IT202000004663A1 - Nuovo uso di probiotici - Google Patents
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
DESCRIZIONE
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo
?Nuovo uso di probiotici?
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto una composizione comprendente batteri per l?uso nel trattamento o nella prevenzione di una patologia causata o associata ad uno squilibrio del microbiota dell?apparato riproduttivo femminile.
STATO DELL?ARTE
Nelle donne in et? fertile l?endometrio, ovvero il tessuto che riveste lo strato pi? interno della cavit? uterina, subisce rimodellamenti sotto lo stimolo delle fluttuazioni ormonali tipiche del ciclo mestruale e va incontro a profonde modificazioni che riguardano sia il numero di cellule che lo compongono sia la struttura e la loro funzione.
Di particolare interesse per le implicazioni collegate alle metodiche di fecondazione in vitro, ? lo studio dell?endometrio durante la finestra di impianto (5-7 giorni dopo l?ovulazione) dove la recettivit? endometriale dovrebbe essere massima al fine di favorire l?impianto dell?embrione allo stadio di blastocisti. Questa particolare fase ? controllata dalle cellule stromali endometriali (ESC) che vanno incontro a un fenomeno conosciuto come decidualizzazione, ovvero un processo di differenziamento cellulare nel quale le ESC da fibroblasti proliferanti si trasformano in cellule specializzate con attivit? secretoria. Le ESC decidualizzate (dESC) infatti producono sia fattori in grado di aumentare direttamente la recettivit? endometriale attraverso l?induzione di geni codificanti per fattori di crescita e proteine d?adesione, sia indirettamente regolando l?attivit? di diversi tipi cellulari del sistema immunitario e vascolare.
Risulta pertanto evidente che la comprensione e la capacit? di influenzare e modulare i meccanismi molecolari che regolano il fenomeno della decidualizzazione sia fondamentale per aumentare le possibilit? del concepimento.
In questa direzione, negli ultimi anni si sono resi disponibili diversi protocolli per ottenere modelli in vitro di ESC decidualizzate la maggioranza dei quali si basa sull?evidenza che la decidualizzazione avviene in un microambiente ricco di androgeni; pertanto, incubando colture primarie di ESC con progesterone (o suoi analoghi) e AMP ciclico (cAMP) per tempi sufficienti (1-8 giorni dipende dai dosaggi) ? possibile indurre la fenotipizzazione diretta delle ESC in cellule decidualizzate.
Un recente studio ha dimostrato come diversi ceppi batterici sia patogeni che normalmente considerati commensali (Lactobacillus spp.) presenti nel microambiente uterino dei bovini siano in grado di influenzare le cellule endometriali epiteliali in vitro. In questo studio, i batteri sono riconosciuti dalle cellule endometriali epiteliali attraverso i recettori tipo Toll (Toll-like receptors) presenti sulla membrana di queste cellule in grado di riconoscere i pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) come i lipopolisaccaridi (LPS), che costituiscono la membrana esterna dei batteri Gram negativi, e gli acidi lipoteicoici che costituiscono la parete batterica dei Gram positivi.
Poich? l?impianto si verifica nella cavit? endometriale e non in vagina, la medicina della riproduzione concentra il suo interesse sul microbiota endometriale e sul suo impatto nell?ottenimento ed il mantenimento della gravidanza.
Le infezioni uterine sono un noto fattore di rischio per l?infertilit?, poich? l?ambiente patogeno che provoca infiammazione e attivazione del sistema immunitario a livello endometriale, pu? arrivare a compromettere un eventuale impianto dell'embrione e quindi l'inizio di una gravidanza.
In tutti gli studi effettuati su infezioni endometriali ed infertilit? ? stato osservato che quando dal fluido endometriale venivano isolati patogeni come lo Streptococco, lo Stafilococco, l?Enterococco, E. coli, Klebsiella pnuemoniae e batteri Gram negativi, l?outcome riproduttivo delle pazienti era significativamente pi? basso rispetto a quello di pazienti i cui campioni avevano un esame colturale negativo.
Il ruolo del microbiota endometriale sull?interfaccia materno-fetale per l?ottenimento di una gravidanza ?, dunque, di forte interesse. Una migliore comprensione di quello che ? l?ambiente endometriale sano e come poterlo ottenere potrebbe diventare un elemento importante non soltanto a livello diagnostico (in quanto permetterebbe di individuare le cause dell?infertilit? femminile nei casi finora classificati come idiopatici), ma anche e soprattutto per iniziare a sviluppare interventi terapeutici personalizzati basati sull?utilizzo di prodotti in grado di ristabilire l?equilibrio dell?ambiente uterino e favorire il concepimento.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda una composizione comprendente batteri, preferibilmente batteri probiotici o paraprobiotici, per uso nel trattamento o nella prevenzione di una condizione patologica dell?apparato riproduttivo femminile causata o associata ad uno squilibrio del microbiota dell?apparato riproduttivo femminile e/o ad una insufficiente decidualizzazione uterina.
Un secondo aspetto della presente invenzione si riferisce all?uso di una composizione comprendente batteri, preferibilmente batteri probiotici o paraprobiotici, per aumentare i livelli o la proliferazione di batteri commensali, e/o per ridurre i livelli o ridurre la proliferazione di microorganismi patobionti. Preferibilmente, detto uso prevede almeno una fase di somministrazione ad un individuo che ne abbia necessit? di una quantit? efficace di una composizione comprendente batteri, preferibilmente probiotici o paraprobiotici.
Un terzo aspetto della presente invenzione si riferisce ad un kit comprendente una composizione a base di batteri, preferibilmente batteri probiotici o paraprobiotici, ed un dispositivo per una somministrazione endouterina o intratubarica della composizione.
Un quarto aspetto della presente invenzione riguarda un metodo per il trattamento o la prevenzione di una condizione patologica dell?apparato riproduttivo femminile causata o associata ad uno squilibrio del microbiota dell?apparato riproduttivo femminile e/o ad una insufficiente decidualizzazione. Detto metodo comprende almeno una fase di somministrazione ad un individuo che ne abbia necessit? di una quantit? efficace di una composizione comprendente batteri, preferibilmente probiotici o paraprobiotici, come sopra dettagliatamente descritta.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
La Figura 1 mostra l?analisi in un gel denaturante (SDS-PAGE) di estratti proteici provenienti da colture di L. acidophilus e L. plantarum vive o tindalizzate;
La Figura 2 mostra l?espressione del marker di decidualizzazione prolattina (PRL) in colture di ESC trattate con L. acidophilus vivo o tindalizzato;
La Figura 3 mostra l?espressione del marker di decidualizzazione insulinlike growth factor binding protein 1 (IGFBP-1) in colture di ESC trattate con L. acidophilus vivo o tindalizzato;
La Figura 4 mostra l?espressione del marker di leukemia inhbiting factor (LIF) in colture di ESC trattate con L. acidophilus vivo o tindalizzato;
La Figura 5 mostra la quantificazione tramite metodica ELISA di PRL secreta nel mezzo di coltura di cellule ESC trattate con L. acidophilus vivo o tindalizzato;
La Figura 6 mostra la quantificazione tramite metodica ELISA di IGFBP-1 secreto nel mezzo di coltura di cellule ESC trattate con L. acidophilus vivo o tindalizzato;
La Figura 7 mostra la quantificazione tramite metodica ELISA di LIF secreto nel mezzo di coltura di cellule ESC trattate con L. acidophilus vivo o tindalizzato;
La Figura 8 si riferisce all?analisi tramite immunoblot delle proteine secrete nel mezzo di colture di ESC: 1) ESC controllo; 2) ESC+ L. acidophilus vivi; 3) ESC progesterone cAMP; 4) ESC proteine stratte da L. acidophilus tindalizzato;
La Figura 9 mostra i risultati della colorazione immunoistochimica della conta di 1000 cellule a vetrino a campo ed espressi come percentuale della conta media delle cellule positive all?anticorpo anti-PRL: 1) ESC controllo; 2) ESC+ L. acidophilus vivi; 3) ESC progesterone cAMP; 4) ESC proteine stratte da L. acidophilus tindalizzato;
La Figura 10 mostra la composizione media espressa in percentuale dei microorganismi che compongono la flora batterica endometriale, nel campione di 14 donne esaminate prima dei trattamenti;
La Figura 11 mostra la composizione media espressa in percentuale dei microorganismi che compongono la flora batterica endometriale, nel campione di donne trattate con lattobacilli vivi somministrati per via vaginale;
La Figura 12 mostra la composizione media espressa in percentuale dei microorganismi che compongono la flora batterica endometriale, nel campione di donne trattate con lattobacilli tindalizzati somministrati per via endouterina;
La Figura 13 mostra la composizione espressa in percentuale dei microorganismi che compongono la flora batterica endometriale, nel campione di 14 donne esaminate prima dei trattamenti con lattobacillo tindalizzato endouterino;
La Figura 14 mostra la composizione media espressa in percentuale dei microorganismi che compongono la flora batterica endometriale, nel campione di 14 donne esaminate dopo trattamenti con lattobacilli tindalizzati endouterini;
La Figura 15 mostra: (A) un catetere endouterino e (B) una siringa associabile a detto catetere endouterino;
La Figura 16 mostra: (A) un catetere intratubarico e (B) una siringa associabile a detto catetere intratubarico.
DEFINIZIONI
Nel contesto della presente invenzione, con il termine ?decidualizzazione? si intende il processo di differenziamento cellulare nel quale le cellule stromali endometriali (ESC) da fibroblasti proliferanti si trasformano in cellule specializzate con attivit? secretoria.
Nel contesto della presente invenzione, con il termine ?microbiota? si intende l'insieme di microorganismi sinbiotici che convivono con l'organismo umano senza danneggiarlo.
Nel contesto della presente invenzione, con il termine ?microbioma? si intende la totalit? del patrimonio genetico posseduto dal microbiota, cio? i geni che quest?ultimo ? in grado di esprimere.
Nel contesto della presente invenzione, con il termine ?patobionte? ci si riferisce a batteri presenti nell?apparato riproduttivo femminile e che sono potenzialmente patogeni se presenti in quantit? elevate.
Per ?probiotico? in questo contesto si intende secondo quanto previsto da FAO e OMS: ?Live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host?, ovvero ?organismi vivi e vitali che, quando somministrati in quantit? adeguata, conferiscono benefici alla salute dell?ospite?.
I probiotici sono microrganismi che si dimostrano in grado, una volta ingeriti in adeguate quantit?, di esercitare funzioni benefiche per l?organismo sostanzialmente riprendendo la definizione delle due organizzazioni sopracitate.
Nel contesto della presente invenzione, con il termine ?paraprobiotico? si intende cellule microbiche non vitali (integre o rotte) o estratti cellulari grezzi (cio?, con composizione chimica complessa), che, quando somministrati (per via orale o topica) in quantit? adeguate, conferiscono un vantaggio per la salute del consumatore umano o animale.
Nel contesto della presente invenzione per ?postbiotici? si intendono i bioprodotti metabolici generati dai microorganismi probiotici.
Nel contesto della presente invenzione con il termine ?tindalizzato? si intende un microorganismo inattivato tramite il calore, in particolare tramite un processo di sterilizzazione a fasi discontinue.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda una composizione comprendente batteri, preferibilmente batteri probiotici o paraprobiotici, per uso nel trattamento o nella prevenzione di una condizione patologica dell?apparato riproduttivo femminile causata o associata ad uno squilibrio del microbiota dell?apparato riproduttivo femminile e/o ad una insufficiente decidualizzazione uterina.
Detta condizione patologica ? preferibilmente causata o associata ad uno squilibrio del microbiota endometriale e/o vaginale e/o della mucosa tubarica, preferibilmente endometriale e/o della mucosa tubarica.
In una forma di realizzazione, detta condizione patologica ? causata o associata ad una diminuzione nel microbiota endometriale e/o della mucosa tubarica dei livelli di batteri commensali e/o alla proliferazione di microorganismi patobionti.
Preferibilmente, detta condizione patologica ? causata o associata ad una diminuzione nel microbiota endometriale e/o nel microbiota della mucosa tubarica dei livelli di batteri del genere Lactobacillus e/o del genere Bifidobacterium, preferibilmente dei batteri appartenenti al genere Lactobacillus, pi? preferibilmente della specie Lactobacillus crispatus e/o Lactobacillus gasseri.
In un'altra forma di realizzazione, detta condizione patologica ? causata o associata ad un aumento della proliferazione nel microbiota endometriale e/o nel microbiota della mucosa tubarica di almeno un microorganismo scelto tra: Streptococcus, preferibilmente specie S. pyogenes, S agalactiae, S. faecalis, S. pneumoniae, S. mutans; Staphilococcus, preferibilmente specie Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Enterobatteriacee, preferibilmente E. coli, Klebsiella ed Enterobacter, Gardenerella vaginalis, Candida, Trichomonas, Clamidia Trachomatis e loro combinazioni.
Preferibilmente, detta condizione patologica ? preferibilmente causata o associata ad una insufficiente decidualizzazione, ovvero ad un insufficiente differenziamento dei fibroblasti endometriali in cellule stromali endometriali (ESC). Le ESC decidualizzate producono fattori in grado di aumentare la recettivit? endometriale e regolano l?attivit? di diversi tipi cellulari del sistema immunitario e vascolare.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, detta condizione patologica ? scelta tra: infertilit?, sterilit?, endometrite acuta, endometrite cronica, minaccia di aborto, aborto, abortivit? ricorrente, fallimento di impianto, gravidanza extrauterina, placenta previa, distacco placentare, ritardo della crescita intrauterina, parto pretermine, preclampsia, rottura prematura delle membrane e loro combinazioni.
Preferibilmente, la composizione della presente invenzione comprende batteri, preferibilmente probiotici o paraprobiotici, del genere Lactobacillus e/o del genere Bifidobacterium.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la composizione comprende batteri del genere Lattobacillus, pi? preferibilmente appartenenti ad almeno una delle seguenti specie: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius e Lactobacillus sanfranciscensis.
Secondo un ulteriore aspetto preferito dell?invenzione, i batteri del genere Lactobacillus appartengono ad almeno una specie scelta tra L. acidophilus, L. plantarum e L. paraplantarum.
Pi? preferibilmente, i batteri sono della specie L. acidophilus, preferibilmente il ceppo ATCC 4357 e/o il ceppo ATCC BAA-2832 e/o il ceppo ATCC 11975 e/o il ceppo ATCC 53544.
Pi? preferibilmente, i batteri sono della specie L. plantarum, preferibilmente il ceppo ATCC BAA-793 e/o il ceppo ATCC 700210 e/o il ceppo ATCC 55324.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la composizione comprende batteri del genere Bifidobacterium, pi? preferibilmente appartenenti ad almeno una delle seguenti specie: B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum, B. adolescentis, B. catenulatum, B. angulatum, B. asteroides, B. boum, B. choerinum, B. coryneforme, B. cuniculi, B. denticolens, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum, B. inopinatum, B. lactis, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. subtile, B. thermacidophilum, B. thermophilum e B. tsurumiense; pi? preferibilmente scelta tra: Bacillus clausii, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium Bacillus halodurans, Bacillus thuringiensis, Bacillus insolitus e Bacillus marinus.
I batteri come sopra descritti, preferibilmente del genere Lactobacillus, sono utilizzati vivi, ovvero essi sono utilizzati come probiotici.
Alternativamente i batteri, preferibilmente del genere Lactobacillus, sono morti o inattivati, per esempio tramite tindalizzazione, o in forma di lisato e/o estratto, ovvero sono utilizzati come paraprobiotici.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, i batteri utilizzati sono tindalizzati.
In un?altra forma di realizzazione, i batteri sono utilizzati come estratto, preferibilmente come estratto proteico, pi? preferibilmente come estratto proteico di batteri tindalizzati.
Alternativamente, la composizione comprende ulteriormente i bioprodotti metabolici generati dai microorganismi definiti come postbiotici.
Preferibilmente, detti bioprodotti metabolici sono scelti tra: surnatante, metaboliti, parete cellulare e suoi componenti, esopolisaccaride, proteine, e qualsiasi componente del surnatante.
I batteri, preferibilmente del genere Lactobacillus, sono presenti nella composizione in una quantit? minima sufficiente a consentire la temporanea colonizzazione della vagina e/o dell?endometrio e/o di altri distretti dell?apparato riproduttivo femminile. Preferibilmente detta quantit? varia tra 10<8 >e 10<12 >unit? di microrganismi, pi? preferibilmente 10<9 >e 10<11 >unit? di microrganismi.
I batteri della presente invenzione, preferibilmente del genere Lactobacillus, sono somministrati in una quantit? variabile compresa tra 1*10<8 >e 1*10<12>, preferibilmente tra 2*10<8 >e 5*10<9>, pi? preferibilmente tra 5*10<8 >e 3*10<9>, per ciascuna somministrazione.
Secondo un aspetto preferito, l?assunzione di batteri secondo la presente invenzione ? effettuata almeno 1-2 volte alla settimana, preferibilmente almeno 3 volte la settimana.
La composizione comprende ulteriormente eccipienti e/o ulteriori sostanze e/o carrier farmaceuticamente accettati.
La somministrazione pu? avvenire mediante qualsiasi via. Preferibilmente la somministrazione della composizione ? per via topica, pi? preferibilmente per via vaginale o endouterina o intratubarica.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la composizione ? somministrata per via endouterina. Preferibilmente, la composizione ? somministrata per via endouterina tramite iniezione mediante un catetere endouterino o di un catetere transcervicale.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la composizione ? somministrata all?interno delle tube dell?utero (salpingi). Preferibilmente, la composizione ? somministrata per via intratubarica tramite iniezione mediante un catetere intratubarico.
In una forma di realizzazione della presente invenzione, la composizione ? formulata per applicazioni di tipo topico, preferibilmente in forma di soluzione, sospensione, polvere per sospensioni ginecologiche, ovuli vaginali, capsule vaginali, lavande vaginali, creme vaginali o enema.
Alternativamente, la composizione ? preparata estemporaneamente mescolando la composizione con acqua o con una soluzione salina.
Il mantenimento di livelli di lattobacilli nel microbiota endometriale e/o vaginale ? di particolare interesse in quanto correlato con la possibile insorgenza di infezioni dell?apparato riproduttivo femminile. Infatti, la presenza di batteri, in particolare del genere Lattobacillus, nel microbiota endometriale ? in grado di controllare la proliferazione di microorganismi patobionti. Inoltre, l?equilibrio del microbiota, in particolare del microbiota endometriale, sembra essere coinvolto nei meccanismi di decidualizzazione dell?endometrio.
A tale riguardo, la Richiedente ha dimostrato come la somministrazione di batteri, in particolare del genere Lactobacillus e/o Bifidobacterium, sia in grado di ristabilire il corretto equilibrio nell?ambiente endometriale che contribuisce ad una corretta decidualizzazione. In particolare, si ? dimostrato come la somministrazione di batteri vivi o inattivati, preferibilmente tindalizzati, o di estratti proteici detti batteri sia/siano in grado di favorire la decidualizzazione.
Come mostrato nella sezione sperimentale, colture di batteri vivi, in particolare del genere Lactobacillus, inducono ESC indifferenziate ad assumere un fenotipo decidualizzato con tempistiche e livelli di attivazione di geni marker paragonabili a quelli ottenuti in colture primarie di ESC sottoposte al protocollo ?classico? di decidualizzazione indotta da progesterone e cAMP.
Inoltre, in colture primarie di ESC trattate con estratti proteici derivanti da Lactobacilli tindalizzati, i livelli di espressione genica e di proteine legate alla decidualizzazione aumentano significativamente rispetto sia alla coltura di ESC trattate secondo il protocollo di decidualizzazione classico sia alle ESC trattate o in co-coltura con Lactobacilli vivi, anticipando di fatto il conseguimento dello stato decidualizzato delle ESC.
Le differenze riscontrate nel ?timing? di conseguimento del fenotipo decidualizzato di campioni trattati con Lactobacilli tindalizzati rispetto alle co-colture con Lactobacilli vivi sono presumibilmente riconducibili a una diversa attivazione di recettori posti sulle membrane delle ESC da parte di diverse proteine-ligando prodotte dai Lactobacilli.
Infine, la Richiedente ha dimostrato che una somministrazione di batteri, preferibilmente del genere Lactobacillus, direttamene nell?utero tramite somministrazione endouterina ? particolarmente efficace nel ristabilire un corretto equilibrio del microbiota endometriale.
Un secondo aspetto della presente invenzione si riferisce all?uso di una composizione comprendente batteri, preferibilmente probiotici o paraprobiotici, come sopra dettagliatemene descritta, per aumentare i livelli o la proliferazione di batteri commensali, preferibilmente della specie Lactobacillus crispatus e/o Lactobacillus gasseri, e/o per ridurre i livelli o ridurre la proliferazione di almeno un microorganismo scelto tra: Streptococcus, preferibilmente specie S. pyogenes, S agalactiae, S. faecalis, S. pneumoniae, S. mutans; Staphilococcus, preferibilmente specie Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, e Enterobatteriacee scelti tra E. coli, Klebsiella ed Enterobacter, Gardnerella Vaginalis, Candida, Trichomonas, Chlamydia Trachomatis e loro combinazioni. In altre parole, la composizione dell?invenzione pu? essere impiegata per ristabilire l?equilibrio del microbiota endometriale e/o della mucosa tubarica anche in assenza di una condizione patologica clinicamente evidente. In una forma di realizzazione, detto uso prevede almeno una fase di somministrazione ad un individuo che ne abbia necessit? di una quantit? efficace di una composizione comprendente batteri, preferibilmente probiotici o paraprobiotici, come sopra dettagliatamente descritta.
Un terzo aspetto della presente invenzione si riferisce ad un kit comprendente una composizione a base di batteri, preferibilmente probiotici o paraprobiotici, come sopra dettagliatamente descritta ed un dispositivo per una somministrazione endouterina o intratubarica della composizione. Preferibilmente, detto dispositivo comprende almeno una siringa, preferibilmente precaricata con la composizione sopra dettagliatamene decritta, ed un catetere endouterino o intratubarico. Un esempio di catetere endouterino ? mostrato nella Figura 15A unitamente ad una siringa ad esso associabile (Figura 15B), mentre un esempio di catetere intratubarico ? mostrato nella Figura 16A unitamente ad una siringa ad esso associabile (Figura 16B).
Un quarto aspetto della presente invenzione riguarda un metodo per il trattamento o la prevenzione di una condizione patologica dell?apparato riproduttivo femminile causata o associata ad uno squilibrio del microbiota dell?apparato riproduttivo femminile e/o ad una insufficiente decidualizzazione.
Detta condizione patologica ? preferibilmente causata o associata ad uno squilibrio del microbiota endometriale e/o vaginale e/o della mucosa tubarica, preferibilmente endometriale e/o della mucosa tubarica.
In una forma di realizzazione, detta condizione patologica ? causata o associata ad una diminuzione nel microbiota endometriale e/o nel microbiota della mucosa tubarica dei livelli di batteri commensali ed alla proliferazione di microorganismi patobionti, come sopra descritti.
In una forma di realizzazione, detto metodo comprende almeno una fase di somministrazione ad un individuo che ne abbia necessit? di una quantit? efficace di una composizione comprendente batteri, preferibilmente probiotici o paraprobiotici, come sopra dettagliatamente descritta.
ESEMPIO
Trattamento in vitro di cellule stromali endoteliali (ESC) con ceppi di Lactobacilli
Raccolta dei campioni di endometrio
Le biopsie endometriali sono state raccolte durante la fase proliferativa del ciclo mestruale (dal giorno 5 al giorno 14 del ciclo mestruale) da donne sane con regolare ciclo mestruale che si sono sottoposte a isteroscopia diagnostica prima della fecondazione in vitro (IVF) consigliata per ragione connesse all?infertilit? del partner maschile.
Coltura primaria di cellule endometriali stromali (ESC)
Le biopsie endometriali sono state raccolte 1X Dulbecco?s phosphate buffered saline (DPBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e immediatamente processate a temperature ambiente e in condizioni di sterilit?. Le biopsie endometriali, originariamente di circa 5-7 mm<3 >sono state ulteriormente lavate due volte con 1X DPBS e infine depositate in una piastra Petri sterile per permettere la purificazione delle cellule endometriali stromali secondo il protocollo descritto in Ciarmela et al., 2011.
Brevemente, la biopsia endometriale ? stata trattata a temperatura ambiente per 2 minuti con 1 mg/ml di Collagenase Type II (Sigma, St. Louis, MO) disciolta in un tampone per la collagenasi (DMEM medium; 100 U/ml penicillina; 100 ?g/ml streptomicina; 50 ?g/ml gentamicina; 2 mM L-Glutammina; tutti questi prodotti sono stati acquistati da Life Technologies, UK) per consentire la digestione enzimatica del tessuto. Dopo la rimozione del sottile strato esterno di tessuto connettivo, la biopsia endometriale immersa nella soluzione collagenasica ? stata sminuzzata il pi? possibile mediante l?uso di un bisturi sterile. La risultante sospensione ? stata infine trasferita in un tubo da 50 ml contenente 8 ml di soluzione collegenasica e la digestione del tessuto ? stata portata avanti in un bagnetto termostatato a 37?C in gentile agitazione evitando di formare schiuma, fino alla completa digestione del tessuto (generalmente il processo si compie in 1-4 ore dipende dalle dimensioni iniziali della biopsia).
L?endometrio digerito ? stato poi lavato mediante centrifugazione a 600 xg per 12 minuti e successiva rimozione del surnatante. Il risultante pellet di cellule ? stato risospeso in 3 ml di siero bovino fetale (foetal bovine serum, FBS) South America (EU Approved, Carlo Erba, Italy) e incubato per 20 minuti a 37?C (5% di CO2) per permettere alle cellule un recupero fisiologico.
Le ESC cos? recuperate sono state lavate come precedentemente descritto e infine sospese nel mezzo di coltura (DMEM medium addizionato con 10% FBS and 2 mM L-Glutammina), contate mediante l?uso di un emocitometro e piastrate alla concentrazione di 10<5 >cellule/pozzetto in una piastra multi-pozzetto da 12. Le colture primarie cos? allestite sono state mantenute in coltura (37?C, 5% CO2) fino al raggiungimento della confluenza (circa il 70% della superficie disponibile occupata) e quindi utilizzate per gli esperimenti o trattate secondo il protocollo di decidualizzazione classico (Dimitriadis et al., 2005).
Protocollo classico di decidualizzazione
Al raggiungimento della confluenza, le colture primarie di ESC sono state mantenute in un mezzo di decidualizzazione (mezzo di coltura precedentemente descritto addizionato di 600 ng/ml progesterone e 10 ng/ml di cAMP; Sigma, St. Louis, MO) fino al raggiungimento del fenotipo decidualizzato. Durante la progressione del protocollo, le colture primarie di ESC sono state quotidianamente sottoposte a: valutazione della morfologia cellulare al microscopio, sostituzione del terreno di coltura esausto con terreno fresco, campionamento delle colture per consentire le future analisi molecolari.
Condizioni di crescita dei ceppi batterici
I ceppi batterici di L. acidophilus e L. plantarum fatti crescere in anaerobiosi in 400 ml di deMan-Rogosa-Sharp (MRS) brodo (BD, Oxford, U.K.) per 18-24 ore (fino al raggiungimento di una densit? ottica di 0.6 = O.D.600nm misurata attraverso spettrofotometria) a 37?C. Una aliquota di coltura batterica da 10 ml ? stata usata come coltura di partenza per espandere i due ceppi di Lactobacillus vivi da utilizzare per i successivi esperimenti. I restanti 390 ml di ogni coltura sono stati centrifugati e impiegati per preparare gli heat-killed Lactobacilli. In breve, i Lactobacilli centrifugati sono stati lavati con 1X PBS e inattivati in autoclave per 1 h a 70?C. L?effettiva mancanza di vitalit? dei Lactobacilli ? stata confermata inoculando una aliquota da 10<6 >batteri termo-inattivati nel brodo di crescita MRS e controllandone la crescita (O.D.) per mezzo di uno spettrofotometro.
Estrazione delle proteine batteriche totali
Una aliquota da 10 ml di ogni ceppo di Lactobacilli ? stata inoculata 150 ml di brodo MRS a 37?C fino al raggiungimento di una OD600nm = 0.6. Il surnatante delle due colture ? stato eliminato mediante centrifugazione a 700 xg e il risultante pellet di batteri ? stato lavato per 3 volte con 1X PBS (5000 xg, 10 minutes, 4?C).
I pellet di Lactobacilli vivi e termo inattivati sono stati processati per l?estrazione diretta delle proteine usando RIPA buffer (Sigma, St. Louis, MO). Le proteine cos? estratte sono state quantificate mediante il saggio di Bradford
SDS-PAGE
Una stessa quantit? di proteine (estratte come precedentemente descritto) per ogni campione (10, 25 o 50 ?g) sono state mischiate con il buffer di caricamento (2X loading buffer: 4% SDS; 20% glicerolo; 0.004% blu di bromofenolo; 0.125 M Tris-Cl, pH 6.8; 10% 2-mercaptoetanolo), con 1X cocktail inibitore delle proteasi (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) e 5 mM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), e infine bolliti per 10 minuti.
Gli estratti proteici sono stati separati mediante corsa elettroforetica attraverso un gel di acrilammide/bis-poliacrilammide al 12% in condizioni denaturanti. Il marker di peso molecolare noto ColorBurst Electrophoresis Marker (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) ? stato usato come riferimento per l?identificazione delle bande. I campioni sono stati caricati in duplicato per generare due gel identici. La corsa ? stata effettuata per 90 minuti a 120 V. Il primo gel ? stato traferito con un elettroblotter (modalit? semi-dry) a una membrana di nitrocellulosa per permettere il successivo immunoblot. Il gel utilizzato per il trasferimento ? stato ? stato colorato con il Comassie brilliant blue (Sigma, St. Louis, MO) per visualizzare la posizione delle bande corrispondenti alle proteine. Il secondo gel ? stato utilizzato per l?estrazione e la purificazione delle proteine di interesse dal gel.
Estrazione/purificazione di proteine da gel di poliacrilammide
Le proteine di interesse, separate in base al peso molecolare per elettroforesi, sono state identificate nel secondo gel (non colorato) usando come riferimento il gel colorato con Comassie. Le bande di interesse, dopo l?allineamento dei gel, sono state escisse dal gel non colorato mediante l?uso di un bisturi sterile. Per confermare l?accuratezza dell?escissione, la restante parte del gel ? stata colorata e confrontata col gel colorato con Comassie. Le bande corrispondenti alle proteine di interesse sono state eluite passivamente dal gel dopo averlo frammentato mediante l?uso di un pestello sterile, in 1 ml di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA; pH 7.5). L?eluizione ? stata condotta overnight in uno shaker a rotazione a 30 ?C. Il mix di eluizione ? stato poi centrifugato a 10,000 xg for 10 minuti e il sopranatante contenete le proteine eluite trasferito a un nuovo tubo da microcentrifuga. Aliquote di sovranatante sono state corse in un nuovo SDS-PAGE per confermare la presenza delle proteine di interesse.
Le proteine eluite e purificate con questa metodologia si prestano a essere utilizzate in diverse applicazioni come gli esperimenti (direttamente dissolte nel mezzo) o il sequenziamento N-Terminale (per definire la tipologia di proteina).
Trattamento delle ESC con Lactobacilli
Le colture primarie di ESC sono state incubate con L. acidophilus o con L. plantarum vivi, heat-killed o con i loro relativi estratti proteici per 10 giorni a 37 ?C e 5% CO2, secondo lo schema riportato di seguito:
1. ESC (106 cells/well)
2. ESC (10<6 >cells/well) vivi L. acidophilus or L. plantarum (10<8 >cells/well). Ratio Lactobacilli: ESC = 100: 1
3. ESC (10<6 >cells/well) heat-killed L. acidophilus or L. plantarum (10<8 >cells/well) 4. ESC (10<6 >cells/well) lisato proteico ottenuto da L. acidophilus or L. plantarum (1 ?g/ml) vivi
5. ESC (10<6 >cells/well) lisato proteico ottenuto da L. acidophilus or L. plantarum (1 ?g/ml) heat-killed
6. ESC (10<6 >cells/well) progesterone cAMP (protocollo classic di decidualizzazione) Le ESC e dESC trattate come descritto sono state processate quotidianamente seguendo i protocolli riportati di seguito.
Preparazione del campione e trascrizione inversa (RT)
Dopo la rimozione del surnatante, i campioni sono stati lisati direttamente nel pozzetto della piastra con 1 ml del prodotto commerciale Tri-Reagent? (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) e immediatamente processati per l?estrazione dell?RNA totale seguendo le istruzioni riportate nel datasheeet. L?RNA totale estratto ? stato sospeso in 20 ?l di RNase free water e digerito con DNase I (Promega, Madison, WI, USA) per 30 minuti a 37 ?C per rimuovere l?eventuale presenza di DNA genomico contaminante. L?RNA ? stato valutato attraverso spettrofotometria usando lo strumento Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) per determinarne qualit? e concentrazione. Due ?g di RNA totale per ogni campione ? stato retrotrascritto a cDNA usando iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) rispettando il protocollo fornito dal produttore. Il profilo termico della reazione utilizzato ? stato 5 minuti a 25 ?C, 30 minuti a 42 ?C, 5 minuti a 85 ?C usando lo strumento 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystem, Waltham, MA, USA).
RT-quantitativa PCR (RT-qPCR)
I cDNAs ottenuti da ogni campione sono stati impiegati (2 ?l) come stampo in reazioni di RT-qPCR. Le reazioni per ogni campione sono state condotte in triplicato ed espresse come media per consentire l?analisi dell?espressione genica. Le reazioni sono state assemblate in ghiaccio usando come enzima SsoAdvanced Universal SYBR<? >Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) secondo le indicazioni della ditta produttrice. Laddove possibile, i primers utilizzati (Tabella I) sono stati disegnati per appaiarsi alla sequenza di giuntura tra due esoni, evitando in questo modo la possibile amplificazione di DNA genomico contaminante (contenente gli introni) ancora eventualmente presente dopo la digestione con DNasi I. Tutti i primer utilizzati hanno temperature di melting molto simili tra loro (circa 60?) per cui le reazioni sono state effettuate col medesimo profilo termico: 30 secondi a 95?C per l?iniziale attivazione dell?enzima, seguito da 40 cicli di 5 secondi (denaturazione) a 95?C e annealing/extension a 60?C per 20 secondi usando lo strumento StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA).
Tabella I Lista dei primers utilizzati in RT-qPCR
I risultati sono sati normalizzati nei confronti del gene costitutivamente espresso ?-actin (reference gene). I controlli negativi delle reazioni in triplicato, sono stati allestiti usando volumi corrispondenti di acqua molecular biology grade al posto dei cDNAs. La specificit? di ogni reazione ? stata controllata mediante valutazione della risultante curva di dissociazione e correndo parte gli amplificati (10 ?l) in un gel di agarosio al 1.5% in 1X Tris-Acetic acid-EDTA (TAE).
ELISA
Le proteine PRL, IGFBP-1 e LIF prodotte e tradotte a seguito dei trattamenti con Lactobacilli o con le loro proteine, sono state quantificate mediante saggio immunoenzimatico (ELISA) come descritto in Rose et al., 1978. il corrispondente saggio ELISA per ciascuna molecola ? stato acquistato da R&D Biosystems e impiegato secondo il procedimento indicato dalla ditta produttrice.
La densit? ottica (O.D.) relativa a ciascun campione ? stata misurata a una lunghezza d?onda di 450 nm usando il lettore di piastre MultiSkan FC (Thermo Fisher). La sensibilit? e il limite di rilevamento (detection limit) sono stati calcolati seguendo le istruzioni per l?analisi dei dati contenute nel kit ovvero comparando la O.D. generata dal controllo positivo (quantit? nota e massima di proteina) con la O.D. corrispondente allo standard pi? diluito per ottenere una curva di calibratura (Sensitivity = 0.67 pmol/ml; Detection limit = 0.31 pmol/ml; Coefficient of variation R<2 >= 0.9974). La concentrazione della proteina ? stata calcolata usando il programma bioinformatico MyAssay disegnato specificamente per il tipo di proteina in esame.
Immunoblot
Stesse quantit? di proteine (30 ?g) derivanti da ciascun campione sono state frazionate attraverso un gel di poliacrilammide/bispoliacrilammide al 12% in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) come descritto in precedenza. Al termine della corsa i gel sono stati trasferiti usando l?apparato Trans-Blot SD semi-dry transfer cell (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) su membrane di polivinilidenfluoruro (PVDF, Thermo scientific, Rockford, IL, USA). Le membrane sono state bloccate overnight con un tampone salino a base di Tris (TBS, pH 7.4) addizionato di 5% di latte scremato in polvere (skim milk powder; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) per saturare i siti di legami aspecifici. Le membrane sono state infine incubate per 1 ora con i relativi anticorpi primari ricavati in capra antihuman PRL or IGFBP-1 or LIF (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) diluiti 1:200. Dopo tre lavaggi con 0.05% Tween 20 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) in TBS per allontanare il primario non legato, le membrane sono state ulteriormente incubate con l?anticorpo secondario ricavato in coniglio anti-capra coniugato all?enzima perossidasi di rafano (horseradish peroxidase (HRP) diluito 1:10000 (Bethyl, Montgomery, TX, USA). Al termine dell?incubazione e dopo 3 lavaggi con TBS-Tween, le membrane sono state immerse nell?ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) e le bande sono state rivelate in chemiluminescenza usando lo strumento ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). I segnali sono stati acquisiti e semi-quantificati con un software per l?analisi delle immagini (VersaDoc Imaging System and QuantityOne software, Bio-Rad Laboratories Inc.).
Dopo l?acquisizione delle immagini, le membrane sono state ?strippate? ovvero gli anticorpi utilizzati sono stati staccati, ri-incubate con un anticorpo primario ricavato in coniglio anti-human ?-tubulina (Abcam, Cambridge, UK) diluito 1:500 e infine processate come descritto sopra. Dopo lo sviluppo, le bande corrispondenti alla ?-tubulina sono state usate come controllo interno sulla quantit? di lisato proteico inizialmente caricata nel gel.
Analisi immunoistochimica
Colture primarie di ESC Lactobacillus-trattate e dESC sono state incubate con 1 ml di 1X PBS-Tripsina-EDTA (Life Technologies) per 15 minuti a 37?C per consentire il distacco delle cellule dal fondo del pozzetto. La reazione di tripsinizzazione ? stata monitorata a intervalli regolari di 2 minuti al microscopio. La reazione di tripsinizzazione ? stata interrotta aggiungendo 2 ml di mezzo di coltura contenente 10% di FBS. La sospensione cellulare risultante ? stata lavata per tre volte con 1X PBS mediante centrifugazione e risospensione in 1X PBS fresco. Al termine, le sospensioni cellulari relative a ogni singolo campione sono state trasferite su vetrini mediante l?uso di un citospin (Shandon Cytospin4, Thermo Scientific) a 500 xg per 5 minuti e infine fissate a 4 ?C per 1 ora in una soluzione paraformaldeidica (4% paraformaldeide dissolta in 1X PBS a 7.4 pH). I vetrini contenenti le ESC fissate sono stati lavati 3 volte con 1X PBS e impiegati in reazioni immunoistochimiche come descritto in seguito.
La smascherazione degli antigeni (antigen unmasking) ? stata ottenuta mediante trattamento dei vetrini con proteasi (Pronase 1:20, DakoCytomation, CA, USA) per 7 minuti a 37 ?C. I vetrini sono stati in seguito trattati con 3% si albumina sierica di bovino (BSA) dissolta in 1X PBS, per 30 minuti a temperatura ambiente. I vetrini sono stati incubati con i seguenti anticorpi policlonali ricavati in coniglio anti-human PRL, ILGFB-1 e LIF diluiti 1:25 in 1X PBS contenente il 3% di BSA per 1 ora a temperatura ambiente (tutti gli anticorpi sono stati acquistati da Santa Cruz, Dallas, TX, USA). Dopo tre lavaggi in 1X PBS, i vetrini sono stati incubati per 1 ora a temperatura ambiente con l?anticorpo secondario ricavato in capra anti-coniglio coniugato alla tetrametil-rodamina isotiociananto (Sigma, St. Louis, MO, USA) diluito 1:20 in 1X PBS contenente il 3% di BSA. dopo tre lavaggi in 1X PBS per rimuovere l?anticorpo non legato, i vetrini relativi a ciascun campioni sono stati sigillati grazie all?uso di un montante anti-dissolvimento del segnale (0.21 M 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) and 90% glycerol in 0.02 M Tris, pH 8.0). I controlli negativi non stati incubati con gli anticorpi primari. Le immagini sono state acquisite al microscopio confocale (Leica TCS SP2 AOBS confocal laser scanning microscope). L?eccitazione e la rivelazione dei campioni sono state eseguite in modo sequenziale per evitare la sovrapposizione dei diversi segnali. Le ESC positive sono state contate in doppio cieco da due diversi operatori selezionando campi casuali da 100 ESC totali.
Analisi statistica
L?analisi statistica ? stata condotta usando il test di Kruskal-Wallis seguito dal test di Dunn-Bonferroni, ponendo come appropriata una probabilit? di P<0.05 per la significativit? statistica. L?espressione relativa per ogni singolo gene analizzato ? stata calcolata usando il metodo del 2-??Ct [Livak and Schmittgen, 2001] e rapportata all?espressione dello stesso gene nel campione di controllo, ovvero in ESC non trattate, posto arbitrariamente uguale a 1.
Risultati
I lisati proteici provenienti da L. acidophilus e L. plantarum vivi o heatkilled sono stati frazionati in un gel di poliacrilammide al 12% in condizioni denaturanti al fine di evidenziare eventuali differenze in termini di bande rappresentative.
Dal confronto delle bande presenti nei due gel riportati in Figura 1 ? stata evidenziata (rettangolo rosso) la zona contraddistinta dal maggior numero di variazioni nel numero e nell?arricchimento di bande tra i due ceppi di Lactobacillus, che al momento ? oggetto di studi preliminari per l?identificazione, attraverso sequenziamento, delle proteine contenute nelle bande.
Allo scopo di valutare gli effetti dei due ceppi di Lactobacillus sulla decidualizzazione, ESC purificate come descritto sopra, sono state messe in coltura con L. acidophilus o L. plantarum (10<8 >cellule/ml) vivi o heatkilled o con i loro relativi lisati proteici. Parallelamente ESC purificate sono state incubate con progesterone e cAMP secondo il classico protocollo di decidualizzazione. Per seguire gli effetti della co-coltura sul processo di decidualizzazione l?espressione di 2 geni marker (PRL e IGFBP-1) sono stati analizzati mediante qPCR. Come mostrato in Figura 2 e 3 l?aggiunta di L. acidophilus vivi o heat-killed o del lisato proteico derivante dai batteri vivi alle ESC in coltura, genera profili di espressione per entrambi i geni paragonabili a quelli indotti dal classico protocollo di decidualizzazione. Inoltre, nelle colture di ESC trattate con il lisato proteico proveniente da Lactobacilli heat-killed (1 ?g) si ? riscontrata una induzione dell?espressione di entrambi i geni a livelli significativamente maggiori rispetto a alle co-colture semplici o alle ESC trattate col protocollo di decidualizzazione in assenza di L. acidophilus. L?aggiunta di heat killed L. acidophilus favorisce quindi il raggiungimento del fenotipo decidualizzato in tempo minore.
I dati relativi alla co-coltura L. plantarum-ESC non presentano nessuna differenza significativa rispetto a quelli generati dalla co-coltura L. acidophilus-ESC (dati non mostrati).
Per capire se i protocolli oltre che a influenzare la decidualizzazione potessero influenzare anche la ricettivit? endometriale l?espressione del marker LIF ? stata seguita nel corso del trattamento e analizzata con qPCR. Come si evince dai dati riportati in Figura 4, i livelli di espressione di LIF sono paragonabili tra ESC in decidualizzazione e ESC in co-coltura semplice con L. acidophilus (o con L. plantarum). I livelli di espressione di LIF sono significativamente pi? alti nei campioni dove la co-coltura con L. acidophilus ? avvenuta in presenza del lisato batterico proveniente da heat-killed L. acidophilus confermando un possibile ruolo benefico del L. acidophilus nel migliorare la ricettivit? dell?endometrio durante la decidualizzazione.
Gli esperimenti condotti sulla co-coltura ESC-L. plantarum con le stesse modalit? eseguite per la co-coltura ESC-L. acidophilus non hanno evidenziato nessuna differenza significativa nella regolazione di LIF tra le due co-colture (dati non mostrati).
Al fine di confermare i risultati ottenuti sulla regolazione genica con metodiche di qPCR, la presenza e l?effettiva produzione delle proteine finali sono state confermate con metodi immunoenzimatici del tipo ELISA. Come si evince dalle figure 4 e 5 la quantificazione delle due proteine secrete nel mezzo mostrano un andamento generale paragonabile a quello osservato sulla regolazione genica con rapporti e livelli di produzione sovrapponibili per quanto riguarda la co-coltura semplice e ESC sottoposte a protocollo di decidualizzazione. Di nuovo si nota un generale contributo positivo del L. acidofilus al protocollo di decidualizzazione. Questo apporto positivo ? riscontrabile anche nel caso del marker della ricettivit? endometriale LIF (Fig. 6) sebbene marginali discrepanze in termini di tempistiche esistano sia tra i trattamenti che sulle tempistiche e vanno probabilmente ricondotte alle specifiche cinetiche di trascrizione proteica.
Al fine di confermare ottenuti con la metodica dell?ELISA, campioni derivanti dai diversi trattamenti sono stati analizzati con la metodica dell?immunoblot. Basandoci sui risultati ottenuti con la qPCR solo i campioni trattati per sei giorni sono stati valutati con questa metodica come si evince dalla Figura 8 tutte e tre le proteine prese in esame mostrano un significativo aumento di espressione a seguito dei trattamenti.
I risultati della colorazione immunoistochimica sono riportati in Figura 9. I risultati si riferiscono alla conta di 1000 cellule a vetrino a campo ed espressi come percentuale della conta media delle cellule positive all?anticorpo anti-PRL. Come si evince dai risultati riassunti in figura 9, le percentuali di cellule positive decidualizzate con L. acidophilus (o con L. plantarum) vivi sono comparabili alle percentuali ottenute applicando il classico protocollo di decidualizzione.
Inoltre, nei campioni in cui le ESC vengono incubate con lisati proteici estratti da L. acidophilus (o da L. plantarum) si riscontrano percentuali di positivit? e quindi di decidualizzazione superiori a quelle registrate con ESC sottoposte a protocollo di decidualizzazione.
Iniezione endouterina e vaginale di Lactobacilli tindalizzati a confronto.
Popolazione studiata e procedura dello studio
14 donne in et? fertile, di et? compresa tra i 26 ed i 43 anni, con cicli mestruali regolari, si sono sottoposte volontariamente ad uno studio finalizzato alla rappresentazione della flora batterica autoctona a livello uterino ed al suo cambiamento in termini di composizione batterica dopo la somministrazione topica a livello vaginale ed uterino rispettivamente di probiotici e probiotici inattivati.
In seguito al processo di randomizzazione, sono stati creati due bracci di studio. In fase follicolare del ciclo mestruale, le 14 donne della popolazione di studio sono state sottoposte a prelievo di liquido dalla cavit? uterina mediante l?utilizzo di un catetere da embryo transfer.
Successivamente, 7 donne del primo braccio di studio (da n. 1-7) hanno effettuato terapia topica sotto forma di ovuli vaginali costituiti da lattobacillo vivo (Lactobacillus acidophilus, 40 mg) da applicare un ovulo alla sera per una settimana, le altre 7 donne (da n. 8-14) sono state sottoposte a trattamento topico mediante iniezione in utero di lattobacillo tindalizzato (Lactobacillus acidophilus, 1X10<9 >corpi microbici per iniezione), una applicazione 3 volte in una settimana. Al termine della settimana di trattamento, le donne costituenti i due bracci di studio sono state sottoposte a prelievo di fluido dalla cavit? endometriale eseguito con catetere da embryo transfer mediante aspirazione pi? consistente, al fine di isolare anche le cellule endometriali e non solo il liquido endometriale. Con la paziente in posizione litotomica, la cervice ? stata detersa con un batuffolo di cotone inumidito e sono stati aspirati dai 20 agli 80 ?L di fluido endometriale usando un catetere introdotto attraverso la cervice nella cavit? uterina, evitando qualsiasi contatto con le pareti vaginali. Per prevenire la contaminazione, il muco cervicale ? stato aspirato prima del prelievo di liquido endometriale e l'aspirazione ? stata interrotta all'ingresso dell'ostio uterino interno durante la rimozione del catetere. L'aspirazione di fluido endometriale ? indolore e minimamente invasiva, non causa alcun rischio per la paziente.
Lo studio del microbioma ? stato eseguito mediante tecniche di sequenziamento basate sui geni del DNA ribosomiale 16S (rDNA), che rappresenta la regione di interesse (sequenza target), unico per tutte le specie batteriche, nella ricerca del microbioma. L?utilizzo di tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha consentito il sequenziamento del DNA batterico eliminando la necessit? di isolare le colture prima dell'analisi.
Per ottenere una digestione completa della parete cellulare batterica, ? stata eseguita una fase di lisi enzimatica extra utilizzando 50 ?L di lisozima (50 mg / mL) (Sigma, Dorset, Regno Unito) e un buffer di lisi batterica (Roche, Madison, WI) con incubazione a 37 ?C per 30 minuti. Le fasi successive (trattamento di inattivazione e purificazione) sono state eseguite secondo il protocollo del produttore nel sistema MagNa Pure Compact (Roche).
Il sequenziamento del rDNA 16S ? stato eseguito utilizzando il kit metagenomico Ion 16S (Ion Torrent di Life Technologies, Grand Island, New York, USA). I frammenti amplificati sono stati sequenziati sul sistema Ion PGM? e i risultati sono stati analizzati utilizzando il software Ion Reporter? secondo le linee guida del produttore.
Risultati
Dall?analisi eseguita sui campioni di fluido endometriale prelevato prima e dopo il trattamento si ? visto che in tutte e 14 le donne esaminate, i batteri maggiormente rappresentati nel liquido endometriale prima del trattamento sono risultati essere in una pi? alta percentuale di casi Lattobacilli (66.2% dei batteri identificati). Gli altri agenti batterici pi? comunemente rappresentati sono stati Pseudomonas (8.7%), Acinetobacter (7.7%), Streptococco (2.5%) e Gardnerella (1.5%) (Figure 10 e 13).
Questa percentuale di composizione dei microrganismi che costituiscono la flora batterica endometriale, ? rimasta grossomodo stabile nelle donne del braccio di trattamento con lattobacilli vivi vaginali, mostrando un aumento del1.9% della flora batterica lattobacillo-simile (Figura 11).
Nelle pazienti sottoposte ad iniezione di lattobacilli inattivati a livello endometriale, l?analisi del fluido endometriale post trattamento ha mostrato invece un aumento del 22.4% di spettro lattobacillo-simile (Figure 12 e 14).
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Una composizione comprendente batteri appartenenti al genere Lactobacillus e/o Bifidobacterium per uso nel trattamento o nella prevenzione di una condizione patologica dell?apparato riproduttivo femminile causata o associata ad uno squilibrio del microbiota dell?apparato riproduttivo femminile e/o ad una insufficiente decidualizzazione.
- 2. La composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1, dove la condizione patologica ? causata o associata ad uno squilibrio del microbiota endometriale e/o della mucosa tubarica.
- 3. La composizione per l?uso secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta condizione patologica ? causata o associata ad una diminuzione nel microbiota endometriale e/o della mucosa tubarica dei livelli di batteri del genere Lactobacillus, preferibilmente i batteri appartenenti alla specie Lactobacillus crispatus e/o Lactobacillus gasseri.
- 4. La composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui detta condizione patologica ? causata o associata ad un aumento della proliferazione nel microbiota endometriale e/o della mucosa tubarica di almeno un microorganismo scelta tra: Streptococcus, preferibilmente specie S. pyogenes, S agalactiae, S. faecalis, S. pneumoniae, S. mutans; Staphilococcus, preferibilmente specie Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, e Enterobatteriacee scelti tra E. coli, Klebsiella ed Enterobacter, Gardnerella Vaginalis, Candida, Trichomonas, Clamidia Trachomatis e loro combinazioni.
- 5. La composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, dove detta condizione patologica ? scelta tra: infertilit?, sterilit?, endometrite acute, endometrite cronica, minaccia di aborto, aborto, abortivit? ricorrente, fallimento di impianto, gravidanza extrauterina, placenta previa, distacco placentare, ritardo della crescita intrauterina, parto pretermine, preclampsia, rottura prematura delle membrane e loro combinazioni.
- 6. La composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui i batteri del genere Lactobacillus appartengono ad almeno una delle seguenti specie: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis e loro combinazioni.
- 7. La composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in cui i batteri del genere Lactobacillus sono della specie acidophilus e/o della specie plantarum e/o della specie paraplantarum, preferibilmente, i batteri della specie acidophilus sono del ceppo ATCC 4357 e/o ceppo ATCC BAA-2832 e/o ceppo ATCC 11975 e/o ceppo ATCC 53544 e i batteri della specie plantarum sono del ceppo ATCC BAA-793 e/o ceppo ATCC 700210 e/o ceppo ATCC 55324.
- 8. La composizione per uso secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni 1-7, in cui detti batteri sono vivi o morti o inattivati, preferibilmente tindalizzati, in forma di lisato o estratto, preferibilmente i batteri sono tindalizzati.
- 9. La composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, somministrata per via vaginale o per via endouterina o intratubarica, preferibilmente per via endouterina o intratubarica.
- 10. La composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, formulata come soluzione, sospensione, polvere per sospensioni ginecologiche, ovuli vaginali, capsule vaginali, lavande vaginali, creme vaginali o enema.
- 11. La composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10, in cui i batteri sono somministrati in una quantit? compresa tra 1*10<8 >e 1*10<12>, preferibilmente tra 2*10<8 >e 5*10<9>, pi? preferibilmente tra 5*10<8 >e 3*10<9 >di cellule batteriche per ciascuna somministrazione.
- 12. Uso di una composizione comprendente batteri secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-11, per aumentare i livelli o la proliferazione nel microbiota endometriale e/o nel microbiota della mucosa tubarica di batteri della specie Lactobacillus crispatus e/o Lactobacillus gasseri, e/o per ridurre i livelli o ridurre la proliferazione nel microbiota endometriale e/o nel microbiota della mucosa tubarica di almeno un microorganismo scelto tra: Streptococcus, preferibilmente specie S. pyogenes, S agalactiae, S. faecalis, S. pneumoniae, S. mutans; Staphilococcus, preferibilmente specie Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus delphini, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, e Enterobatteriacee scelti tra E. coli, Klebsiella ed Enterobacter, Gardnerella Vaginalis, Candida, Trichomonas, Clamidia Trachomatis e loro combinazioni.
- 13. Un kit comprendente la composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-11 ed un dispositivo per iniezione endouterina o intratubarica, comprendente preferibilmente una siringa ed un catetere.
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- 2021-03-04 WO PCT/IB2021/051800 patent/WO2021176387A1/en active Application Filing
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021176387A1 (en) | 2021-09-10 |
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