IT202000007807A1 - Metodo per il calcolo veloce del decadimento del tempo di vita di un segnale di fluorescenza e sistema che implementa il metodo. - Google Patents

Metodo per il calcolo veloce del decadimento del tempo di vita di un segnale di fluorescenza e sistema che implementa il metodo. Download PDF

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IT202000007807A1
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IT
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fluorescence signal
phasor
phase
calculate
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Application number
IT102020000007807A
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Alessandro Rossetta
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Flim Labs S R L
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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Description

Metodo per il calcolo veloce del decadimento del tempo di vita di un segnale di fluorescenza e sistema che implementa il metodo.
La presente invenzione riguarda un metodo per il calcolo veloce del decadimento del tempo di vita di un segnale di fluorescenza, in particolare per l?analisi dell?istogramma del tempo di vita della fluorescenza.
La presente invenzione riguarda anche un sistema che implementa il metodo.
Pi? dettagliatamente l?invenzione concerne un metodo del tipo detto, studiato e realizzato in particolare per il calcolo dei fasori dell?istogramma del tempo di decadimento di un segnale di fluorescenza, ma che pu? essere usato per l?analisi di qualsiasi segnale, di cui sia necessario il calcolo dei fasori.
Nel seguito la descrizione sar? rivolta all?analisi del tempo di decadimento di un segnale di fluorescenza, ma ? ben evidente come la stessa non debba essere considerata limitata a questo impiego specifico.
Com?? ben noto, la tecnica di microscopia dell?immagine del tempo di vita della fluorescenza o FLIM - Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy ? una tecnica per la produzione di un'immagine basata sulle differenze nei tempi di decadimento esponenziale della fluorescenza di un campione fluorescente. La durata del segnale di fluorescenza emesso da un fluoroforo, piuttosto che la sua intensit?, viene utilizzata per creare l'immagine in FLIM.
In particolare, un fluoroforo che viene eccitato da un fotone cadr? nello stato fondamentale con una certa probabilit? basata sui tassi di decadimento attraverso una serie di percorsi di decadimento diversi.
L?uso della trasformazione in fasori degli istogrammi del tempo di decadimento della fluorescenza semplifica l?interpretazione dei risultati ottenuti mediante la tecnica FLIM.
Attualmente, ? noto il calcolo dei fasori a partire dall?istogramma discreto del tempo di decadimento del segnale di fluorescenza, svolto mediante l?uso di sommatorie.
Appare evidente come questa procedura sia onerosa in termini di costo computazionale per un calcolatore ed in termini di occupazione della memoria del sistema che lo implementa.
Infatti, l?impiego di sommatorie richiede necessariamente l?uso e l?implementazione, a livello computazionale, di cicli cosiddetti ?for?.
Nello specifico, se si intende analizzare tutto il contributo armonico di un segnale di decadimento della fluorescenza, ? necessario implementare dei cicli ?for? annidati, che comportano un aggravio dell?onere computazionale.
Alla luce di quanto sopra, ?, pertanto, scopo della presente invenzione quello di impiegare un metodo per il calcolo dei fasori dell?istogramma di decadimento della fluorescenza che sia meno complesso a livello computazionale, in quanto riduce i tempi di calcolo dei fasori.
E? ulteriore scopo della presente invenzione quello di fornire un metodo che consenta di ridurre i tempi di visualizzazione ed analisi dei tempi di emivita o decadimento della fluorescenza.
Infine, scopo della presente invenzione ? quello di fornire un sistema ottimizzato per implementare il metodo.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un metodo per il calcolo veloce del decadimento del tempo di vita di un segnale di fluorescenza, comprendente le seguenti fasi:
a. fornire un campione fluorescente da analizzare e, a partire dai fotoni emessi a seguito dell?eccitazione da parte di una sorgente laser pulsata esterna, costruire un istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza associato a detto campione fluorescente;
b. calcolare un primo g ed un secondo s fasore; c. calcolare la fase e la modulazione di detto segnale di fluorescenza, a partire da detti primo g e secondo s fasore, in forma vettoriale;
d. calcolare il tempo di vita di detto segnale di fluorescenza a partire da dette fase e modulazione, calcolate in detta fase c.; e
e. visualizzare i valori di detti primo g e secondo s fasore.
Ulteriormente secondo l?invenzione, dette fasi b., c. e d. vengono eseguite per tutti i contributi armonici del segnale di fluorescenza, superiori al primo contributo.
Ancora secondo l?invenzione, detta fase a. comprende le seguenti sottofasi:
a.1. dati un primo e un secondo
contatore, memorizzati in un registro di memoria di un sistema di acquisizione esterno, rilevata la presenza di un fotone in arrivo in un determinato canale del sistema di acquisizione esterno, estrapolare da detto registro di memoria per ciascun fotone arrivato, i valori di detti primo e secondo
contatore e associare, tramite metodologia nota, i valori di questi contatori al fotone in arrivo e inviare detti parametri alla memoria del sistema oggetto della presente invenzione;
a.2. calcolare l?effettivo bin temporale di arrivo del fotone tramite la formula
dove m ? un numero predefinito di bin temporali nei quali si intende dividere l?istogramma e ? una operazione matematica che restituisce il resto della divisione intera rispetto a m;
a.3. calcolare il numero totale di fotoni rilevati;
a.4. usare detti primo e secondo
contatore e il bin temporale di ogni fotone rilevato mediante le precedenti sottofasi a.1., a.2., a.3., per popolare un istogramma avente sull?asse delle ascisse m bin e sull?asse delle ordinate il numero di fotoni registrati per ogni valore di bin restituendo inoltre, come output, l?istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza e il numero di fotoni rilevati per l?intero istogramma
Sempre secondo l?invenzione, detta fase b. comprende le seguenti sottofasi:
b.1. applicare la trasformata di Fourier discreta all?istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza per ogni frequenza armonica h mediante la seguente formula:
in cui ? l?istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza, ottenuto in detta fase a.4.;
b.2. calcolare detto secondo fasore s, per ogni frequenza armonica h, come parte immaginaria della trasformata di Fourier discreta e normalizzata per il numero totale di fotoni rilevati, secondo la seguente formula
in cui ? l?operatore matematico della trasformata di Fourier veloce e discreta, ? l?operatore matematico che estrapola la parte immaginaria di un numero complesso, ? il numero totale di fotoni rilevati per un determinato canale all?interno di un intervallo temporale;
b.3 calcolare detto primo fasore g, per ogni frequenza armonica h, come parte reale della trasformata di Fourier discreta e normalizzata per il numero totale di fotoni rilevati, secondo la seguente formula:
in cui ? l?operatore matematico della trasformata di Fourier veloce e discreta, ? l?operatore matematico che estrapola la parte reale di un numero complesso, ? il numero totale di fotoni rilevati per un determinato canale all?interno di un intervallo temporale;
b.4. restituire come output detto primo fasore s in forma vettoriale e detto secondo fasore g in forma vettoriale aventi dimensioni 1 X h.
Preferibilmente secondo l?invenzione, detta fase c. comprende le seguenti sottofasi:
c.1. calcolare la fase in radianti per ogni contributo armonico h, secondo la seguente formula:
c.2. calcolare la fase in gradi per ogni contributo armonico h, secondo la seguente formula:
c.3. calcolare la modulazione per ogni contributo armonico h, secondo la seguente formula:
c.4. calcolare la modulazione per ogni contributo armonico h, normalizzata per il valore della modulazione per h = 0, secondo la seguente formula:
Ulteriormente secondo l?invenzione, detta fase d. comprende le seguenti sottofasi:
d.1. calcolare, per ogni contributo armonico, il tempo di vita del segnale di fluorescenza nella fase, a partire dalla fase espressa in radianti, calcolata in detta fase c.1., secondo la seguente formula:
dove ? il valore della frequenza fondamentale della sorgente di emissione del campione fluorescente;
d.2. calcolare, per ogni contributo armonico, il tempo di vita del segnale di fluorescenza nella modulazione, a partire dalla modulazione normalizzata per il contributo armonico per h = 0, calcolata in detta fase c.4., secondo la seguente formula:
d.3. restituire come output i valori dei tempi di decadimento calcolati per fase e modulazione per ogni contributo armonico dell?istogramma del segnale di fluorescenza.
Ancora secondo l?invenzione, detta fase e. comprende le seguenti sottofasi:
e.1. rappresentare, su un numero h di piani cartesiani aventi sull?asse delle ascisse detto primo fasore g e sull?asse delle ordinate detto secondo fasore s, il semicerchio descritto dalla seguente equazione:
e.2 rappresentare sull?h-esimo piano cartesiano le coppie di valori h-esimi di detto primo fasore g e di detto secondo fasore s;
e.3. fornire in uscita i valori di s, g, m, ?, t?, tm in funzione di h per ogni punto F rappresentato sul piano cartesiano e individuato da una coppia di coordinate (g, s).
E? ulteriore oggetto delle presente invenzione un programma per elaboratore, comprendente mezzi a codice tali che, quando operano su un computer, eseguono le fasi del metodo sopra descritto.
E? ulteriore oggetto della presente invenzione un sistema configurato per eseguire il metodo per il calcolo veloce del decadimento del tempo di vita di un segnale di fluorescenza, accoppiabile ad un sistema di acquisizione esterno, del tipo comprendente una sorgente laser pulsata configurata per eccitare un campione fluorescente in modo che possa emettere un flusso di fotoni, detto sistema comprendente una pluralit? di linee di dati, collegabile a detto sistema di acquisizione esterno, una unit? di memoria in grado di memorizzare i dati in ingresso su detta pluralit? di linee di dati; una unit? logica di controllo, operativamente collegata a detta unit? di memoria, in grado di eseguire le fasi a. ? d. di detto metodo, a partire dai dati memorizzati in detta unit? di memoria; e una unit? di visualizzazione, operativamente collegata a detta unit? logica di controllo, in grado di ricevere i dati calcolati da detta unit? logica di controllo e di visualizzare detti primo g e secondo s fasore, calcolati in detta fase e. di detto metodo.
Ancora secondo l?invenzione, in detta unit? logica di controllo ? installato il programma per elaboratore.
La presente invenzione verr? ora descritta a titolo illustrativo ma non limitativo, secondo le sue preferite forme di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui: la figura 1 mostra un diagramma a blocchi di una prima fase del metodo per il calcolo veloce del tempo di vita della fluorescenza, oggetto della presente invenzione;
la figura 2 mostra un diagramma a blocchi di una seconda fase del metodo oggetto della presente invenzione;
la figura 3 mostra un diagramma a blocchi di una terza fase del metodo oggetto della presente invenzione;
la figura 4 mostra un diagramma a blocchi di una quarta fase del metodo oggetto della presente invenzione;
la figura 5 mostra una vista schematica del sistema che implementa il metodo per il calcolo veloce del decadimento del tempo di vita di un segnale di fluorescenza, oggetto della presente invenzione;
la figura 6 mostra una vista schematica di una ricostruzione dell?istogramma del decadimento del tempo di vita di un segnale di fluorescenza, ottenuto mediante la fase a.4. del metodo oggetto della presente invenzione; e
la figura 7 mostra una visualizzazione associata all?istogramma ricostruito nella figura 6.
Nelle varie figure le parti simili verranno indicate con gli stessi riferimenti numerici.
Facendo riferimento alle figure 1-4, il metodo per il calcolo veloce del tempo di vita della fluorescenza, oggetto della presente invenzione, comprende una serie di fasi consecutive.
In particolare, sostanzialmente le fasi sono le seguenti:
a. a partire dai fotoni associati ad un campione fluorescente da analizzare, emessi a seguito dell?eccitazione da parte di una sorgente laser pulsata esterna, costruire l?istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza di detto campione fluorescente;
a.1. dati un primo e un secondo
contatore, memorizzati in un registro di memoria di un sistema di acquisizione esterno, rilevata la presenza di un fotone in arrivo in un determinato canale del sistema di acquisizione esterno, estrapolare da detto registro di memoria per ciascun fotone arrivato, i valori di detti primo e secondo
contatore e associare, tramite metodologia nota, i valori di questi contatori al fotone in arrivo e inviare detti parametri alla memoria del sistema oggetto della presente invenzione;
a.2. calcolare l?effettivo bin temporale di arrivo del fotone tramite la formula 1) seguente, come verr? descritto in dettaglio in seguito;
a.3. calcolare il numero totale di fotoni rilevati;
a.4. usare detti primo e secondo
contatore e il bin temporale di ogni fotone rilevato mediante le precedenti sottofasi a.1., a.2., a.3., per popolare un istogramma avente sull?asse delle ascisse m bin e sull?asse delle ordinate il numero di fotoni registrati per ogni valore di bin restituendo inoltre, come output, l?istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza e il numero di fotoni rilevati per l?intero istogramma.
Segue una fase b.:
b. calcolo di un primo fasore g ed un secondo fasore s per tutti i contributi armonici del segnale di fluorescenza, in particolare per tutti i contributi armonici superiori al primo contributo;
b.1. applicare la trasformata di Fourier discreta all?istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza per ogni frequenza armonica h;
b.2 calcolare il primo fasore g, per ogni frequenza armonica h, come parte reale della trasformata di Fourier discreta e normalizzata per il numero totale di fotoni rilevati all?interno dell?istogramma oggetto del calcolo;
b.3. calcolare il secondo fasore s, per ogni frequenza armonica h, come parte immaginaria della trasformata di Fourier discreta e normalizzata per il numero totale di fotoni rilevati all?interno dell?istogramma oggetto del calcolo;
b.4. restituire come output i vettori s e g aventi dimensioni 1 X h.
Segue una fase c.:
c. calcolare la fase e la modulazione del segnale di fluorescenza per ogni contributo armonico, a partire dal primo s e secondo g fasore in forma vettoriale;
c.1. calcolare la fase in radianti per ogni contributo armonico h;
c.2. calcolare la fase in gradi per ogni contributo armonico h;
c.3. calcolare la modulazione per ogni contributo armonico h;
c.4. calcolare la modulazione per ogni contributo armonico h, normalizzata per il valore della modulazione per h = 0.
Segue una fase d.:
d. calcolare i tempi di decadimento, ossia il tempo di vita del segnale di fluorescenza a partire dalla fase e dalla modulazione, per ogni contributo armonico;
d.1. calcolare, per ogni contributo armonico, il tempo di vita del segnale di fluorescenza nella fase, a partire dalla fase espressa in radianti;
d.2. calcolare, per ogni contributo armonico, il tempo di vita del segnale di fluorescenza nella modulazione, a partire dalla modulazione normalizzata per il contributo armonico per h = 0;
d.3. restituire come output i valori dei tempi di decadimento calcolati per fase e modulazione per ogni contributo armonico dell?istogramma del segnale di fluorescenza.
Segue una fase e.:
e. visualizzare i valori di detti primo e secondo fasore;
e.1. rappresentare, su un numero h di piani cartesiani, corrispondenti al numero delle armoniche, aventi come asse delle ascisse g e come asse delle ordinate s, il semicerchio descritto dalla equazione 10) seguente;
e.2 rappresentare sull?h-esimo piano cartesiano le coppie di valori h-esimi di g e s;
e.3. fornire in uscita i valori di s, g, m (da intendersi come modulazione e non numero di bin), ?, t?, tm in funzione di h per ogni punto F rappresentato sul piano cartesiano e individuato da una coppia di coordinate (g, s).
Si descrivono ora pi? in particolare le fasi e le sottofasi del metodo sopra descritto.
In particolare, nella fase a., impiegando un sistema noto di acquisizione della fluorescenza in tempo reale, provvisto di una pluralit? di canali di acquisizione dei dati esterno, operante e funzionante nel dominio della frequenza, a partire dai dati grezzi provenienti da detto sistema di acquisizione, si realizza l?istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza, per ogni canale dati disponibile.
In particolare, per dati grezzi si intendono i fotoni associati ad un campione fluorescente emessi a seguito dell?eccitazione da parte di una sorgente laser pulsata esterna del campione fluorescente stesso da analizzare.
Come ? gi? in uso in algoritmi noti, ad ogni fotone rilevato, viene assegnato un valore di tipo booleano vero o falso, associato a due contatori, uno che indica la fase, indicato con ed uno che indica la finestra temporale, indicato con
nella quale ? stato rilevato il fotone in arrivo.
I contatori e vengono rilevati e memorizzati in una memoria del sistema S.
In particolare, contraddistingue il valore di un contatore binario memorizzato nella memoria del sistema S che incrementa ad una velocit? pari al clock del laser che eccita il campione fluorescente.
? un numero intero che viene predefinito e scelto in un intervallo da 0 ad m-1, solitamente come potenza del 2, dove m ? un numero naturale intero che rappresenta il numero di bin temporali, ossia il sottoinsieme di punti sull?asse delle ascisse dell?istogramma, in cui si vuole suddividere l?istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza.
La scelta del valore del dipende da due fattori: dal numero di bin dell?istogramma del decadimento e dal valore della frequenza di crosscorrelazione generata mediante il principio noto della eterodina digitale nel sistema di acquisizione esterno: pi? m ? grande, maggiore sar? il periodo della crosscorrelazione e minore la frequenza di crosscorrelazione, maggiore sar? anche il numero di punti sull?asse delle ascisse con cui viene rappresentato l?istogramma del decadimento della fluorescenza.
? il valore di un contatore binario nel sistema di acquisizione che incrementa ad una velocit? pari al clock del laser moltiplicato per il fattore di
cross-correlazione e per il numero di armoniche o finestre che si vogliono campionare per il segnale di fluorescenza.
? un numero intero che va da 0 a ? ? 1 dove n ? un numero naturale intero ed ? il numero di armoniche che si vogliono campionare per poi ricostruire il segnale di fluorescenza e il numero di armoniche che si vogliono impiegare per poi calcolare il decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza.
La ricostruzione pu? avvenire in maniera assoluta, ossia ? possibile ricostruire l?istogramma del decadimento per uno specifico canale di fluorescenza, indipendentemente dalla presenza di un sistema di scansione che esplori in x, y e z il campione fluorescente, come viene descritto in dettaglio in seguito.
Oppure, se ? presente un sistema di scansione che esplori in maniera bidimensionale e tridimensionale il campione fluorescente, la ricostruzione pu? essere condotta per ogni pixel, se si hanno a disposizione segnali di sincronizzazione provenienti da un sistema di scansione.
In particolare, quando la ricostruzione del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza ? effettuata pixel per pixel o voxel per voxel, se si esplora il campione fluorescente mediante un sistema in grado di scansionare in maniera 2D o 3D il campione, tale sistema di scansione fornisce in uscita dei segnali di sincronizzazione quali ad esempio: clock di pixel, clock di linea, clock di fotogramma, in modo da sapere quali pixel o voxel vengono mano a mano scansionati.
Tali segnali di sincronizzazione vengono campionati nel tempo, in modo tale che poi ? possibile associare/mappare/raggruppare i fotoni all?interno di un pixel/voxel e conseguentemente anche ricostruire per quel pixel/voxel l?istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza, come da tecnica nota.
Se viene rilevato un fotone sul k-esimo canale dati del sistema di acquisizione esterno, viene impostato su vero il campo di tipo booleano.
Mediante la formula 1) seguente si calcola la fase totale o bin effettivo di arrivo del fotone di fluorescenza
dove i valori che compaiono nella formula sono stati descritti in precedenza, mentre ? una operazione matematica che restituisce il resto della divisione intera rispetto a m.
Dopo aver calcolato il valore questo viene immagazzinato sotto forma di istogramma, nel quale in ordinata viene riportata la numerosit? degli eventi, ossia il numero di fotoni rilevati per ogni bin temporale, ed in ascissa viene riportata la fase totale di arrivo dei fotoni.
L?espressione immagazzinata sotto forma di istogramma significa che ogni valore del bin di arrivo finale di ogni fotone viene utilizzato per popolare un istogramma avente in ascissa il numero di bin bin, da 0 a e in ordinata il numero di fotoni che sono stati rilevati dal sistema di acquisizione per ogni bin.
Nella fase b. avviene il calcolo di detti primo e secondo fasore.
A tal fine, occorre specificare che il segnale di fluorescenza viene generato a partire dalla frequenza fondamentale di ripetizione degli impulsi del laser, pertanto la Frequenza Fondamentale ? uguale alla Frequenza del Laser.
Nei fenomeni periodici, le frequenze armoniche sono le frequenze contenute all?interno del segnale, il cui valore ? multiplo intero della frequenza base ossia della Frequenza Fondamentale. Le Frequenze Armoniche sono anche dette Contenuto Armonico.
Viene definito h un numero naturale intero che contraddistingue la frequenza armonica, multipla della Frequenza Fondamentale, racchiusa all?interno del segnale di fluorescenza.
All?interno del segnale di fluorescenza ? possibile analizzare o estrarre i contributi del segnale della fluorescenza dovuti alle frequenze armoniche.
In particolare, a partire dall?istogramma realizzato nella precedente fase a. e usando il numero totale di eventi in esso contenuti, si calcolano, avvalendosi della trasformata discreta di Fourier, le componenti fasoriali ?(?) ed ?(?) in funzione del contributo armonico h.
In particolare, g ed s sono computate come parte reale e parte immaginaria della trasformata di Fourier, per ogni componente armonica disponibile nel segnale di ingresso, secondo le seguenti formule:
dove: tematico della trasformata di Fourier veloce e discreta che restituisce un vettore di numeri complessi per ogni frequenza armonica del segnale di partenza, che in questo caso ? l?istogramma di decadimento della fluorescenza; ? l?operatore matematico che estrapola la parte immaginaria di un numero complesso ? l?operatore matematico che estrapola la parte reale di un numero complesso
? il numero totale di fotoni rilevati per un determinato canale all?interno dell?intervallo temporale in cui il calcolo di e viene condotto.
Nella fase c. si calcolano la fase e la modulazione del segnale di fluorescenza.
In particolare, impiegando detti primo g e secondo s fasore ottenuti nella precedente fase b., impiegando una nota tecnica di analisi dei segnali in fluorescenza nel dominio della frequenza, si calcolano i seguenti valori mediante le seguenti formule:
dove: ? una variazione a due argomenti della funzione arcotangente; ? la fase calcolata in radianti; ? la fase calcolata in gradi, ? il termine o fattore di proporzionalit? tra gradi e radianti; ? la modulazione espressa come un vettore di h elementi; ? la normalizzazione di
Nella fase d. si calcolano i tempi di decadimento della fluorescenza per fase e modulazione, ossia i valori del tempo di vita del segnale di fluorescenza.
In particolare,
dove: ? il tempo di vita del segnale di fluorescenza calcolato a partire dalla fase del segnale; ? il tempo di vita del segnale di fluorescenza calcolato a partire dalla modulazione del segnale; ? il valore della frequenza fondamentale ossia della frequenza del laser espresso in Hz.
Nella fase e. vengono visualizzati i valori di detti primo g e secondo s fasore, ottenuti nella fase c., su un grafico nel quale in ascissa ? riportato il primo fasore g ed in ordinata il secondo fasore s, in modo che tali valori siano visualizzati in riferimento ad un semicerchio secondo la seguente equazione:
Il sistema S che implementa il metodo ? preliminarmente accoppiabile ad un sistema esterno noto di acquisizione SA.
Detto sistema esterno noto di acquisizione SA comprende una sorgente laser pulsata L che eccita un campione fluorescente C da analizzare, secondo una frequenza di clock.
Il flusso F di fotoni emessi dal campione fluorescente viene rilevato dai sensori R che inviano l?informazione mediante una pluralit? di canali di dati di fluorescenza Ch1, Ch2, ?, Chh, ?, Chk ad un sistema di acquisizione A basato su tecnica nota nel dominio della frequenza.
Detto sistema di acquisizione A comprende una unit? di memoria M o registro di memoria nella quale vengono memorizzate le informazioni su detta pluralit? di canali di dati di fluorescenza Ch1, Ch2, ?, Chh, ?, Chk e i valori di detti primo e secondo
contatore.
Detto sistema S che implementa il metodo oggetto della presente invenzione comprende essenzialmente una pluralit? di linee di dati 1, una unit? di memoria 2, una unit? logica di controllo 3 ed una unit? di visualizzazione 4.
Su detta pluralit? di linee di dati 1 confluiscono le informazioni ed i dati provenienti da detto sistema esterno noto di acquisizione SA, come i dati di fluorescenza Ch1, Ch2, ?, Chh, ?, Chk, i valori di detti primo e secondo contatore, il valore della frequenza fondamenta i valori e le coordinate spaziali x, y, e z secondo le quali viene scansionato il campione fluorescente dal sistema esterno SA.
In detta unit? di memoria 2 vengono memorizzati i dati in ingresso mediante detta pluralit? di linee di dati 1.
In detta unit? logica di controllo 3 avviene il calcolo e l?esecuzione di dette fasi a. ? d. del metodo sopra descritto.
Detta unit? di visualizzazione 4 riceve i dati calcolati da detta unit? logica di controllo 3 e consente la visualizzazione dei valori di detti primo g e secondo s fasore, calcolati secondo la fase e. del metodo sopra descritto.
Come ? evidente dalla descrizione sopra riportata, il metodo oggetto della presente invenzione consente una riduzione dei tempi di calcolo dei fasori, in funzione del contributo armonico, di circa 2?10<3>.
La presente invenzione ? stata descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo le sue forme preferite di realizzazione, ma ? da intendersi che variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti del ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni allegate.

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per il calcolo veloce del decadimento del tempo di vita di un segnale di fluorescenza, comprendente le seguenti fasi: a. fornire un campione fluorescente da analizzare e, a partire dai fotoni emessi a seguito dell?eccitazione da parte di una sorgente laser pulsata esterna, costruire un istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza associato a detto campione fluorescente; b. calcolare un primo g ed un secondo s fasore; c. calcolare la fase e la modulazione di detto segnale di fluorescenza, a partire da detti primo g e secondo s fasore, in forma vettoriale; d. calcolare il tempo di vita di detto segnale di fluorescenza a partire da dette fase e modulazione, calcolate in detta fase c.; e e. visualizzare i valori di detti primo g e secondo s fasore.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che dette fasi b., c. e d. vengono eseguite per tutti i contributi armonici del segnale di fluorescenza, superiori al primo contributo.
  3. 3. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta fase a. comprende le seguenti sottofasi: a.1. dati un primo e un secondo
    contatore, memorizzati in un registro di memoria di un sistema di acquisizione esterno, rilevata la presenza di un fotone in arrivo in un determinato canale del sistema di acquisizione esterno, estrapolare da detto registro di memoria per ciascun fotone arrivato, i valori di detti primo e secondo
    contatore e associare, tramite metodologia nota, i valori di questi contatori al fotone in arrivo e inviare detti parametri alla memoria del sistema oggetto della presente invenzione; a.2. calcolare l?effettivo bin temporale di arrivo del fotone tramite la formula
    dove m ? un numero predefinito di bin temporali nei quali si intende dividere l?istogramma e ? una operazione matematica che restituisce il resto della divisione intera rispetto a m; a.3. calcolare il numero totale di fotoni rilevati; a.4. usare detti primo e secondo
    contatore e il bin temporale di ogni fotone rilevato mediante le precedenti sottofasi a.1., a.2., a.3., per popolare un istogramma avente sull?asse delle ascisse m bin e sull?asse delle ordinate il numero di fotoni registrati per ogni valore di bin restituendo inoltre, come output, l?istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza e il numero di fotoni rilevati per l?intero istogramma
  4. 4. Metodo secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta fase b. comprende le seguenti sottofasi: b.1. applicare la trasformata di Fourier discreta all?istogramma del decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza per ogni frequenza armonica h mediante la seguente formula: in cui decadimento del tempo di vita del segnale di fluorescenza, ottenuto in detta fase a.4.; b.2. calcolare detto secondo fasore s, per ogni frequenza armonica h, come parte immaginaria della trasformata di Fourier discreta e normalizzata per il numero totale di fotoni rilevati, secondo la seguente formula
    in cui ? l?operatore matematico della trasformata di Fourier veloce e discreta, ? l?operatore matematico che estrapola la parte immaginaria di un numero complesso, ? il numero totale di fotoni rilevati per un determinato canale all?interno di un intervallo temporale; b.3. calcolare detto primo fasore g, per ogni frequenza armonica h, come parte reale della trasformata di Fourier discreta e normalizzata per il numero totale di fotoni rilevati, secondo la seguente formula:
    in cui ? l?operatore matematico della trasformata di Fourier veloce e discreta, ? l?operatore matematico che estrapola la parte reale di un numero complesso, ? il numero totale di fotoni rilevati per un determinato canale all?interno di un intervallo temporale; b.4. restituire come output detto primo fasore s in forma vettoriale e detto secondo fasore g in forma vettoriale aventi dimensioni 1 X h.
  5. 5. Metodo secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta fase c. comprende le seguenti sottofasi: c.1. calcolare la fase in radianti per ogni contributo armonico h, secondo la seguente formula:
    c.2. calcolare la fase in gradi per ogni contributo armonico h, secondo la seguente formula:
    c.3. calcolare la modulazione per ogni contributo armonico h, secondo la seguente formula:
    c.4. calcolare la modulazione per ogni contributo armonico h, normalizzata per il valore della modulazione per h = 0, secondo la seguente formula:
  6. 6. Metodo secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta fase d. comprende le seguenti sottofasi: d.1. calcolare, per ogni contributo armonico, il tempo di vita del segnale di fluorescenza nella fase, a partire dalla fase espressa in radianti, calcolata in detta fase c.1., secondo la seguente formula:
    dove ? il valore della frequenza fondamentale della sorgente di emissione del campione fluorescente; d.2. calcolare, per ogni contributo armonico, il tempo di vita del segnale di fluorescenza nella modulazione, a partire dalla modulazione normalizzata per il contributo armonico per h = 0, calcolata in detta fase c.4., secondo la seguente formula:
    d.3. restituire come output i valori dei tempi di decadimento calcolati per fase e modulazione per ogni contributo armonico dell?istogramma del segnale di fluorescenza.
  7. 7. Metodo secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta fase e. comprende le seguenti sottofasi: e.1. rappresentare, su un numero h di piani cartesiani aventi sull?asse delle ascisse detto primo fasore g e sull?asse delle ordinate detto secondo fasore s, il semicerchio descritto dalla seguente equazione:
    e.2. rappresentare sull?h-esimo piano cartesiano le coppie di valori h-esimi di detto primo fasore g e di detto secondo fasore s; e.3. fornire in uscita i valori di s, g, m, ?, t?, tm in funzione di h per ogni punto F rappresentato sul piano cartesiano e individuato da una coppia di coordinate (g, s).
  8. 8. Programma per elaboratore, comprendente mezzi a codice tali che, quando operano su un computer, eseguono le fasi del metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 ? 7.
  9. 9. Sistema (S) configurato per eseguire il metodo per il calcolo veloce del decadimento del tempo di vita di un segnale di fluorescenza, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, accoppiabile ad un sistema di acquisizione esterno (SA), del tipo comprendente una sorgente laser pulsata (L) configurata per eccitare un campione fluorescente (C) in modo che possa emettere un flusso di fotoni (F), detto sistema (S) comprendente: una pluralit? di linee di dati (1), collegabile a detto sistema di acquisizione esterno (SA); una unit? di memoria (2) in grado di memorizzare i dati in ingresso su detta pluralit? di linee di dati (1); una unit? logica di controllo (3), operativamente collegata a detta unit? di memoria (2), in grado di eseguire le fasi a. ? d. di detto metodo, a partire dai dati memorizzati in detta unit? di memoria (2); e una unit? di visualizzazione (4), operativamente collegata a detta unit? logica di controllo (2), in grado di ricevere i dati calcolati da detta unit? logica di controllo (3) e di visualizzare detti primo g e secondo s fasore, calcolati in detta fase e. di detto metodo.
  10. 10. Sistema (S) secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che in detta unit? logica di controllo (3) ? installato il programma della rivendicazione 8.
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