IT202000014011A1 - Processo di preparazione di un estratto di epilobium spp. ad alto contenuto di enoteina b - Google Patents
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
?PROCESSO DI PREPARAZIONE DI UN ESTRATTO DI EPILOBIUM SPP. AD ALTO CONTENUTO DI ENOTEINA B?
La presente invenzione ha per oggetto un processo di preparazione di un estratto di Epilobium spp. ad alto contenuto di enoteina B.
Stato della tecnica
Epilobium angustifolium L. ? una pianta erbacea perenne appartenente alla famiglia delle Onagraceae. Presenta fusti semplici, glabri, a portamento eretto e radici rizomatose; i fiori sono raccolti in vistosi racemi di forma piramidale di colore tra il rosa ed il porpora. I frutti sono delle capsule allungate, che a maturit? si aprono per rilasciare i semi provvisti di pappo per la dispersione anemofila. L?Epilobio ? nativo delle regioni dell?Europa e dell?Asia Occidentale, dove cresce spontaneamente nei suoli sassosi (Gruenwald J. et al. PDR for herbal medicines, 4th Ed. Thomson, 2007).
Il fitocomplesso dell?epilobio contiene tre classi principali di polifenoli: acidi fenolici, flavonoidi ed ellagitannini, questi ultimi principalmente rappresentati da ellagitannini macrociclici, come l?enoteina B. Al fitocomplesso, alle singole classi di polifenoli ed in misura maggiore all?enoteina B, vengono associate le numerose propriet? salutistiche di questa pianta tra cui attivit? anti-infiammatoria e anti-ossidante a livello urologico (es. prostatiti, ipertrofia prostatica benigna, infiammazioni del tratto urinario), gastrico ed intestinale (Granica S. et al., Phytochemistry, pharmacology and traditional uses of different Epilobium species (Onagraceae): A review. Journal of Ethnopharmacology, 156, 316?346, 2014); Schepetkin IA et al. Therapeutic potential of polyphenols from Epilobium angustifolium (Fireweed). Phytother Res. 30(8):1287-97, 2016). L?enoteina B pu? essere ottenuta da diverse specie botaniche e non necessariamente dall?E. angustifolium L. (US 2018/0256619).
L?E. angustifolium L. non ? presente tra le monografie della Eur. Ph.; pertanto le preparazioni galeniche di questo estratto fanno riferimento agli infusi (preparazioni tradizionali della medicina popolare) e a quanto presente in letteratura e sul mercato. La maggior parte degli estratti sono acquosi (Lesuisse D. et al., Determination of oenothein B as the active 5-alpha-reductase-inhibiting principle of the folk medicine Epilobium parviflorum; Nat Prod. May;59(5):490-2, 1996; Assessment report on Epilobium angustifolium L. and/or Epilobium parviflorum Schreb., herba, EMA, 10 March 2015; FR 2712594; DE 3605250), ma l?utilizzo di altri solventi come metanolo, acetato di etile, butanolo ed etanolo ? altres? documentato (Deng L. et al. Evaluation of the therapeutic effect against benign prostatic hyperplasia and the active constituents from Epilobium angustifolium L. Journal of Etnopharmacology. 232:1-10, 2019; Granica S. et al., Phytochemistry, pharmacology and traditional uses of different Epilobium species (Onagraceae): A review. Journal of Ethnopharmacology, 156, 316?346, 2014). La concentrazione di enoteina B ottenuta in estratti acquosi di Epilobio spp. ? sempre inferiore al 10%.
US 6528490 descrive l?attivit? anti-infiammatoria di estratti di Epilobium angustifolium con un contenuto di enoteina B non superiore al 9.6% in peso. La domanda US 2018/0256619 riporta che un intervallo preferito di quantit? efficaci di enoteina varia dal 2.5 al 14% ma i dati sperimentali in essa riportati si riferiscono ancora all?estratto con contenuto in enoteina B del 9.6% descritto US 6528490. FR 2712594 e il corrispondente brevetto US 552594 descrivono un processo di estrazione di enoteina B da Epilobium parviflorum con miscele di acqua e solventi solubili in acqua, in particolare acetone e purificazione per HPLC in fase inversa.
WO2017108907 descrive l?associazione tra varie specie di Epilobio e altre piante.
L?importanza dell?enoteina B ? dimostrata dai riferimenti sopra citati. Tuttavia:
1) secondo quanto previsto dai Reg. Europei, l?enoteina B purificata al momento non ? addizionabile in integratori in Italia (Circolare Ministeriale del 16/06/2016) e in Europa (i.e. Novel food catalogue), mentre ? invece consentito l?utilizzo di estratti di E. angustifolium, titolati e standardizzati in questo principio attivo. L?efficienza di estrazione di questa molecola nei processi noti ? associata ad uno step di purificazione.
2) le molecole presenti negli estratti acquosi non sono rappresentative del fitocomplesso, in quanto in queste condizioni la resa estrattiva dei flavonoidi ? bassa.
La maggior parte di estratti presenti sul mercato manca di standardizzazione, ed i procedimenti estrattivi e di purificazione noti non forniscono una soluzione ottimale alla necessit? di disporre di estratti contenenti tutti i pi? importanti ingredienti bioattivi dell?Epilobio, congiuntamente ad un alto contenuto di enoteina B. Si delinea pertanto la necessit? di un estratto che valorizzi il ricco fitocomplesso ed un elevato contenuto di enoteina B per esplicare la funzione biologica e fisiologica in integratori alimentari e preparazioni nutraceutiche.
Descrizione dell?invenzione
Si ? ora trovato un processo di estrazione di specie di epilobio che consente di ottenere estratti con contenuto di enoteina B superiore al 15% sul peso dell?estratto secco, ad esempio dal 15 al 35%, senza la necessit? di stadi di purificazione.
Il processo dell?invenzione pu? essere applicato con successo a diverse specie di epilobio, in particolare a Epilobium angustifolium L. ed Epilobium parviflorum Schreb. ? particolarmente preferito l?impiego di materiale vegetale (droga) in fase di fioritura (?herba cum floribus?).
L?estratto secco ottenibile dal processo dell?invenzione con titolo in enoteina B ? 15,0% presenta un fitocomplesso molto ricco, costituito da diverse classi di principi attivi; in particolare sono presenti tra il 10 e il 20% di acidi fenolici (il cui 50% ? rappresentato da acidi idrossicinnamici), tra il 20 e il 30% di flavonoidi (rappresentati prevalentemente da flavonoli) e tra il 40 e il 60% di tannini idrolizzabili, classe di composti a cui appartiene l?enoteina B.
Il processo dell?invenzione per la preparazione di un estratto di Epilobium spp. con contenuto di enoteina B superiore al 15% in peso ? caratterizzato da:
- Estrazione della droga per almeno due volte con una miscela di acqua:etanolo in rapporti compresi tra 3:1 e 1:1;
- Filtrazione dei percolati, evaporazione del solvente ed essicazione dell?estratto concentrato cos? ottenuto senza ulteriori stadi di purificazione. L?estrazione della droga ? ripetuta preferibilmente per 3-6 volte, pi? preferibilmente 4-5 volte, utilizzando ogni volta solvente fresco.
Le estrazioni con la miscela di acqua:etanolo sono preferibilmente effettuate ad una temperatura compresa tra 25 e 50?C per tempi compresi tra 1 e 3 ore, a pH compreso fra 2 e 6, preferibilmente a pH tra 2 e 3.5.
Il rapporto in peso tra droga e miscela acqua:etanolo ? preferibilmente compreso tra 1:3 e 1:10.
L?essicazione del concentrato delle estrazioni con acqua:etanolo pu? essere effettuata con una qualunque tecnica nota, ad esempio per spray-drying.
Secondo un aspetto preferito dell?invenzione, il processo comprende inoltre una fase di estrazione con acqua a pH acido della droga sottoposta alle estrazioni con acqua ed etanolo, filtrazione del percolato, concentrazione della fase acquosa, essicazione ed aggiunta dell?estratto acquoso essiccato agli estratti essiccati ottenuti dal processo precedente.
Pertanto, secondo tale aspetto preferito, il processo dell?invenzione comprende:
- A. Estrazione della droga per almeno due volte con una miscela di acqua:etanolo in rapporti compresi tra 3:1 e 1:1 a pH acido; filtrazione dei percolati, evaporazione del solvente ed essicazione dell?estratto concentrato cos? ottenuto senza ulteriori stadi di purificazione;
- B. Estrazione con acqua a pH acido della droga sottoposta alle estrazioni con acqua ed etanolo, filtrazione del percolato, concentrazione della fase acquosa, essicazione ed aggiunta dell?estratto acquoso essiccato agli estratti essiccati ottenuti dallo stadio A sopradescritto.
Le due frazioni ottenute dagli stadi A e B, con profilo metabolico diverso, vengono analizzate e miscelate opportunamente, fino ad ottenere un prodotto avente la concentrazione desiderata di enoteina B.
L?essicazione del concentrato dell?estrazione con acqua a pH acido pu? essere effettuata con una qualunque tecnica nota, ad esempio per evaporazione a pressione ridotta.
Il processo dell?invenzione non prevede una purificazione e quindi ? pi? semplice ed economico dei metodi noti.
L?analisi del titolo in enoteina B viene effettuata mediante HPLC-UV (metodo comparabile a quello descritto da Ka?konien? V, et al. (2015). ?Evaluation of phytochemical composition of fresh and dried raw material of introduced Chamerion angustifolium L. using chromatographic, spectrophotometric and chemometric techniques?, Phytochemistry; 115:184-93). La tabella 1 riporta i risultati del profilo chimico del fitocomplesso mediante RP-HPLC-PDA-ESI-MSn. Il cromatogramma ? riportato in Figura 1.
Tabella 1.
L?invenzione ? illustrata in maggior dettaglio negli esempi che seguono. Esempio 1
Processo A: estrazione con miscela idroalcolica
In un reattore da 2 litri si introducono 50 g di droga e si aggiungono 250 g di soluzione idroalcolica in rapporto acqua:etanolo=3:1 a pH acido; si scalda la miscela estrattiva a 50?C, mantenendo in estrazione per percolazione per 2,5 ore. Al termine di questa prima fase, l?estratto liquido ottenuto viene allontanato e la droga estratta per altre 3 volte nelle medesime condizioni con il medesimo solvente. Al termine dell?estrazione, tutti i percolati vengono filtrati, riuniti ed il solvente viene evaporato a pressione ridotta a temperatura di 50?C fino ad ottenere un estratto concentrato. L?essiccazione finale viene effettuata mediante essiccatore a spruzzo (spray dryer). La quantit? di estratto secco ottenuto ? di 12,6 g.
Processo B: estrazione con acqua
Al termine della fase 1, alla droga si aggiungono 250 g di acqua a pH acido; si scalda la miscela estrattiva a 50?C, mantenendo in estrazione per percolazione per 1 ora. Al termine dell?estrazione, il percolato viene allontano dalla droga, filtrato ed il solvente viene evaporato a pressione ridotta a temperatura di 50?C fino ad ottenere un estratto concentrato. L?acqua residua viene eliminata per essiccazione a pressione ridotta a 50?C fino ad ottenere un estratto secco. La quantit? di estratto secco ottenuto ? di 2 g.
Esempio 2
Processo A: estrazione con miscela idroalcolica
In un reattore da 2 litri si introducono 50 g di droga e si aggiungono 250 g di soluzione idroalcolica in rapporto acqua:etanolo=1:1 a pH acido; si scalda la miscela estrattiva a 50?C, mantenendo in estrazione per percolazione per 1 ora. Al termine di questa prima fase, l?estratto liquido ottenuto viene allontanato e la droga estratta per altre 3 volte nelle medesime condizioni con il medesimo solvente. Al termine dell?estrazione, tutti i percolati vengono filtrati, riuniti ed il solvente viene evaporato a pressione ridotta a temperatura di 50?C fino ad ottenere un estratto concentrato. L?essiccazione finale viene effettuata mediante essiccatore a spruzzo (spray dryer). La quantit? di estratto secco ottenuto ? di 13,4 g.
Processo B: estrazione con acqua
Al termine della fase 1, alla droga si aggiungono 250 g di acqua a pH acido; si scalda la miscela estrattiva a 50?C, mantenendo in estrazione per percolazione per 1 ora. Al termine dell?estrazione, il percolato viene allontano dalla droga, filtrato ed il solvente viene evaporato a pressione ridotta a temperatura di 50?C fino ad ottenere un estratto concentrato. L?acqua residua viene eliminata per essiccazione a pressione ridotta a 50?C fino ad ottenere un estratto secco. La quantit? di estratto secco ottenuto ? di 2 g.
Claims (11)
1. Un processo per la preparazione di un estratto di Epilobium spp. con contenuto di enoteina B superiore al 15% in peso caratterizzato da:
- Estrazione della droga per almeno due volte con una miscela di acqua:etanolo in rapporti compresi tra 3:1 e 1:1;
- Filtrazione dei percolati, evaporazione del solvente ed essicazione dell?estratto concentrato cos? ottenuto senza ulteriori stadi di purificazione.
2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui Epilobium spp. ? scelto fra Epilobium angustifolium L. e Epilobium parviflorum Schreb.
3. Processo secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui l?estrazione della droga ? ripetuta per 3-6 volte.
4. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui le estrazioni con la miscela di acqua:etanolo sono effettuate ad una temperatura compresa tra 25 e 50?C per tempi compresi tra 1 e 3 ore.
5. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui le estrazioni con la miscela di acqua:etanolo sono effettuate a pH compreso fra 2 e 6.
6. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui la droga ? ?herba cum floribus?.
7. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 6 in cui il rapporto in peso tra droga e miscela acqua:etanolo ? compreso tra 1:3 e 1:10.
8. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 7 comprendente inoltre una fase di estrazione con acqua a pH acido della droga precedentemente sottoposta alle estrazioni con acqua ed etanolo, filtrazione del percolato, concentrazione della fase acquosa, essicazione ed aggiunta dell?estratto acquoso essiccato agli estratti essiccati ottenuti dal processo delle rivendicazioni 1-7.
9. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 8 in cui l?essicazione del concentrato delle estrazioni con acqua:etanolo ? effettuata per spray-drying.
10. Processo secondo una o pi? delle rivendicazioni da 1 a 9 in cui l?essicazione del concentrato dall?estrazione con acqua a pH acido ? effettuata per evaporazione a pressione ridotta.
11. Estratto ottenuto dal processo delle rivendicazioni 1-10.
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