IT202000015895A1

IT202000015895A1 - L’impiego di acido arundico nella terapia della sclerosi multipla

Info

Publication number: IT202000015895A1
Application number: IT102020000015895A
Authority: IT
Inventors: Fabrizio Michetti; Francesco Ria; Sante Gabriele Di; Mariagrazia Valentini; Elisabetta Clementi; Beatrice Sampaolese; Susanna Amadio
Original assignee: Univ Cattolica Del Sacro Cuore; Fond Italiana Sclerosi Multipla Fism Onlus; Elisabetta Clementi; Beatrice Sampaolese; I R C C S Fondazione Santa Lucia Istituto Di Ricovero E Cura A Carattere Scient
Priority date: 2020-07-27
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2022-01-27

Description

"L?impiego di acido arundico nella terapia della sclerosi multipla?

CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione riguarda acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di sclerosi multipla (SM). L?invenzione si riferisce inoltre ad un?associazione e ad una composizione farmaceutica comprendenti detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, nonch? ad un kit farmaceutico comprendente il principio attivo in una o pi? forme di dosaggio adatte, per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di SM.

STATO DELL?ARTE

La sclerosi multipla (SM) ? una malattia autoimmune cronica caratterizzata da demielinizzazione e perdita assonale, con lesioni focali o placche nella sostanza bianca del sistema nervoso centrale (CNS). In particolare, la sclerosi multipla recidivante-remittente (RR-SM) rappresenta la tipologia di SM largamente pi? diffusa nel mondo occidentale (circa 80% dei malati), esercitando un impatto significativo sia in ambito socioeconomico che sanitario (Lublin, J. Neurol Sci 1982).

La RR-SM ? caratterizzata da un?alternanza di fasi acute, ?recidive?, nelle quali si presentano nuovi sintomi, e fasi di remissione, con parziale o completa assenza di sintomatologia.

Ad oggi non sono del tutto noti i meccanismi esatti che sono in grado di scatenare i processi infiammatori alla base della formazione delle placche di demielinizzazione, e di conseguenza le strategie terapeutiche attualmente impiegate nel trattamento della SM sono necessariamente aspecifiche e non efficaci in maniera soddisfacente (Kaunzner et al., Curr Treat Options Neurol.

2017).

Negli ultimi anni, numerosi studi hanno investigato gli effetti neuroprotettivi dell?acido arundico in modelli animali di condizioni patologiche del sistema nervoso centrale (SNC) diverse dalla sclerosi multipla, quali ischemia cerebrale, malattia di Alzheimer, e malattia di Parkinson (Mari C. et al., Int J Dev Neurosci 2019; Mori T. et al., J Pharmacol Exp Ther; 2006; Kato H. et al., Brain Res.2004). Yamamura M. e Tateishi N. (EP3520795 A1), hanno riportato, ad esempio, l?uso di acido arundico in combinazione con un ormone di rilascio della tireotropina (TRH) per il trattamento di malattie neurodegenerative, tra cui demenza, e di infarto cerebrale. In particolare, ? stato mostrato che l?impiego di suddetta combinazione consente di migliorare disturbi di apprendimento in topi modello soggetti a chirurgia di cauterizzazione dell'arteria vertebrale.

L'acido arundico ? stato anche studiato come farmaco per il trattamento di malattie neurodegenerative intrattabili come la sclerosi laterale amiotrofica, SLA (Chen et al., Cent Nerv Syst Agents Med Chem.2009). Una formulazione iniettabile comprendente questo farmaco ? denominata ?Proglia? ed ? attualmente in fase di studio negli Stati Uniti e in Giappone per il trattamento dell?infarto cerebrale. Una formulazione orale di acido arundico, ?Cereact?, ? in sperimentazione nel Regno Unito per il potenziale trattamento della malattia di Alzheimer e Parkinson; in Giappone e in Europa ? invece in fase di sperimentazione per il trattamento della SLA (dePaulis et al., Current Opin Investig Drugs 2003).

Bench? gli studi sperimentali e preclinici condotti finora abbiano dimostrato l?efficacia dell?acido arundico in nuovi approcci terapeutici per il trattamento o la prevenzione di numerose malattie neurodegenerative, comunque non ? stato definito a tutt?oggi un suo possibile ruolo nel trattamento di processi patologici della SM.

Alla luce di quanto detto sopra, vi ? pertanto una crescente esigenza di poter disporre di soluzioni terapeutiche efficaci per il trattamento della SM, soluzioni che consentano non solo di ridurre la gravit? sintomatologica, ma allo stesso modo di ritardare e/o di prevenire l?insorgenza della malattia.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Dopo estensiva sperimentazione, gli autori della presente invenzione hanno trovato che l?acido arundico (o acido (2R)-2-propilottanoico) fornisce una soluzione efficace per la prevenzione e/o per il trattamento della sclerosi-multipla (SM).

In particolare, la presente invenzione si basa sulla scoperta che l?acido arundico consente di attenuare la severit? sintomatologica della patologia in un modello murino sperimentale affetto encefalomielite autoimmune sperimentale indotta nella forma RR (RR-EAE), forma maggiormente diffusa tra le tipologie di SM umana diagnosticate nel mondo occidentale. Vantaggiosamente, gli autori dell?invenzione hanno trovato che la somministrazione di acido arundico in topi affetti da RREAE ? in grado non solo di bloccare o ritardare l?insorgere della fase acuta della malattia, nonch? di diminuirne l?intensit? sintomatologica e migliorare il quadro dei parametri biomolecolari ed istopatologici, ma anche di anticiparne e prolungarne la fase di remissione.

Infatti, i risultati della ricerca preclinica e traslazionale condotta dagli inventori (riportati nelle Figure 1-3), mostrano che la somministrazione di acido arundico risulta in grado di modulare l?andamento della malattia e di indurre cambiamenti infiammatori in topi affetti da RR-SM. Inoltre, l?acido arundico esercita il proprio effetto quando somministrato durante la fase acuta della malattia, in concomitanza con il danno alla barriera ematoencefalica che ? noto accompagnare questa fase della patologia (Osorio-Querejeta et al., Front Mol Neurosci 2018), facilitando il passaggio al tessuto nervoso del farmaco, senza alcuna controindicazione.

Alla luce di tali effetti terapeutici, l?acido arundico ha un?enorme potenzialit? di applicazione come farmaco nella prevenzione e/o trattamento della SM e in particolare nel miglioramento sintomatologico della malattia nella forma RR-SM.

Pur non volendo legare la presente invenzione ad alcun meccanismo d?azione specifico si riporta che l?inibizione della sintesi di S100B, che costituisce verosimilmente un fattore chiave in detti processi patologici della SM, consente un significativo avanzamento dell?efficacia terapeutica della presente invenzione sia rispetto ai farmaci generici attualmente impiegati, che rispetto ad altri farmaci noti nello stato della tecnica, come la pentamidina, i quali hanno ugualmente S100B come bersaglio terapeutico ma ne bloccano l?attivit? e non la sintesi, esponendo il paziente al rischio che la molecola ritorni attiva. L?inibizione della sintesi di S100B ? stata ottenuta in modo efficace mediante la somministrazione di acido arundico.

Inoltre, ? utile sottolineare l?ulteriore vantaggio che l?acido arundico ? gi? disponibile sul mercato permettendo quindi una rapida applicazione, come mostrato dai trial clinici attualmente in corso per altre patologie diverse da SM (Chen et al., Cent Nerv Syst Agents Med Chem 2009). Questo aspetto appare particolarmente rilevante sul piano commerciale.

Pertanto, un primo aspetto della presente invenzione si riferisce all?acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento della sclerosi multipla (SM). L?invenzione si riferisce inoltre ad un?associazione comprendente detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, e un secondo principio attivo, ad esempio a scelta tra uno o pi? anticorpi anti-S100B neutralizzanti, come BL356, pentamidina, o uno o pi? farmaci che modificano la malattia, gi? previsti dall?algoritmo terapeutico (disease-modifying therapies, DMTs) di prima linea per le RR-MS quali: Interferon Beta 1a e 1b, dimetifumarato, glatiramer acetato, teriflunomide e alemtuzumab o ocrelizumab (Montalban X. et al., Mult. Scler. J, 2018), per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento della sclerosi multipla (SM). Ulteriori aspetti dell?invenzione hanno come oggetto una composizione farmaceutica comprendente acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, nonch? un kit farmaceutico comprendente il principio attivo in una o pi? forme di dosaggio adatte, per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento della SM.

Altri vantaggi e caratteristiche della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1. Trattamento AA nei topi SJL affetti da EAE (modello di RR-MS). a. Come indicato dalla timeline, l?esperimento ha previsto di indurre l?EAE in 19 topi femmina del ceppo SJL per mezzo di immunizzazione con iniezione sottocutanea (S.C.) alla base della coda di un?emulsione composta dall?antigene della mielina Plp139-151 e l?adiuvante, quest?ultimo costituito dalla parete di Mycobacterium Tuberculosis, altrimenti detto adiuvante completo di Freund (CFA), e concentrato di 4 volte (4X); nello stesso giorno della immunizzazione (giorno 0) ed in ripetizione (terzo d.p.i., ossia dopo l?immunizzazione) si ? iniettato per via intraperitoneale (IP) un preparato di tossina di Bordetella Pertussis (BDT). Sei giorni dopo l'induzione dell?EAE, un gruppo di topi (n=10, in totale in due esperimenti differenti) ? stato trattato con acido arundico (AA, 4mg/kg IP, formulazione in polvere poi ridisciolta in PBS, come fornita con il codice ONO2506 dalla ditta Tocris, Biotechne, Italia), come spiegato nei metodi e sulla base delle di precedenti studi (Othani et al., 2007; Ishiguro et al.2019). b) ? stato valutato lo score di malattia secondo esperienza e seguendo delle scale comunemente riconosciute e parzialmente illustrate a sinistra delle ordinate del grafico (0= topo non malato/normale, 1 atonia della coda, 1,5=perdita dei riflessi motori e/o aumento del tempo di ritorno nella posizione dopo rovesciamento, 2-2,5=emi-paralisi di un arto posteriore con o senza combinazione con paralisi della coda e 3=paralisi di entrambi gli arti posteriori) e sono stati omessi gli score peggiori di malattia che non sono stati raggiunti negli esperimenti (4=paralisi degli arti anteriori e 5= morte). ? possibile osservare differenze significative nel punteggio clinico (test t-Student): il gruppo trattato ha mostrato una gravit? inferiore confrontando il punteggio medio e il punteggio cumulativo della malattia con i topi trattati con veicolo, e in particolare nella fase di inizio della malattia che comprende la prima fase acuta e l?inizio della remissione: infatti il gruppo di topi non trattati (linea e simboli in grigio) iniziano ad ammalarsi e con maggiore severit? dall?11? giorno e in maniera significativa dal 14? al 16? giorno, mentre i topi trattati con acido arundico (linea e simboli neri) ritardano ad ammalarsi, lo fanno in maniera significativamente pi? lieve e rimettono gi? al 16? giorno quando i topi trattati sono al loro picco massimo di malattia. Questi dati propongono che l'inibizione della sintesi di S100B ad opera di acido arundico possa essere un fattore ritardante della malattia, che esplica la sua efficacia in particolare nella fase acuta della Sclerosi Multipla. c & d) esiste un altro modo di analizzare l?intensit? di malattia, mettendo cio? a confronto da una parte (c) la quantit? di malattia accumulata da ciascun topo (che equivale alla somma degli score di ciascun topo per ogni giorno di malattia) e dell?altra (d) la media di malattia di ciascun topo (calcolata come la somma degli score di ciascun topo rapportata al numero di giorni di malattia); in entrambi i grafici a barre si confrontano il gruppo trattato (barra nera, AA) e il gruppo non trattato (barra grigia, PBS o veicolo) e si pu? notare una maggiore quantit? (c, p=0,02) e media (d, p=0,03) di malattia nel gruppo dei non trattati, ancora una volta confermando il ruolo dell?acido arundico nel ridurre la severit? di malattia.

Figura 2. Impatto dell?acido arundico nell'espressione di NOS e ROS. Tutte le isoforme dell'ossido nitrico sintasi (NOS) sono presenti nel sistema nervoso centrale con una chiara upregolazione nella microglia e nei macrofagi reattivi, con conseguente elevata generazione di ossido nitrico, un radicale libero che si trova a concentrazioni pi? alte del normale all'interno della SM infiammatoria. Inoltre, ? stato ampiamente accertato che la SM pu? essere affetta da stress ossidativo. Tuttavia, ? stato anche riportato che nella RR-MS prevale il processo infiammatorio e lo stress ossidativo ? contrastato da meccanismi antiossidanti. Questo grafico mostra la misurazione dell'attivit? enzimatica di NOS e delle specie reattive dell?ossigeno (ROS) nei topi affetti da RR-EAE evidenziando che il trattamento con acido arundico (AA, barre nere) ha un effetto antiossidante (diminuendo ROS) e ripristina l'attivit? dell'enzima NOS ai livelli di controllo. Pur rimanendo ancora da chiarire i meccanismi molecolari che contribuiscono alla riduzione della produzione di ossido nitrico (NO) con il conseguente potenziale antiossidante e antinfiammatorio tale saggio di attivit? colorimetrica per ROS e per NOS ha prodotto una differenza significativa (PBS, barre grigie, vs AA, barre nere, con una significativit? di p<0,0001 per entrambi i t test).

Figura 3. Modulazione delle citochine e S100B da parte di acido arundico. Il saggio quantitativo con metodica PCR quantitativa (qPCR) in real-time eseguito a partire da campioni di RNA messaggero totale estratto dai lisati di 'emi-encefalo di topi (sacrificati al 23? giorno p.i.) non affetti da EAE (simboli bianchi), affetti da RR-EAE non trattati (EAE+PBS, simboli grigi) e trattati (EAE+AA, simboli neri), mostra una riduzione negli animali trattati con AA rispetto ai non trattati significativa di interferon-? (IFN?, a, p=0,0381) e sebbene non significativa di ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS, b, p=0,9).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE

GLOSSARIO

I termini impiegati nella presente descrizione sono come generalmente compresi dall?esperto della tecnica, salvo ove diversamente indicato.

Con il termine specifico ?sclerosi multipla recidivante-remittente?, abbreviato RR-SM, la presente invenzione si riferisce alla forma pi? comune di sclerosi multipla. Circa l?80% delle persone diagnosticate ha inizialmente questa forma, che ? caratterizzata da un?alternanza di fasi acute, ?recidive?, nelle quali si presentano nuovi sintomi, e fasi di remissione, con parziale o completa assenza di sintomatologia.

Con il termine ?encefalomielite autoimmune sperimentale?, abbreviato EAE dall?inglese ?experimental autoimmune encephalomyelitis?, nella presente invenzione si fa riferimento al modello animale di SM in grado di riprodurre i principali aspetti neuroimmunologici e istopatologici della malattia.

Con il termine di Acido Arundico, abbreviato AA dall?inglese ?Arundic Acid?, si fa riferimento all?inibitore della sintesi di S100B, utilizzato nella presente invenzione nel trattamento degli animali affetti da EAE.

Come precedentemente menzionato, un primo aspetto della presente invenzione ha come oggetto l?acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, per l?uso nella prevenzione e/o trattamento della sclerosi multipla (SM).

L?acido arundico, o acido (2R)-2-propilottanoico, ? un composto chirale noto commercialmente con la sigla ONO-2506, e presenta la seguente struttura:

Formula I

Esempi non limitanti di sali di acido arundico farmaceuticamente accettabili e impiegabili nella presente invenzione includono sali di sodio, sali di potassio, o sali di ammonio, cos? come sali di cationi divalenti quali, ad esempio, sali di Ca<2+>, Mg<2+>, Fe<2+>, Ba<2+>, <+>H3N-NH3<+>, <+>H2N-NH2<+ >o <+>HN-NH<+>.

Formula II

L?acido arundico pu? essere impiegato nella presente invenzione anche in una delle sue forme enantiomeriche, R-(-) o S-(+), o eventualmente in forma racemica (formula II). L?invenzione prevede preferibilmente l?impiego di acido arundico con le due forme enantiomeriche in quantit? equimolare. In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, un sale farmaceuticamente accettabile di acido arundico ? un composto di formula II che include i due enantiomeri, in forma amorfa o in forma cristallina, dove X<2+ >? preferenzialmente Ca<2+>.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione concerne un?associazione di acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, e un secondo principio attivo, ad esempio a scelta tra uno o pi? anticorpi anti-S100B neutralizzanti, quale BL356, e/o uno o pi? farmaci che modificano la malattia, gi? previsti dall?algoritmo terapeutico (disease-modifying therapies, DMTs) di prima linea per le RR-MS quali, ad esempio, Interferon Beta 1a e 1b, dimetifumarato, glatiramer acetato, teriflunomide e alemtuzumab o ocrelizumab (Montalban X. et al., Mult. Scler. J, 2018), e/o pentamidina, per l?uso nella prevenzione e/o trattamento della SM.

L?associazione di acido arundico e di uno o pi? farmaci che modificano la malattia, di prima linea per le RR-MS, consentirebbe di implementare l?efficacia nel controllo della fase acuta/onset di malattia. Un aspetto particolarmente preferito della presente invenzione si riferisce ad un?associazione di acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, e pentamidina per l?uso nella prevenzione e/o trattamento della SM.

Sotto un altro aspetto, la presente invenzione riguarda inoltre una composizione farmaceutica comprendente acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabili, e uno o pi? eccipienti, per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di SM.

Componenti eccipienti adatti ad essere impiegati nella presente invenzione, possono essere scelti tra quelli normalmente noti nello stato della tecnica quali, ad esempio, stabilizzanti, conservanti, solventi, regolatori di pH, regolatori di isotonia, agenti chelanti, agenti diluenti, antiossidanti, agenti leganti, agenti crioprotettori, tensioattivi.

Preferibilmente, la composizione farmaceutica della presente invenzione comprende acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, in una concentrazione compresa tra il 20% e l?80% rispetto al peso totale di detta composizione.

La presente invenzione riguarda inoltre una composizione farmaceutica comprendente acido arundico, come sopra descritta, da solo oppure in combinazione con un secondo principio attivo, ad esempio a scelta tra uno o pi? anticorpi anti-S100B neutralizzanti, quale BL356, o pentamidina. Un esempio di anticorpo anti-S100B neutralizzante BL356 disponibile commercialmente e adatto ad essere impiegato in una delle forme di realizzazione della presente invenzione ? BL356 prodotto da Bethyl Laboratories (Kabadi S.V. et al., J. Cer. Bl. Flow & Met., 2015).

Forme di pentamidina commercialmente disponibili che possono essere utilizzate in associazione con acido arundico secondo una qualsiasi delle forme della presente invenzione, includono ad esempio la Pentamidina isetionato, disponibile in commercio dalla ditta Abbott, con il nome Pentacarinat dalla ditta Sanofi-Aventis, o Pentacrinat dalla ditta Abbott (Di Sante et al. Cells, 2020). In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detta composizione comprende detto anticorpo anti-S100B, BL356, in una concentrazione compresa tra il 5% e il 30% rispetto al peso totale di detta composizione.

In una forma di realizzazione altrettanto preferita della presente invenzione, detta composizione comprende pentamidina in una concentrazione compresa tra il 5% e il 30% rispetto al peso totale di detta composizione.

In un aspetto preferito dell?invenzione, detta composizione farmaceutica comprende detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, in concentrazione compresa tra il 70% e il 95%, e detto secondo principio attivo, quale anticorpo anti-S100B BL356, in concentrazione compresa tra il 5% e il 30% rispetto al peso totale di detta composizione. In un altro aspetto particolarmente preferito dell?invenzione, detta composizione farmaceutica comprende detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, in concentrazione compresa tra il 70% e il 95%, e detto secondo principio attivo, quale pentamidina, in concentrazione compresa tra il 5% e il 30% rispetto al peso totale di detta composizione.

Le composizioni secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione fornite nella presente descrizione, possono essere formulate in forma solida come, ad esempio, polvere, polvere orosolubile, granulato, capsula rigida o soft-gel, compressa, oppure in forma liquida, come, ad esempio, sospensione, soluzione, emulsione, sciroppo, spray.

Detta composizione farmaceutica pu? essere somministrata per via orale, via sistemica, via intraperitoneale, via intra-nasale, via endovenosa, via intra-muscolare, via sub-cutanea, o via transdermica. Preferibilmente, detta composizione farmaceutica ? somministrata per via orale, per via sistemica o per via intra-peritoneale.

La presente invenzione si riferisce inoltre all?uso di acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, o delle associazioni o delle composizioni comprendenti detto inibitore in accordo ad una qualunque delle forme di realizzazione qui descritte, nella prevenzione e/o trattamento di tutte le forme di SM clinicamente rilevanti, quali SM recidivante-remittente (RR-SM), SM secondariamente progressiva (SP-SM), SM primariamente protettiva (PP-SM).

Come evidente dagli esempi sperimentali ivi descritti (Figura 1-3), la somministrazione di acido arundico consente di migliorare la sintomatologia clinica della patologia in un modello sperimentale di RR-SM, e in particolare in topi affetti da encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Detta somministrazione consente inoltre di ritardare l?insorgere della malattia e di renderne anche pi? rapida la remissione.

Pertanto, secondo un aspetto preferito della presente invenzione, l?acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, o un?associazione o una composizione comprendenti detto principio attivo, potranno essere utilizzati per la prevenzione e/o per il trattamento di SM nella forma RR, la forma di SM pi? diffusa, caratterizzata dall?alternanza di fasi acute e di fasi di remissione.

La somministrazione del composto, dell?associazione, o della combinazione qui descritte potr? essere effettuata in particolare durante una fase acuta e/o durante una fase di remissione della RR-SM.

Detto acido arundico, o associazione, o composizione formulate secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione dell?invenzione potranno essere somministrate in una o pi? dosi, con un dosaggio compreso tra 3 e 9.5 mg/Kg/die di detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile.

Secondo un aspetto dell?invenzione, le composizioni comprendenti acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, e suddetto secondo principio attivo, secondo una delle forme di realizzazione qui descritte, potranno essere somministrate in una o pi? dosi, con un dosaggio compreso tra 3 e 9.5 mg/Kg/die di detto acido arundico, e un dosaggio compreso tra 0.5 e 3 mg/Kg/die di detto secondo principio attivo.

Secondo un aspetto dell?invenzione, le composizioni comprendenti acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, e suddetto anticorpo S100B neutralizzante, BL356, secondo una delle forme di realizzazione qui descritte, potranno essere somministrate in una o pi? dosi, con un dosaggio compreso tra 3 e 9.5 mg/Kg/die di detto acido arundico, e un dosaggio compreso tra 0.5 e 3 mg/Kg/die di detto anticorpo anti-S100B neutralizzante, BL356.

Secondo un aspetto preferito dell?invenzione, detta composizione comprendente acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, e detto secondo principio attivo, quale pentamidina, secondo una delle forme di realizzazione qui descritte, potr? essere somministrata in una o pi? dosi, con un dosaggio compreso tra 4 e 10 mg/kg/die di detto acido arundico, e un dosaggio compreso tra 0.5 e 3 mg/Kg/die di detta pentamidina.

Pi? dosi comprendenti il principio attivo secondo una delle forme precedentemente descritte, potranno ad esempio essere somministrate in maniera sequenziale o contemporanea ad un paziente che ne abbia bisogno.

La combinazione degli ingredienti attivi sopra detti potr? essere usata formulata in un?unica composizione secondo le varie forme di realizzazione sopra descritte, o in un kit comprendente i diversi ingredienti separati, ad esempio in composizioni singole preconfezionate secondo un?adatta forma di dosaggio per la somministrazione sequenziale o contemporanea dei diversi principi attivi. Pertanto, costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un kit comprendente una o pi? aliquote contenenti i principi attivi dell?associazione secondo una qualunque delle forme di realizzazione qui descritte, o una loro miscela, preconfezionate secondo un?adatta forma di dosaggio per somministrazione sequenziale o contemporanea.

ESEMPI

Esempi di solventi per la formazione dei sali e dei solventi dell'acido arundico accettabili dal punto di vista farmaceutico sono, tra l'altro, l'acqua, l'etanolo, l'acetone, l'acido acetico, il 1-propanolo, il 2-propanolo, l'acetato di etile, l'etere dietilico e simili. Il solvente ? preferibilmente acqua, etanolo, o una loro miscela; e pi? preferibilmente acqua. La frase "comprendente, in combinazione", come qui usata, ? usata con significati che comprendono i seguenti casi per la composizione della presente invenzione e sono riportati di seguito alcuni esempi di realizzazione, forniti a titolo illustrativo e non limitativo.

ESEMPIO 1:

ESEMPIO 2:

STUDI IN VITRO

Metodo Sperimentale:

Animali utilizzati: Femmine SJL di 8 settimane (del peso compreso tra 18 e 24 g) stabulati in gabbie da massimo 5 individui, con un accesso ?ad libitum? al cibo e acqua ed all?interno di ambienti a temperatura controllata (23?1?C), con un?umidit? di 55?5% e illuminati per 12 ore (dalle 6:45 alle 18:45).

Encefalite Autoimmune Sperimentale (EAE)

L?EAE ? stata indotta in 19 topi femmina del ceppo SJL (in totale, suddivisi in gruppi e ripetuti in due diversi esperimenti) per mezzo di immunizzazione con iniezione sottocutanea (S.C.) alla base della coda di un?emulsione composta dall?antigene della mielina Plp139-151 (comunemente usato in questo ceppo di topi, in quanto altamente immunogeno, essendo il frammento immuno-dominante della PLP murina contenuta nella mielina, proteina che a sua volta compone la guaina dei nervi, bersaglio dei processi autoimmuni e auto-infiammatori della SM), e l?adiuvante (che dunque serve a potenziare la risposta immune innescando la cascata dei meccanismi autoimmuni). Tale adiuvante ? rappresentato dalla parete di Mycobacterium della Tuberculosis, altrimenti detto adiuvante completo di Freund (CFA), e concentrato di 4 volte (4X).

Nello stesso giorno della immunizzazione (giorno 0) ed in ripetizione (terzo d.p.i., ossia dopo l?immunizzazione) si ? iniettato per via intraperitoneale (IP) un preparato di tossina di Bordetella Pertussis (BDT).

I topi in cui ? stata indotta la malattia sono stati tenuti sotto osservazione per studiarne il decorso. La EAE porta inizialmente ad una atonia della coda e di seguito ad un difetto di deambulazione che inizia dalle zampe posteriori e si pu? estendere a quelle anteriori. Nel 15% circa degli animali il quadro si aggrava fino a portare ad uno stato di difficolt? di deambulazione (score 3), della durata di 24 ore. Tutti i sintomi regrediscono spontaneamente con successiva ricaduta con un quadro simile dopo 3-7 giorni, per poi evolvere verso una fase cronica di malattia meno grave. Nel periodo di acuzie della sintomatologia che generalmente non si protrae per pi? di 24/48 ore, gli animali vengono agevolati nel poter raggiungere cibo bagnato con acqua, posto all?interno della gabbia e trattati con analgesici. I topi sono stati monitorati giornalmente valutando tutte le varie sintomatologie neurologiche. Gli animali sono stati sacrificati al 23? giorno di malattia e ne ? stato prelevato il sistema nervoso centrale (CNS) per effettuare le analisi dei lisati. Lo score della malattia ? stato cos? calcolato: 1- atonia della coda; 2- atonia della coda e andamento esitante delle zampe posteriori (clumsy gate); 3- atonia della coda e difficolt? di deambulazione delle zampe posteriori; 4- atonia della coda e difficolt? di deambulazione delle zampe posteriori e anteriori; 5-morte (Nicolo et al 2006, Penitente et al 2008, Nicol? et al 2010, Miller et al 2010).

Efficacia dell?inibizione farmacologica della sintesi di S100B in RR-EAE:

I topi sono stati monitorati quotidianamente per la stadiazione clinica e sacrificati durante la recidiva (23?giorno). Al fine di inibire la sintesi di S100B, ? stato utilizzato l'acido arundico (AA) (Ono Pharmaceutical Co., Ltd., Mishima, Osaka, Giappone). La molecola ONO-2506 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Arundic-acid) [(R)-(-)-2-acido propilottanoico (acido arundico)] ? stata fornita dalla ditta Tocris, rivenditrice per conto di Ono Pharmaceutical Co., Ltd. (Osaka, Japan). All?interno del gruppo trattato con ONO-2506, gli animali hanno ricevuto un?iniezione quotidiana intraperitoneale di ONO-2506 (4 mg/kg) dal sesto al diciassettesimo giorno dopo l?immunizzazione (d.p.i.), mentre nel gruppo di animali di controllo ? stata inietta la soluzione salina (PBS). Il dosaggio e la via di somministrazione del farmaco sono stati decisi sulla base di studi precedenti (Othani et al., 2007; Ishiguro et al. 2019). L?acido arundico ? stato somministrato alla dose di 4 mg/kg/0,08ml/die e preparato in una soluzione 10 volte pi? concentrata. La somministrazione intraperitoneale di AA ha mostrato di ridurre in modo significativo l'espressione di S100B, con effetti benefici, nel modello sperimentale di topi RR-EAE. In breve, i topi RR-EAE sono stati distribuiti casualmente in due gruppi diversi:

- Il gruppo 1 ? RR-EAE trattato (n=10) che ha ricevuto giornalmente 4 mg/kg (0,08 ml di soluzione per individui da 20 g) di AA per 12 giorni consecutivi, IP, a partire da 6? giorno d.p.i. fino al 17? giorno d.p.i.

- Il gruppo 2 - placebo-RR-EAE (n=9) trattato con un volume equivalente di veicolo (PBS) con lo stesso programma.

Gli animali sono stati sacrificati per il recupero dei SNC che sono stati processati e analizzati con le procedure descritte. Sia i risultati clinici che quelli patologici/biomolecolari hanno mostrato un effetto protettivo contro l?EAE esercitata dall'inibizione da parte di AA della sintesi di S100B.

Metodi molecolari e istologici

Allo scopo di valutare le caratteristiche patologiche dell?EAE, sia i topi trattati e non trattati, entrambi affetti da RR-EAE, che i topi sani, sono stati sacrificati durante la recidiva (23? giorno), espiantando e processando per analisi cellulari e molecolari i campioni di SNC.

L'RNA messaggero ? stato isolato con "SV Total RNA Isolation System" (Promega) e la concentrazione di RNA ? stata valutata mediante lettura spettrofotometrica a 280 e 260 nm. L'RNA messaggero ? stato utilizzato per la sintesi del cDNA con il "Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacit?" (Applied Biosystems). I reagenti Power Mix ? SYBR? Green (Applied Biosystem) Master Mix (2X) sono stati utilizzati secondo le raccomandazioni del produttore. La quantizzazione dell'espressione genica ? stata ottenuta per mezzo di Applied Biosystems 7900HT FAST REALTIME PCR SYSTEM. I reagenti Master Mix (2X) di PowerUp ? SYBR? Green (Applied Biosystem) sono stati utilizzati in base alle raccomandazioni del produttore.

Preparazione degli omogenati

200 mg di cervello congelato sono stati trasferiti su un mortaio e si ? ottenuto l?omogenato del tessuto in azoto liquido con un pestello, secondo il metodo di Dutring, che mantiene il tessuto completamente congelato per preservarne l'integrit? funzionale e strutturale. I campioni sono stati trasferiti in una provetta per microcentrifuga con 1 ml di reagente di lisi cellulare ProteoJET (Fermental Life Science) pi? un cocktail di inibitori della proteasi, agitato su vortex e quindi centrifugato a 13000 rpm a 4? C per 10 minuti. La concentrazione proteica dei sovranatanti ? stata misurata con lo strumento Bio-Rad in micropiastre. Tutti i campioni sono stati normalizzati alla stessa concentrazione proteica e utilizzati secondo specifiche procedure sperimentali.

L?impatto dell?acido arundico nell?espressione di NOS e di ROS nel sistema nervoso centrale (Figura 2) ? stato studiato utilizzando i metodi seguenti:

Test delle specie reattive dell?ossigeno (ROS).

I livelli di ROS sono stati misurati utilizzando il kit di dosaggio ROS intracellulare OxiSelect? (fluorescenza verde; Cell Biolabs, Inc. San Diego, California, USA) secondo le istruzioni del produttore. La piastra ? stata letta con un lettore di piastre a fluorescenza a 480 nm di eccitazione / 530 nm di emissione. Una curva standard ? stata realizzata utilizzando una soluzione standard 2?,7?-diclorodiidrofluoresceina (DCF) (la soluzione del produttore).

Attivit? della ossido nitrico sintasi (NOS).

L'attivit? dell'enzima NOS ? stata misurata con il metodo colorimetrico utilizzando il kit di analisi dell'attivit? NOS (BioVision) secondo le indicazioni del produttore. La densit? ottica di questo colorante ? stata misurata a 540 nm usando un lettore di micropiastre. Per generare la curva di calibrazione ? stata utilizzata una soluzione standard, corrispondente a 0, 250, 500, 750, 1000 pmol / pozzetto di nitrito standard. ? stata calcolata l'attivit? specifica dell'ossido nitrico sintasi = B/TxC = mU/mg di proteina dove, B ? la quantit? di nitrito nel pozzetto del campione dalla curva standard, T ? il tempo di reazione (60 min) C ? la quantit? di proteina.

Analisi statistica.

Sono stati eseguiti i test di student, ANOVA a una via o ANOVA a due vie (con RR-EAE ed EE come fattori principali) per esaminare gli effetti e la possibile interazione di variabili indipendenti (software GraphPad 6.0). Sono stati effettuati confronti post hoc utilizzando l'HSD di Tukey, con un livello di significativit? di p <0,05. Per l'analisi statistica dei dati quantitativi della PCR, il test t non parametrico ? stato utilizzato per confrontare i valori di ?Ct tra i replicati, impostando il valore di cut-off del valore p su 0,05.

CONCLUSIONI

La presente invenzione si basa sulla scoperta l?acido arundico (o acido (2R)-2-propilottanoico) fornisce una soluzione efficace per la prevenzione e/o trattamento dei processi patologici della sclerosi-multipla (SM). Pertanto, la presente invenzione riguarda acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di SM. L?invenzione si riferisce inoltre ad un?associazione e ad una composizione farmaceutica comprendenti detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, nonch? ad un kit farmaceutico comprendente il principio attivo in una o pi? forme di dosaggio adatte, per l?uso sopra descritto.

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Acido arundico, o un suo sale e/o farmaceuticamente accettabile, per l?uso nella prevenzione e/o trattamento della sclerosi multipla (SM).

2. Acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui detto acido arundico ? in quantit? equimolare tra i due enantiomeri.

3. Acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, per l?uso secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui detta sclerosi multipla ? sclerosi multipla recidivanteremittente (RR-SM).

4. Acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, ? somministrato in una o pi? dosi, con un dosaggio giornaliero compreso tra 3 e 10 mg/kg/die.

5. Acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, per una via di somministrazione scelta tra orale, sistemica, intraperitoneale, intra-nasale, endovenosa, intramuscolare, subcutanea, transdermica.

6. Acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, ? somministrato durante la fase acuta e/o durante la fase di remissione della malattia.

7. Associazione di acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, e un secondo principio attivo, ad esempio a scelta tra uno o pi? anticorpi anti-S100B neutralizzanti, quale BL356, e/o uno o pi? farmaci che modificano la malattia (farmaci per disease-modifying therapies, DMTs), quali Interferon Beta 1a e 1b, dimetifumarato, glatiramer acetato, teriflunomide e alemtuzumab o ocrelizumab, e/o pentamidina, per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di sclerosi multipla (SM).

8. Associazione per l?uso secondo la rivendicazione 7, in cui detto secondo principio attivo ? la pentamidina, in particolare Pentamidina isetionato.

9. Associazione per l?uso secondo le rivendicazioni 7 o 8, in cui detta sclerosi multipla ? sclerosi multipla recidivante-remittente (RR-SM).

10. Associazione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 9, in cui detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, ? somministrato in una o pi? dosi, con un dosaggio giornaliero compreso tra 3 e 9.5 mg/Kg/die, e/o detto secondo principio attivo ? somministrato in una o pi? dosi, con un dosaggio giornaliero compreso tra 0.5 e 3 mg/kg/die.

11. Associazione per l?uso secondo la rivendicazione 10, in cui detto secondo principio attivo ? un anticorpo anti-S100B neutralizzante, BL356.

12. Associazione per l?uso secondo la rivendicazione 10, in cui detto secondo principio attivo ? pentamidina, somministrata in una o pi? dosi, con un dosaggio giornaliero compreso tra 0.5 e 3 mg/Kg/die.

13. Associazione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 12, in cui detta somministrazione di acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, e detta somministrazione di detto secondo principio attivo sono effettuate in maniera contemporanea.

14. Associazione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 13, in cui detta associazione ? somministrata durante la fase acuta e/o durante la fase di remissione della malattia.

15. Composizione farmaceutica comprendente acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, e uno o pi? eccipienti per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di sclerosi multipla (SM).

16. Composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione 15, in cui detta sclerosi multipla ? sclerosi multipla recidivante-remittente (RR-SM).

17. Composizione farmaceutica per l?uso secondo le rivendicazioni 15 o 16, in cui detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, ? presente in concentrazione compresa tra 30% e 95% in peso rispetto al peso totale di detta composizione.

18. Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 17, comprendente un secondo principio attivo, ad esempio a scelta tra uno o pi? anticorpi anti-S100B neutralizzanti, quale BL356, e/o uno o pi? farmaci che modificano la malattia (farmaci per disease-modifying therapies, DMTs), quali Interferon Beta 1a e 1b, dimetifumarato, glatiramer acetato, teriflunomide e alemtuzumab o ocrelizumab, e/o pentamidina.

19. Composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione 18, in cui detto secondo principio attivo, ? presente in concentrazione compresa tra 5% e 70 % in peso rispetto al pesto totale di detta composizione.

20. Composizione farmaceutica per l?uso secondo le rivendicazioni 18 o 19, in cui detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, ? presente in concentrazione compresa tra 30% e 95% in peso di detta composizione e detto secondo principio attivo, ? presente in concentrazione compresa tra 5% e 70 % in peso di detta composizione.

21. Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 18 a 20 in cui detto secondo principio attivo ? l?anticorpo anti-S100B neutralizzante BL356.

22. Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 18 a 20, in cui detto secondo principio attivo ? pentamidina ed ? presente in concentrazione compresa tra 5% e 30% in peso rispetto al peso totale di detta composizione, in particolare Pentamidina isetionato.

23. Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 18 a 20, in cui detto acido arundico, o un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, ? presente in concentrazione compresa tra 30% e 95% in peso di detta composizione, e detto secondo principio attivo ? pentamidina ed ? presente in concentrazione compresa tra 5% e 30% in peso rispetto al peso totale di detta composizione.

24. Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 23, in una forma scelta tra polvere, polvere orosolubile, granulato, capsula rigida o softgel, compressa, sospensione, soluzione, emulsione, sciroppo, spray.

25. Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 24, in cui detta composizione ? somministrata per via orale, via sistemica, via intraperitoneale, via intra-nasale, via endovenosa, via intra-muscolare, via sub-cutanea, o via transdermica.

26. Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 25, in cui detta composizione ? somministrata durante la fase acuta e/o durante la fase di remissione della malattia.

27. Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 26, in cui detta composizione ? somministrata in una o pi? dosi, con un dosaggio giornaliero compreso tra 3 e 9.5 mg/Kg/die di acido arundico, o di un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile.

28. Composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 18 a 27, in cui detta composizione ? somministrata in una o pi? dosi, con un dosaggio giornaliero compreso tra 3 e 9.5 mg/Kg/die di acido arundico, o di un suo sale e/o enantiomero farmaceuticamente accettabile, e tra 0.5 e 3 mg/kg/die di detto secondo principio attivo, ad esempio l?anticorpo anti-S100B neutralizzante BL356, e/o pentamidina.

29. Kit farmaceutico comprendente una o pi? aliquote di acido arundico o di un suo sale farmaceuticamente accettabile, una o pi? aliquote di un secondo principio attivo, ad esempio l?anticorpo anti-S100B neutralizzante, BL356 o ad esempio la pentamidina, o una o pi? aliquote di una loro miscela per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di sclerosi multipla (SM).

30. Kit farmaceutico secondo la rivendicazione 29, in cui dette aliquote sono preconfezionate in una o pi? forme di dosaggio giornaliero.