IT201900014430A1 - Uso di un derivato piastrinico per stimolare la proliferazione cellulare - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
del brevetto per invenzione industriale dal titolo:
“USO DI UN DERIVATO PIASTRINICO PER STIMOLARE LA PROLIFERAZIONE CELLULARE”
La presente invenzione è relativa all’uso di un plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche per stimolare la proliferazione cellulare e come supplemento per un terreno di coltura cellulare. E’ inoltre relativa ad un terreno di coltura comprendente tale plasma.
La riparazione e la rigenerazione di un tessuto comportano un insieme di fasi complesse e non è completamente definito quale sia il ruolo dei fattori di crescita nell’indurre ed accelerare questi meccanismi.
Per rigenerazione si intende la ricostituzione della forma e della funzione di un tessuto danneggiato; per riparazione, invece, il ritorno alla continuità del tessuto, senza necessariamente reintegrare la sua originaria architettura e, soprattutto, senza il ripristino integrale della sua funzione.
E’ noto l’utilizzo di concentrati piastrinici, tra cui plasma ricco di piastrine (o PRP), per la riparazione e la rigenerazione di un tessuto.
E’ consuetudine, quando si descrive l’azione dei concentrati piastrinici, attribuire l’effetto rigenerativo ai fattori di crescita piastrinici.
Studi di proteomica hanno identificato più di 2000 proteine biologicamente attive derivate dalle piastrine e coinvolte nei meccanismi di: chemiotassi, proliferazione cellulare, angiogenesi, deposizione di matrice extracellulare (ECM) e riparazione tissutale. Queste sono direttamente indotte dai fattori piastrinici (fattori crescita, angiopoietina, SDF-1, MMP-1,-2 e -9) e indirettamente da chemochine e citochine prodotte da cellule bystander (fibroblasti, macrofagi, cellule endoteliali e linfociti) la cui azione è innescata da un complesso network di attivazioni geniche.
Uno dei primi lavori di comparazione tra metodiche diverse per la preparazione di plasma ricco di piastrine è stato “Not every PRP-gel is born equal Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet<®>, RegenPRP-KIT<®>, Plateltex<® >and one manual procedure” (Mazzucco et al., Vox Sang. 2009 Aug; 97(2):110-8).
In tale pubblicazione era stato ipotizzato che PRP preparati con metodiche diverse e quindi con caratteristiche distinte per concentrazione piastrinica e cinetica di rilascio dei fattori di crescita piastrinici, potevano essere applicati in ambiti clinici differenti.
Tali valutazioni avevano portato a concludere che metodiche e sistemi di preparazione, seppur sostanzialmente simili, possono indurre effetti secondari sulle piastrine e pertanto modulare e modificare il rilascio finale dei fattori di crescita. La conseguente variabilità nel rilascio di fattori di crescita e di sostanze bioattive può incidere variamente sui meccanismi di risposta dei tessuti trattati con derivati del PRP, condizionando risposte di rigenerazione tissutale variabili. Tuttavia, su questo importante punto mancano evidenze cliniche.
La biodisponibilità delle molecole presenti nei diversi prodotti ottenuti dalle metodiche prese in esame hanno fatto pensare e concludere che sarebbe stato possibile ottimizzare l’appropriatezza d’uso dei diversi PRP, identificando concentrati di piastrine specifici per ciascuna condizione clinica. Questo ambizioso obiettivo terapeutico resta tuttavia ancora irrealizzato.
Dal 1998 ad oggi dal semplice plasma ricco di piastrine definito da Marx, sono state sviluppate molteplici tipologie di preparazioni di questi emocomponenti che si differenziano per le caratteristiche del prodotto ma possono essere raggruppate in: concentrati piastrinici puri, concentrati piastrinici arricchiti di fibrina, con o senza leucociti.
Il concentrato piastrinico puro è un plasma arricchito di piastrine. La concentrazione delle piastrine è variabile ma deve essere superiore al valore normale del sangue periferico (da 3 a 6 volte). Esso può presentare un bassissimo contenuto di leucociti, inferiore allo 0,5 per µL. Può essere ottenuto attraverso la centrifugazione del sangue anticoagulato (ACD o Sodio Citrato) con specifici protocolli o dispositivi dedicati.
Il concentrato piastrinico arricchito in fibrina è un concentrato di piastrine che ha un’alta densità di fibrina e si presenta in forma di gel. Si ottiene attraverso la centrifugazione diretta del sangue, generalmente senza anticoagulante. La concentrazione di piastrine è difficilmente valutabile essendo intrappolate nella fibrina e nel coagulo.
Sia il concentrato piastrinico puro che quello arricchito in fibrina possono essere arricchiti in leucociti. La reologia del sangue induce una stratificazione degli elementi cellulari per dimensione e peso specifico. I leucociti si posizionano nel “buffy-coat” che si trova tra il plasma, in cui rimangono in sospensione le piastrine, e i globuli rossi. Attraverso il recupero di questa frazione è possibile ottenere una contaminazione non selettiva del concentrato piastrinico (CP) poiché la frazione leucocitaria è globale e contiene quindi linfociti, monociti e neutrofili.
E’ tuttavia sentita nell’arte la necessità di nuovi concentrati piastrinici che presentino proprietà migliorate in termini di induzione della proliferazione cellulare.
E’ pertanto uno scopo della presente invenzione quello di fornire nuovi concentrati piastrinici in grado di incrementare i livelli di proliferazione cellulare rispetto ai concentrati piastrinici noti.
Lo scopo della presente invenzione è raggiunto da un plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche per l’uso nella stimolazione della proliferazione cellulare o come supplemento di un terreno di coltura secondo le rivendicazioni 1 e 2. Viene inoltre fornito un terreno di coltura secondo la rivendicazione 5.
In particolare, secondo un primo aspetto dell’invenzione viene fornito un plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche per l’uso nella stimolazione della proliferazione cellulare in cui detto plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche ha un contenuto di piastrine di almeno 600000 piastrine/µL, preferibilmente 800000-1600000 piastrine/µL e un contenuto di proteine plasmatiche di almeno 10 g/dL, preferibilmente 12-18 g/dL.
In accordo ad un secondo aspetto dell’invenzione, il plasma così ottenuto può inoltre trovare impiego come supplemento di un terreno di coltura cellulare.
Il plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche dell’invenzione è ottenuto mediante le fasi di:
- ottenere un plasma arricchito in piastrine mediante centrifugazione o estrazione da sangue intero anticoagulato o da concentrato piastrinico da aferesi;
- sottoporre detto plasma arricchito in piastrine a filtrazione su fibre cave di polisulfone o suoi derivati aventi una superficie esterna provvista di pori di diametro medio compreso tra 5 μm e 15 μm ed una superficie interna provvista di pori di diametro medio compreso tra 5 nm e 80 nm per ottenere un plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche.
Con il termine “plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche” si intende un plasma in cui i livelli di piastrine sono almeno tre volte più alti di quelli basali del sangue circolante e i livelli di proteine plasmatiche sono almeno due volte più alti di quelli basali del sangue circolante.
Vantaggiosamente, la filtrazione del plasma su polisulfone consente di concentrare piastrine e proteine plasmatiche grazie all’eliminazione di parte della componente acquosa del plasma. Tale processo eseguito in modalità a fondo cieco a pressione controllata, unitamente alla emocompatibilità del materiale filtrante, consentono di non danneggiare le piastrine e di minimizzare l’interazione tra i componenti ematici e il biomateriale.
La componente plasmatica apporta importanti proteine come fibrinogeno, fibronectina, vitronectina, fattore di Von Willebrand, trombospondina-1 e 2, inibitore dell’attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1), fattore piastrinico-4 (PF4), proteine ad azione adesiva-chemiotattica per monociti e neutrofili ed immunoregolatoria, β tromboglobulina, IL-1β, fattori FV, FVIII, FXI, HMWK, C1-inibitore, Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI), proteina S, proteine ad azione anti-microbica ed infine il network di fattori di crescita che diventano strategici per la guarigione e la ricostruzione della matrice cellulare.
La biodisponibilità di tutte queste molecole derivate dall’ambiente ematopoietico influenza la proliferazione cellulare che comunque dipende solo in parte dal numero di piastrine presenti nel concentrato.
In una forma di realizzazione, il plasma può essere arricchito in più proteine selezionate nel gruppo costituito da:
Secondo un terzo aspetto dell’invenzione viene fornito un terreno di coltura cellulare comprendente un plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche come sopra descritto, in particolare, ottenuto mediante le fasi di:
- ottenere un plasma arricchito in piastrine mediante centrifugazione o estrazione da sangue intero anticoagulato o da concentrato piastrinico da aferesi;
- sottoporre detto plasma arricchito in piastrine a filtrazione su fibre cave di polisulfone o suoi derivati aventi una superficie esterna provvista di pori di diametro medio compreso tra 5 μm e 15 μm ed una superficie interna provvista di pori di diametro medio compreso tra 5 nm e 80 nm per ottenere un plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche.
La presente invenzione verrà ora descritta in modo dettagliato con riferimento alle figure dei disegni annessi, che riportano esempi realizzativi puramente illustrativi e non limitativi, in cui:
- la Figura 1 illustra schematicamente la procedura seguita per ottenere il plasma arricchito in piastrine e proteine secondo la presente invenzione;
- la Figura 2 illustra i risultati della proliferazione di fibroblasti coltivati in terreno supplementato con emocomponenti di varia natura;
- la Figura 3 illustra i risultati della proliferazione di fibroblasti coltivati in terreno supplementato con il plasma arricchito in piastrine e proteine secondo la presente invenzione
- la Figura 4 illustra il contenuto in fattori di crescita di plasma arricchito in piastrine (PRP) a concentrazioni diverse;
- la Figura 5 illustra l’aumento delle proteine plasmatiche in campioni del plasma arricchito in piastrine e proteine secondo la presente invenzione.
Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno dalla seguente descrizione di alcuni esempi meramente illustrativi e non limitativi.
Esempi
Preparazione del plasma ricco di piastrine (PRP) Uno schema della metodologia utilizzata per produrre gli emocomponenti testati nei seguenti esempi è riportato alla Figura 1.
I campioni di sangue sono stati raccolti da 10 donatori volontari e sono stati preparati due pool: uno di sangue anticoagulato per produrre, tramite centrifugazione, un plasma ricco di piastrine (PRP) (sistema CPunT – Eltek Group SpA – Hone Italia) e uno di sangue senza anticoagulante per ottenere tramite centrifugazione, siero (provette VI 2PRP Biomed Device – Modena). Il PRP concentrato 2x (PRP 0.4 x 10<6 >piastrine/µL) è stato ottenuto attraverso una centrifugazione a bassa velocità (156 rcf x 10’ Heraeus Megafuge 16 ThermoFisher Scientific - Germany) processato e separato automaticamente. Sono stati raccolti 40 mL di PRP: 20 mL sono stati sottoposti a centrifugazione (1200 rcf x 10’) per ottenere le concentrazioni: 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0 x 10<6 >piastrine/µL attraverso l’opportuna modulazione del volume di plasma surnatante, gli altri 20 mL sono stati destinati alla filtrazione per ottenere il PEFPRP. Il plasma povero di piastrine (PPP) è stato raccolto dopo la seconda centrifugazione del PRP (PRP 0.4 si veda Fig. 1) e diviso successivamente in due aliquote, una delle quali è stata sottoposta a filtrazione per ottenere il PEFPPP. Tutte le preparazioni sono state valutate per contenuto corpuscolare attraverso emocromo (ABX Micro ES 60 – Horiba Medical Group) e per il numero di piastrine è stato accettato in un intervallo di tolleranza ± 0.5 %; tutti i preparati sono stati aliquotati e stoccati a –40°C.
Arricchimento dei componenti del sangue attraverso filtrazione: preparazione di PEFPRP, PEFPPP, PEFPL
La parte di PRP 0,4 piastrine/µL (20mL) e dei diversi emocomponenti (PPP e PL) sono stati sottoposti a filtrazione con il filtro ProtSMART<TM >(Medica Group – SpA, Medolla -Italia). E’ un dispositivo medico (CE) che attraverso fibre capillari di Medisulfone<® >(15 kDa cut-off medio delle fibre; porosità media 5 nm) permette di ottenere, partendo da un plasma ricco di piastrine, un concentrato di piastrine arricchito in proteine (PEFPRP). Il filtro si collega alla siringa che contiene il prodotto da filtrare (da 7 a 20 mL massimo) e grazie alla pressione esercitata in modo lento e costante sulla siringa, per filtrazione “dead-end” avviene la concentrazione dell’emocomponente. Gli elementi filtranti sono trasferiti sterilmente (Laminar Flow Cabinet Biohazad – Bluebam 4, Blueair - Italy) in siringhe: la filtrazione/concentrazione dell’emocomponente è stata eseguita secondo le istruzioni della ditta produttrice. Il prodotto concentrato viene recuperato per aspirazione attraverso la stessa via di ingresso al filtro (2–8 mL). Le piastrine post-filtrazione risultano funzionanti (PFA– Siemens Germany), morfologicamente integre e non aggregate (microscopio Leica DFC 295). La concentrazione è di 4-5 volte rispetto il valore basale e il plasma risulta concentrato ed arricchito di proteine (almeno 2 volte il valore basale). Su una aliquota di ogni emocomponente pre e post filtrazione è stato effettuato il dosaggio delle proteine totali (ADVIA 2400 Siemens - Germany) compreso sull’acqua estratta.
Il plasma (PL) è stato ottenuto da sangue anticoagulato (provette VI 1PRP con ACD Biomed Device – Modena) separato attraverso centrifugazione (1200 rcf x 10’) e diviso in due aliquote, una è stata sottoposta a filtrazione per ottenere il PEFPL.
Il plasma povero di piastrine (PPP) ottenuto come sopra descritto e raccolto dopo la seconda centrifugazione del PRP (PRP 0.4 si veda Fig. 1) è stato sottoposto a filtrazione con Medisulfone<® >per ottenere il PEFPPP.
Il PRP ottenuto come sopra descritto è stato sottoposto a filtrazione con Medisulfone<® >per ottenere il PEFPRP.
Siero
Le provette prive di anticoagulante (provette VI 2PRP Biomed Device – Modena) sono state centrifugate (2340 rcf x 15’) e il siero estratto da ogni provetta è stato raccolto in un pool omogeneo.
Lisato piastrinico (PLTLys)
Una aliquota di PRP 1.0 è stata sottoposta a tre lavaggi delicati con PBS al 3% di EDTA, le piastrine quindi sono state risospese in PBS (volume uguale a quello iniziale) e sottoposte a shock termico -80°C/+37°C. Le membrane piastriniche frantumate per congelamento sono state rimosse per centrifugazione ad alta velocità. PLTLys è stato quindi congelato in aliquote a -40°C fino al momento dell’uso. Questa preparazione è stata usata come standard di riferimento per verificare l’effetto delle molecole estratte dalle piastrine e quindi evitare l’interferenza d’interazione con quelle del plasma.
Quantificazione dei fattori di crescita in PRP 1.0, PPP, PL, SIERO, PEFPRP, PEFPPP e PEFPL
Sono state quantificate IGF-1, VEGF, EGF, PDGF-bb, TGF-β, usando il kit Quantikine®ELISA (R&D Systems, Abingdon, UK). Il saggio è stato eseguito secondo le direttive del produttore.
Colture di fibroblasti dermici umani
Sono stati utilizzati fibroblasti umani primari (Normal Human Dermal Fibroblats adult skin – Lonza Walkersville Inc. – USA) mantenuti in terreno di coltura completo (D-MEM addizionato a 2mM L-Glutammina, 100 IU/mL penicillina, 100 µg streptomicina and 0.5% di amfotericina B - Invitrogen Corporation, USA) al 10% di FBS. La crescita e la morfologia delle cellule sono state valutate attraverso l’osservazione a microscopio ottico (Leica DMIL - Germany). Le prove sono state effettuate in piastre da 96 pozzetti ed ad ogni seduta i risultati sono stati rapportati ad una curva di crescita (definita standard). Al giorno 0, sono state seminate (gg0) 5000 cellule per pozzetto in terreno di coltura completo, dopo 24 h (gg1), ad avvenuta adesione, il terreno è stato sostituito con terreno completo senza FBS, al fine di indurre la sincronizzazione delle cellule seminate ed evitare ulteriori interferenze da plasma di origine animale.
Stimolazione della proliferazione cellulare mediante le preparazioni di componenti del sangue
A 4 giorni dalla semina il terreno è stato sostituito con terreno senza FBS addizionato a 10% di delle preparazioni di componenti del sangue. Sono quindi state allestite le culture per la verifica dell’effetto di: PL, PEFPL, PPP, PEFPPP, PRP 1.0, PEFPRP (1.0), SIERO e PRP a concentrazione di piastrine scalare e crescente 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0. Le colture sono state eseguite a 37°C e 5% CO2, in alcuni esperimenti (n=8), in parallelo sono state allestire colture in presenza di cellule espanse 10% FBS come additivo standard.
Saggio di proliferazione cellulare a breve termine Per la determinazione del tasso di proliferazione cellulare, è stato scelto il termine breve di 7 e 11 giorni dalla semina, dopo la stimolazione con preparazioni di componenti del sangue.
Le cellule, dopo un prolungato lavaggio con PBS, sono state incubate a tempi differenti con una soluzione diluita di soluzione reagente (CellTiter 96 Aqueous One Solution cell proliferation assay Promega – USA) per 3 ore a 37°C in umidificatore, in atmosfera 5% CO2. L’assorbanza è stata registrata a 490 nm usando un lettore a piastra (Anthos 2010 GSG Robotics – Italia).
Statistiche
I risultati differenti tra le condizioni di coltura cellulari sono state stabilite mediante il metodo ANOVA con il software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA). Le analisi sono state eseguite utilizzando i post-test ANOVA one-way e Dunnet.
Nelle figure, i dati sono espressi come medie e deviazioni standard.
Risultati
Le prove di crescita sono state effettuate con terreno al 10% di FBS o al 10% delle diverse frazioni degli emocomponenti, in base a studi effettuati con curve di crescita ottenute da stimolazioni a percentuali diverse e pubblicate in letteratura che hanno definito questa supplementazione efficace (SH Zaky, A Ottonello, P Strada, R Cancedda : Platelet lysate favours in vitro expansion of human bone marrow stromal cells for bone and cartilage engineering- Journal of tissue engineering and regenerative12/2008).
Sono state preparate 9 aliquote di PRP con un numero di piastrine da 0.4 x10<6 >(due volte il valore basale medio di PLT nel sangue periferico) fino a 2.0 x10<6>/µL come supplemento al terreno completo in sostituzione del FBS, per verificare se il variare della concentrazione di piastrine nel PRP influenzi la crescita cellulare. Tutti i risultati sono stati riportati in un grafico e tutte le concentrazioni sono state confrontate come variazione percentuale rispetto al PLTLys.
Le cellule sono state seminate (per garantire una corretta adesione e vitalità) e poi stimolate dopo 72 ore dalla semina con i diversi emocomponenti. A 7 gg dalla semina (Figura 2a) sono state effettuate le valutazioni di crescita e non si evidenziano differenze statisticamente significative di proliferazione tra la condizione di riferimento, PLTLys, e i diversi trattamenti.
Ripetendo il trattamento come precedente, ma mantenendo la supplementazione sino a gg 11 dalla semina (Figura 2b) si osserva come la proliferazione indotta da tutte le diverse concentrazioni di PRP risulti significativamente più elevata rispetto a quella di riferimento, mentre non lo sono i valori raggiunti dopo trattamento con PPP, PL e siero.
I risultati hanno dimostrato che il numero di piastrine influenza la crescita cellulare anche se non in modo lineare e senza una diretta proporzionalità. In particolare, andando a calcolare il numero di cellule, si osserva che, in vitro, anche a basse concentrazioni (0.4 x10<6 >/ µL) il concentrato piastrinico ha un effetto induttivo sulla crescita, ma l’effetto migliore si raggiunge quando la concentrazione è tra 4 e 8 volte (0.8 x10<6 >e 1.6 x 10<6>/µL) il valore basale.
In Figura 2 sono riportati i dati di proliferazione risultanti dall’uso di un terreno addizionato con PRP con concentrazione di piastrine 1x10<6>/µL a confronto con tutte le frazioni ottenute dalle diverse fasi di lavorazione e preparazione del PRP. Come controllo è stato utilizzato un terreno completo con FBS (CTRL+ FBS). La filtrazione è stata aggiunta come metodica innovativa alla preparazione di questi emocomponenti e i concentrati ottenuti sono risultati non solo arricchiti in piastrine ma anche in proteine totali (Tabella 1).
Tabella 1
La valutazione è stata effettuata a gg7 e gg11 dalla semina essendo stato già osservato che l’aumento maggiore di crescita avviene dal giorno 7.
A gg7, nessuno dei trattamenti ha determinato un incremento significativo della proliferazione (Figura 3) mentre dopo 11 giorni di trattamento, solo il PEFPRP si è dimostrato in grado di indurre un aumento significativo della proliferazione con un incremento di circa il 50%, rispetto al controllo (CTRL+FBS).
Dai risultati si conferma che il PRP aumenta la proliferazione cellulare, ottenendo una crescita doppia rispetto al controllo; il siero mantiene un effetto positivo di poco superiore al controllo. La proliferazione più intensa è quella sostenuta dal PEFPRP.
Si è riscontrata una scarsa correlazione tra il contenuto dosabile dei GFs e la concentrazione piastrinica dei PRP. L’IGF-1, che è una proteina plasmatica, è relativamente uniforme in tutti i prodotti. Per gli altri fattori si nota una certa scalarità da PRP 0.4 a PRP 1.0, mentre a concentrazioni superiori a PRP 1.4 si osserva quasi un effetto paradosso che può essere attribuibile ad una polimerizzazione dei GFs oltre ad una certa concentrazione (Figura 4).
Nella Tabella 2 sono riportate le concentrazioni dei GFs ottenute nelle diverse formulazioni.
Tabella 2
La filtrazione ha permesso di recuperare una maggiore quantità di GFs in tutti i preparati, in particolare il PEFPRP aumenta la concentrazione di almeno 1.5/2 volte rispetto al PRP.
L’IGF-1, quale proteina plasmatica è maggiormente espressa nel PPP, PL e rispettivi filtrati, mentre nel PRP è più bassa ma si concentra con la filtrazione; nel siero il valore eguaglia PEFPRP.
VEGF, EGF, PDGF-BB e TGF-β sono fattori di rilascio piastrinici, rispecchiano tutti lo stesso andamento: quantitativamente inferiori, come previsto, in PPP, PL e rispettivi filtrati, molto espressi in particolare il PDGF-BB e EGF in PRP e PEFPRP. Nel siero le quantità sono rilevanti essendo comunque per definizione ottenuto da retrazione del coagulo, ma comunque più basse rispetto al PEFPRP.
DISCUSSIONE
La somministrazione topica di plasma ricco di piastrine è una procedura frequentemente utilizzata per il trattamento di numerose condizioni cliniche che richiedono un miglioramento della riparazione tissutale. Questo richiede sinergia e ridondanza tra i meccanismi coinvolti per generare risultati appropriati e stabili. La maggior parte delle attività cellulari sono risposte a numerosi segnali e ciascun segnale provoca più di un’attività. La ridondanza di segnali multipli è un ruolo generale nello sviluppo e nella riparazione di un tessuto.
Lo scopo dell’applicazione degli emocomponenti per uso non trasfusionale in Medicina Rigenerativa è quello di fornire biomolecole e proteine fisiologicamente già presenti nei tessuti, ma che per fattori intrinseci o estrinseci sono deficitari in quanto subiscono una qualunque inibizione a livello locale, o mancano del tutto, comportando il rallentamento della guarigione. Le piastrine sono serbatoi naturali di fattori diversi con funzioni sinergiche anaboliche e cataboliche. Quindi, la loro somministrazione in concentrazione superiore al livello basale apporta i giusti fattori nella giusta proporzione per accelerare la risposta cellulare e ottenere la rigenerazione del tessuto.
Il rapporto tra concentrazione piastrinica e rilascio di GFs è stato già valutato in molti studi, in particolare in lavori che comparavano metodiche di preparazione diverse. Gli stessi inventori hanno pubblicato nel 2009 il confronto tra 4 tipologie di preparazioni. La sola valutazione quantitativa dei GFs rilasciati/presenti nelle diverse formulazioni di concentrati piastrinici è solo un passo preliminare per predirne l’efficacia clinica in vivo. Il presente studio ha infatti valutato l’effetto sulla proliferazione cellulare indotta da componenti del sangue arricchiti in proteine a confronto con quella indotta da alcuni prodotti già utilizzati in numerose condizioni cliniche.
La filtrazione del PRP è stata introdotta come metodica innovativa per ottenere, attraverso un processo non selettivo a livello cellulare ma di privazione della componente acquosa plasmatica, una maggiore concentrazione delle piastrine e delle proteine plasmatiche. La filtrazione è un’alternativa alla centrifugazione che normalmente si applica per aumentare la concentrazione piastrinica del PRP. Rispetto alla centrifugazione è meno aggressiva sulle piastrine e ne conserva maggiormente la struttura e la funzione. Inoltre, oltre a consentire un maggior recupero numerico e funzionale di cellule, ne arricchisce il contenuto proteico.
La valutazione dell’effetto sulla crescita cellulare di concentrazioni piastriniche differenti nel PRP ha confermato dati già pubblicati precedentemente da parecchi autori.
Le piastrine rilasciano nel plasma quantità di molecole bioattive grossolanamente proporzionali alla concentrazione piastrinica nel preparato. L’effetto sulla proliferazione delle cellule bersaglio indotta dalle quantità variabili di fattori liberati dalle piastrine è illustrato nella Fig. 4. Si può affermare con certezza che il rilascio di fattori dalle piastrine è una componente essenziale e basilare in rapporto allo stimolo sulla proliferazione cellulare; l’importanza dell’effetto biologico da parte dei preparati di PRP è evidente quando si confronta la proliferazione indotta rispetto a quella dal plasma (che contiene proteine plasmatiche ma è virtualmente privo di piastrine attivabili), con il lisato piastrinico (che contiene fattori di derivazione piastrinica ma è privo di molecole plasmatiche) e il siero (che contiene fattori della coagulazione residui e molecole di rilascio della componente cellulare “intrappolate” nel coagulo). Infatti, l’aggiunta al terreno di plasma, siero o lisato stimola la proliferazione cellulare in modo non dissimile da quella ottenuta nel controllo (terreno completo con 10% FBS) mentre tutti i PRP, qualsiasi sia la concentrazione piastrinica, producono uno stimolo superiore. In virtù del fatto che la proliferazione delle cellule bersaglio è sensibile alla duplicità di meccanismi di innesco (proteine plasmatiche e fattori di derivazione piastrinica), questa non è correlata in maniera diretta con la sola concentrazione piastrinica. Questo è un elemento nuovo: infatti si è sempre pensato che, entro certi limiti, la crescita cellulare indotta dalle piastrine fosse sempre correlata alla loro concentrazione. Gli inventori hanno però evidenziato che tale relazione lineare si verifica solo fino alla concentrazione massima di piastrine pari a 1.4 x10<6 >µL (PRP 1.4).
A concentrazioni superiori, la proliferazione cellulare diminuisce, mostrando una relazione gaussiana tra concentrazione piastrinica e risposta proliferativa. Sebbene studi sulla rigenerazione dei tessuti effettuati in vivo attribuiscono infatti a 1x10<6>µL (PRP 1.0) la massima efficacia clinica dei concentrati piastrinici, i dati relativi alla presente invenzione dimostrano che alla stessa concentrazione di piastrine nei diversi preparati, le cellule in coltura rispondono in modo diverso, ed in particolare, ove è presente una maggiore concentrazione di proteine (PEFPRP) la risposta è più rilevante e statisticamente significativa.
Le proteine plasmatiche nei preparati senza la componente piastrinica (PL e PPP), nel modello cellulare qui utilizzato, inducono una proliferazione pari al controllo sia a 7 giorni che a 11 giorni dalla semina, anche dopo filtrazione (PEFPL e PEFPPP). Nonostante la concentrazione di proteine totali sia maggiore, la crescita cellulare non aumenta come presunto; l’effetto del siero seppure leggermente maggiore, risulta analogo.
Da queste considerazioni si può affermare che l’aumento significativo indotto a gg11 dal PEFPRP è dovuto alla cooperazione dell’azione delle proteine plasmatiche e di quelle piastriniche.
Le piastrine sono cellule anucleate ma specializzate nella secrezione del contenuto dei loro granuli intracellulari (che contengono inoltre proteine autosintetizzate) in risposta a stimoli.
Nei granuli si trovano, insieme a vescicole con membrana, proteine di rilascio protrombico, proteine mitogeniche, proteine immunomodulatorie e proteine adesive, fattori di crescita, molecole di segnale, citochine, integrine e proteine della coagulazione. Tra le proteine nel PRP ci sono fattori del complemento (C1RL, CO6, CFAH, CO3, CFAB, C1QA, CO4B), immunoglobuline (LV101, LV107) e proteasi del tipo serina (THBG, CBG). Queste ultime sono i principali componenti della coagulazione e della cascata del complemento presenti nel plasma.
Molte di queste proteine, che si trovano nei granuli α, sono presenti nel plasma ma alcuni fattori della coagulazione che derivano da piastrine sono strutturalmente differenti dai corrispondenti fattori presenti nel plasma.
Ciò suggerisce che alcune proteine plasmatiche e i fattori rilasciati dalla piastrine cooperino sinergicamente all’induzione della risposta proliferativa nelle cellule bersaglio e che tale azione sinergica potrebbe dipendere dal concorso di varie vie di attivazione dei meccanismi citoplasmatici che convergono sulle stesse vie di trasduzione del segnale innescando il network della proliferazione cellulare (attivazione genica, mitosi, sintesi proteica) e quindi dar vita alla rigenerazione tissutale.
CONCLUSIONI
I risultati dello studio mostrano che la relazione tra la proliferazione di fibroblasti primari in vitro e la concentrazione di piastrine nel mezzo di condizionamento non è strettamente lineare, in particolare si è visto che la differenza in un intervallo tra 0.6 e 1.6 x 10<6 >piastrine/µL non induce un risultato di crescita cellulare significativamente diverso. Il PRP prodotto mediante filtrazione (PEFPRP) induce una crescita cellulare maggiore di ogni altro prodotto testato. Il probabile minore stress piastrinico che viene indotto durante la filtrazione, condiziona un notevole incremento della frazione disponibile di fattori di crescita.
Comparazione ed identificazione delle proteine rilevate con analisi proteomica nel PEFPRP e nel PRP
E’ stata condotta un’analisi proteomica sul PRP e sul PEFPRP per identificare le principali proteine plasmatiche Il prodotti analizzati sono:
A) PRP (concentrazione di piastrine: 1x10<6 >per µL) B) PEFPRP (concentrato piastrinico filtrato ottenuto da un aliquota di PRP 1x10<6 >piastrine/µL)
L’analisi proteomica effettuata su A e B è stata rivolta all’identificazione delle proteine maggiormente espresse coinvolte nei meccanismi di rigenerazione tissutale. Sono state identificate circa 80 proteine per prodotto che sono poi state confrontate.
Il confronto, mirato a valutare come la filtrazione su Medisulfone<® >modula la concentrazione di queste proteine, è stato effettuato attraverso un software specifico dedicato.
I risultati, riportati nella Figura 5a e 5b, mostrano un aumento di 44 proteine nel filtrato rispetto al corrispondente PRP (Figura 4a, “fold change” = quante “volte” - statisticamente significative - la proteina ha una maggiore concentrazione nel PEFPRP rispetto al PRP) e una riduzione della presenza di altre 33 proteine (Figura 4b).
In Tabella 3 sono riportate le proteine up- e downregolate raggruppate con riferimento ai principali effetti nel processo di guarigione delle ferite.
Tabella 3
Sono poi state identificate proteine della componente plasmatica (frazioni del Complemento e Immunoglobuline) e della membrana piastriniche quali antigeni piastrinici (Glicoproteine di membrana). I risultati sono riportati nella Tabella 4.
Tabella 4
Claims (6)
- RIVENDICAZIONI 1.- Plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche per l’uso nella stimolazione della proliferazione cellulare in cui detto plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche ha un contenuto di piastrine di almeno 600000 piastrine/µL e un contenuto di proteine plasmatiche di almeno 10 g/dL.
- 2.- Plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche per l’uso come supplemento di un terreno di coltura cellulare in cui detto plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche ha un contenuto di piastrine di almeno 600000 piastrine/µL e un contenuto di proteine plasmatiche di almeno 10 g/dL.
- 3.- Plasma secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, caratterizzato dal fatto di avere un contenuto di piastrine compreso nell’intervallo tra 800000 e 1600000 piastrine/µL e un contenuto di proteine plasmatiche compreso nell’intervallo tra 12 e 18 g/dL.
- 4.- Plasma secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzato dal fatto di essere ottenuto mediante le fasi di: - ottenere un plasma arricchito in piastrine mediante centrifugazione o estrazione da sangue intero anticoagulato o da concentrato piastrinico da aferesi; - sottoporre detto plasma arricchito in piastrine a filtrazione su fibre cave di polisulfone o suoi derivati aventi una superficie esterna provvista di pori di diametro medio compreso tra 5 μm e 15 μm ed una superficie interna provvista di pori di diametro medio compreso tra 5 nm e 80 nm per ottenere un plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche.
- 5.- Plasma secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, caratterizzato dal fatto di essere arricchito in più proteine selezionate nel gruppo costituito da
- 6.- Terreno di coltura cellulare comprendente un plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche, in cui detto plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche ha un contenuto di piastrine di almeno 600000 piastrine/µL e un contenuto di proteine plasmatiche di almeno 10 g/dL. 7.- Terreno di coltura cellulare secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detto plasma è ottenuto mediante le fasi di: - ottenere un plasma arricchito in piastrine mediante centrifugazione o estrazione da sangue intero anticoagulato o da concentrato piastrinico da aferesi; - sottoporre detto plasma arricchito in piastrine a filtrazione su fibre cave di polisulfone o suoi derivati aventi una superficie esterna provvista di pori di diametro medio compreso tra 5 μm e 15 μm ed una superficie interna provvista di pori di diametro medio compreso tra 5 nm e 80 nm per ottenere un plasma arricchito in piastrine e proteine plasmatiche.
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