminoforo organico, pi? preferibilmente selezionato dai seguenti derivati: derivati di antracene, derivati di coloranti di xantene, derivati di cianina, derivati di colorante bodipy e derivati di colorante di cumarina.
Il potenziale ?
Il potenziale ? ? un ben noto parametro fisico, che ? definito come il potenziale elettrico nel Hydrodynamic Plane of Shear.
Il bio-linker (bioconnettore/legante/collegatore)/linker
(connettore/legante/collegatore) biochimico/linker (connettore/legante/collegatore) chimico
Il bio-linker (bl) e/o linker biochimico (bcl) e/o linker chimico (cl) secondo la presente invenzione ? scelto (sono scelti) in base alla natura dell'analita da studiare, ossia secondo la bio-natura, o natura biochimica o natura chimica del bio analita corrispondente, o analita biochimico o analita chimico da studiare.
Preferibilmente il bio-linker (bl) e/o un linker chimico (cl) e/o un linker biochimico (bcl) compresi nello strato di rivestimento/involucro b) secondo la presente invenzione, comprendono una porzione di ancoraggio bl-1), cl-1) o bcl-1), rispettivamente, in avanti rispetto al/verso il nucleo di rete di silicato a) incorporante l'uno o pi? coloranti e una porzione idrofila bl-2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, verso l'esterno del nucleo di rete di silicato a) incorporante l'uno o pi? coloranti, in cui:
? la parte terminale della porzione idrofilica bl-2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, comprende almeno una porzione di bioriconoscimento br-3)), una porzione di riconoscimento chimico cr-3) o una porzione di riconoscimento biochimico bcr-3), rispettivamente, in particolare, in cui la natura della "porzione di bioriconoscimento", porzione di riconoscimento biochimico" o "porzione di riconoscimento chimica" dipende dalla bio-natura o natura biochimica o natura chimica del corrispondente bio-analita, o analita biochimico o analita chimico da studiare o
? la parte terminale della porzione idrofilica bl-2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, comprende almeno un gruppo funzionale, utile per l'introduzione di una porzione di bioriconoscimento br-3)), una porzione di riconoscimento chimico cr-3) o una porzione di riconoscimento biochimico bcr-3), rispettivamente, detto gruppo funzionale preferibilmente selezionato dal gruppo comprendente ammina, -COOH, -N3, alchino, alchene, acriloile, -SH, maleimmide, aldeide, -OH, isotiocianato, solfonil cloruro, iodoacetil, TCT (2,4,6-Tricloro-1,3,5-triazina) o un gruppo carbossilico attivato come NHS o NHS-solfo esteri (N-idrossisuccinimmide e solfo N-idrossisuccinimmide), TFP estere (2,3,5,6- Tetrafluorofenolo), PFP estere (pentafluorofenolo), HOBt estere (1-idrossibenzotriazolo), N-acilimidazolo, in particolare in cui la natura della "porzione di bioriconoscimento", porzione di riconoscimento biochimico" o "porzione di riconoscimento chimica" dipende dalla bio-natura o natura biochimica o natura chimica del corrispondente bio-analita, o analita biochimico o analita chimico da studiare.
Pi? preferibilmente il bio-linker (bl) e/o un linker chimico (cl) e/o un linker biochimico (bcl) compresi nello strato di rivestimento/involucro b) secondo la presente invenzione, comprendendo una porzione di ancoraggio bl-1), cl-1) o bcl-1), rispettivamente, in avanti rispetto al/verso il nucleo di rete di silicato a) incorporante l'uno o pi? coloranti, dette porzioni di ancoraggio essendo una porzione di ancoraggio idrofobica, ancora pi? preferibilmente una porzione di alcossisilano, la pi? preferita una porzione di trialcossisilano e/o una porzione idrofilica bl-2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, verso l'esterno del nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti, dette porzioni idrofiliche comprendendo una porzione di polietere, ancora pi? preferibilmente una porzione di -PEGn-OH [-Poli(etilene glicole)n-OH] in cui n ? tra 3 e 100, preferibilmente tra 4 r 50, mentre:
? la parte terminale della porzione idrofilica bl2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, comprende almeno una porzione di bioriconoscimento br-3)), una porzione di riconoscimento chimico cr-3) o una porzione di riconoscimento biochimico bcr-3), rispettivamente, in particolare, in cui la natura della "porzione di bioriconoscimento", porzione di riconoscimento biochimico" o "porzione di riconoscimento chimica" dipende dalla bio-natura o natura biochimica o natura chimica del corrispondente bio-analita, o analita biochimico o analita chimico da studiare o
- la parte terminale della porzione idrofilica bl-2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, comprende almeno un gruppo funzionale, utile per l'introduzione di una porzione di bioriconoscimento br-3)), una porzione di riconoscimento chimico cr-3)) o una porzione di riconoscimento biochimico bcr-3)), rispettivamente, detto gruppo funzionale preferibilmente selezionato dal gruppo comprendente ammina, -COOH, -N3, alchino, alchene, acriloile, -SH, maleimmide, aldeide, -OH, isotiocianato, solfonil cloruro, iodoacetil, TCT (2,4,6-Tricloro-1,3,5-triazina) o un gruppo carbossilico attivato come NHS o NHS-solfo esteri (Nidrossisuccinimmide e solfo N-idrossisuccinimmide), TFP estere (2,3,5,6- Tetrafluorofenolo), PFP estere (pentafluorofenolo), HOBt estere (1idrossibenzotriazolo), N-acilimidazolo, in particolare in cui la natura della "porzione di bioriconoscimento", porzione di riconoscimento biochimico" o "porzione di riconoscimento chimica" dipende dalla bio-natura o natura biochimica o natura chimica del corrispondente bio-analita, o analita biochimico o analita chimico da studiare.
Un ulteriore obiettivo della presente invenzione ? l'uso dell'una o pi? nanoparticelle o una o pi? nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione come nuovi strumenti diagnostici e in particolare l'una o pi? nanoparticelle di silice (SNP o NP) o una o pi? nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione da utilizzare per, o il loro uso in applicazioni per la rilevazione, l'etichettatura e l'imaging di biomolecole e/o molecole biochimiche e o molecole chimiche.
Un altro obiettivo della presente divulgazione/descrizione ? l'uso della nanoparticella di silice di cui sopra nella terapia e nella diagnostica. Una divulgazione/descrizione particolarmente preferita della nanoparticella di silice della presente invenzione ? una sonda, secondo definizioni come inteso comunemente in questo campo tecnico e anche secondo le definizioni fornite nei documenti WO2010013136 e WO2010013137 prima citati.
Un altro obiettivo della presente invenzione ? l'uso della nanoparticella di silice di cui sopra nella chimica analitica, in particolare come una sonda come intesa comunemente in questo campo tecnico.
Un altro obiettivo della presente invenzione ? una composizione diagnostica comprendente una quantit? adatta/idonea della nanoparticella di silice di cui sopra.
PROCESSO
Un esempio del processo di produzione dell'una o pi? delle nanoparticelle di silice o una o pi? nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione, detto processo comprendente il metodo di Micro-Emulsione inversa (RME), ? rappresentato schematicamente nella figura 1 in cui il processo dell'una o pi? nanoparticelle di silice o una o pi? nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione inizia con la preparazione dell'emulsione di acqua in olio stabilizzata con tensioattivi non ionici, come glicole polietilenico terz-ottilfenile etere (Triton? X-100) o poliossietilene (12) isoottilfenil etere (Igepal? CO-520), infine, come preferito, in presenza di cotensioattivo come 1-esanolo, quindi al momento dell'aggiunta di: un luminoforo (colorante) o un luminoforo (colorante) avente una porzione di ancoraggio, come derivato di [Ru(bpy)3]<2+ >trietossi silano (Ru(bpy)3<2+>-Si(OEt)3), un precursore di silice, come TEOS e una base, come l?idrossido di ammonio (NH4OH), si forma il nucleo di rete di silicato core a) incorporante uno o pi? coloranti dell'una o pi? nanoparticelle di silice o una o pi? nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione.
I nuclei di rete di silicato a) incorporanti uno o pi? coloranti cos? ottenuti sono quindi rivestiti con uno strato di rivestimento/involucro b) comprendente un agente stabilizzante come un agente anti-incrostazione come il derivato di glicole polietilenico trietossi silano (PEG6-9Si(OEt)3) e con bio-linker come derivato di glicole polietilenico trietossisilano marcato con biotina (Biotin-PEG45-Si(OEt)3). La sintesi termina con la purificazione dell'una o pi? nanoparticelle di silice o una o pi? nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione, dal tensioattivo e dalla fase oleosa.
Come tensioattivo non ionico o co-tensioattivo secondo la presente invenzione si intende: come tensioattivo non ionico si intende una molecola che non ha alcuna carica, e che presenta una catena idrofilica, preferibilmente comprendente o composta da un poliossoetere e una coda idrofobica, preferibilmente detta coda idrofobica selezionata dal gruppo comprendente un alchile, fluoroalchile o coda steroidea; o qualsiasi tensioattivo non ionico o cotensioattivo che sono ben noti nella tecnica da utilizzare o coinvolgere nel metodo di Micro-Emulsione inversa (RME), come alchil fenil eteri di poliossoetilene o poliossoetilene (n) nonilfeniletere in cui
n = 5, 9, 12, 40, ossia glicole polietilenico terzottilfenil etere (come Triton<TM >X-100), poliossoetilene nonilfenileteri (come IGEPAL?), poliossietilene (12) isoottilfenil etere (come IGEPAL<? >CA-720), glicole polietilenico sorbitano monolaurato (come TWEEN<? >20), esteri di sorbitano (come Span<?>), glicole polietilenico alchil eteri (come Brij) e 1-esanolo.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? un processo per la produzione di una o pi? nanoparticelle di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione, detto processo comprendendo il metodo di micro-emulsione inverso (RME) in cui sono presenti le seguenti fasi:
i) Preparare una emulsione di acqua in olio stabilizzata con uno o pi? tensioattivi non ionici, e infine, come preferito, mediante la presenza di uno o pi? tensioattivi,
ii) Aggiungere alla porzione di acqua dell'emulsione stabilizzata di acqua in olio ottenuta nella fase i) un luminoforo (colorante) avente una porzione di ancoraggio, un precursore di silice e una base per formare il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti della nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP),
iii) Rivestire il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti della nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP) ottenuta nella fase ii) mediante l?aggiunta di un agente stabilizzante per ottenere uno strato di rivestimento/involucro b) della nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP).
Quale forma di realizzazione preferita del processo per la produzione di nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione, detto processo comprende il metodo di micro-emulsione inverso (RME) in cui sono presenti le seguenti fasi:
i) Preparare una emulsione di acqua in olio stabilizzata con uno o pi? tensioattivi non ionici, e infine, come preferito, mediante la presenza di uno o pi? tensioattivi,
ii) Aggiungere alla porzione di acqua dell'emulsione stabilizzata di acqua in olio ottenuta nella fase i) un luminoforo (colorante) avente una porzione di ancoraggio, un precursore di silice e una base per formare il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti della nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP),
iii) Rivestire il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti della nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP) ottenuta nella fase ii) mediante l?aggiunta di un agente stabilizzante per ottenere uno strato di rivestimento/involucro b) della nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP),
iv) Purificare la nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante ottenuta nella fase iii) dal tensioattivo non ionico e olio.
Quale forma di realizzazione pi? preferita del processo per la produzione di nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione, detto processo comprende il metodo di micro-emulsione inverso (RME) in cui sono presenti le seguenti fasi:
i) Preparare una emulsione di acqua in olio stabilizzata con uno o pi? tensioattivi non ionici, e infine, come preferito, mediante la presenza di uno o pi? tensioattivi,
ii) Aggiungere alla porzione di acqua dell'emulsione stabilizzata di acqua in olio ottenuta nella fase i) un luminoforo (colorante) avente una porzione di ancoraggio, un precursore di silice e una base per formare il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti della nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante,
(iii) Rivestire il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti della nanoparticelle di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante ottenuta nella fase ii) mediante l?aggiunta di un agente stabilizzante e un linker selezionato dal gruppo comprendente: bio-linker e/o linker biochimico e/o linker chimico, per ottenere uno strato di rivestimento/involucro b) della nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante.
Quale forma di realizzazione maggiormente preferita del processo per la produzione di nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione, detto processo comprende il metodo di micro micro-emulsione inverso (RME) in cui sono presenti le seguenti fasi:
i) Preparare una emulsione di acqua in olio stabilizzata con uno o pi? tensioattivi non ionici, e infine, come preferito, mediante la presenza di uno o pi? tensioattivi,
ii) Aggiungere alla porzione di acqua dell'emulsione stabilizzata di acqua in olio ottenuta nella fase i) un luminoforo (colorante) avente una porzione di ancoraggio, un precursore di silice e una base per formare il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti della nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP),
(iii) Rivestire il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti della nanoparticelle di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP) ottenuta nella fase ii) mediante l?aggiunta di un agente stabilizzante e un linker selezionato dal gruppo comprendente: bio-linker e/o linker biochimico e/o linker chimico, per ottenere uno strato di rivestimento/involucro b) della nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP),
iv) Purificare la nanoparticella di silice o nanoparticella di silice drogata con colorante (DDSNP) ottenuta nella fase iii) dal tensioattivo non ionico e olio.
In particolare, per spingere/incrementare ulteriormente l'intensit? di segnale, sono state sintetizzate nuove nanoparticelle di silice (NP) o nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione con un metodo di microemulsione inverso, che permette di ottenere una sospensione di nanoparticelle di silice monodisperse NP con maggiore flessibilit? in termini di dimensione di particelle e propriet? di superficie e con differente funzionalizzazione di superficie, attraverso un eccellente controllo sui parametri di sintesi.
Come forma di realizzazione della presente invenzione, la Richiedente ha ottenuto (schema sintetico nella figura 1) due serie di NP di silice drogate con Ru(bpy)3<2+ >monodisperse, vale a dire bio-Triton@RuNP e bio-Igepal@RuNP, utilizzando due tipi differenti di tensioattivi non ionici (TritonX-100 e Igepal CO-520), derivato di [Ru(bpy)3]<2+>-Si(OEt)3 come colorante e glicole-Si(OEt)3 biotinilato come unit? di bioriconoscimento.
Il diametri di nucleo (~ 90nm) e idrodinamico (dH ~ 150 nm) ? determinati con TEM e DLS rispettivamente (si vedano le figure 2A e 2B) ? di bio-Triton@RuNP e bio-Igepal@RuNP sono riportati nella Tabella 1.
Si pu? notare che sono quasi indipendenti dal tensioattivo utilizzato (si veda la figura 4).
Tabella 1. % delle molecole di coloranti rispetto alle molecole di TEOS e valore numerico dei coloranti per NP di bio-Triton@RuNP e bio-Igepal@RuNP. Diametro idrodinamico, il diametro di nucleo, indice di polidispersione (PDI), potenziale ? misurato a pH 6.7.
Gli spettri di assorbimento ed emissione, riportati nella figura 2, mostrano che la forma di picco e la posizione delle due serie di NP sono simili l'una all'altra, come rispetto a [Ru(bpy)3]<2+ >in soluzione acquosa (linea tratteggiata), poich? la matrice di silice non disturba in modo drastico le condizioni di stato di massa elettronica. La resa quantistica di fosforescenza ? e la durata/tempo di vita media del colorante in bio-Triton@RuNPs (?PL = 0,080, ? ~ 790 ns) mostrano un incremento di tre volte rispetto al colorante libero di [Ru(bpy)3]<2+ >(?PL = 0,028, ? = 334 ns) in soluzioni acquose aerate, mentre un minore incremento ? stato osservato per bio-Igepal@RuNPs (?PL = 0,050, ? ~ 618 ns) [si veda la figura 5]. L'incremento della resa quantistica di fosforescenza e l'allungamento della durata/tempo di vita dello stato eccitato possono essere attribuiti alla velocit? di diffusione ridotta di ossigeno molecolare nella matrice di silice, che dipende dalla procedura di sintesi.
Presumendo che il coefficiente di assorbimento dei complessi di [Ru(bpy)3]<2+ >non sia significativamente alterato per via del loro inserimento all'interno della matrice di silice, la Richiedente era in grado di stimare (per ulteriori dettagli si veda la Tabella 1) che ciascuna nanoparticella di silice (NP o SNP) secondo la presente invenzione include, una media di 3200 e 4800 complessi di rutenio per bio-Igepal@RuNP e bio-Triton@RuNP, rispettivamente, nonostante lo stesso livello di drogaggio iniziale (2%). E? importante rimercare che, sebbene il numero di coloranti in bio-Triton@RuNP fosse elevato, in queste NPs il potenziale ? ? rimasto molto vicino a 0 mV a differenza dei risultati precedenti con NP Plus, mentre si ? rilevato un valore leggermente positivo per bio-Igepal@RuNP.
Per testare i rendimenti ECL delle due serie di NP, ? stata eseguita la voltammetria ciclica (CV) su 1 nM di NP utilizzando TPrA (180 mM) come co-reagente sacrificale e l'intensit? ECL ? stata acquisita da un tubo fotomoltiplicatore che applica una polarizzazione di 750 V. Nella figura 3, l'intensit? ECL registrata ? stata rappresentata rispetto al potenziale scansionato tra 0 V e 1,6 V. Il meccanismo generale attivo in questa condizione per la generazione di ECL si basa sul cosiddetto meccanismo di co-reagente di ossidoriduzione schematizzato nella figura 3A e con la seguente equazione:
TPrA ? e<- >? TPrA<?+ >(1) TPrA<?+ >? TPrA<? >+ H<+ >(2) TPrA<? >bio-Triton@RuNps ? P1 bio-Triton@Ru_Nps (3) TPrA<?+ >+ bio-Triton@Ru_Nps ? TPrA bio-Triton@Ru?Nps
(4)
bio-Triton@Ru?Nps ? bio-Triton@RuNps h? (5)
in cui TPrA tri-n-propilammina; bio-Triton@RuNps ? il [Ru(bpy)3]<2+>; bio-Triton@RuNps ? il [Ru(bpy)3]<2+>; bio-Triton@Ru*Nps ? il [Ru(bpy)3]<2+>* incorporato nella nanoparticella e P1 ? il prodotto dell'ossidazione omogenea di TPrA<?>.
Si pu? vedere chiaramente che i bio-Triton@RuNP mostrano una intensit? ECL molto maggiore rispetto ai bio-Igepal@RuNp.
Questa differenza pu? essere spiegata solo in parte dal grado di drogaggio maggiore osservato per gli NP sintetizzati con il tensioattivo Triton.
Di fatto, anche dopo la normalizzazione dell'intensit? di ECL mediante il numero di coloranti/NP, il bio-Triton@RuNP mostrer? ancora una intensit? maggiore (si veda la Tabella 2), suggerendo quindi che dovrebbero essere considerati altri fattori, per esempio, i differenti potenziali ?- e rese quantiche di fotoluminescenza.
Tabella 2 Intensit? ECL massime ottenute in voltammetria ciclica ed eseguite su bio-Igepal@RuNp e bio-Triton@RuNp (si veda la figura 3A) e l'intensit? ECL normalizzata per il numero di coloranti per NP.
Il potenziale ? positivo di bio-Igepal@RuNP ?, secondo i risultati precedenti, svantaggioso rispetto all'emissione di ECL, pi? probabilmente per via della repulsione elettrostatica tra la superficie NP e gli intermedi cationici co-reagenti vicini.
Per questo problema, la generazione di ECL con NP finora era limitata all'uso di co-reagenti idrofili (come 2-(dibutilammino)etanolo), quindi bloccando la generazione di ECL ottenibile con TPrA.
Tuttavia, i dati mostrano che la Richiedente poteva, con questa strategia di sintesi, ottenere NP dotate dei parametri di NP corretti (per esempio, potenziali ?, unit? di bioriconoscimento, idrofobicit?, distribuzione di colorante e dimensione NP) per la generazione di ECL efficiente utilizzando TPrA (si veda la figura 4).
L'intensit? di ECL potenziata ottenuta con basse concentrazioni di bio-Triton@RuNP e l'uso di TPrA come coreagente ci hanno spinto a testare tali NP in imaging ECL, che ? stato un insuccesso con altre NP di nucleorivestimento/involucro probabilmente per via degli effetti deleteri di cui sopra.
Secondo il meccanismo schematizzato nella figura 3B (si veda inoltre l'equazione 1-5), l'imaging ? stato eseguito su singole perle da 2,8 ?m funzionalizzate con bio-Triton@RuNp (perle@Triton) o un anticorpo biotinilato marcato con complesso di [Ru(bpy)3]<2+ >(perle@bio-Ru), imitando l'approccio analitico del sistema di saggio immunitario a base ECL commerciale (Figura 7).
? interessante che l'intensit? di ECL ottenuta in caso di perle@Triton era di 8,5 volte pi? volte (si vedano le figure 3C, D, Tabella 3), rappresentando un risultato molto interessante e promettente.
Tabella 3. L'intensit? di ECL a un singolo livello di perla di perle@bio-Ru e perle@triton insieme con i parametri quantitativi di colorante presente.
Le immagini da perle da 2,8 ?m funzionalizzate (figure 3C e 3D), da molteplici perle (figure 8-10) e rispettivi profili di emissione ECL (figura 3E), confermano il massiccio potenziamento/incremento di segnale ECL di perle@Triton (linea grigia) in confronto a perle@bio-Ru (linea nera e si veda l'inserto della figura 3E).
Per porre a confronto in modo quantitativo i due casi, la quantit? di Ru immobilizzato sulla superficie delle microperle ? stato quantificato con analisi ICP-MS (Tabella 4).
Tabella 4. Parametri ICP-MS relativi alla quantificazione di colorante ottenuta dall'analisi di 500 ?L perle@bio-Ru e perle@Triton avente un'area stabilita di 4,42E+09 ?m<2>.
La concentrazione di rutenio [Ru] ? ottenuta direttamente da analisi ICP-MS. Il n? di rutenio ? il numero di ione di rutenio ottenuto dal prodotto di concentrazione di Ru, il volume (500 ?L) e la costante di Avogadro. Ru/?m<2 >? il numero di rutenio diviso per l'area delle perle in 500 ?L.
Come si pu? vedere, la concentrazione di colorante era circa 660 volte maggiore nel caso di perle@Triton, un valore che ? in linea con una occupazione simile prevista dei siti attivi sulla superficie di microperla mediante l'anticorpo rutenioderitivizzato biotinilato o bio-Triton@RuNp, che contengono 6 e 4800 complessi [Ru(bpy)3]<2+>, rispettivamente. Questo indica che solo una piccola porzione dei complessi di Ru (intorno al 1,3%, presumendo un sistema s? o no) partecipano al vasto (750%) incremento di emissione ECL rispetto all'approccio commercialmente disponibile.
Nel presente caso, i coloranti bio-Ru mostrano una durata/tempo di vita lunga quasi come [Ru(bpy)3]<2+ >in NP Triton (immagini FLIM nella figura 7, Tabella 3), ossia notevolmente pi? lunga rispetto a una del complesso [Ru(bpy)3]<2+ >in acqua. Questo indica che l'incremento di durata/tempo di vita di luminescenza e resa quantica causata dall'inclusione del complesso dentro la matrice di silice pu? essere solo in minima parte la causa dell'incremento di segnale osservato.
Risulta interessante che l'ECL delle perle@Triton ha mostrato una stabilit? migliorata in confronto a perle@bio-Ru (figura 11) grazie al nanoambiente di matrice di silice che protegge contro le reazioni elettrochimiche indesiderate, aumentando il loro rendimento potenziale.
Questo risultato, gi? promettente di per s?, suggerisce che l'azione sulla procedura di sintesi pu? portare a un incremento del segnale ancora pi? pronunciato. Saranno eseguiti ulteriori studi in questa direzione per implementare la combinazione tra NP e l'imaging ECL.
Per concludere, la Richiedente ha sintetizzato una nuova famiglia di NP di silice, secondo la presente invenzione come le dette bio-Triton@RuNp, ottenute seguendo il metodo di microemulsione inverso e derivatizzato con biotina.
Utilizzando questo approccio sintetico, in opposizione a quello che ? stato osservato con un altro tipo di NP gi? noto nello stato della tecnica, l?elevato grado di drogaggio di colorante (circa 4800 complessi ogni NP) non ha portato a una carica superficiale positiva permettendo quindi una emissione ECL elevata. Inoltre, mediante utilizzo TPrA come co-reagente, queste DDSNP portano a un notevole potenziamento di segnale ECL in confronto alle condizioni che riproducono il sistema di saggio immunologico a base di ECL commerciale (ossia basato su un anticorpo marcato con 6 coloranti). La matrice di silice pu? aumentare la stabilit? del segnale ECL, aumentando, ancora di pi?, le prestazioni potenziali di queste NP. Questi risultati supportano l'uso dell'una o pi? nanoparticelle (SNPo NP) o una o pi? nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) secondo la presente invenzione, in tecniche di microscopia ECL e apron inoltre un nuovo promettente percorso verso la rilevazione pi? sensibile di analita, anche nella biorilevazione e nei dispositivi presso i punti di assistenza. Il miglioramento del numero di complessi attivi nella generazione di segnali ECL maggiori e un incremento ancora maggiore nella stabilit? ECL rappresenta una ulteriore spinta per orientare possibili studi di impatto in questa direzione.
ESEMPI METODI
Agenti chimici
Igepal CO-520 (poliossoetilene nonilfeniletere, MWmedia=2200 g/mol), Triton X-100 (glicole polietilenico terz-ottilfenil etere, MWmedia=5900 g/mol), tetraetil ortosilicato (TEOS, MW=208,33 g/mol, ? 99, 99%), soluzione acquosa di ammoniaca (NH4OH, MW=40,08 g/mol, 28-30 wt% in acqua), glicole O-[2-(Biotinilammino)etil]-O?-[3-(N-succinimidilossi)-3-ossopropil]polietilenico (biotina-PEG-NHS, MW=3000 g/mol), Tri-n-propilammina (TPrA, MW=143,27 g/mol, ?98% V/V), diidrato monobasico di fosfato di sodio (NaH2PO4?2H2O, MW= 119.98 g/mol, ?99%), fosfato di sodio dibasico (Na2HPO4, MW=141,96 g/mol, ?99%), acido fosforico (H3PO4, MW=98,00 g/mol, ?85%), 4,4?- dimetil-2,2?-bipiridina (MW=184,24 g/mol, ?99%), Lidiisopropilammina (MW=107,12 g/mol, ?97%), 1,3-bromopropano (MW=201,89 g/mol, ?99%), potassio ftalimmide (MW=185,22 g/mol, ?98%), n-esanolo (anidro, MW=102,17 g/mol, ?99%), Cicloesano (MW=84,16 g/mol, ?99%), trietil-ammina (TEA, MW=101,19 g/mol, ?99,5%), (3-amminopropil)trietossisilano (APTS, MW=221,37 g/mol, ?99%) e Dimetil solfossido (DMSO, anidro, MW=78,13 g/mol, ?99,9%), dimetilformammide (DMF) e diammina (i-iv) sono stati acquistati dalla Sigma-Aldrich. 3-isocianatopropiltrietossisilano (MW=237,36 g/mol, ?95%), e 2-[metossi(polietileneossi)6-9propil]trimetossisilano (MWavg=525 g/mol, ?90%) sono stati acquistati da Gelest. Perle da 2,8 ?m rivestite (perle Dynabeads) con streptavidina sono state acquistate dalla ThermoFisher scientific e anticorpi marcati con biotina e Ru(bpy)3<2+>.
Sintesi
La sintesi di uno o pi? precursori di silice del nucleo di rete di silicato della nanoparticella secondo la presente invenzione, come precursori di alcossisilano.
Sintesi - caratterizzazione <1>H NMR di alcuni precursori di organosilano/alcossisilano, come i derivati di organoetossisilano 1-4
I derivati di organoetossisilano 1-4 sono stati sintetizzati con reazioni ?click? tra le corrispondenti diammine (i-iv) e (3-isocianatopropil)trietossisilano. In una tipica preparazione, 0,2 mmol di diammina sono stati disciolti in 0,1 mL di dimetilformammide (DMF) e sono stati aggiunti 0,4 mmol di (3-isocianatopropil)trietossisilano. Questa miscela ? stata fatta vorticare (con vortex) per 1 minuti e quindi agitata per 30 minuti a temperatura ambiente. Ciascuna sintesi ? stata eseguita prima della preparazione delle nanoparticelle e il loro prodotto ? stato usato senza ulteriore purificazione.
1,1'-(etano-1,2-diil)bis(3-(3-(trietossisilil)propil)urea)
(1)
<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d8, 25 ?C) ? (ppm): 0,51 (m, 4H, - NHCH2CH2CH2-Si), 1,14 (t, J 8,0 Hz, 18H, -Si-(OCH2CH3)3), 1,41 m, 4H, -NHCH2CH2CH2-Si), 2,94 (q, 4H, J 4,0 Hz, -NHCH2CH2CH2-Si), 2,99 (t, J 4,0 Hz, 4H, -NHCH2CH2NH-), 3,74 (q, J 8,0 Hz, 12H, -Si-(OCH2CH3)3), 5,86 (t (ampio), J 8,0 Hz, 2H, - NHCH2CH2CH2-Si), 5,96 (t (ampio), J 8,0 Hz, 2H, -NHCH2CH2NH-).
<13>C NMR (75,5 MHz, DMSO-d8, 25 ?C) ? (ppm): 7,3, 18,2, 22,6, 40,1, 42,1, 57,7, 158,2.
1,1'-(esano-1,6-diil)bis(3-(3-(trietossisilil)propil)urea)
(2)
<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d8, 40 ?C) ? (ppm): 0,51 (m, 4H, - NHCH2CH2CH2-Si), 1,15 (t, J 12,0 Hz, 18H, -Si-(OCH2CH3)3), 1,24 m, 4H, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 1,34 (t (ampio), J 6,0 Hz, 4H, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 1,41 (m, 4H, -NHCH2CH2CH2-Si), 2,95 (m, 8H, CH2NH-CO-NHCH2CH2CH2-Si), 3,74 (q, J 6,0 Hz, 12H, -Si-(OCH2CH3)3), 5,70 (t (ampio), J 6,0 Hz, 2H, -NHCH2CH2CH2-Si), 5,76 (t (ampio), J 6,0 Hz, 2H, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-).
<13>C NMR (151 MHz, DMSO-d8, 40 ?C) ? (ppm): 7,2, 18,0, 23,5, 26,1, 30,0, 39,1, 41,9, 57,6, 158.
1,1'-(1,4-fenilene)bis(3-(3-(trietossisilil)propil)urea)
(3)
<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d8, 25 ?C) ? (ppm): 0,53 (m, 4H, - NHCH2CH2CH2-Si), 1,15 (t, J 8,0 Hz, 18H, -Si-(OCH2CH3)3), 1,47 (m, 4H, -NHCH2CH2CH2-Si), 3,03 (m, 4H, -NHCH2CH2CH2-Si), 3,74 (q, J 8,0 Hz, 12H, -Si-(OCH2CH3)3), 6,04 (t (ampio), J 4,0 Hz, 2H, -NHCH2CH2CH2Si), 7,22 (s, 4H, Harom), 8,14 (s, 2H, - CONH-C6H6-NHCO-)
<13>C NMR (75,5 MHz, DMSO-d8, 25 ?C) ? (ppm): 7,3, 18,2, 23,5, 41,8, 57,7, 114,2, 134,4, 155,4.
1,1'-(etano-1,2-diil)bis(1-fenil-3-(3-(trietossisilil)propil)urea) (4)
<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d8, 25 ?C) ? (ppm): 0,61 (m, 4H, - NHCH2CH2CH2-Si), 1,17 (t, J 8,0 Hz, 18H, -Si-(OCH2CH3)3), 1,62 (m, 4H, -NHCH2CH2CH2-Si), 3,23 (s (ampio), 4H, -NHCH2CH2NH-), 3,31 (t, 4H, J 4,0 Hz, -NHCH2CH2CH2-Si), 3,77 (q, J 8,0 Hz, 12H, -Si-(OCH2CH3)3), 5,58 (s (ampio), 2H, -NHCH2CH2CH2-Si), 6,54 (m, 2H), 6,60 (m, 4H), 7,08 (m, 2H) Harom
<13>C NMR (75,5 MHz, DMSO-d8, 25 ?C) ? (ppm): 7,0, 18,1, 24,6, 42,1, 44,9, 57,7, 58,1, 112,0, 116,2, 128,8, 148,7.
Sintesi del derivato di Ru(bpy)3<2+>-TES. Questo composto (figura 1B) ? stato ottenuto mediante sintesi e accoppiamento di Bis(2,2?-bipiridina)-[4-(4?-metil-2,2?-bipiridin4il)amminobutil]rutenio(II)
bis(esafluorofosfato), e 3isocianatopropiltrietossisilano secondo le procedure riportate in precedenza (si veda lo schema S1)
Schema S1. Schema di sintesi del derivato di Ru(bpy)3<2+>-TES (3) ottenuto mediante accoppiamento di Bis(2,2?-bipiridina)-[4-(4?-metil-2,2?-bipiridin4il)amminobutil]rutenio(II) ? (esafluorofosfato) (1) e 3-isocianatopropiltrietossisilano (2).
Sintesi del derivato di Biotina-PEG45-TES. La sintesi del derivato di PEG ha iniziato a disciogliersi in un tubo di plastica da 1,5 ml, circa 5 mg di Biotin-PEG45-NHS (1,66 ?mol) con 100 ?L di DMSO e aggiungendo quindi 0,5 ?L di APTES (2,12 ?mol). La reazione viene tenuta in condizione di miscelazione con un agitatore vortex, per 2 ore e quindi utilizzata senza alcuna ulteriore purificazione per la funzionalizzazione della superficie delle nanoparticelle di silice.
Preparazione di nanoparticelle di Ru(bpy)3<2+ >Triton o Igepal Silica drogate in modo covalente. Lo schema di sintesi della preparazione delle nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP), viene mostrato nella figura 1. Due famiglie di DDSNP sono state sintetizzate mediante l?utilizzo di un metodo di microemulsione inversa (RME) a temperatura ambiente. Il tensioattivo (Triton X-100 o Igepal CO-520), cicloesano, acqua e TEOS sono stati introdotti in una fiala di vetro sotto agitazione magnetica rapida creando un sistema di microemulsione ternario. Per le nanoparticelle di silice utilizzanti Triton X-100 come tensioattivo, ? stato inoltre aggiunto n-esanolo alla microemulsione quaternaria. Dopo un tempo di equilibratura di 20 minuti ? stato aggiunto il derivato di Ru(bpy)3<2+>-TES alla miscela; dopo miscelazione per 20 minuti ? stata aggiunta ammoniaca acquosa NH4OH sia come reagente (H2O) sia come catalizzatore (NH3) per l'idrolisi del TEOS. La reazione ? stata posta sotto agitazione per ulteriori 24 ore a temperatura ambiente, seguita dall'aggiunta di PEG e silano-PEG-biotina per il post-rivestimento della particella e la modifica di superficie.
La miscela ? stata quindi fatta reagire per ulteriori 24 ore sotto agitazione.
Quindi, le nanoparticelle sono state isolate dalla microemulsione con acetone, centrifugate pi? volte a 4000 rpm per 3 min. e lavate con etanolo e acqua diverse volte per rimuovere qualsiasi molecola di tensioattivo. Si ? usata ultrasonicazione durante il processo di lavaggio per rimuovere i fluorofori assorbiti fisicamente dalle superfici delle particelle.
Tutti i reagenti impiegati con le loro esatte quantit? per la sintesi di bio-Triton@RuNP e bio-Igepal@RuNP sono elencati nella Tabella 5.
Tabella 5
Funzionalizzazione delle perle
Per consentire le misurazioni di imaging ECL, le perle rivestite con strepavidina con un diametro di 2,8 ?m sono state funzionalizzate con nanoparticelle di silice o nanoparticelle di silice drogate con colorante (DDSNP) come bio-Triton@RuNps. La soluzione di perle magnetiche (diametro 2,8 ?m; Perle Dynabeads (ThermoFisher scientific) 6 mL, (area della superficie totale di 7 x 10<9 >?m<2>) sono state versate in una fiala da 20 mL e le perle sono state raccolte utilizzando un magnete per 2 minuti. Successivamente, il supernatante ? stato scaricato e sono stati aggiunti 18 mL di soluzione bio-Trito@RuNP (10 nM) in tampone fosfato (0,01 M), seguiti da 2 ore di incubazione a 37? C sotto rotazione per formare il legame di biotinastreptavidina. La soluzione ? stata separata con un magnete e il supernatante ? stato scaricato. L'intera procedura ? stata ripetuta cinque volte. Alla fine del quinto ciclo, le perle@Triton sono state lavate cinque volte in tampone fosfato (0,2 M) e tensioattivo di polidodecanolo per eliminare le nanoparticelle non legate e stoccate nel tampone di perle a 4? C. Sono state ottenute perle@bio-Ru utilizzando la stessa procedura ma utilizzando il coniugato libero (anticorpo mercato con biotina e Ru(bpy)3<2+>) invece della soluzione di bio-Triton@RuNps.
Misurazioni fotofisiche
Gli spettri di assorbimento di UV?Vis sono stati registrati a 25? C utilizzando uno spettrofotometro PerkinElmer Lambda 45. Gli spettri di fluorescenza sono stati registrati con un fluorimetro PerkinElmer Lambda LS55 e con uno spettrofluorimetro modulare UV-Vis-NIR Edinburgh Instruments FLS920 dotato di un fotomultiplatore HamamatsuR928P. Quest'ultimo strumento collegato a una scheda di PC PCS900 ? stato usato per esperimenti di conteggio del singolo fotone correlati al tempo (TCSPC) (lunghezza d?onda del laser di eccitazione ? = 410 nm). La sospensione di NP ? sta diluita con acqua milli-Q. Le rese quantiche di luminescenza (incertezza 15%) sono state registrate su soluzioni acquose equilibrate in aria utilizzando Ru(bpy)3<2+ >come colorante di riferimento<. >Le decadenze di durata/tempo di vita di fosforescenza sono compatibili con una decadenza bi-esponenziale, i valori di durata/tempo di vita sono riportati come media ponderata di due gruppi di dati opportunamente rielaborati.
Microscopia elettronica di trasmissione (TEM) e diffusione di luce dinamica (DLS).
Per gli studi di TEM, ? stato usato un microscopio elettronico a trasmissione Philip CM 100 operante a 60 kV e griglie di rame da 3,05 mm (film di supporto da Formvar - 400 mesh). Una goccia di soluzione di DDSN diluita con acqua (1:50) ? stata posta sulla griglia e quindi asciugata sotto vuoto. Le immagini TEM mostranti i nuclei di silice pi? densi sono stati analizzati con il software ImageJ, considerando poche centinaia di nanoparticelle. L'istogramma ottenuto ? stato sottoposto a un fit su una distribuzione Gaussiana ottenendo il diametro medio per le nanoparticelle di silice.
Le distribuzioni delle dimensioni/diametro della nanoparticella di silice secondo la presente invenzione sono state determinate mediante diffusione di luce dinamica (DLS) impiegando uno strumento Malvern Nano ZS con un diodo laser da 633 nm. I campioni sono stati alloggiati in cuvette di polistirene monouso di 1 cm di lunghezza di percorso ottico. L?ampiezza della distribuzione del diametro idrodinamico DLS ? indicata dal PdI (indice di polidispersione). Nel caso di una distribuzione monomodale (Gaussiana), ? stata calcolata utilizzando l'analisi cumulante PdI = (?/Zavg)<2>, in cui ? ? l?ampiezza della distribuzione e Zavg ? il diametro medio della popolazione di particelle, rispettivamente.
Esperimenti per il Potenziale ?
I valori di potenziale ? sono stati determinati utilizzando uno strumento Malvern Nano ZS. I campioni erano alloggiati in cella capillare piegata di policarbonato monouso (DTS1070, 750 ?L, lunghezza percorso ottico 4 mm). La determinazione elettroforetica del potenziale ? ? stata eseguita con approssimazione Smoluchowski in mezzo acquoso a concentrazione elettrolitica moderata.
Fluorescenza confocale di scansione laser e imaging di durata/tempo di vita di fluorescenza (FLIM) Le perle funzionalizzate sono state caratterizzate con un microscopio confocale di scansione laser Nikon A1R. Le immagini sono state raccolte utilizzando un obiettivo a immersione in olio Nikon PLAN APO 100x, NA 1,45. Lo stenoscopio ? stato impostato a una 1 unit? Airy. Nell'Imaging a fluorescenza confocale di scansione laser ? stato usato un lase CW da 401 nm per l?eccitazione, che era riflesso sullo specchio dicroico (405 nm), mentre i fotoni di emissione sono stati raccolti attraverso un filtro di emissione da 595/50 nm. Nel FLIM ? stato usato un sistema di conteggio a singolo fotone correlato al tempo (TCSPC) della Picoquant GmbH Berlino con un laser ad eccitazione a impulsi da 405 nm a frequenza di ripetizione da 25 kHz, lo stesso specchio dicroico, un filtro di emissione a passo lungo da 560 nm, un rilevatore PMA ibrido e un pannello di correlazione Picoquant TimeHarp.
Stima del numero medio dei complessi dentro ciascuna NP
Il peso di ciascuna NP ? stato ottenuto calcolando il volume delle NP dal diametro del nucleo misurato con le immagini TEM e prendendo 2,0 g mL<-1 >quale densit? della matrice di silice. Da questo valore, il numero di NP prodotte durante la fase di sintesi ? stata stimata presumendo che tutte le TEOS introdotte fosse convertite in NP di silice, un presupposto che si ? rivelato valido se si assegna un tempo sufficiente prima dell'isolamento di NP, come in questo caso. La concentrazione finale ? stata calcolata conoscendo il volume di acqua aggiunta per preparare la soluzione da NP isolate. Dagli spettri di assorbimento ? stato infine possibile determinare la concentrazione totale dei complessi di Ru presumendo lo stesso coefficiente di eccitazione molare per il complesso nella soluzione (a 452 nm ?=14600 cm<-1 >M<-1>) quando incorporato nel reticolo di silce); e dividendo questo valore per la concentrazione delle NP ? possibile stimare il numero medio di complessi Ru contenuti in ciascuna NP.
Spettrometria di massa al plasma con accoppiamento induttivo
La X Series<II >ICP-MS della Thermo Fisher ? stata usata per quantificare il Ru coniugato alle perle (perle@Triton e perle @bio-Ru). In breve, 500 ?L di perle sono stati disciolti in 358 ?L di acido nitrico (70%) e acqua a doppia distillazione a un volume finale di 5 mL e incubati per la notte a 80? C. Dopo la dissoluzione, si ? ottenuta una soluzione chiara. La quantit? totale di Ru, come concentrazione di ppm, ? stata normalizza rispetto all'area della superficie totale della dimensione di ciascuna perla per ottenere la densit? Ru ?m<?2 >(si veda la Tabella 4).
Misurazioni di ECl e imaging ECL
Le misurazioni ECL sono state eseguite con la stazione elettrochimica PGSTAT30 Ecochemie AUTOLAB in una cella di plexiglass artigianale a tre elettrodi utilizzando un disco con diametro di 2 mm di carbonio vetroso (GC) come elettrodo operativo, una spirale di Pt come contro-elettrodo e Ag/AgCl, KCl (3 M) come elettrodo di riferimento. Le misurazioni ECL sono state eseguite su sospensione NP diluita con tampone fosfato (PB, pH 7.4). Per la generazione ECL, si sono utilizzati 180 mM di TPrA come co-reagente ossidante. Il segnale ECL generato mediante esecuzione dei programmi di fasi potenziali ? stato misurato con un tubo fotomoltilplicatore Acton PMT PD471 posto a una distanza costante di fronte alla cella e dentro la scatola scura. Una tensione di 750 V ? stata erogata al PMT. Le curve di luce/corrente/tensione sono state registrate mediante raccolta del segnale di uscita PMT pre-amplificato (mediante un modello di ricerca Acton con rumore ultra-basso 181) con il secondo canale di ingresso del modulo ADC dello strumento AUTOLAB.
L'imaging ECL/ottico di perle@Triton e perle@bio-Ru, depositate sull'elettrodo operativo e raccolte con un magnete, ? stato eseguito utilizzando una soluzione di 0,2 M PB (pH 6,9), 180 mM TPrA e tensioattivo di polidodecanolo in una cella elettrochimica fatta in casa in PTFE comprendente elettrodi di: operativo di Pt (0,16 cm<2>), contatore di Pt e di riferimento Ag/AgCl (3 M KCl). Per l'imaging microscopico, ? stato usato un microscopio a epifluorescenza della Nikon (Chiyoda, Tokyo, Giappone) dotato da una fotocamera EMCCD ultrasensibile (EM-CCD 9100?13 della Hamamatsu, Hamamatsu Giappone) con una risoluzione di 512 x 512 pixel e una dimensione/diametro di 16 x 16 ?m<2>. Il microscopio ? stato racchiuso in una scatola oscura fatta in casa per evitare le interferenze della luce esterna. Inoltre era dotato di uno stadio di microscopio a motore (Corvus, M?rzhauser, Wetzlar, Germania) per il posizionamento dei campioni e con obbiettivi a lunga distanza della Nikon (100x/0,80 /DL4,5 mm e 40x/0,60/DL3,6). Il sistema integrato includeva inoltre un potenziostato della AUTOLAB (PGSTAT 30). Le immagini sono state registrare durante l'applicazione di un potenziale costante di 1,4 V (rispetto a Ag/AgCl 3M KCl) per 4 s con un tempo di integrazione di 8 s.
Traduzione delle figure
Figura 1
Oil: olio;
Water: acqua;
Surfactant: tensioattivo;
Silica: silice;
Biotion: biotina;
Purification: purificazione;
Figura 2
Probability: probabilit?;
Diameter: diametro;
Normalized: normalizzato;
Wavelength: lunghezza d?onda;
Figura 3
ECL Intensity (a.u.): intensit? ECL (unit? arbitrarie);
Distance: distanza;
Potential: potenziale;
Electrode: elettrodo;
Bead/s: perla/perle;
Figura 4
Size distribution by intensity: distribuzione del diametro/dimensione per intensit?;
Intensity (Percent): intensit? (percento);
Size (d nm): diametro/dimensione (d nm);
Undersize: sottodiametro/sottodimensione;
Figura 5
Counts: conteggi;
t(ns): tempo (ns);
Residuals: residui;
Figura 6
ECL Intensity (a.u.): intensit? ECL (unit? arbitrarie);
Potential: potenziale;
Figura 7
Fast lifetime: tempo di vita/durata veloce;
Figura 8
ECL Intensity (a.u.): intensit? ECL (unit? arbitrarie);
Figura 9
ECL Intensity (a.u.): intensit? ECL (unit? arbitrarie);
Figura 10
ECL Intensity (a.u.): intensit? ECL (unit? arbitrarie);
Figura 11
ECL Intensity (a.u.): intensit? ECL (unit? arbitrarie);
time: tempo.
Claims (13)
1. Nanoparticella di silice comprendente:
a) un nucleo di rete di silicato con un diametro in un intervallo tra 10 nm e 500 nm, preferibilmente tra 20 nm e 250 nm, in cui almeno un luminoforo (colorante) ? confinato in detto nucleo di rete di silicato, o collegato in modo covalente alla rete di silicato del nucleo poich? detto luminoforo (colorante) ha una porzione di ancoraggio in grado di formare almeno un legame covalente con il nucleo di rete di silicato, b) uno strato di rivestimento/involucro sul nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti, detto strato di rivestimento/involucro b) con uno spessore tra 0,5 e 7 nm, preferibilmente tra 0,5 e 6 nm, pi? preferibilmente da 1 e 5 nm, comprendente uno o pi? agenti stabilizzanti colloidali, selezionati dal gruppo comprendente: agenti anti-incrostazione sterici o elettrostatici o agenti anti-incrostazione di polietere.
2. Nanoparticella secondo la rivendicazione 1, in cui la porzione di ancoraggio ? preferibilmente una porzione di ancoraggio idrofobica, pi? preferibilmente una porzione di alcossisilano, ancora pi? preferibilmente una porzione di trialcossisilano.
3. Nanoparticella secondo la rivendicazione 1, in cui lo strato di rivestimento/involucro b) comprende un bio-linker (bl) e/o un linker chimico (cl) e/o un linker biochimico (bcl) ciascuno di essi comprendendo una porzione di ancoraggio bl-1), cl-1) o bcl-1), rispettivamente, in avanti rispetto al/ verso il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti e una porzione idrofila bl-2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, verso l'esterno del nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti, in cui:
? la parte terminale della porzione idrofilica bl-2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, comprende almeno una porzione di bioriconoscimento br-3), una frazione di riconoscimento chimico cr-3) o una porzione di riconoscimento biochimico bcr-3), rispettivamente, o ? la parte terminale della porzione idrofilica bl-2), cl-2) o bcl-2), rispettivamente, comprende almeno un gruppo funzionale, utile per l'introduzione di una porzione di bioriconoscimento br-3), una porzione di riconoscimento chimico cr-3) o una porzione di riconoscimento biochimico bcr-3), rispettivamente, detto gruppo funzionale selezionato preferibilmente dal gruppo comprendente ammina, -COOH, -N3, alchino, alchene, acriloile, -SH, maleimmide, aldeide, -OH, isotiocianato, solfonil cloruro, iodoacetile, TCT (2,4,6-Tricloro-1,3,5-triazina) o un gruppo carbossilico attivato come NHS e NHS-solfo esteri (N-idrossisuccinimmide e solfo N-idrossisuccinimmide), TFP estere (2,3,5,6-Tetrafluorofenolo), PFP estere (pentafluorofenolo), HOBt estere (1-idrossibenzotriazolo), N-acilimidazolo.
4. Nanoparticella secondo la rivendicazione 1, in cui il luminoforo (colorante) ? un luminoforo (colorante) avente una funzionalit? utile per l'introduzione di una porzione di ancoraggio, preferibilmente una porzione di ancoraggio idrofobica, pi? preferibilmente una porzione di alcossisilano, ancora pi? preferibilmente una porzione di trialcossisilano.
5. Nanoparticella secondo la rivendicazione 4, in cui detto gruppo funzionale ? selezionato dal gruppo comprendente: ammina, -COOH, -N3, alchino, alchene, acriloile, -SH, maleimmide, aldeide, -OH, isotiocianato, solfonil cloruro, iodoacetil, TCT (2,4,6-Tricloro-1,3,5-triazina) o un gruppo carbossilico attivato come NHS o NHS-solfo esteri (N-idrossisuccinimmide e solfo N-idrossisuccinimmide), TFP estere (2,3,5,6- Tetrafluorofenolo), PFP estere (pentafluorofenolo), HOBt estere (1-idrossibenzotriazolo), N-acilimidazolo.
6. Nanoparticella secondo le rivendicazioni 1 - 5, in cui il luminoforo (colorante) ?:
un complesso di metallo, pi? preferibilmente selezionato dal gruppo comprendente:
- Derivati di rutenio(II) polipiridina, come Ru(bpy)3<2+ >in cui bpy ? tris(2,2?-bipiridina), Ru(fen)3<2+ >in cui fen ? 1,10-fenantrolina, o Ru(bpy)2(bps) - in cui bps ? 4,7-difenil-1,10-fenantrolina disolfonato e loro derivati con struttura generale [Ru(bpy)3-n (bps)n]<2-2n >o [Ru(fen)3-n(bps)n]<2-2n >in cui n ? 1, 2 o 3, Ru(fen)2(dppz)<2+ >o Ru(bpy)2(dppz)<2+ >- in cui dppz ? dipirido[3,2-a:2,3-c]fenazina,
- Complessi di metallo Ir(III) ciclometallati omolettici, come Ir(C^N)3 in cui C^N ? un legante monoanionico come 2-fenilpiridina, e Ir(C^N)2 (L^L) eterolettico in cui C^N ? un legante monoanionico come 2-fenilpiridina e L^L ? 2,2?-bipiridina,
o
un luminoforo organico, pi? preferibilmente selezionato dal gruppo comprendente: derivati di antracene, derivati di colorante di xantene, derivati di cianina, derivati di colorante bodipy e derivati di colorante di cumarina.
7. Nanoparticella secondo le rivendicazioni 1 - 6, in cui l'agente stabilizzante colloidale dello strato di rivestimento/involucro b) ? un agente stabilizzante colloidale, come agenti anti-incrostazione sterici o elettrostatici o agenti anti-incrostazione di polietere, preferibilmente un agente stabilizzante comprendente almeno una struttura di catena (cs) avente una porzione di ancoraggio cs-1 avanti rispetto al/verso il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti e una porzione idrofilica cs-2) all'esterno/verso l?esterno del nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti, preferibilmente la porzione di ancoraggio cs-1 ? una porzione di ancoraggio idrofobica, pi? preferibilmente una porzione di alcossilato, ancora pi? preferibilmente una porzione di trialcossisilano e/o la porzione idrofilica cs-2 comprende una porzione di polietere, pi? preferibilmente una porzione di -PEGn-OH [-Poli(etilene glicole)n-OH] in cui n ? tra 3 e 100, preferibilmente tra 4 e 50, pi? preferibilmente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
8. Nanoparticella di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7 per l'uso nella diagnostica, in particolare come una sonda.
9. Uso della nanoparticella di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7 in chimica analitica, in particolare come sonda.
10. Composizione diagnostica comprendente una quantit? adatta/idonea della nanoparticella di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7.
11. Processo per la produzione di una nanoparticella secondo le rivendicazioni 1 - 7, detto processo comprendente il metodo di Micro-Emulsione inversa (RME) in cui sono presenti le seguenti fasi:
i) Preparare una emulsione di acqua in olio stabilizzata con uno o pi? tensioattivi non ionici, e infine mediante la presenza di uno o pi? tensioattivi, ii) Aggiungere alla porzione di acqua dell'emulsione stabilizzata di acqua in olio ottenuta nella fase i) un luminoforo avente una porzione di ancoraggio, un precursore di silice e una base per formare/ottenere il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti della nanoparticella, iii) Rivestire il nucleo di rete di silicato a) incorporante uno o pi? coloranti ottenuti nella fase ii) mediante aggiunta di un agente stabilizzante colloidale, per formare/ottenere uno strato di rivestimento/involucro b) della nanoparticella.
12. Processo secondo la rivendicazione 11, in cui nella fase iii) si aggiunge inoltre un linker selezionato dal gruppo comprendente: bio-linker e/o linker biochimico e/o linker chimico.
13. Processo secondo le rivendicazioni 11-12, comprendente inoltre la fase:
iv) Purificare la nanoparticella ottenuta nella fase iii) da tensioattivo non ionico e olio.
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