IT202000007558A1 - Procedimento per l’ottenimento di materiale spugnoso per la rigenerazione ossea - Google Patents
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Description
Descrizione dell?invenzione avente per titolo:
?PROCEDIMENTO PER L?OTTENIMENTO DI MATERIALE SPUGNOSO PER LA RIGENERAZIONE OSSEA?
Descrizione
Campo della tecnica
La presente descrizione si riferisce al settore medico. Pi? in dettaglio la presente descrizione si riferisce ad un peculiare procedimento per l?ottenimento di un altrettanto peculiare materiale in forma di spugna da utilizzarsi nel campo della rigenerazione ossea.
Arte nota
Nell?ambito della rigenerazione ossea, l?innesto osseo ? largamente impiegato ed ? rappresentato da 500.000 casi all?anno nei soli Stati Uniti e circa 2.200.000 nel mondo. I campi medici maggiormente interessati per l?innesto sono ortopedia, neurochirurgia e odontoiatria. Le cause delle atrofie o dei difetti ossei dei mascellari sono rappresentate per un 90% di edentulia e malattie parodontali. Il gold standard ? rappresentato dall?innesto osseo autologo che tuttavia non ? scevro di svantaggi tra cui: lunga durata e complessit? della procedura chirurgica, svantaggi cosmetici e dolore residuo nella sede di prelievo. La complicanza maggiore ? data da un possibile fallimento della procedura in caso di mancata sopravvivenza delle cellule osteogeniche durante il trapianto; dei criteri di esclusione vanno inoltre riferiti a pazienti di et? pediatrica o avanzata o nei casi di patologie maligne. Altre complicanze hanno un tasso di comparsa compreso tra 8,5% e 20% includendo: formazione di un ematoma, perdita di sangue, danni a componenti del sistema nervoso, infezioni, danni arteriosi e dolore cronico nel sito donatore.
Come opzione secondaria all?innesto osseo autologo, l?innesto osseo omologo ?, ampiamente utilizzato negli Stati Uniti (rappresenta il 30% degli innesti ossei ed ? disponibile in varie composizioni commerciali come tasselli, nastri, perni (dowels, chips, strips) di osso corticale o spugnoso. Tale terapia consiste nell?impiego di osso prelevato da un donatore compatibile con il paziente.
Ovviamente questo tipo di osso ha delle limitazioni rispetto all?osso autologo, nonch? la possibilit? di trasmissione di patologie se non adeguatamente trattato prima dell?impianto nel sito ricevente. La manipolazione del materiale donato prevede la sterilizzazione (con ossido di etilene o raggi gamma) e il congelamento o congelamento/essiccamento. Lo scopo principale ? di prevenire le complicanze infettive ma va a modificare le caratteristiche che il materiale inizialmente presenta, motivo per cui l?osso congelato o congelato/essiccato perde la capacit? di osteoinduzione; l?osso fresco non trattato non pu? difatti essere utilizzato in quanto andrebbe a creare una risposta immunitaria o porterebbe alla trasmissione di patologie infettive. L?osso congelato/essiccato cos? ottenuto ha la capacit? minore di indurre una risposta immune ma ? meno osteoinduttivo e ha peggiori caratteristiche meccaniche dell?osso trattato col solo congelamento. Come vantaggi si notano la mancanza di complicanze connesse al prelievo dal sito donatore del paziente, invece che come svantaggi si osserva una osteoconduzione e una limitata osteoinduzione e una mancata capacit? osteosintetica.
Come trattamento migliorativo del trapianto autologo si ha il gel osteopriastrinico che consiste nell?aggiunta di PRP con frammenti di osso autologo che andr? a riempire le zone in cui non ? presente l?osso. Anche se l?uso del PRP facilita la manipolazione e il posizionamento degli innesti ossei ed accelera la guarigione dei tessuti molli e duri, la bibliografia non dimostra un vantaggio statisticamente significativo nella rigenerazione ossea o un beneficio clinico evidente tale da supportare l?utilizzo. Altri inconvenienti che presenta questa terapia sono il suo alto costo e il tempo impiegato nell?applicazione della stessa (Nikolidakis and Jansen, 2008).
In alternativa ? presente la rigenerazione ossea guidata (Guided Bone Regeneration, GBR) ed ? una delle tecniche chirurgiche sviluppate negli ultimi due decenni per rigenerare l?osso e permettere, cos?, l?inserimento di impianti in siti compromessi. ? una procedura chirurgica che consiste nel posizionare fisicamente una membrana impermeabile alle cellule tra il tessuto connettivo e il difetto osseo alveolare. Questa barriera impedisce la migrazione dei tessuti molli nel difetto e crea uno spazio protetto nel quale il coagulo e l?innesto sono stabilizzati. La migrazione di cellule epiteliali e connettivali risulta impedita, mentre la lenta proliferazione delle cellule osteogeniche pu? avvenire con conseguente formazione di nuovo osso. La complicanza pi? comune di questo trattamento riguarda l?esposizione precoce della membrana nel cavo orale, con le sue sequele. Sono state per? riportate anche altre complicanze, tra cui la formazione di un ascesso e le lesioni vascolo-nervose che cercano di trovare una soluzione impiegando membrane in politetrafluoroetilene espanso (e-PTFE) grazie alla loro comprovata efficacia e alla facilit? d?impiego.
Tuttavia nuovi approcci sperimentali usano materiali naturali come gelatina (Hamai et al., 2020) per creare scaffold liofilizzati con l?aggiunta di composti inorganici come idrossiapatite o fosfato octacalcico, impiegati nella rigenerazione ossea. Alcuni di loro impiegano il plasma ricco in piastrine aggiunto allo scaffold per migliorarne le performance (Rodriguez et al., 2013). Frank et al. offrono una completa visione delle scoperte in questo campo (Frank-Kamenetskaya et al., 2020).
Descrizione dell?invenzione
La presente descrizione si riferisce ad un peculiare kit comprendente almeno un altrettanto peculiare materiale spugnoso impiegato nell?ambito biomedico e segnatamente per la rigenerazione ossea. Specificatamente, date le complicazioni delle terapie attualmente in uso per la rigenerazione ossea, la presente invenzione prevede che il detto kit trovi impiego, oltre che in applicazioni in chirurgia odontoiatrica e ortopedia umana e animale, anche nel campo della chirurgia estetica e maxillofacciale. Detto materiale spugnoso, si ottiene partendo da un idrogel ottenuto da derivati secondari della filiera alimentare. Oggetto della presente descrizione ? pertanto anche un procedimento per l?ottenimento del detto materiale spugnoso o spugna.
In particolare il processo utilizzato e rivendicato dalla Richiedente prevede:
- il recupero di pericardi di origine bovina, che vengono decellularizzati, liofilizzati, ridotti in una polvere, che viene trattata enzimaticamente per portarne le proteine in forma di sospensione acquosa;
- La sospensione acquosa, portata a pH e temperatura fisiologici, diventa un idrogel, con viscosit? superiore a quella della sospensione di partenza;
- Per migliorarne le caratteristiche, come le propriet? meccaniche o la compatibilit? con strutture di tipo osseo, durante il processo di ottenimento dell?idrogel sono aggiunte altre molecole: l?idrossiapatite (HA) e\o l?Esametilene diisocianato (HMDI), quest?ultimo agisce da cross-linker, per rinforzare la struttura dell?idrogel e migliorarne le propriet? meccaniche. Per poter valutare l?efficacia di queste molecole, gli idrogel sono stati realizzati a diverse concentrazioni sia di HA (0%, 60%) che di HMDI (0%, 0,01%, 0,05%, 0,1%);
- A loro volta, gli idrogel vengono successivamente liofilizzati, in modo da ottenere delle strutture asciutte e spugnose.
la struttura degli idrogel liofilizzati cos? ottenuti non ? immediatamente distrutta dalla successiva immersione in un liquido, per permetterne l?inserimento nelle strutture ossee danneggiate.
Le dimensioni del materiale spugnoso o spugna cos? ottenuto sono variabili ma la struttura che conforma le fibre della stessa ? diversa per ogni conformazione. In questo modo, le dimensioni della prima conformazione sono di 1,5-2,0 cm di diametro e 2-3 cm di altezza; della seconda conformazione di 2,0-3,0 cm di diametro e 1,0-1,5 cm di altezza e della terza di 3,0-4,0 cm di diametro e 0,5-1 cm di altezza.
Tabella 1.
I materiali spugnosi del kit secondo la presente invenzione presentano vantaggiosamente la capacit? di essere imbibite con diversi fluidi autologi del paziente che aumenteranno la biocompatibilit? e la capacit? di rigenerazione del tessuto come plasma ricco in piastrine, sangue intero o frazioni ematiche. Come alternativa possono essere impiegati altri fluidi come gel che funzionalizzeranno il materiale per diverse applicazioni come per esempio l?immersione in fibrinogeno conferendo una capacit? emostatica.
Il vantaggio di poter modificare la porosit? e rigidit? dello stesso materiale impiegando reticolanti in diverse quantit? offre una versatilit? nella catena di produzione dello stesso. Anche la mancanza di reticolante nel materiale pu? offrire caratteristiche interessanti per alcune applicazioni dato che rende il materiale altamente idrofilo sciogliendosi completamente nell?ambiente acquoso circondante.
La natura proteica della struttura offre la possibilit? di aggiungere biomolecole al materiale, conferendole cos? diverse propriet? legate alla molecola. Descrizione delle figure
L?invenzione verr? qui di seguito dettagliatamente descritta in riferimento alle figure annesse in cui:
FIGURA 1 mostra due immagini del materiale spugnoso che corrispondono alla prima conformazione A (Fig.1 (a)) e alla terza conformazione B (Fig. 1 (b)) Specificatamente la Figura 1 mostra: Idrogel liofilizzati a forma cilindrica in prima conformazione A e tonda piatta in seconda conformazione B.
FIGURA 2 mostra un?analisi morfologica mediante microscopia stereoscopica, i cui risultati sono apprezzabili nelle Figure 2(a) (prima conformazione A) e 2(b) (terza conformazione B). Dalle dette figure si pu? notare il modificarsi della morfologia in relazione alla quantit? di HA e HDMI presenti cos? come le differenze fra la prima conformazione A e terza conformazione B. Specificatamente la Figura 2(a) mostra le immagini dei campioni al microscopio stereoscopico con varie concentrazioni di HDMI e HA e la Figura 2(b) le immagini dei campioni al microscopio stereoscopico con varie concentrazioni di HDMI e HA.
FIGURA 3 mostra la vitalit? delle cellule MG63 coltivate sulle spugne per 1, 7 e 14 giorni. Specificatamente la detta figura mostra i risultati ottenuti per valutare la biocompatibilit? dei vari materiali prodotti in un ambiente di tipo osseo. In particolare a tal fine sono state coltivate sulle spugne cellule di linea di tipo osteoblastico, chiamate MG-63, per tempi fino a 1, 7 e 14 giorni, e ne ? stata valutata la vitalit? alla fine di ognuno dei time point mediante saggio MTS (Figura 3(a) e 3(b)).
FIGURA 4 mostra i test di emocompatibilit? sui materiali.
Descrizione dettagliata dell?invenzione
L?invenzione secondo la presente descrizione si riferisce ad un processo per l?ottenimento di un materiale spugnoso per la rigenerazione ossea, che prevede: - il recupero di pericardi di origine bovina che vengono decellularizzati, liofilizzati, ridotti in una polvere, dove la polvere viene trattata enzimaticamente per portarne le proteine in forma di sospensione acquosa; - che la sospensione acquosa, portata a pH e temperatura fisiologici, diventi un idrogel, con viscosit? superiore a quella della sospensione di partenza;
- che a loro volta, gli idrogel vengano successivamente liofilizzati, in modo da ottenere delle strutture asciutte e spugnose.
Il detto procedimento pu? ulteriormente prevedere, una volta ottenuto l?idrogel con viscosit? superiore a quella di partenza, che durante il processo di ottenimento dell?idrogel siano aggiunte altre molecole scelte tra: l?idrossiapatite (HA) e\o l?Esametilene diisocianato (HMDI), dove quest?ultimo agisce da cross-linker per rinforzare la struttura dell?idrogel e migliorarne le propriet? meccaniche. A titolo esemplificativo e non limitativo HA ? aggiunto in quantit? del 60% in peso, oppure HA ? aggiunto in quantit? del 60% in peso e HMDI del 0,01% in peso, oppure HA ? aggiunto in quantit? del 60% in peso e HMDI in quantit? del 0,05% in peso, oppure HA ? aggiunto in quantit? del 60% in peso e HMDI in quantit? del 0,1% in peso, oppure ? aggiunto solo HMDI in quantit? del 0,01% in peso, oppure ? aggiunto solo HMDI in quantit? del 0,05% in peso oppure ? aggiunto solo HMDI in quantit? del 0,1% in peso.
Secondo la presente descrizione viene altres? descritto un materiale spugnoso ottenibile con il suddetto procedimento, comprendente pericardio di origine bovina decellularizzata, liofilizzata, HA, e\o l?Esametilene diisocianato (HMDI)e avente diametro compreso tra 1,5 cm e 4,0 cm e altezza compresa tra 0,5 cm e 3,0 cm. A titolo esemplificativo e non limitativo il detto materiale presenta: diametro compreso tra 1,5 cm e 2,0 cm e altezza compresa tra 2 cm e 3 cm; oppure diametro compreso tra 3,0 cm e 4,0 cm e altezza compresa tra 0,5 cm e 1,0 cm. La presente descrizione si riferisce altres? ad un Kit comprendente almeno un materiale spugnoso come sopra definito e al Materiale spugnoso come definito in uno qualsiasi dei suddetti esempi, nonch? ad un kit comprendente almeno uno dei suddetti materiali spugnosi per uso come medicamento per la rigenerazione ossea. Per poter avere una stima della densit? e della porosit? del materiale, ? stata fatta un?analisi morfologica mediante microscopia stereoscopica, i cui risultati sono apprezzabili nelle Figure 2(a) (prima conformazione A; e 2(b) terza conformazione B).
Dalle figure si pu? notare il modificarsi della morfologia in relazione alla quantit? di HA e HDMI presenti cos? come le differenze fra la prima e la terza conformazione.
Riguardo alla bagnabilit? dei materiali, ? stato osservato che successivamente all?immersione nel liquido, i materiali mantengono le sue strutture ottenute dopo liofilizzazione e non si sciolgono nel liquido.
Per valutare la biocompatibilit? dei vari materiali prodotti in un ambiente di tipo osseo, sono state coltivate cellule di linea di tipo osteoblastico, chiamate MG-63, per tempi fino a 1, 7 e 14 giorni, e ne ? stata valutata la vitalit? alla fine di ognuno dei time point mediante saggio MTS (Figura 3).
Dai risultati si pu? evincere come la vitalit? sia pi? alta per le cellule coltivate su materiali che presentano una bassa o nulla concentrazione di HDMI, mentre per le cellule coltivate su materiali con concentrazione uguale o superiore allo 0,05% di HDMI la vitalit? diminuisce.
Per quanto riguarda l?effetto sulla vitalit? cellulare della concentrazione di HA, in assenza di HDMI non si riscontrano differenze significative al variare della quantit? di HA.
Sia le analisi morfologiche che quelle relative alla biocompatibilit? mostrano come i materiali a basse concentrazioni di HDMI e allo 0% e 60% di HA risultino possedere una vitalit? cellulare adeguata all?adesione e alla ripopolazione cellulare, coadiuvate dal lato morfologico da una presenza di porosit? adatta all?infiltrazione di cellule e del loro successivo nutrimento.
Dal punto di vista ematico non interferisce nella nomale coagulazione del sangue.
Per valutare il comportamento dei materiali a contatto con il sangue, sono stati effettuati dei test di coagulazione mediante l?utilizzo del tromboelastografo, che calcola diversi parametri relativi al tempo di inizio della coagulazione, ovvero il tempo di reazione, il tempo di completamento della coagulazione, la velocit? di formazione del coagulo e la forza di formazione del coagulo. I dati ricavati vengono confrontati con i range fisiologici, riportati di seguito:
R: 3.8-9.8 min,
K: 0.7-3.4 min,
angle: 47.8-77.7 degrees,
MA: 49.7-72.7 mm.
Come si pu? vedere dai dati riportati nella Figura 4, per tutti i materiali i parametri considerati rientrano negli intervalli fisiologici, pur riscontrando alcune differenze per alcuni materiali. Infatti, si pu? notare che quest?ultimi in cui sono presenti HA e/o HDMI possiedono valori leggermente differenti rispetto alla spugna non arricchita.
In sintesi, si pu? affermare che la modifica dei materiali non altera significativamente la normale coagulazione del sangue.
Claims (15)
- Rivendicazioni 1. Procedimento per l?ottenimento di un materiale spugnoso per la rigenerazione ossea, detto procedimento prevedendo. - il recupero di pericardi di origine bovina che vengono decellularizzati, liofilizzati, ridotti in una polvere, detta polvere venendo trattata enzimaticamente per portarne le proteine in forma di sospensione acquosa; - che la sospensione acquosa, portata a pH e temperatura fisiologici, diventi un idrogel, con viscosit? superiore a quella della sospensione di partenza; - che a loro volta, gli idrogel vengano successivamente liofilizzati, in modo da ottenere delle strutture asciutte e spugnose.
- 2. Procedimento per l?ottenimento di un materiale spugnoso per la rigenerazione ossea secondo la precedente rivendicazione in cui ? ulteriormente previsto, una volta ottenuto l?idrogel con viscosit? superiore a quella di partenza che, durante il processo di ottenimento dell?idrogel siano aggiunte altre molecole scelte tra: l?idrossiapatite (HA) e\o l?Esametilene diisocianato (HMDI), quest?ultimo agendo da cross-linker per rinforzare la struttura dell?idrogel e migliorarne le propriet? meccaniche.
- 3. Procedimento secondo la precedente rivendicazione in cui HA ? aggiunto in quantit? del 60% in peso.
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 2 in cui HA ? aggiunto in quantit? del 60% in peso e HMDI del 0,01% in peso.
- 5. Procedimento secondo la rivendicazione 2 in cui HA ? aggiunto in quantit? del 60% in peso e HMDI in quantit? del 0,05% in peso.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 2 in cui HA ? aggiunto in quantit? del 60% in peso e HMDI in quantit? del 0,1% in peso.
- 7. Procedimento secondo la rivendicazione 2 in cui HMDI ? presente in quantit? del 0,01% in peso.
- 8. Procedimento secondo la rivendicazione 2 in cui HMDI ? presente in quantit? del 0,05% in peso.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 2 in cui HMDI ? presente in quantit? del 0,1% in peso.
- 10. Materiale spugnoso comprendente pericardio di origine bovina decellularizzata, liofilizzata, HA, e\o l?Esametilene diisocianato (HMDI)e avente diametro compreso tra 1,5 cm e 4,0 cm e altezza compresa tra 0,5 cm e 3,0 cm.
- 11. Materiale spugnoso secondo la precedente rivendicazione avente diametro compreso tra 1,5 cm e 2,0 cm e altezza compresa tra 2 cm e 3 cm.
- 12. Materiale spugnoso secondo la rivendicazione 10 avente diametro compreso tra 3,0 cm e 4,0 cm e altezza compresa tra 0,5 cm e 1,0 cm.
- 13. Kit comprendente almeno un materiale spugnoso come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 12.
- 14. Materiale spugnoso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 12 per uso come medicamento per la rigenerazione ossea.
- 15. Kit secondo la rivendicazione 13 per uso come medicamento per la rigenerazione ossea.
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